Abstract
Modelos animales experimentales de ictus son herramientas muy valiosas para la comprensión de la patología de carrera y el desarrollo de estrategias de tratamiento más eficaces. Un protocolo de 2 semanas para precondicionamiento hipóxico repetitivo (RHP) induce una protección a largo plazo contra las lesiones del sistema nervioso central (SNC) en un modelo de ratón de accidente cerebrovascular isquémico focal. RHP consta de 9 exposiciones estocásticos a la hipoxia que varían tanto en duración (2 o 4 hr) y la intensidad (8% y 11% O 2). RHP reduce los volúmenes de infarto, barrera hematoencefálica (BBB) perturbación, y la respuesta inflamatoria posterior al accidente cerebrovascular durante semanas después de la última exposición a la hipoxia, lo que sugiere una inducción a largo plazo de un fenotipo SNC-protectora endógena. La metodología para la cuantificación de doble el volumen del infarto y disrupción de la BHE es eficaz en la evaluación de la protección neurovascular en ratones con RHP u otros neuroprotectores putativos. Adultos ratones macho Swiss Webster fueron acondicionados previamente por RHP o exposiciones de duración equivalente al 21% de O
Introduction
Como la principal causa de discapacidad en los adultos y la cuarta causa principal de muerte, accidente cerebrovascular es uno de los estados de enfermedad más debilitantes que enfrenta la población adulta de los Estados Unidos. 1 Los modelos animales de accidente cerebrovascular permiten para la investigación experimental de nuevos métodos de reducción de la lesión isquémica y mejorar la recuperación después de un accidente cerebrovascular. Una vía novedosa para este tipo de investigación traslacional se preacondicionamiento. Preacondicionamiento es el uso intencional de un estímulo no perjudicial para reducir el daño de una posterior, y más grave, lesiones. 2 hipóxico preacondicionamiento se ha demostrado que producen cambios pleiotrópicos en el cerebro que proporcionan protección contra el accidente cerebrovascular en tanto in vivo e in vitro . 3 Sin embargo, una sola exposición a la hipoxia sólo ofrece neuroprotección corto plazo, lo que induce a menos de 72 horas de la tolerancia frente a la isquemia en ratones adultos. 4 incluso después de cuatro semanas de exposiciones diarias 14 hr a la hipoxia hipobárica, Lin et al. found neuroprotección que solamente se mantuvo durante una semana. 5 precondicionamiento hipóxico repetitiva (RHP) se caracteriza por las variaciones estocásticas en la frecuencia, duración e intensidad de las exposiciones hipóxicas. En contraste con un único reto preacondicionamiento, RHP induce un fenotipo cerebroprotectora que dura hasta ocho semanas en ratones. 6 RHP redujo los volúmenes de infarto, barrera hematoencefálica (BBB) perturbación, inflamación vascular y diapedesis de leucocitos durante semanas después de la exposición hipóxica definitiva . RHP reduce específicamente la inflamación en el cerebro isquémico mediante la reducción de las células T, monocitos, macrófagos y las poblaciones, mientras que el mantenimiento de las poblaciones de células B en el hemisferio isquémico. 7 De hecho, RHP induce un fenotipo inmunosupresor en ratones antes de cualquier lesión del SNC, incluido el accidente cerebrovascular. Células B tratados con RHP aisladas de ratones sanos tratados-RHP exhibieron un fenotipo antiinflamatorio único, con una regulación a la baja tanto de la presentación de antígenos y la producción de anticuerpos. Losreducción general en mecanismos inmunes adaptativos pro-inflamatorias hace RHP una excelente metodología para inducir inmunosupresión endógena no sólo para enfermedades inflamatorias del SNC-específicos, sino también modelos de lesión o enfermedad sistémica que incluyen una patología pro-inflamatorio.
RHP reduce tanto el volumen del infarto y la disrupción de la BHE tras una oclusión transitoria de la arteria cerebral media (tMCAo). Los modelos animales de accidente cerebrovascular, tales como el comúnmente usado tMCAo, mejorar dramáticamente la comprensión de la fisiopatología del accidente cerebrovascular, así como el diseño de Neurotherapeutics más eficaces. Primero desarrollado por Koizumi et al., En 1986, el procedimiento tMCAo 8 es un método ampliamente utilizado de inducir accidente cerebrovascular en roedores y uno de los métodos preferidos para la investigación de la inflamación después de la reperfusión. Como los métodos para tMCAo evolucionan, el uso más reciente de filamentos recubiertos de silicona reducir aún más el riesgo de hemorragia subaracnoidea en comparación con otros modelos de 9,10 </ Sup> y mejorar la fiabilidad, aunque por desgracia tMCAo menudo produce una amplia variación en los volúmenes de infarto. 11-13 La mayor parte de estos estudios delinear regiones de infarto en el cerebro secciones coronales mediante tinción con cloruro de 2,3,5- trifeniltetrazolio (TTC), considerado un estándar de oro para la cuantificación del infarto debido a que es una manera simple y barata de producir vivos, resultados replicables. TTC sirve como un sustrato de deshidrogenasas presentes en las mitocondrias. Cuando rodajas de cerebro están expuestos a la solución de TTC, TTC se toma selectivamente en células vivas donde su producto de reducción no soluble, formazán, precipita a un color rojo intenso en la mitocondria viables. Debido a la disfunción mitocondrial en el tejido isquémico, este tejido permanece blanco, lo que permite la diferenciación del tejido dañado y sano. 14
RHP también reduce la acreditación interrupción en el hemisferio isquémico. 6 Por lo tanto, la doble cuantificación de acreditación integridad dentro de la misma blluvias como el volumen del infarto basado en TTC Determinaciones 15 proporcionaría información útil sobre la eficacia plena de la protección endógena, y posibles relaciones causales entre la disrupción de la BHE y el infarto en los animales no tratados y tratados. La afluencia de sangre periférica a través de una acreditación interrumpido, secundaria a un accidente cerebrovascular, aumenta poblaciones de leucocitos, citoquinas pro-inflamatorias, estrés oxidativo, edema vasogénico y transformación hemorrágica en el hemisferio isquémico, en última instancia, el aumento de las tasas de infección y mortalidad en pacientes con ictus isquémico 16,17. Un método común de medir la disrupción de la BHE en modelos animales es a través de la cuantificación de azul de Evans (EB) de fugas de tinte en el cerebro. 15,18-21 EB se une selectivamente a la albúmina sérica, una proteína globular (MW = 65 kDa) que no atraviesa la BBB en animales no lesionados. 22 Tras el accidente cerebrovascular isquémico, EB se infiltra en el cerebro, y emite fluorescencia a 620 nm, lo que permite la medición de la densidad óptica within el parénquima lesionado perfundido. 22 La densidad óptica es directamente proporcional a la permeabilidad de la BBB cuando EB ha sido lavada fuera de la vasculatura cortical post-mortem por perfusión transcardiaca. Con el procesamiento inmediato de los cerebros teñidas con TTC en animales con administración EB, tanto el volumen del infarto y la disrupción de la BHE se pueden cuantificar de manera efectiva. Cabe señalar, sin embargo, que el daño neuronal y la disrupción de la BHE no son procesos concomitantes en el cerebro post-accidente cerebrovascular, 23,24 lo que la selección de tiempo de sacrificio es una consideración importante.
El protocolo que sigue detalla el método RHP, el método tMCAo para inducir una oclusión arterial temporal que los modelos de las oclusiones de la arteria cerebral media en pacientes humanos, y los métodos histológicos duales para determinar neurales y vasculares puntos finales de lesiones accidente cerebrovascular. TTC mide la muerte celular y el daño tisular acumulativa, lo que permite la cuantificación de un infarto vol generalume, mientras que EB ofrece para la cuantificación hemisférica de acreditación daños.
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Protocol
NOTA: Este protocolo fue aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) en UT Southwestern Medical Center, que se rige por los Institutos Nacionales de la política de la Salud (NIH) para el uso de animales de experimentación.
1. repetitivo hipóxico Precondicionamiento
- Diseño personalizado cuatro caudalímetros en reguladores de gas y conectar a las cámaras de inducción 15 L estándar con tubos de PVC para permitir que el gas comprimido del oxígeno (O 2) tanques fluyan a las cámaras a través de un orificio de entrada. Ver Equipos y Materiales para más detalles sobre el diseño personalizado.
- Divida los ratones en 2 grupos: Repetitivo hipóxico Precondicionamiento (RHP) del Grupo, que reciben las exposiciones al 8% y el 11% de O 2, y el grupo de control, que reciben las exposiciones al 21% de O2 (aire ambiente) al mismo tiempo. Ver Tabla 1 para las variaciones en la frecuencia, intensidad (8 y 11% de O 2 o el 21% de O 2), y la duración (2 o 4 horas) de las exposiciones RHP. </ Li>
- Retire la tapa del filtro de la parte superior de cada jaula y coloque la jaula, con botellas intactas de alimentos y agua, en las cámaras conectadas a sus respectivos O 2 tanques. Cierre y asegure la tapa de la cámara.
- Abrir la válvula de gas principal para los tanques y establecer el flujo inicial para cada cámara de inducción a 2 L por min (LPM) durante los primeros 5 minutos de exposición. Reducir la tasa de flujo de 1 LPM para el resto de la exposición.
- Al final de la exposición, para reducir el flujo a 0 LPM y cerrar la válvula de gas para los tanques.
- Abra las tapas de la cámara y vuelva a colocar la tapa superior del filtro en cada jaula. Coloque las jaulas en la vivienda estándar hasta la próxima exposición hipóxica.
- Rocíe cada cámara de inducción con NPD (Steris) o un desinfectante equivalente / desodorante después de cada uso.
- Expose tanto 21% y ratones RHP en el mismo momento del día durante el transcurso de dos semanas como se describe en la Tabla 1.
2. TransitorioLa oclusión de la arteria cerebral media (tMCAo)
- Ver discusión para más detalles sobre el tiempo de la carrera después de la exposición final de RHP.
- Preparar un lugar de trabajo de la cirugía aséptica. Limpie el lugar de trabajo alrededores con un 70% de etanol o un desinfectante equivalente y autoclave todos los instrumentos quirúrgicos.
- Coloque el instrumento láser Doppler Flujometría (LDF) para medir los cambios relativos en el flujo sanguíneo cerebral (FSC). Encienda la almohadilla térmica a 37 ° C. Encienda la incubadora a 34 ° C.
- Anestesiar ratones con una breve exposición a una mezcla de 4% de isoflurano / 70% NO 2/30% O 2 en una cámara de inducción pequeño. Confirme la anestesia adecuadas ligeramente pellizcar la pata. Si el ratón retira su pata, devolver el ratón a la cámara de inducción y continuar la exposición isoflurano.
- Retire los ratones de la cámara de la inducción anestésica e inserte rápidamente la nariz del ratón en el cono de la nariz. Abra el flujo de gas al cono de la nariz, cerrando el flujo a las Anestesia cámara de inducción.
- Sin cambiar el 70% NO mezcla de gas 2/30% O 2, fijar isoflurano al 1,8% como la dosis de mantenimiento para el resto del procedimiento. La respiración debe seguir siendo lento y regular a lo largo del procedimiento, pero si la respiración se vuelve rápida y superficial, aumentar la dosis de isoflurano. Dosis de mantenimiento puede variar entre la fabricación de equipos y animal usado en el experimento.
- El uso de un microshaver, afeitar el pelo en la región temporal entre la esquina del ojo y el oído, así como la línea media ventral del cuello. Retire el exceso de piel y aplicar lubricante ocular con un hisopo de algodón estéril para mantener las córneas se sequen durante el procedimiento. Limpie el área de la incisión con almohadillas con alcohol y hisopo providona-yodo con un hisopo de algodón estéril para mantener las condiciones de asepsia.
- Administrar analgésicos según las directrices quirúrgicas roedores.
- Hacer una incisión a través de la piel temporal entre el ojo y el oído.Exponer el músculo temporal. El uso de micro-tijeras quirúrgicas, cortar el ligamento músculo temporal en la cresta temporal dentro del área de estriación muscular blanco.
- Empuje suavemente la masa muscular lateralmente con unas pinzas para visualizar la arteria cerebral media (ACM) a través del cráneo. Tras la incisión del músculo temporal, el área puede llenarse de sangre. Utilizar suavemente un hisopo de algodón para detener cualquier sangrado potencial.
- Apunte la punta de la sonda a la zona LDF MCA. Registre el vaso escogido ya que esta zona varía entre los ratones.
- Mantenga el LDF en su lugar y al ras con el cráneo hasta que se lee un flujo estable de células de sangre roja y registrar este valor como el CBF línea de base. CBF basal Ideal en un Doppler Flujometría láser son> 600 flujo, pero esto puede variar con el fabricante. Si la línea de base CBF es <400 de flujo, es más probable de una vena, o una colocación incompleta de la sonda sobre el vaso diana la grabación de flujo.
- Después de establecer la línea de base CBF, repositien el ratón de manera que se expone el cuello. Apoye la cabeza y mantener el ratón bajo anestesia constante de la ojiva.
- Haga una incisión en la línea media ventral desde justo debajo de la mandíbula a la clavícula.
- Con unas pinzas, blunt diseccionar todo fascia superficial para exponer la arteria carótida común izquierda (CCA). Separar la CCA a partir de tejido conectivo y el nervio vago.
- Permanentemente ligar el CCA con una sutura de seda 6.0. Coloque la sutura ligadura proximal como sea posible para permitir espacio suficiente para ocluir la colocación de filamentos.
- Loop y sin apretar atar un segundo seda 6.0 sutura alrededor del CCA distal a la oclusión de sutura. Tenga cuidado de no obstruir la arteria como el filamento de oclusión posteriormente se pasa a través de la carótida.
- Utilice un 8 x 2 mm de luz micro serrafine pinza areterial para sujetar la CCA distal a la sutura de seda atada vagamente. Levante con cuidado el CCA con pinzas y hacer una pequeña incisión longitudinal, como proximal a la ligadura de sutura comoes posible con 3 Vannas mm.
- Enrosque un 12 mm de calibre 6,0 oclusión nylon filamento de silicio recubiertos través de la incisión para entrar en el lumen de la arteria, y luego adelantarlo unos pocos mm. Sin apretar apretar la segunda sutura de seda floja alrededor de la punta del filamento de oclusión para asegurar el flujo sanguíneo no empuja el filamento de la CCA y retire la pinza arterial.
- En la primera bifurcación de la CCA en la arteria carótida interna (ACI) y la arteria carótida externa (CEPA), pase el filamento de oclusión en la rama derecha de la primera bifurcación para entrar en el ICA.Advance el filamento de oclusión 9-10,5 mm pasado la segunda sutura de seda en la arteria carótida interna izquierda (ACI).
- Poco después de entrar en el ICA, avanzar en el filamento de oclusión en la rama izquierda en la segunda bifurcación entre el ICA y la arteria pterogopalantine (PPA). La visualización de la PPA es poco probable por lo que procede hasta que sienta una resistencia leve con la colocación completa del filamento de oclusión.El levantamiento de la ACI con fórceps puede ayudar a que el filamento para enhebrar más fácilmente en la rama izquierda de la segunda birfurcation. Apriete la segunda sutura de seda.
- Ponga el ratón por lo que la incisión sobre el MCA es visible. Con el equipo LDF, confirme que la CBF se bloquea a través de lecturas LDF. Una oclusión exitosa es una reducción> 80% a partir de la línea de base CBF.
- Completamente apriete y de doble nudo de la segunda sutura de seda alrededor del filamento de oclusión cuando se alcanza la posición correcta. Si es necesario, empuje ligeramente en o sacar el filamento de oclusión para lograr criterios CBF para una oclusión éxito (por ejemplo, reducción> 80% del valor inicial CBF).
- Cierre la abertura del cuello y la cabeza con suturas de nylon 6.0.
- Coloque los ratones en la incubadora a 34 ° para la duración de la oclusión. La longitud recomendada de la oclusión es de 60 minutos, pero esto varía de edad, las diferencias de tensión dependiente de la anatomía vascular cerebral, el 25 y el grado de injury desea (leve, moderada, severa). Asegúrese de que los animales recuperen la conciencia dentro de minutos saliendo de la anestesia.
- Re-anestesiar a los animales con isoflurano, como se describe en el paso 2.3, 5 min antes del final del período de oclusión predefinida, abrir la incisión del cuero cabelludo y confirme que la perfusión MCA está todavía reduce utilizando lecturas LDF transcraneal. Si CBF no se reduce lo suficiente (por ejemplo, <20% CBF línea de base), la MCA ha reperfundido en algún momento durante la oclusión y el ratón debe ser excluido de la experimentación.
- Abra la línea media incisión en el cuello y sin apretar atar una tercera sutura de seda alrededor de la CCA, distal a la segunda sutura de seda, pero proximal a la bifurcación CCA para asegurar que la arteria carótida externa (CEPA) seguirá siendo viable después de retirar el filamento.
- Cortar o desatar el nudo que mantiene el filamento de oclusión (es decir, la sutura segundo seda) y retirar el filamento de oclusión lentamente. Una vez eliminado, cerrar rápidamente eltercera sutura de seda alrededor de la CCA para minimizar el reflujo de sangre desde el ICA. Doble nudo esta sutura y cerrar la incisión con suturas de nylon 6,0.
- Vuelva a colocar el ratón para cuantificar el nivel de CBF después de 5 minutos de la reperfusión. Reperfusión exitosa se define generalmente como CBF de> 50% de la línea de base CBF, pero, al igual que con el flujo de oclusión, los investigadores pueden establecer su propio criterio. Si los animales exhiben una CBF por debajo del 50% de su línea de base, es probable que el MCA es "permanente 'ocluida, y por lo tanto representa otro criterio de exclusión estudio.
- Cierre ambas incisiones con suturas de nylon 6.0. Proporcionar solución salina, anestésico (lidocaína) y antibióticos según las directrices de roedores. Sin embargo se han encontrado algunas pequeñas dosis de antibióticos (3 mg / kg de minociclina) ser siguiente golpe neuroprotector. 26
- Después de recuperar la conciencia en la incubadora calienta después de la cirugía, los ratones en un lugar, jaula estéril limpio. Proporcionar foo humedecidod o nutricionales de hidratación de gel suplementos dietéticos y una placa de Petri de agua como los animales se han restringido la movilidad después de un accidente cerebrovascular. Supervise de cerca los animales durante la recuperación para el dolor post-quirúrgico excesivo y la muerte.
3. Evans Blue (EB) Inyección
- Inyectar EB 22 horas después de la reperfusión y deben circular en el torrente sanguíneo durante 2 horas antes del sacrificio y la tinción TTC.
- Hacer una solución de EB para inyección (2% en solución salina EB) y mezclar suavemente a temperatura ambiente. Filtrar la solución a través de papel de filtro o empujar a través de un filtro de 0,2 micras unido a una pequeña jeringa para eliminar sin disolver EB y almacenar a temperatura ambiente.
- Preparar la cantidad de EB necesaria para la inyección (4 ml / kg de peso corporal) Dibuja la cantidad deseada de colorante en una jeringa de insulina 0.3 cc con una aguja de calibre 29 y asegúrese de que la solución esté a temperatura ambiente
- Restringir ratón usando inmovilización fondo plano. Mantenga la cola para que la vena lateral es uppermost. Venas laterales están situadas a ambos lados de la línea central de la cola. Sostenga la punta de la cola para mantener el ratón constante para inyección.
- Inserte la aguja en la vena de aproximadamente 3,5 mm, con cuidado de no perforar la vena. Confirme que la aguja está en la vena dibujando de nuevo en la jeringa y en busca de rastros de sangre.
- Inyectar todo del colorante en el transcurso de 1 min. Si la solución va en la vena debe ser mínima resistencia como se aplica presión a la jeringa. Confirme la administración venosa sistémica exitosa de EB por un cambio de color inmediata en la cola, extremidades y ojos del ratón.
- Retire la aguja de la cola y suavemente aplique presión con una gasa limpia para detener el sangrado.
- Comience momento cuando la piel del ratón se vuelve azul. Deje que el EB circule durante 2 horas para penetrar la acreditación debilitado.
4. 2,3,5- trifeniltetrazolio Cloruro (TTC) de tinción
- Una vez que el polvo se haya disuelto por completo, transferir inmediatamente a una botella, cubierta en papel de aluminio, y se almacena a 4 ° C. TTC y el tejido teñido con TTC son sensibles a la luz.
- Arrancar la bomba de perfusión a 5 ml / min velocidad de flujo con una jeringa de 60 cc llena de hielo frío PBS 0,01 M y conectado a una aguja de infusión de calibre 27 con alas. Coloque la punta de la aguja alrededor de 0,5 cm en el ventrículo izquierdo del corazón y cortar la aurícula derecha. Progresivamente sangre venosa diluido debe fluir fuera de la aurícula durante la perfusión hasta que aparezca sangre venosa incoloro. Transcardially perfundir 30 ml 0,01 M tampón fosfato salino (PBS) a través del corazón.
- Eliminar los bulbos olfatorios mediante la inserción de un acero inoxidable de 0,21 mm de espesor cuchilla en la segunda ranura desde el lado rostral de la matriz.
- Retire el cerebelo mediante la inserción de una cuchilla en la cuarta ranura desde el lado caudal de la matriz.
- Inserte una cuchilla en la ranura medio de las ranuras restantes en la matriz. Insertar las cuchillas restantes, de manera uniforme bisectriz del tejido restante para garantizar la distribución más uniforme de tejido durante el corte en lonchas.
- Una vez que se han insertado todas las cuchillas, agregue 1 a 2 gotas de PBS al cerebro para humedecerlo.
- Retire la hojas uno a la vez de la matriz a partir de la región rostral. Mantenga los primeros 7 rebanadas de análisis TTC después tMCAo. Use una pequeña espátula para transferir cuidadosamente las rodajas de la hoja al vial lleno-TTC.
- Cuando las secciones se disponen en la diapositiva, escanear la diapositiva utilizando un escáner estándar. Configure la resolución en un mínimo de 600 dpi para el análisis de imágenes. Asegúrese de incluir el nombre del animal y una regla métrica en la imagen escaneada.
- Dé la vuelta a la diapositivay escanear la parte de atrás para asegurar que todos los datos se recogen.
5. La cuantificación del volumen del infarto
- Cuantificar el volumen del infarto mediante el uso de un software de análisis de imagen estándar (por ejemplo, ImageJ).
- Escaneado de imágenes a alta resolución (por ejemplo, 600 dpi) para un análisis adecuado. Recorte de imágenes. Estandarizar la escala para todas las imágenes utilizando el regla métrica incluido en la imagen escaneada.
- Calcular el volumen total del hemisferio contralateral usando la siguiente fórmula. Repita esta fórmula para calcular el volumen total del hemisferio ipsilateral.
Suma de hemisferio contralateral total de cada rebanada de espesor x rebanada - Calcular el volumen del infarto indirecta. . Control para el edema ipsilateral de un accidente cerebrovascular mediante el, hemisferio contralateral sano como control 27 Utilice la siguiente fórmula para calcular el volumen del infarto indirecta:
Volumen total de hemisferio contralateral -
(Volum totale del hemisferio ipsilateral -Promedio volumen de 3 mediciones de infarto)
6. barrera hematoencefálica Cuantificación (BBB) Integridad
- Para prepararse para EB cuantificación, primero pesan 2,5 pulgadas pesa barcos. Anotar el peso y la etiqueta de dos sopesar barcos para cada animal: una para el hemisferio ipsilateral y uno para el hemisferio contralateral.
- Después de escanear las secciones teñidas con TTC, dividir en dos cada sección con una cuchilla de afeitar desechable en hemisferios ipsilateral y contralateral. Coloca los hemisferios ipsilaterales de las 7 secciones en un barco pesar y registrar el peso. Repita para el hemisferio contralateral.
- Transferir inmediatamente los barcos de peso a un conjunto horno por 56 ° C durante 48 horas.
- Pesar las secciones secas. Traslado ambos hemisferios en 1,5 ml tubos de microcentrífuga separados.
- Calcular la cantidad de formamida necesario para cada hemisferio (8 ml / g de tejido seco), y añadir a sus respectivos microcentrifugtubos e. La formamida es sensible a la luz y cubren todas las muestras de formamida tratados en papel desde este punto en adelante.
- Transferir los tubos de microcentrífuga a una incubadora a 56 ° C durante 48 hr otro.
- Después de la 48 horas, pipetear el sobrenadante azul en otro conjunto de tubos de microcentrífuga etiquetados. Empuje tejido a la parte inferior del tubo para maximizar el volumen de sobrenadante extraído. Mantenga los tubos de sobrenadante y disponer de todos los tejidos.
- Preparar diluciones seriadas exponenciales de EB en formamida para la curva estándar. Incluya 1 en blanco (sólo formamida) y luego 10 soluciones exponenciales de 0.125 ug / ml a 64 ug / ml de EB en formamida.
- Pipetear 300 l de las diluciones realizadas para la curva estándar en una placa de 96 pocillos. Pipetear 300 l del sobrenadante en los pozos correspondientes.
- Medir la absorbancia en un espectrofotómetro a 620 nm.
- Comparación de la curva estándar de las diluciones EB con el o absorbanciaf las muestras de sobrenadante. La densidad óptica es directamente proporcional a la integridad de la BBB.
- Suponga que la densidad óptica del hemisferio contralateral como fondo y el uso de la fórmula (ipsilateral contralateral) / contralateral para determinar el cambio veces. Para más detalles sobre el análisis estadístico ver Martin et al., 2010. 18
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Representative Results
Este estudio incluyó a 25 ratones macho Swiss Webster que eran las 10 semanas de edad en el inicio de la asignación al azar en RHP (n = 10) o 21% de O 2 (n = 15) grupos. Dos semanas después de la exposición final RHP, se realizaron procedimientos quirúrgicos, con grupos cegados y contrapeso entre los días. Siguiendo tMCAo, 1 ratón murió durante la recuperación postoperatoria y 1 ratón fue excluido del estudio, ya que no cumplía con el criterio CBF reperfusión. Ambos ratones fueron excluidos del grupo 21% de O2. De acuerdo con LLEGA directrices, 28 Tabla 2 muestra los parámetros quirúrgicos. Volúmenes indirectos de infarto, hinchazón hemisférica (es decir, edema), y azul de Evans (EB) extravasaciones se muestran en la Figura 2. Todos los datos se analizaron con pruebas t no apareados (media, desviación estándar se muestra), y los valores atípicos detectados con una Tasa de Falso Descubrimiento menos de 1% (GraphPad Prism), que eliminó 4 valores atípicos (2 de 21%, 2 de RHP) del conjunto de datos EB.
3) en comparación con 21% O 2 ratones tratado con (62,6 ± 42,6 mm 3), pero esta diferencia no fue significativa (p = 0.10). Sin embargo, un análisis a priori de energía predijo un n = 10 por grupo requerido, que no logramos con los ratones tratados con RHP después se eliminaron los valores atípicos. Esto debe ser considerado en el diseño de futuros experimentos utilizando RHP. No hubo efecto de RHP en hinchazón hemisférica, una métrica derivada del análisis del volumen TTC que se podría equiparar con edema. 6 ratones tratados con RHP exhibió una tendencia (p = 0,05) en la reducción de la disrupción de la BHE en el hemisferio isquémico normalizado a el hemisferio contralateral. Figura 2D muestra una gama de valores de EB de fugas para ambos grupos de tratamiento.
Figura 1:. RHP cámaras de diseño personalizado Panel superior representa los caudalímetros hechos a medida para el control individual de flujo de aire en hasta cuatro cámaras. Tubo impermeable al aire está mostrado abandona el medidor de flujo y adjuntando al puerto de entrada de la cámara de inducción 15 L en el panel inferior. El orificio de salida permanece abierto durante RHP para permitir la circulación del aire.
Figura 2:.. RHP reduce los volúmenes de infarto y disrupción de la BHE RHP (A) reduce los volúmenes de infarto en un 46% en comparación con los ratones control, pero tiene (B) ningún efecto sobre la inflamación hemisférica derivado de los datos de TTC (C) En los mismos animales, RHP reduce disrupción de la BHE (p = 0,05) como se define por Evans Blue fugas normalizado al hemisferio contralateral. (D) manchas Representante TTC de ambos O RHP-tratada y 21% 2
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Discussion
Una sola exposición a la hipoxia sistémica (es decir, 2 hr de 11% O 2) en ratones protege "transitoriamente" el cerebro de tMCAo, 29 es decir, la respuesta epigenética al desafío de preacondicionamiento hipóxica es de corta duración, y el fenotipo de la línea de base se restablece dentro de día. Presentaciones repetitivo del estímulo hipóxico preacondicionamiento se extienden dramáticamente la duración del fenotipo neuroprotector. 6 Muchos estudios han demostrado que la frecuencia, magnitud y duración del tren de estímulo repetitivo son determinantes críticos de esta respuesta. Por ejemplo, sólo tiene que repetir la misma intensidad y la duración de la hipoxia (2 h de 11% de oxígeno) 3 veces por semana (MWF) más de 2 semanas no ampliar la ventana terapéutica para la protección neurovascular de tMCAo, 6, pero fue suficiente para inducir a largo tolerancia isquémica plazo en la retina. 30 Curiosamente, a pesar 5 exposiciones a la hipoxia sistémica (5 hr de 8% O 2 </ Sub>) espaciados 6 días aparte protegidos contra tMCAo inducida por 3 días después de la última exposición hipóxica, la neuroprotección se perdió si las exposiciones hipóxicas 5 se colocaron 3 días aparte. 31 La razón de esta diferencia no está clara, pero puede haber sido debido a la duración de la hipoxia severa en relación con este protocolo y / o tiempo de recuperación insuficiente entre los retos de hipoxia de esta gravedad.
En resumen, la valoración de la simulación hipóxica repetitivo en todos los dominios de la frecuencia, magnitud y duración, parece fundamental para el desarrollo de la tolerancia mientras no inducir lesión, por no hablar de los efectos en tejidos específicos y quizás específicos de especies. Por ejemplo, 3 de 9 de las exposiciones RHP implican la exposición a 8% de O 2 durante 4 horas, aunque 6 h de 8% de O 2 induce la muerte neuronal del hipocampo. 32 Por lo tanto, debe haber un estricto apego al protocolo RHP con respecto a la duración y la gravedad de las exposiciones hipóxicas para inducir endógenoprotección. Aunque el efecto potencial del ritmo circadiano en la protección inducida preacondicionamiento-necesita una mayor exploración, 33 realizan exposiciones RHP en el mismo momento del día para una cohorte determinada reduce el riesgo de cualquier posible efecto de confusión. En términos de dosis-respuesta y la eficacia, la más robusta protección mediada por RHP por accidente cerebrovascular focal se produjo cuando el tMCAo fue inducida 2 semanas después de la exposición hipóxica final, 3 en un momento de malos RHP ratones sanos presentan un fenotipo inmunosupresor (en el ausencia de lesión isquémica). 7 Este punto de tiempo 2 semana puede no coincidir con el período de máxima protección contra otras lesiones agudas del sistema nervioso central, o en otros sistemas de órganos. Tanto el protocolo de RHP, y las características temporales de la respuesta epigenética, sin duda, necesita optimización para cada nuevo uso de la traducción.
Una de las mayores limitaciones del procedimiento tMCAo es la distribución heterogénea de vo infartoLumes, como lo demuestra este conjunto de datos representativos. La circulación colateral proporcionado por el Círculo de Willis, anastomosis leptomeníngeas y uniones colaterales dorsales puede dar lugar a volúmenes de infarto inconsistentes. 34 Variaciones entre el Círculo de Willis en diferentes cepas de ratones, así como la presencia y la permeabilidad de las arterias posteriores comunicar, 25 , 35 se puede reducir aún más la coherencia de los volúmenes de infarto dentro de los grupos. Tamaño de las muestras sólidas y la replicación a menudo son necesarias para producir resultados concluyentes y deben ser incluidos en el diseño del experimento después de accionar en consecuencia. Otros métodos de carrera de admisión, métodos isquémicos focales particularmente distales como la oclusión de la rama MCA primaria a través de un agujero de trépano en el cráneo lateral o photothrombosis de ramas distales de la MCA, a menudo producen una menor variación en el volumen sistólico. Golpes photothrombotic son limitados, sin embargo, ya que producen edema extracelular e intracelular simultánea, un phenomenon no se ve en los accidentes cerebrovasculares isquémicos en los seres humanos. 36 Por el contrario, tMCAos son más directamente aplicable a la práctica clínica ya que más del 60% de todos los accidentes cerebrovasculares en los seres humanos ocurrir debido a la obstrucción de la arteria cerebral media. 37 Por último, la anestesia utilizada durante tMCAo, isoflurano , se ha demostrado que induce la neuroprotección. 38 Con el fin de dar cuenta de esta neuroprotección, los niveles de isoflurano deben ser consistentes entre cirugías y entre los grupos experimentales tratados y no tratados, y se mantuvo a <3% para reducir sus posibles efectos neuroprotectores. 39
El tiempo también es fundamental en el proceso de tinción TTC. Aunque hay una gran variación en la literatura de carrera sobre el tiempo en el que la tinción de TTC se puede realizar después de la isquemia, que varía de 4 horas a 7 días después del accidente cerebrovascular, 18,40 tinción TTC debe ocurrir en 24 a 48 horas después del accidente cerebrovascular en su mayor volúmenes de infarto consistentes y claramente delineadas. Volúmenes de infarto TTC tienen abejan encontrado para estabilizar las 24 horas después del accidente cerebrovascular, pero después de 48 horas, una afluencia de macrófagos en el cerebro isquémico hace que define el volumen del infarto difícil. 14,40 Además, la tinción del tejido cerebral con TTC debe seguir de inmediato sacrificio. Retrasar la tinción disminuirá la calidad de la mancha debido a aumento de la muerte mitocondrial resultante de la muerte del animal, no infarto cerebral. Un incremento similar en la muerte mitocondrial se producirá si el cerebro no se mantiene húmedo durante la inserción de las cuchillas. Mientras que este protocolo ilustra claramente el beneficio de análisis del infarto con la tinción de TTC, otras manchas inmunohistoquímico se pueden usar para cuantificar el volumen del infarto siguiente tMCAo. Violeta de cresilo o manchas fluoro-jade tienen requisitos de tiempo de menos rígidas para la tinción después del sacrificio, pero estas manchas clásicos requieren secciones muy finas obtenidas por criostato o microtomo, y por lo tanto requieren más tiempo para la suma y el análisis integrador. 14 Por otra parte, estos stains no se pueden utilizar en conjunción con EB cuantificación de disrupción de la BHE, como el desarrollado por otros, 15 eliminando la posibilidad de comparación directa entre el volumen del infarto y la acreditación integridad en un cerebro dado. Cabe señalar que los animales normalmente expuestas rosa RHP-tratada en contraposición a los volúmenes de color blanco puro. 6 A fin de evitar lavado de infarto en los ratones tratados con RHP, usamos un período más corto para la tinción de TTC que resulta en tejido sano más rosa en oposición a rojo oscuro. Evans procesamiento Azul también puede oscurecer el área de infarto infartos blancos tan puras son poco probables con la tinción cuantificación dual presentado en este protocolo.
Con el fin de comparar EB cuantificación dentro y entre grupos, todos los animales deben someterse a tiempos de circulación equivalentes para EB. Otros han inyectado EB inmediatamente después de la reperfusión y permitió EB circule durante un máximo de 72 horas, 41 oa 4 horas después de la tMCAo circule durante 4 horas, 15 como alternativenfoques e. La cantidad de EB que cruza la acreditación perturbado y entra en el tejido cerebral representa la acumulación integral de tinte unida a la albúmina del momento de la inyección al momento del sacrificio. Por lo tanto, el método descrito en este documento revela el estado de la acreditación, precisamente en el tiempo entre 22 y 24 h de reperfusión, y puede perderse anteriores o posteriores aperturas o cierres de la barrera. Por el contrario, el método empleado por Wang et al. revela el estado de la acreditación de 72 horas después del accidente cerebrovascular, incluyendo todos los cambios en la acreditación de estado durante ese tiempo 3 días después del accidente cerebrovascular 42 Ni protocolo es mejor o peor.; aunque sigue existiendo un riesgo de "perdido" una apertura transitoria de la acreditación mediante el uso de tiempos de circulación más corto, que permite a los investigadores para identificar características temporales específicos de acreditación fisiopatología y para sincronizarlo con otros métodos, como se muestra aquí. Otros han combinado TTC y EB inyectando EB intracardially 1 min después de la perfusión transcardial. 18 Sin embargo, esto se reunióhod produjo resultados inconsistentes y es un procedimiento mucho más complicado que el protocolo descrito anteriormente.
Una de las más prometedoras direcciones futuras para RHP es la aplicación de la traducción de este protocolo preacondicionamiento a otros estados de la enfermedad. Exposiciones hipóxicas intermitentes se han encontrado para ser protectora en condiciones pro-inflamatorias del SNC distintos de isquemia. En un modelo de rata de la enfermedad de Alzheimer, 2 semanas de 4 hr exposiciones diarias a la hipoxia hipobárica reducen el deterioro de la retención de la memoria y la pérdida de neuronas corticales después de las inyecciones intracerebrales de beta-amiloide. 43 hipoxia intermitente (2 semanas de exposiciones diarias 15 hr a la hipoxia hipobárica ) también resultó ser protectora en ratas después de la L-buthionine- [S, R] -sulfoximine (L-BSO) de infusión, un modelo de Parkinson, que afecta la transmisión dopaminérgica estriatal. 44 Sin embargo, estos modelos de la enfermedad de Alzheimer y el Parkinson solamente investigó el efectos a corto plazo deprecondicionamiento hipóxico. 43,44 Investigando el largo plazo neuroprotección inducida por RHP pueden ser una futura dirección fructífera para la investigación. Además, la neuroprotección inducida por RHP puede extenderse a la mejora de la integridad de BBB en modelos de ratón de la enfermedad de Alzheimer, lo que podría ser analizada con la EB. 45 El análisis dual TTC y EB sería aún más útil en el modelo de Parkinson ya que induce lesiones estriatales 46 y BBB interrupción, 47 que se puede cuantificar con TTC 48 y EB, 49 respectivamente. RHP En general es una forma sencilla y potente de preacondicionamiento con un gran potencial de traslación ya que induce de forma única a largo plazo, anti-inflamatorios, y los efectos neuroprotectores. La doble cuantificación de TTC y EB también podría aplicarse fácilmente a otros estados de enfermedad que implican la interrupción mitocondrial, la muerte celular, y la acreditación fugas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flowmeters, regulators | VetEquip, Inc | Specialty order | Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench. |
| 21% O2 tank | AirGas | OX USP200 | |
| 11% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 8% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 15 L induction chambers | VetEquip | 941454 | |
| Moor Laber Dopper Flow | Moor Instruments | moorVMS-LDF1-HP | 0.8 mm diameter probe |
| High Intensity Illuminator | Nikon | NI-150 | |
| Zoom Stereo Microscope | NIkon | SMZ800 | Other surgical microscopes may be used. |
| Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | Discontinued | Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT). |
| Hovabator Incubator | Stromberg's | 2362-E | Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. |
| V010 Anesthesia system | VetEquip | 901807 | Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters |
| 250 ml isoflurane | Butler Schein | NDC-11695 | |
| D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer | Andis | #23905 | Replacement blades are available from Andis (#23995) |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-898-867 | |
| Q-tips | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Gauze Pads | Fisher Scientific | 67622 | |
| Surgical drape | Fisher Scientific | GM300 | |
| Silk Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP115 | |
| Nylon Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP185 | |
| Durmont #5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11251-35 | Angled 45° |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| 3 mm Vannas | Kent Scientific Corporation | INS600177 | Straight blade |
| Hartman Hemostats | Fine Scientific Tools | 13002-10 | |
| Occluding filaments | Washington University | Specialty order | Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. |
| Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
| Filter Paper | Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, circles, Grade 1 |
| Weigh Boats | Fisher Scientific | 02-202-101 | 2.5" diameter |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter Pharmaceutics | 2B1321 | |
| 0.3 cc insulin syringe with 29 gauge needle | Becton Dickinson Labware | 309301 | |
| Flat bottom restrainer | Braintree Scientific | FB M | 2.0" diameter |
| TTC | Sigma | T8877 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| Water Bath | Multiple sellers | Catalog number not available | Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath. |
| Styrofoam board | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Large Syringe Kit | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
| Perfusion Pump | PumpSystems Inc | NE-300 | |
| 60 cc syringe | Fisher Scientific | NC9203256 | |
| 27 gauge winged infusion set | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
| 20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
| Stainless steel spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal | CellPoint Scientific | Catalog number not available | |
| 0.21 mm stainless steel blades, 25 pk | CellPoint Scientific | Catalog number not available | Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative. |
| 4% paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | SC-281692 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HP Scanjet G4050 | Multiple sellers | Catalog number not available | Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol. |
| ImageJ | National Institute of Health | Catalog number not available | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 205U | |
| Precision Compact Oven | Thermo Scientific | PR305225M | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes (Eppendorfs) | Denville Scientific | C2170 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| 96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek | Catalog number not available |
References
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