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Summary

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Abstract

Détecter de faibles concentrations de molécules jusqu'à la limite de la molécule unique a un impact sur des domaines tels que la détection précoce de la maladie, et des études fondamentales sur le comportement des molécules. Techniques simples de détection de molécule utilisent couramment des labels tels que des marqueurs fluorescents ou quantum dots, cependant, les étiquettes ne sont pas toujours disponibles, augmenter le coût et la complexité, et peuvent perturber les événements étudiés. Résonateurs optiques ont émergé comme un moyen prometteur pour détecter des molécules simples, sans l'utilisation d'étiquettes. Actuellement, la plus petite particule détectée par un système de résonateur non-renforcée plasmonically optique nue en solution est un polystyrène 25 nm ^une sphère. Nous avons développé une technique connue sous le verrouillage de fréquence optique Whispering évanescent résonateur (fleur) qui peut dépasser cette limite et d'atteindre seule détection de molécule sans étiquette en solution ^aqueuse à 2. Comme échelles force du signal avec un volume de particules, notre travail représente un> 100x improvement dans le rapport signal sur bruit (SNR) sur l'état actuel de la technique. Voici les procédures à l'origine FLEUR sont présentés dans le but d'accroître son utilisation dans le domaine.

Introduction

Des expériences simples de détection moléculaires sont utiles pour réduire la quantité d'analyte utilisé dans des biocapteurs pour la détection précoce de la maladie, et pour examiner les propriétés fondamentales des molécules ^3. Ces expériences sont généralement effectuées en utilisant des étiquettes, cependant, étiquettes ne sont pas toujours possible d'obtenir pour une protéine particulière, augmenter le coût, peut perturber les événements à l'étude, et peut être gênant, en particulier pour le temps réel sur le site des expériences ou point de service diagnostics de soins.

L'étalon-or actuel biocapteurs sans étiquette est la résonance plasmonique de surface ^4, mais les systèmes de résonance de plasmon de surface commerciale ont généralement une limite inférieure de détection typique de l'ordre de nM. Récemment, résonateurs optiques ont émergé comme une technologie prometteuse pour sans étiquette seule molécule biodétection ^5. Résonateurs optiques travail basée sur le long terme (NS) confinement de la lumière ^6,7. La lumière est évanescentecouplé dans ces dispositifs typiquement via une fibre optique. Lorsque la longueur d'onde de la lumière passant par la fibre correspond à la longueur d'onde de résonance du résonateur, la lumière efficacement couplé au résonateur. Ceci reflète la lumière couplée intérieurement totalement à l'intérieur de la cavité du résonateur à générer un champ évanescent dans le voisinage de la périphérie du résonateur. Comme particules entrent dans le champ évanescent et se lient au résonateur, la longueur d'onde de résonance des changements de résonateur en proportion du volume de la particule ^8.

En termes de capacité de détection, résonateurs microsphères ont précédemment été utilisé pour détecter la grippe A seule particules de virus (100 nm) ^9,10. Récemment, résonateurs optiques microsphères plasmonically améliorée ont été utilisées pour détecter seul sérum albumine bovine molécules oligonucléotides ^{11 et} 8-mères ^12, mais cette approche limite la zone de capture des particules à 0,3 um ^{2 par} device. Grandes biocapteurs de la zone de capture sont idéales pour maximiser les chances de détection de particules. Les technologies actuelles à base de solution sans étiquette biocapteurs avec de grandes (> 100 um ²⁾ zones de capture ont été limitées à la détection de particules de polystyrène ≥ 25 nm.

Nous avons développé un système de biocapteur sans étiquette basée sur la technologie de résonateur optique connu sous le verrouillage de fréquence optique Whispering évanescent résonateur (fleur) ¹³ (Figure 1) qui est capable de détecter en temps résolu de molécules simples en solution. FLEUR utilise la longue durée de vie des photons de résonateurs optiques microtoroid combinés à un verrouillage de fréquence commande de rétroaction, la détection équilibrée, et le filtrage de calcul pour détecter de petites particules jusqu'à des molécules de protéines simples. L'utilisation de la fréquence de verrouillage permet au système de toujours suivre la résonance de déplacement de la microtoroid que les particules se lient, sans la nécessité de balayer ou numériser la longueur d'onde de laser surgrandes plages. Les principes de la fleur peuvent être utilisés pour améliorer les capacités de détection des autres techniques, y compris l'amélioration plasmonique. Dans ce qui suit, les procédures pour effectuer FLEUR sont décrits.

Protocol

1. installation expérimentale et la préparation d'échantillons

1. Fabriquer microtoroids utilisant la lithographie, la gravure, et la fonte de la procédure comme décrit précédemment ^6. Fabriquer microtoroids sur le dessus d'une plaquette de silicium (puce) qui ont typiquement un diamètre majeur de 80 à 100 um, et un diamètre mineur de 2 um.
2. Se détendre à peu près un mètre de fibre optique monomode (125 um gaine, 4,3 um de diamètre de champ de mode) de sa bobine de fibre.
3. Au milieu de la partie déroulée de la fibre optique, la bande un petit segment (2,5 cm) de la couche de polymère autour de la fibre optique en utilisant une pince à dénuder. Note: Ceci est la partie de la fibre optique qui sera utilisé pour coupler la lumière évanescente dans le microtoroid.
4. Nettoyez la fibre dénudée avec de l'alcool de l'isopropanol et un non pelucheux lingette.
5. Maintenez cette partie de la fibre en place à l'aide d'un support de fibre fait de pinces magnétiques.
6. Diluer la fibre dénudée à ~ 500 nm par melting et en tirant à l'aide d'un chalumeau à hydrogène et moteurs pas à pas deux mobiles dans des directions opposées à 60 um / min. Placez la fibre optique à l'intérieur de la partie supérieure de la flamme, qui devrait être ~ 10 mm de hauteur. Arrêter tirant sur la fibre lorsque la transmission à travers la fibre arrête fluctuant, qui peut être surveillée soit visuellement (en regardant la lumière qui est diffusée latéralement à partir du clignotement de fibres sur et en dehors) ou en connectant la fibre à une photodiode qui est fixé à un oscilloscope .
7. Cliver une extrémité de la fibre optique et l'insérer dans un adaptateur de fibre nue. Placer cette extrémité de la fibre à l'entrée du photo-récepteur.
8. Fibre coupler l'autre extrémité de la bobine de fibre à l'aide d'un laser par le coupleur de fibre optique.
9. Placez la puce microtoroid sur un porte-échantillon (acier inoxydable, 37,8 mm x 6,4 mm x 3,2 mm) en utilisant soit époxy ou ruban adhésif double face.
10. Monter le porte-échantillon sur une platine de positionnement qui se compose d'une nano 3 axes de positionnement (nanocube) stade (voir la liste d'équipement) sur le dessus d'un micromètre à 3 axes. Effectuer toutes les expériences sur une table optique pneumatique isolé pour minimiser les vibrations.
11. Position grossière de la puce de l'échantillon en utilisant le micromètre à 3 axes.
12. Alignez les contenant microtoroid puce parallèle à la fibre optique en utilisant la nano-positionneur. Remarque: Aligner le microtoroid à une distance d'une longueur d'onde de la lumière d'entrée (~ 633 nm). Pour la visualisation de ce processus utiliser deux colonnes d'imagerie (tube avec objectif et la caméra objective, voir la liste de l'équipement) positionnée sur le dessus et sur le côté de la puce.
13. Optimiser la polarisation de la lumière laser dirigé à travers la fibre optique en utilisant un contrôleur en ligne de polarisation (voir la liste d'équipement) avec un bouton pour ajuster la polarisation. Remarque: la polarisation optimale est obtenue lorsque l'inclinaison mesurée dans la transmission de la fibre optique apparaît le plus étroit. Observez cette trempette sur un oscilloscope (voir l'étape 2.2 pour plus de détails).
14. Constructionune chambre d'échantillon par epoxying une lamelle de verre sur la platine porte-échantillon en utilisant une lame de microscope en verre comme un écarteur. Remarque: Un boîtier en plexiglas couvrant l'ensemble de la configuration peut être utile pour minimiser les courants d'air. Une petite ouverture devrait être laissée à la solution pour permettre à pomper à l'aide de tubes.
15. Équilibrer thermiquement suspensions de particules ou de solutions aqueuses d'une seule molécule ≥ 1 heure dans un bain d'eau RT (~ 500 ml). Note: Les échantillons sont dilués à la concentration désirée dans des microtubes en utilisant les tampons associés spécifiées par le fabricant, par exemple, PBS ou HEPES. Si aucun événement de liaison est détecté, augmenter la concentration en sel du tampon.
16. Vortex particule de solutions contenant (1 ml) pendant environ 2 brièvement sec.
17. Injecter des solutions contenant des particules dans la chambre d'échantillon à 1 ml / min en utilisant une pompe à seringue de 1 ml.
18. Après la chambre de l'échantillon a rempli, éteignez la pompe seringue.
19. Attendre 30 secondes avant que les données d'enregistrement afin de minimiserles effets des vibrations mécaniques résultant de l'écoulement de fluide qui peuvent affecter la mesure.

2. Serrure de fréquence

1. Re-coupler le tore à la fibre optique par déplacement du porte-échantillon avec la nanopositionneur, parce que le couplage sera perturbé en raison de l'injection de fluide.
2. Localiser la longueur d'onde de résonance de la microtoroid par le balayage laser d'entrée commandé par ordinateur par le biais d'une variété de longueurs d'onde. Effectuer cette opération par l'envoi d'un signal de tension de forme d'onde triangulaire à un élément piézo-électrique à l'intérieur de l'unité de commande laser qui régule la longueur d'onde du laser. Effectuer des expériences en utilisant la lumière visible (635 nm ± 2,5 nm) car il est faible absorption de la lumière dans l'eau à cette longueur d'onde.
3. Mesure de la transmission de la lumière à travers la fibre optique en branchant la sortie de la fibre optique en un photorécepteur auto-équilibré. Branchez la sortie du photorécepteur en un oscilloscope à l'aide d'un câble BNC. Observer on l'oscilloscope que la longueur d'onde de résonance de la microtoroid, la transmission à travers la fibre optique diminue.
4. Fixez la sortie du photorécepteur à l'entrée principale du blocage contrôleur de rétroaction (voir la liste d'équipement) via un câble fréquence.
5. Exécutez le contrôleur de rétroaction de verrouillage de fréquence en mode de verrouillage automatique à l'aide de verrouillage avec une fréquence de vibration de 2 kHz et une amplitude de l'oscillation de longueur d'onde 19 fm pic haut de. Empiriquement définir les paramètres proportionnelle intégrale dérivés dans la fenêtre du logiciel en utilisant les règles de réglage de Ziegler-Nichols ^14. Remarque: Ces valeurs doivent seulement être réglé une fois au début de toutes les expériences.
6. Auto-verrouiller la longueur d'onde du laser à la longueur d'onde de résonance de la microtoroid. Effectuez cette étape après remplissage de la chambre d'échantillon. Remarque: Si le changement de longueur d'onde est trop grand, alors le contrôleur de rétroaction perdra serrure et passe automatiquement en mode de balayage afin de localiser l'emplacement de longueur d'onde de résonance. Cette occurs pour décale longueur d'onde supérieure à environ une largeur de raie (au moins 600 FM pour tous les systèmes étudiés ici).
7. Enregistrez la sortie du contrôleur de rétroaction à 20 kHz en utilisant une carte d'acquisition de données 24 bits. Exporter les données dans un fichier texte via le logiciel d'acquisition de données.

3. Traitement des données et de l'analyse

1. Transformée de Fourier les données dans MATLAB.
2. Passe-bas les données à l'aide d'un "mur de briques" filtre avec une coupure à 1 kHz pour éliminer la fréquence de vibration imposée de 2 kHz (voir code supplémentaire Fichier d'écran 1).
3. Encoche calcul de filtrer les données en utilisant une taille de fenêtre de 16 Hz. Note: Ceci est fait pour éliminer les sources connues de bruit, dans ce cas, 60 Hz bruit de ligne électronique et ses harmoniques, ainsi 100 Hz (en venant du pilote laser) et ses harmoniques (voir code supplémentaire Fichier d'écran 1).
4. Transformée de Fourier inverse les données dans le domaine temporel.
5. Filtre médian les données en utilisant une fenêtretaille de 1001 échantillons (voir code supplémentaire Fichier d'écran 2).
6. Repérez des changements progressifs dans la longueur d'onde de résonance à l'aide de l'algorithme de recherche de l'étape-Kerssemakers et al. ^15.
7. Générer des histogrammes de l'amplitude de chaque étape de liaison.
8. Calculer la taille des particules en utilisant l'équation. (1) (voir la discussion).

Representative Results

Discussion

Comme une particule se lie, la longueur d'onde de résonance (λ) du tore augmente. Si une particule délie, la longueur d'onde de résonance diminue en conséquence (un événement step-down). Le diamètre des particules (d) peut être déterminée par des histogrammes de l'amplitude de chaque étape de longueurs d'onde. La hauteur de chaque étape de la longueur d'onde varie en raison de variations de la taille des particules lié et en raison de l'emplacement sur le microtoroid où la particule se lie. La variation maximale en résonance longueur d'onde (hauteur de l'étape) se produit lorsque des particules se lient à l'équateur de la microtoroid où le champ électrique (E _{0, max)} est un maximum. Cette hauteur de marche maximale (Δλ) est liée à un diamètre de particules à travers l'équation. (1) ^8, où a est le rayon de la particule, D est une constante diélectrique en fonction de l'indice de réfraction de la particule et lié de ses milieux environnants, V _m est le volume de mode de light dans le microtoroid déterminée par des simulations par éléments finis ^2, et E ₀ (r _s) est l'amplitude du champ électrique à l'équateur de particules également déterminé par des simulations par éléments finis:

Inversion Eq. (1) indique que la puissance du signal (Δλ) évolue avec le volume des particules ^(3). Notre facteur diélectrique est défini comme suit:

où est l'indice de réfraction du milieu environnant, et est l'indice de réfraction de la particule. Estimations théoriques pour la taille des particules basé sur l'équation (1) ainsi que Les histogrammes et la taille cal supplémentairescal- sont présentés dans ^{2, 16.}

FLOWER peut être modifié pour un suivi plus rapide, en augmentant la fréquence à laquelle le contrôleur de verrouillage de rétroaction fréquence suit la longueur d'onde du microtoroid. La procédure de traitement de données peut être modifié en utilisant une moyenne mobile à la place d'un filtre médian, et événements de liaison peut encore être récupéré, mais le filtre médian provoque bords étape pour être mieux préservées. Limites de cette technique comprennent le fait que le changement de longueur d'onde de la microtoroid lors de la liaison des particules dépend où sur le résonateur terres des particules. Ainsi, la confirmation de la fixation d'une seule particule repose sur la génération d'un histogramme de nombreux événements de liaison discrètes. Si aucun événement de liaison distincts sont détectés, ce qui augmente la concentration en sel du solvant permet.

L'importance de cette technique en ce qui concerne les méthodes existantes est qu'il n'y a pas d'étiquettes sont nécessaires pour interroger la molécule cible.La liaison sélective nécessite cependant la fonctionnalisation de la sonde avec des anticorps. D'autres avantages comprennent le fait que, depuis microtoroid résonateurs ont des zones de capture de plus grandes par rapport aux méthodes de résonance de plasmon de surface à haute sensibilité, d'événements de liaison des particules sont plus susceptibles de se produire. En outre, parce FLEUR ne nécessite pas de marqueurs fluorescents qui peuvent photobleach, fleur est capable de (> 10 sec) des mesures de long avec rapide (milliseconde) résolution temporelle.

Les étapes critiques au sein du protocole comprennent alignant le cône de fibre optique avec le microtoroid. Une fois le tore est immergé dans un liquide trop de mouvement de la fibre à travers le liquide, peut causer le cône de rompre, mettant ainsi fin à l'expérience. FLEUR dans sa formulation actuelle ne convient donc pas pour des expériences sur l'échelle de temps des heures. En outre, une fois le microtoroid a été immergé dans un liquide et des particules lier, le facteur de qualité (Q) tombe irrémédiablement sur une échelle de temps d'heures et I crêterrouillage peut devenir instable. Dans cette situation, un nouveau dispositif est nécessaire. Parce que nous tergiversons notre fréquence du laser dans une très petite plage autour du pic de résonance, FLEUR ne scanne pas simultanément à travers le spectre de résonance et donc ne mesure pas les variations de facteur de qualité en temps réel sous forme de particules se lient. En regardant le facteur de qualité avant et après la liaison de seulement quelques particules, nous ne voyons pas une dégradation importante de facteur Q. Nous nous attendons à ce que c'est parce que les tores vierges originales ont relativement faible facteur Q (Q chargé dans l'eau de ~ 1×10 ⁵ -5×10 ^6).

Nous notons que le bruit de fluctuation induite par laser est soustraite à l'aide du photorécepteur auto-équilibré. Nous minimisons les fluctuations de la fibre optique contre le tore en plaçant la fibre en contact direct l'microtoroid. En outre, si les paramètres PID ne sont pas correctement définies, les fluctuations apparaîtront, à savoir, le système ne sera pas rapidement et ACCURATEly quarts de longueur d'onde de la piste. Règles de réglage de Ziegler-Nichols peuvent être utilisés pour définir correctement le PID paramètres ^14. En suivant les procédures décrites ici, il devrait être possible de détecter et de nanoparticules de taille allant de centaines de nanomètres jusqu'à quelques nanomètres, y compris des molécules biologiques simples.

Materials

Tunable diode laser	Newport	TLB-6300
Laser controller	Newport	TLB-6300-LN
Frequency locking feedback controller	Toptica Photonics	Digilock 110
Auto-balanced photoreceiver	Newport	Model 2007
In-line polarization controller	General Photonics	PLC-003-S-90
24-bit data acquisition card	National Instruments	NI-PCI-4461
Recombinant human interleukin-2	Pierce Biotechnology	R201520
20 nm polystyrene beads	Thermo Scientific	3020A
NanoCube XYZ Piezo Stage	Physik Instrumente	P-611.3
Optical table	Newport	VH3660W-OPT
Objective lens for imaging column	Navitar Machine Vision	1-60228
Imaging column (adaptor tube)	Navitar Machine Vision	1-60228
High-Res CCD camera for imaging column	Edmund Industrial Optics	NT39244