Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Высокодоходные и экономически эффективной системы Выражение человека Гранзимы в клетках млекопитающих

Published: June 10, 2015 doi: 10.3791/52911
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1, 2
1Cellular and Molecular Medicine Program, Boston Children’s Hospital and Harvard Medical School, 2Department of Medicine, University of Fribourg, 3Centre Médical Universitaire, University of Geneva

Introduction

В Gzms являются линейку гомологичных серинпротеаз локализованных в специализированных лизосомах CTL и NK клеток 1. Цитотоксические гранулы этих клеток-киллеров также содержат мембранные белки, разрушающие PFN и GNLY, которые выделяются одновременно с Gzms при обнаружении клетке-мишени, предназначенного для устранения 2,3. Есть пять Gzms в организме человека (GzmA, B, H, K и М) и 10 Gzms у мышей (GzmA - G, K, M и N). GzmA и GzmB являются наиболее распространенным и широко изучается в людях и мышах 1. Однако более поздние исследования начали исследовать клетки-смерти путей, а также дополнительные биологические эффекты, опосредованные другими, так называемыми сирот Gzms в здоровье и болезни 4.

Самый известный функция Gzms, в частности GzmA и GzmB, является индукция запрограммированной клеточной гибели в клетках млекопитающих при доставке в клетки-мишени с PFN 5,6. Однако, Более поздние исследования также показали, внеклеточные эффекты Gzms с глубоким воздействием на иммунную регулирования и воспаления, независимо от цитозольной доставки по PFN 7,8. Спектр клеток, которые убивают эффективно после вступления в цитозоле из Gzms был недавно расширен из клеток млекопитающих к бактериям 9,10 и даже некоторых паразитов 11. Эти недавние открытия открыли совершенно новую область для GZM исследователей. Таким образом, экономически эффективной, высокой текучести система экспрессии млекопитающих значительно облегчить путь для тех будущих исследований.

Родные человека, мыши и крысы Gzms успешно очищают от фракции гранул из CTL и NK клеток линий 12-14. Тем не менее, в наших руках выход из таких приемов очистки находится в диапазоне от менее чем 0,1 мг / л клеточной культуры (неопубликованной наблюдения и 12). Кроме того, хроматографический разрешение одной GZM без загрязнения флористикуR Gzms и / или белки, которые также присутствуют в гранулах является сложной задачей (неопубликованные данные и 12,14). Рекомбинантные Gzms были произведены в 15 бактерий, дрожжей, 16 клеток насекомых 17 и в даже в клетках млекопитающих, таких как НЕК 293 18,19. Только млекопитающих системы экспрессии несут потенциал для производства рекомбинантных ферментов с пост-трансляционных модификаций, идентичных родной цитотоксического белка. Посттрансляционных модификаций были вовлечены с конкретным поглощением эндоцитоза и внутриклеточной локализации протеазы в клетках-мишенях 20-22. Таким образом, с помощью pHLsec 23 (вид подарок Раду Aricescu и Ивонн Джонс Оксфордского университета, Великобритания) в качестве плазмиды для экспрессии позвоночника GZM, мы создали простую, времени и экономичное систему производства белка с высоким выходом в HEK293T клетки. pHLsec сочетает в себе ЦМВ усилитель с куриным Β-актина; Все вместе эти элементы ДЕМОНСТРАТед сильный промотор деятельность в различных клеточных линиях 24. Кроме того, плазмида содержит кролика Β-глобина интрон, оптимизированные Козак и сигналы секреции, а Lys-6xHis-тег и поли-сигнала. Вставки могут быть клонированы удобно между сигналом секреции и Lys-6xHis-тега (рис 1) обеспечение оптимальной экспрессии и секреции эффективности для белков, лишенных соответствующие N-концевые домены. Для экспрессии Gzms, мы заменили эндогенного последовательность секреции сигнала с сигналом секреции, предоставленной вектора с последующим энтерокиназа (ЕК) на сайте (DDDDK), так что лечение ЕК активировала выделяемые Gzms (активные Gzms начать с N-терминал аминокислотная последовательность IIGG 25). Кроме того, в пользу для этого метода HEK293T клетки быстро растут в цене низкой среде, такой как модифицированной Игла среде Игла (DMEM), и хорошо подходит для экономичного кальция фосфата методом трансфекции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Производство плазмиды экспрессии pHLsec-GZM

  1. Подготовка общей РНК из человеческих клеток NK (первичные клетки, полученные, как в 26 или клеточной линии NK NK-92, экспрессирующих все пять человека Gzms) с использованием подходящего способа выделения РНК и обратной Расшифруйте использованием первого набора нитей-кДНК синтезировать следующие за manufacturer` S рекомендации. Amplify GZM кДНК с использованием ПЦР и клон в pHLsec, как описано в 23 (вида дар Раду Aricescu и Ивонн Джонс Оксфордского университета, Великобритания), используя сайты AgeI и KpnI (рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте следующие праймеры, указанные в таблице 1.
  2. Подтверждение правильности вставки путем секвенирования. Развернуть экспрессии плазмиды в DH5 & alpha клеток и очистить с использованием набора изоляции плазмиды эндотоксина и следуйте инструкциям изготовителя.
  3. Ресуспендируют очищенные плазмиды в эндотоксинов стерильной воде, при концентрации 2 мг / мл и хранят при -20 ° C Unti• использование.

2. Выражение Gzms в клетках HEK293T

  1. Приготовление реагентов
    1. Приготовьте стандартную культуральную среду. Чтобы Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей высоким содержанием глюкозы (25 мм), GlutaMAX (4 мм), пируват натрия (1 мМ) добавляют 10% от стандартной фетальной телячьей сыворотки (FCS), пенициллин (100 единиц / мл), стрептомицин ( 100 мкг / мл).
    2. Подготовка трансфекции среду. Для культуральной среде без пенициллина-стрептомицина добавить 25 мкг / мл хлорохина (добавить свежий в день трансфекции с 1,000x запасов в PBS, хранили при -20 ° C).
    3. Подготовьте бессывороточной культуральной среды: К бессывороточной среде для НЕК293 добавить глутамина (4 мм), пенициллин (100 единиц / мл), стрептомицин (100 мкг / мл), и 2,5 мг / л амфотерицин В.
    4. Подготовка растворов, описанных в таблице 2 и фильтр с размером пор 0,45 мкм фильтр перед использованием:
  2. Расширение клетки HEK293T
    1. Растут HEK293T клеток в 20 мл культаЮр средней используя 150 х 25 мм культуры тканей блюда.
    2. Разбить ячейки на 80% слияния (сплит-соотношении 1: 4, как правило, каждый 3-й день). Клетки свободно закрепить, они могут быть механически снимается без трипсинизации по строго пипетки вверх и вниз.
    3. Пластина клеток ночь до трансфекции, чтобы дать 60-70% слияния в день трансфекции (посев плотности ~ 2 х 10 5 клеток / мл). Обычный размер подготовка состоит из 20 до 25 чашек для культивирования.
  3. Кальций-фосфатный трансфекции
    1. 1 ч до трансфекции, изменение стандартного культуральной среде до 20 мл трансфекции среду. Ближе к концу этого 1 ч инкубации шаг, смешать 400 мкг плазмидной ДНК с 10,95 мл DDH 2 0 и 1,55 мл 2М CaCl 2 в 50 мл пробирки (1 пробирка / 5 блюд).
    2. От 1 до 2 мин до трансфекции добавляют 12,5 мл 2x HBS с 12,5 мл раствора ДНК-кальций, смешать с инверсией трубок и инкубировать в течение 30 сек при комнатной температуре.
    3. Добавить ее смесь, полученную в 2.3.2 непосредственно к клеткам (5 мл на чашку), по каплям в среду. Опрыскивание равномерно по всей площади, превращая среды в слегка оранжевого цвета.
    4. Инкубируйте чашки для культивирования в течение от 7 до 11 ч в инкубаторе тканевых культур (37 ° С, 5% СО 2 в увлажненном воздухе). После инкубации в порядке осадок видна. Удалить трансфекции среду, затем тщательно промыть подогретого PBS и добавляют 20 мл бессывороточной культуральной среде, приготовленной в 2.1.3. Инкубируют в течение 72 ч в инкубаторе тканевых культур.
    5. Анализ трансфекции и экспрессии эффективность путем запуска образца (~ 20 мкл) клеточной надосадочной на SDS-PAGE и окрашивания кумасси бриллиантовым синим визуализировать гранзим группу.
  4. Очистка Gzms из супернатанта культуры с помощью никель-IMAC
    1. После инкубации переливать супернатантах клеточных культур в 250 мл пробирки и ясно, центрифугированием. Провести первый спин (400 мкг, 10 мин, 4 °С), что очистит среды из отдельных клеток. Перенести супернатант в свежих 250 мл пробирки и спина при 4000 мкг, 30 мин при 4 ° С для удаления остатков мусора клеток.
    2. Добавьте 5 мл 5 М NaCl, 6,25 мл 2 М Трис-основание (рН 8) и 1 мл 0,25 М NiSO 4 на 250 мл очищенной надосадочной жидкости. Фильтр супернатант использованием 500 мл вакуум-фильтра блока (0,45 мм).
    3. Равновесие столбец никель-IMAC с Его связывание буфера А (10 объемов колонки, CV), используя подходящую систему FPLC.
    4. Применение очищенную надосадочную жидкость в уравновешенную колонку при скорости потока 0,5 мл / мин при 4 ° С.
    5. После супернатант наносили, колонки промыть Его-связывающем буфере до тех пор, УФ-поглощение базовая линия не будет достигнута (обычно 10 CV).
    6. Элюции Gzms с линейной 20 мл градиента (от 0 до 250 мМ имидазола) при скорости потока 0,5 мл / мин, собирая 2 мл-вые фракции. Анализируют элюированных фракций в ДСН-ПААГ и окрашивания Кумасси.
  5. Энтерокиназой (ЕК)обработку и окончательное очистки катионообменной хроматографией
    1. Бассейн GZM фракции, содержащие в диализа трубки с ≤10 MWCO. Хранить небольшой образец при -20 ° С в качестве контроля предварительно EK.
    2. Добавить EK на 0,02 единицы / 50 мл исходного супернатанта непосредственно к объединенной фракции в диализной трубке и диализ O / N (по крайней мере, 16 ч) при комнатной температуре в EK-буфера (4 л, изменения буфера один раз).
    3. На следующий день, анализировать EK обрабатывают Gzms по сравнению с предварительной EK контроля в ДСН-ПААГ и окрашивания Кумасси.
    4. Если N-концевого обработка завершена, изменить буфера для диализа в буфер А S (4 л) и диализ еще в течение 4 ч при комнатной температуре. Фильтр диализирующего (0,45 мкм).
    5. Равновесие в S-колонку с S буфером А. загрузить образец в колонку с расходом 0,5 мл / мин при 4 ° С.
    6. После загрузки образца, колонку промывают буфером А S до УФ-поглощение базовая линия не будет достигнута (около 10 CV). Элюируйте Gzms с 30 мл линейным градиентом (от 150 до 1000 мм NaCl). GzmA электроннойлютни на ~ 650 мм NaCl, GzmB на ~ 700 мм NaCl и GzmM на ~ 750 мм NaCl.
    7. Анализ элюированных фракций в ДСН-ПААГ и колориметрических анализов (см ниже). Фракции, содержащие бассейн Gzms и концентрат (около 30 раз, до концентрации приблизительно 100 мкМ) в спиновых фильтров (15 мл, 10 MWCO). Алиготе концентрированные препараты GZM и хранить при температуре -80 ° C.

3. Тестирование GZM деятельность

  1. Приготовление реагентов
    1. Подготовка колориметрического буфера для анализа: 50 мМ Трис-основание, рН 7.
      1. Для измерения GzmA, добавить Na-CBZ-L-лизин thiobenzyl эфир (S-Bzl) (BLT) в буфере для анализа до конечной концентрации 0,2 мМ и 5,5'-дитио-бис (2-нитробензойной кислоты) (ДТНБ) до концентрации 0,22 мМ. Для GzmB, включают в себя 0,2 мм Вос-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) и 0,22 мм DTNB. Для GzmM, включают 0,2 мм SUC-Ala-Ala-Pro-Leu-п-нитроанилид (PNA) (AAPL). Синтетические пептиды добавлены из соответствующих растворов (в ДМСО, Storред при -20 ° C) в буфер свеже перед анализом.
    2. Подготовьте расщепления буфере для анализа: 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-Base, рН 7,5
  2. Колориметрические анализы
    1. Распространение небольших образцов GZM (<5 мкл) из элюированных фракций или концентрированные запасы в 96-луночные плоскодонные пластин. Включите положительный контроль (тестируемых препаратов GZM или сырой клеточных лизатов NK) и отрицательный контроль (только буфер).
    2. Добавить 100 мкл буфера для анализа в каждую лунку (с помощью пипетки многоканальный). Инкубируют в течение 10 мин при 37 ° С. Измерение оптической плотности при 405 нм в микропланшет-ридера.
  3. Расщепление анализ
    1. Для расщепления анализов с использованием очищенных подложек, совместно инкубировать белкового субстрата (нативный или рекомбинантный, 100 - 400 нм; несколько примеров эффективных субстратов GZM представлены в разделе результатов и в записке в конце этого раздела) с серийными разведениями из GZM (начиная с 400 нМ) в буфере для анализа в течение различного времени.Анализ с помощью ДСН-ПААГ и Кумасси или окрашиванием серебром; или с помощью Вестерн-блоттинга с использованием специфических антител.
    2. Для отщепления анализов с использованием клеточных лизатов, приостановить 10 6 клеток HeLa (или любой доступный линии опухолевых клеток) в 1 мл буфера для анализа и лизировать путем замораживания в смеси этанол / сухой лед и оттаивания при 37 ° С в три раза. Удалить клеточного дебриса путем центрифугирования (15000 х г в течение 10 мин при 4 ° С).
    3. Совместное инкубирование очищенного лизата с Gzms при различных концентрациях и времени, как описано выше. Расщепление обнаружен с помощью иммуноблоттинга, используя подходящие антитела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько примеров добросовестных субстратов, для которых коммерческие антитела имеются: Ставка (ВН3 взаимодействующих смерти домена агонист) и каспазы 3 расщепляется GzmB 27,28; несколько гетерогенных ядерных рибонуклеопротеиды (hnRNPA1, А2 и U) расщепляется GzmA 29; цитомегаловирус фосфопротеин 71 по 30 GzmM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В следующем разделе мы представим полную документацию препарата GzmA осветить метод. Мы также успешно очищают GzmB и GzmM, аналогичных результатов в отношении эффективности очистки и деятельности. Тем не менее, из этих более поздних препаратов мы покажем только несколько выбранных частей данных. GzmB препараты из клеток 293Т следующие текущего протокола были использованы в нескольких опубликованных исследований, подчеркивая свою деятельность в различных биологических системах анализа 9,29,31-34.

Типичный очистки GzmA показано на рисунке 2А. Эффективное трансфекции и экспрессии после 72 ч было указано детектируемой полосы GZM на Кумасси-окрашенном SDS-PAGE гель без дальнейшей концентрации супернатанта культуры (~ 37 кДа для GzmB и GzmM в восстанавливающих условиях; ~ 60/34 кДа GzmA под невосстанавливающих / восстановительных условиях). После очистки IMAC образцы обрабатывали ввестиokinase (ЕК). Видимое перемещение EK обработанный образец (после ЕК) наблюдалось по сравнению с контролем до EK. Окончательную очистку на S-столбце в результате высокой чистоты GZM препаратов (GzmA на рисунке 2А; GzmB и GzmM на рисунке 2B) с одной внешности группы по Кумасси окрашенных гелей белка. Объединенные фракции концентрируют до конечной концентрации ~ 100 мкм. Как правило, мы получили выход примерно от 0,5 до 1 мг Gzms на 100 мл супернатанта культуры. Чтобы продемонстрировать эффективное гликозилирование, несколько начальных препараты вводили эндогликозидазу (эндо) H, который удаляет высоким содержанием маннозы олигосахариды из N-связанных гликопротеинов. Родной GzmA имеет N-связанный сайт гликозилирования в Asn-142, к которому высокоманнозный олигосахариды связанный 35. Лечение ЭндоН индуцированной очевидный сдвиг мобильности в GZM А, а также GzmB, препараты из клеток HEK293T но не в бактериях генерируется GzmA, как проанализированы SDS-PAGE и Кумассиокрашивание (рис 2С).

Регулярно, каждая партия GZM был протестирован для ферментативной активности в колориметрических анализов. Это быстрое и надежное испытание демонстрирует протеолитической активности Gzms расщеплением небольших синтетических пептидов, указанного спектрофотометрически по изменению цвета в буфере для анализа. Из-за различных предпочтений, касающихся аминокислотных остатков (P1 позиции), после чего эти протеазы расщепляют, выбор конкретного пептида варьирует среди Gzms. GzmA имеет трипсиноподобной деятельность, рассекая после основные остатки аргинина (Arg, R) и лизин (Lys, K). GzmB расщепляет преимущественно после остатков аспарагиновой кислоты (Asp, D), и GzmM расщепляет после лейцина (Leu, L) и метионина (Met, М) 1. Наша льготный выбор пептид BLT S-Bzl для измерения GzmA деятельность, AAD S-Bzl для GzmB и AAPL -pNA для GzmM.

Основное различие между thiobenzylester субстраты (AAD и BLT) и п-нитроанилид субстрат (AAPL) является конкретной химии, в том GZM посредником расщепление thiobenzylester субстратов релизы бензил-меркаптана, который только вызывает хромогенного реакции в ее нижнем реакции с хромофора DTNB. Таким образом, в реакционных буферов thiobenzylester субстратов ДТНБ должен присутствовать, в то время как GZM-опосредованное высвобождение п-нитроанилид является достаточным для колориметрического детектирования. Подробный способ колориметрических анализов была недавно опубликована 36. 3А показывает представительный BLT и эстеразы деятельности AAPL в элюирования фракций из колонки S-препарата GzmA и GzmM, соответственно. Колориметрический анализ также используется для сравнения активности рекомбинантного в нативных препаратов GzmB. Как показано на фигуре 3В, рекомбинантный 293T GzmB расщепляется хромогенный субстрат с одинаковой эффективностью по сравнению с нативным GzmB очищенного от человеческой NK CELл линия, как недавно описано 12.

Для более конкретно проверить деятельность GZM, GZM анализы расщепления белка, используя известные субстраты указаны. Эти анализы расщепления могут быть выполнены с очищенным рекомбинантным или нативного белка (если имеется), с клеточных лизатов или наиболее физиологический с интактными клетками. Если белок субстрат доступен, протеолитическую активность может быть проанализирована в простых совместной инкубации экспериментов с препаратами GZM, как это продемонстрировано с известным бактериальным GzmA и GzmB субстратов nuoCD и nuoF 9, а также с новыми человека митохондриальной GzmM подложки NDUFAF3 (4А).

Клеточные лизаты представляют собой еще один очевидный источник нескольких субстратов GZM. Коммерческие антитела против доступны многие из субстратов. Быстрый и простой способ для создания клеточных лизатов является применение нескольких циклов замораживания / оттаивания, как показано ранее 33. Использование моющих средств Iы не рекомендуется, так как они могут мешать GZM деятельности. На фиг.4В, GzmA опосредованного расщепления hnRNPA1 в клеточного лизата HeLa продемонстрирована в иммуноблота с использованием анти-hnRNPA1 антитела, а также анти-Β-актина антитела в качестве контроля загрузки.

Для отщепления анализов (или цитотоксичности) в интактных клетках, наличие дополнительной молекулой доставки необходимо (PFN или Стрептолизин вывода, SLO, для клеток млекопитающих; GNLY или другие антимикробные пептиды для прокариотических клеток). Расщепление анализы в интактных клетках наиболее сложным, как концентрация молекул доставки является критическим и требует обширной тонкой настройки. Представляя эти сложные протоколы анализов апоптоза выходит за рамки данной статьи. Здесь мы можем обратиться только к обширная литература, в качестве примеров 12,13.

Таблица 1
<сильный> Таблица 1: Клонирование GZM праймеров.

Последовательности праймеров, которые были использованы для клонирования GzmA, GzmB и GzmM указаны. Праймеры были разработаны, чтобы ввести EK-сайт перед N-конца активную протеазу (рисунок 1)

Таблица 2
Таблица 2: Buffer Композиции маточных растворов и.

Рецепты самых важных растворов и буферов указано.

Фигура 1
Фигура 1. pHLsec Последовательность критическим для Construct клонировании.

В последовательности, несколько элементов в векторе являютсяподчеркнул, что важно для клонирования, секреции очистки IMAC и активации протеаз: Козака консенсуса и секреция сигнальные последовательности, сайты рестрикции KpnI и AgeI, а также С-концевой Lys_6xHis тегов. Мы примере GzmA качестве вставки, которая N-терминально слит с энтерокиназы (ЕК) сайта. Для полного карте полного вектора позвоночника, мы обращаемся к дополнительной информации в 23.

Рисунок 2
Рисунок 2. Выражение, очистка и активация полностью гликозилированного человека Gzms из НЕК 293 Т-клеток.

) Показывает серию Кумасси окрашивали, невосстанавливающих ПААГ с ДСН, демонстрирующие весь процесс производства GzmA от его секреции в надосадочной жидкости к первой очистки никель-IMAC, лечения EK и FINA л полировка с помощью катионообменной хроматографии. Супернатант культуры работать на SDS-ПААГ в восстанавливающих (красный) и не уменьшая (не-красный) условия. GzmA представляет собой гомодимер (ssGzmA), который стабилизирован дисульфидной связью. GzmA гомодимер (~ 60 кДа) проходит вблизи загрязняющих BSA (~ 66 кДа). В восстановительных условиях GzmA мономер (shGzmA) появляется как ~ 34 кДа. Чтобы продемонстрировать чистоту конечного GzmB и препаратов GzmM представитель кумасси-гели окрашивали в соответствии невосстанавливающих условиях показаны в B. бактериально (E.coli) генерируется GzmA а также GzmA и GzmB производится в HEK293T клетки обрабатывали и анализировали ЭндоН по невосстанавливающие SDS-PAGE и окрашивания кумасси. Гликозилирования Gzms, произведенных в клетках HEK293T демонстрируется в подвижности сдвига после обработки ЭндоН по сравнению с негликозилированной GzmA полученного в бактериях (C).

ig3.jpg "/>
Рисунок 3. Рекомбинантный Gzms гидролиза Синтетические пептиды.

), Небольшие образцы элюированных фракций из последней колонки S были испытаны на GzmA и GzmM активности в хромогенных анализах с использованием BLT и AAPL, соответственно, в качестве субстратов. Графики показывают, что расщепление пептида был указан как увеличение оптической плотности при 405 нм. Активность пиковые фракции коррелирует с пиком белка в элюции, как указано в УФ-поглощению и анализа SDS-PAGE (фиг.2А и Б). Б), рекомбинантный 293T и родной GzmB (полученного, как описано 12) в указанных концентрациях инкубировали в присутствии хромогенного субстрата ПВО. GzmB активность наблюдалась как изменение оптической плотности при 405 нм. График показывает среднее ± SEM из наших самых последних препаратов GZM, которые были проверены в трех экземплярах.

52911 / 52911fig4.jpg "/>
Рисунок 4. Рекомбинантный Gzms расщеплять белковые субстраты.

) Рекомбинантные GST-меченый, бактериальные белки дыхательной цепи nuoCD и nuoF, а также млекопитающих белковая цепь дыхательных NDUFAF3, лечили с указанной концентрацией указанных Gzms в течение 15 мин при 37 ° С. 1 мкг очищенных белков в 20 мкл реакции были использованы. Расщепление анализировали с помощью SDS-PAGE и окрашиванием Кумасси. Б) HeLa клеточного лизата (при концентрации белка ~ 1 мг / мл) инкубировали с указанными концентрациями рекомбинантного GzmA в течение 30 мин и анализировали с помощью иммуноблоттинга с использованием анти hnRNPA1 и Β-актин антитела.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Классической и широко изучается роль GzmA и GzmB является индукция апоптоза в клетках млекопитающих после их доставки по цитозольном порообразующего белка PFN 1. Недавно цитотоксический спектр Gzms была существенно расширена из клеток млекопитающих к бактериям 9,10, а также в некоторых паразитов 11. Кроме того, неклассические, внеклеточные функции GzmA и GzmB а также биологическое значение различных сирот Gzms еще неясным. Таким образом, надежная времени и экономически эффективным экспрессия и очистка системы Gzms, как это предусмотрено этим протоколом, будет большим подспорьем для этих будущих исследований.

Сила этого метода особенно на основе вектора экспрессии, pHLsec 23, который используется в этой системе. Эта плазмида имеет большим числом копий в E. палочка, что позволяет эффективное производство ДНК. Его энхансер / промотор элементы обеспечиваютсильный деятельность в различных клеточных линиях 24. Он содержит интрон внутри единицы транскрипции. Интроны были найдены для усиления экспрессии генов в клетках млекопитающих до 100-кратно 37. Кроме того, плазмиды обеспечивает консенсус Козака и оптимизированный сигнал секреции, а Lys-6xHis-тег и поли-A сигнал (рисунок 1). Вставки могут быть клонированы с помощью AgeI и KpnI сайты между сигналом секреции и тега Lys-6xHis. Использование AgeI и XhoI будет избежать тег polyHis. Для Gzms, необходимо было вставить сайт энтерокиназы на N-конце протеаз, позволяющих активацию протеаз после экспрессии и очистки IMAC. Для экспрессии других ферментов это может не быть необходимым. Выражение плазмида была успешно испытана для нескольких конструкций различной длины, гликозилирование состояний, и числа дисульфидных связей, а также белки, которые содержали несколько доменов с различными складками 23.

38. Мы обнаружили, что эффективность трансфекции была линейно зависит от количества ДНК насыщающей только около 80 мкг в течение 15-см чашку (неопубликованное наблюдение). Поэтому, мы рекомендуем использовать до 80 μ г плазмидной ДНК / блюдо в этом протоколе для максимальной эффективности. Это составит около 2 мг ДНК на подготовку (correspondinг до 2 MaxiPrep столбцов). Эффективность трансфекции была наиболее легко контролироваться путем запуска образец супернатанта культуры (около 20 μ л) на SDS-PAGE после 72 ч инкубации. Белок полосы секретируемого протеазы должны быть видимыми окрашиванием Кумасси. Если полоса GZM была слабой и клетки не отделить и появились жизнеспособным, культуры инкубировали еще в течение 24 ч перед очисткой IMAC.

Другой наиболее важным шагом стало энтерокиназой (ЕК) лечение, который активирует фермент. Е.К. активность зависит кальция и ингибируется высокими концентрациями NaCl 39 или имидазола (неопубликованное наблюдение). Поэтому, крайне важно, чтобы диализировать элюата из IMAC против достаточного объема (20 мл элюата в 2 л буфера для диализа) Е.К. буфера, содержащего достаточное количество кальция и не более чем на 50 мм в NaCl при нейтральном рН. Лечение ЭК рекомендуется в течение 16 часов при комнатной температуре и должны быть проверены с помощью SDS-PAGE показал, что мобильности сдвига OF обработанной протеазы, если расщепление было полным. Добавляли свежую ЕК и инкубации в свежем EK диализа буфера продолжаться, если изменение было неполным. Только если расщепление было полным, диализа против буфера А S была начата и очистка продолжалась. Каталитический легкой цепи EK имеет значение PI 5,2, что позволяет полное разделение EK от Gzms в конечном катионообменной хроматографии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TRIzol Reagent Invitrogen 15596-026 Total RNA isolation kit
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064-014
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530L
EndoFree Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12362
EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells Sigma 14571C
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Gibco 31966-021
SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO Thermo Scientific 68100
Enterokinase from bovine intestine Sigma E4906 recombinant, ≥20 units/mg protein
HisTrap Excel 5 ml column GE Healthcare 17-3712-06  Nickel IMAC
HiTrap SP HP 5 ml column GE Healthcare 17-1152-01  S column
N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT) Sigma C3647 GzmA substrate
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) MP Biomedicals 2193608 _10mg GzmB substrate
Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL) Bachem GzmM substrate
5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) Sigma D8130 Ellman`s reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chowdhury, D., Lieberman, J. Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death. Annu Rev Immunol. 26, 389-420 (2008).
  2. Thiery, J., Lieberman, J. Perforin: a key pore-forming protein for immune control of viruses and cancer. Subcell Biochem. 80, 197-220 (2014).
  3. Krensky, A. M., Clayberger, C. Biology and clinical relevance of granulysin. Tissue Antigens. 73, 193-198 (2009).
  4. Bovenschen, N., Kummer, J. A. Orphan granzymes find a home. Immunol Rev. 235, 117-127 (2010).
  5. Lieberman, J. Granzyme A activates another way to die. Immunol Rev. 235, 93-104 (2010).
  6. Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell death and differentiation. 19, 28-35 (2012).
  7. Hiebert, P. R., Granville, D. J. Granzyme B in injury, inflammation, and repair. Trends Mol Med. 18, 732-741 (2012).
  8. Afonina, I. S., Cullen, S. P., Martin, S. J. Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme. B. Immunol Rev. 235, 105-116 (2010).
  9. Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157, 1309-1323 (2014).
  10. Lee, W. Y., et al. Invariant natural killer T cells act as an extravascular cytotoxic barrier for joint-invading Lyme Borrelia. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
  11. Kapelski, S., de Almeida, M., Fischer, R., Barth, S., Fendel, R. Antimalarial activity of granzyme B and its targeted delivery by a granzyme B-scFv fusion protein. Antimicrob Agents Chemother. , (2014).
  12. Thiery, J., Walch, M., Jensen, D. K., Martinvalet, D., Lieberman, J. Isolation of cytotoxic T cell and NK granules and purification of their effector proteins. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit3 37), (2010).
  13. Shi, L., Yang, X., Froelich, C. J., Greenberg, A. H. Purification and use of granzyme B. Methods Enzymol. 322, 125-143 (2000).
  14. Masson, D., Tschopp, J. A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes. Cell. 49, 679-685 (1987).
  15. Lorentsen, R. H., Fynbo, C. H., Thogersen, H. C., Etzerodt, M., Holtet, T. L. Expression, refolding, and purification of recombinant human granzyme B. Protein Expr Purif. 39, 18-26 (2005).
  16. Sun, J., et al. Expression and purification of recombinant human granzyme B from Pichia pastoris. Biochem Biophys Res Commun. 261, 251-255 (1999).
  17. Xia, Z., et al. Expression and purification of enzymatically active recombinant granzyme B in a baculovirus system. Biochem Biophys Res Commun. 243, 384-389 (1998).
  18. Stahnke, B., et al. Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes. Mol Cancer Ther. 7, 2924-2932 (2008).
  19. Gehrmann, M., et al. A novel expression and purification system for the production of enzymatic and biologically active human granzyme. B. J Immunol Methods. 371, 8-17 (2011).
  20. Metkar, S. S., et al. Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore formation. Immunity. 16, 417-428 (2002).
  21. Motyka, B., et al. Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis. Cell. 103, 491-500 (2000).
  22. Pinkoski, M. J., et al. Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis. Blood. 92, 1044-1054 (1998).
  23. Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
  24. Fukuchi, K., et al. Activity assays of nine heterogeneous promoters in neural and other cultured cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30 A, 300-305 (1994).
  25. Tran, T. V., Ellis, K. A., Kam, C. M., Hudig, D., Powers, J. C. Dipeptidyl peptidase I: importance of progranzyme activation sequences, other dipeptide sequences, and the N-terminal amino group of synthetic substrates for enzyme activity. Arch Biochem Biophys. 403, 160-170 (2002).
  26. Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  27. Barry, M., et al. Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid. Mol Cell Biol. 20, 3781-3794 (2000).
  28. Darmon, A. J., Nicholson, D. W., Bleackley, R. C. Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. Nature. 377, 446-448 (1995).
  29. Rajani, D. K., Walch, M., Martinvalet, D., Thomas, M. P., Lieberman, J. Alterations in RNA processing during immune-mediated programmed cell death. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8688-8693 (2012).
  30. Domselaar, R., et al. Noncytotoxic inhibition of cytomegalovirus replication through NK cell protease granzyme M-mediated cleavage of viral phosphoprotein 71. J Immunol. 185, 7605-7613 (2010).
  31. Thiery, J., et al. Perforin activates clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, which is required for plasma membrane repair and delivery of granzyme B for granzyme-mediated apoptosis. Blood. 115, 1582-1593 (2010).
  32. Thiery, J., et al. Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells. Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).
  33. Thomas, M. P., et al. Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins. J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).
  34. Jacquemin, G., et al. Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis. Cell death and differentiation. , (2014).
  35. Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C. The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).
  36. Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419 (2014).
  37. Huang, M. T., Gorman, C. M. Intervening sequences increase efficiency of RNA 3' processing and accumulation of cytoplasmic RNA. Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).
  38. Luthman, H., Magnusson, G. High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells. Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).
  39. Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity. Biochem J. 197, 239-244 (1981).

Tags

Биохимии выпуск 100 Granzyme иммунная серин-протеазы клеточно-опосредованной цитотоксичности рекомбинантного белка система экспрессии млекопитающих очистки белков
Высокодоходные и экономически эффективной системы Выражение человека Гранзимы в клетках млекопитающих
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dotiwala, F., Fellay, I., Filgueira, … More

Dotiwala, F., Fellay, I., Filgueira, L., Martinvalet, D., Lieberman, J., Walch, M. A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (100), e52911, doi:10.3791/52911 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter