Simple détection de molécule libre Label-Utilisation Microtoroid optiques résonateurs

Summary

Nous avons développé un système de biodétection sans marquage basé sur la technologie de résonateur optique connue sous le nom de résonateur évanescent optique à verrouillage de fréquence (FLOWER) qui est capable de détecter des molécules uniques en solution. Ici, les procédures qui sous-tendent ce travail sont décrites et présentées.

Abstract

Détecter de faibles concentrations de molécules jusqu'à la limite de la molécule unique a un impact sur des domaines tels que la détection précoce de la maladie, et des études fondamentales sur le comportement des molécules. Techniques simples de détection de molécule utilisent couramment des labels tels que des marqueurs fluorescents ou quantum dots, cependant, les étiquettes ne sont pas toujours disponibles, augmenter le coût et la complexité, et peuvent perturber les événements étudiés. Résonateurs optiques ont émergé comme un moyen prometteur pour détecter des molécules simples, sans l'utilisation d'étiquettes. Actuellement, la plus petite particule détectée par un système de résonateur non-renforcée plasmonically optique nue en solution est un polystyrène 25 nm ^une sphère. Nous avons développé une technique connue sous le verrouillage de fréquence optique Whispering évanescent résonateur (fleur) qui peut dépasser cette limite et d'atteindre seule détection de molécule sans étiquette en solution ^aqueuse à 2. Comme échelles force du signal avec un volume de particules, notre travail représente un> 100x improvement dans le rapport signal sur bruit (SNR) sur l'état actuel de la technique. Voici les procédures à l'origine FLEUR sont présentés dans le but d'accroître son utilisation dans le domaine.

Introduction

Des expériences simples de détection moléculaires sont utiles pour réduire la quantité d'analyte utilisé dans des biocapteurs pour la détection précoce de la maladie, et pour examiner les propriétés fondamentales des molécules ^3. Ces expériences sont généralement effectuées en utilisant des étiquettes, cependant, étiquettes ne sont pas toujours possible d'obtenir pour une protéine particulière, augmenter le coût, peut perturber les événements à l'étude, et peut être gênant, en particulier pour le temps réel sur le site des expériences ou point de service diagnostics de soins.

L'étalon-or actuel biocapteurs sans étiquette est la résonance plasmonique de surface ^4, mais les systèmes de résonance de plasmon de surface commerciale ont généralement une limite inférieure de détection typique de l'ordre de nM. Récemment, résonateurs optiques ont émergé comme une technologie prometteuse pour sans étiquette seule molécule biodétection ^5. Résonateurs optiques travail basée sur le long terme (NS) confinement de la lumière ^6,7. La lumière est évanescentecouplé dans ces dispositifs typiquement via une fibre optique. Lorsque la longueur d'onde de la lumière passant par la fibre correspond à la longueur d'onde de résonance du résonateur, la lumière efficacement couplé au résonateur. Ceci reflète la lumière couplée intérieurement totalement à l'intérieur de la cavité du résonateur à générer un champ évanescent dans le voisinage de la périphérie du résonateur. Comme particules entrent dans le champ évanescent et se lient au résonateur, la longueur d'onde de résonance des changements de résonateur en proportion du volume de la particule ^8.

En termes de capacité de détection, résonateurs microsphères ont précédemment été utilisé pour détecter la grippe A seule particules de virus (100 nm) ^9,10. Récemment, résonateurs optiques microsphères plasmonically améliorée ont été utilisées pour détecter seul sérum albumine bovine molécules oligonucléotides ^{11 et} 8-mères ^12, mais cette approche limite la zone de capture des particules à 0,3 um ^{2 par} device. Grandes biocapteurs de la zone de capture sont idéales pour maximiser les chances de détection de particules. Les technologies actuelles à base de solution sans étiquette biocapteurs avec de grandes (> 100 um ²⁾ zones de capture ont été limitées à la détection de particules de polystyrène ≥ 25 nm.

Nous avons développé un système de biocapteur sans étiquette basée sur la technologie de résonateur optique connu sous le verrouillage de fréquence optique Whispering évanescent résonateur (fleur) ¹³ (Figure 1) qui est capable de détecter en temps résolu de molécules simples en solution. FLEUR utilise la longue durée de vie des photons de résonateurs optiques microtoroid combinés à un verrouillage de fréquence commande de rétroaction, la détection équilibrée, et le filtrage de calcul pour détecter de petites particules jusqu'à des molécules de protéines simples. L'utilisation de la fréquence de verrouillage permet au système de toujours suivre la résonance de déplacement de la microtoroid que les particules se lient, sans la nécessité de balayer ou numériser la longueur d'onde de laser surgrandes plages. Les principes de la fleur peuvent être utilisés pour améliorer les capacités de détection des autres techniques, y compris l'amélioration plasmonique. Dans ce qui suit, les procédures pour effectuer FLEUR sont décrits.

Protocol

1. installation expérimentale et la préparation d'échantillons

1. Fabriquer microtoroids utilisant la lithographie, la gravure, et la fonte de la procédure comme décrit précédemment ^6. Fabriquer microtoroids sur le dessus d'une plaquette de silicium (puce) qui ont typiquement un diamètre majeur de 80 à 100 um, et un diamètre mineur de 2 um.
2. Se détendre à peu près un mètre de fibre optique monomode (125 um gaine, 4,3 um de diamètre de champ de mode) de sa bobine de fibre.
3. Au milieu de la partie déroulée de la fibre optique, la bande un petit segment (2,5 cm) de la couche de polymère autour de la fibre optique en utilisant une pince à dénuder. Note: Ceci est la partie de la fibre optique qui sera utilisé pour coupler la lumière évanescente dans le microtoroid.
4. Nettoyez la fibre dénudée avec de l'alcool de l'isopropanol et un non pelucheux lingette.
5. Maintenez cette partie de la fibre en place à l'aide d'un support de fibre fait de pinces magnétiques.
6. Diluer la fibre dénudée à ~ 500 nm par melting et en tirant à l'aide d'un chalumeau à hydrogène et moteurs pas à pas deux mobiles dans des directions opposées à 60 um / min. Placez la fibre optique à l'intérieur de la partie supérieure de la flamme, qui devrait être ~ 10 mm de hauteur. Arrêter tirant sur la fibre lorsque la transmission à travers la fibre arrête fluctuant, qui peut être surveillée soit visuellement (en regardant la lumière qui est diffusée latéralement à partir du clignotement de fibres sur et en dehors) ou en connectant la fibre à une photodiode qui est fixé à un oscilloscope .
7. Cliver une extrémité de la fibre optique et l'insérer dans un adaptateur de fibre nue. Placer cette extrémité de la fibre à l'entrée du photo-récepteur.
8. Fibre coupler l'autre extrémité de la bobine de fibre à l'aide d'un laser par le coupleur de fibre optique.
9. Placez la puce microtoroid sur un porte-échantillon (acier inoxydable, 37,8 mm x 6,4 mm x 3,2 mm) en utilisant soit époxy ou ruban adhésif double face.
10. Monter le porte-échantillon sur une platine de positionnement qui se compose d'une nano 3 axes de positionnement (nanocube) stade (voir la liste d'équipement) sur le dessus d'un micromètre à 3 axes. Effectuer toutes les expériences sur une table optique pneumatique isolé pour minimiser les vibrations.
11. Position grossière de la puce de l'échantillon en utilisant le micromètre à 3 axes.
12. Alignez les contenant microtoroid puce parallèle à la fibre optique en utilisant la nano-positionneur. Remarque: Aligner le microtoroid à une distance d'une longueur d'onde de la lumière d'entrée (~ 633 nm). Pour la visualisation de ce processus utiliser deux colonnes d'imagerie (tube avec objectif et la caméra objective, voir la liste de l'équipement) positionnée sur le dessus et sur le côté de la puce.
13. Optimiser la polarisation de la lumière laser dirigé à travers la fibre optique en utilisant un contrôleur en ligne de polarisation (voir la liste d'équipement) avec un bouton pour ajuster la polarisation. Remarque: la polarisation optimale est obtenue lorsque l'inclinaison mesurée dans la transmission de la fibre optique apparaît le plus étroit. Observez cette trempette sur un oscilloscope (voir l'étape 2.2 pour plus de détails).
14. Constructionune chambre d'échantillon par epoxying une lamelle de verre sur la platine porte-échantillon en utilisant une lame de microscope en verre comme un écarteur. Remarque: Un boîtier en plexiglas couvrant l'ensemble de la configuration peut être utile pour minimiser les courants d'air. Une petite ouverture devrait être laissée à la solution pour permettre à pomper à l'aide de tubes.
15. Équilibrer thermiquement suspensions de particules ou de solutions aqueuses d'une seule molécule ≥ 1 heure dans un bain d'eau RT (~ 500 ml). Note: Les échantillons sont dilués à la concentration désirée dans des microtubes en utilisant les tampons associés spécifiées par le fabricant, par exemple, PBS ou HEPES. Si aucun événement de liaison est détecté, augmenter la concentration en sel du tampon.
16. Vortex particule de solutions contenant (1 ml) pendant environ 2 brièvement sec.
17. Injecter des solutions contenant des particules dans la chambre d'échantillon à 1 ml / min en utilisant une pompe à seringue de 1 ml.
18. Après la chambre de l'échantillon a rempli, éteignez la pompe seringue.
19. Attendre 30 secondes avant que les données d'enregistrement afin de minimiserles effets des vibrations mécaniques résultant de l'écoulement de fluide qui peuvent affecter la mesure.

2. Serrure de fréquence

1. Re-coupler le tore à la fibre optique par déplacement du porte-échantillon avec la nanopositionneur, parce que le couplage sera perturbé en raison de l'injection de fluide.
2. Localiser la longueur d'onde de résonance de la microtoroid par le balayage laser d'entrée commandé par ordinateur par le biais d'une variété de longueurs d'onde. Effectuer cette opération par l'envoi d'un signal de tension de forme d'onde triangulaire à un élément piézo-électrique à l'intérieur de l'unité de commande laser qui régule la longueur d'onde du laser. Effectuer des expériences en utilisant la lumière visible (635 nm ± 2,5 nm) car il est faible absorption de la lumière dans l'eau à cette longueur d'onde.
3. Mesure de la transmission de la lumière à travers la fibre optique en branchant la sortie de la fibre optique en un photorécepteur auto-équilibré. Branchez la sortie du photorécepteur en un oscilloscope à l'aide d'un câble BNC. Observer on l'oscilloscope que la longueur d'onde de résonance de la microtoroid, la transmission à travers la fibre optique diminue.
4. Fixez la sortie du photorécepteur à l'entrée principale du blocage contrôleur de rétroaction (voir la liste d'équipement) via un câble fréquence.
5. Exécutez le contrôleur de rétroaction de verrouillage de fréquence en mode de verrouillage automatique à l'aide de verrouillage avec une fréquence de vibration de 2 kHz et une amplitude de l'oscillation de longueur d'onde 19 fm pic haut de. Empiriquement définir les paramètres proportionnelle intégrale dérivés dans la fenêtre du logiciel en utilisant les règles de réglage de Ziegler-Nichols ^14. Remarque: Ces valeurs doivent seulement être réglé une fois au début de toutes les expériences.
6. Auto-verrouiller la longueur d'onde du laser à la longueur d'onde de résonance de la microtoroid. Effectuez cette étape après remplissage de la chambre d'échantillon. Remarque: Si le changement de longueur d'onde est trop grand, alors le contrôleur de rétroaction perdra serrure et passe automatiquement en mode de balayage afin de localiser l'emplacement de longueur d'onde de résonance. Cette occurs pour décale longueur d'onde supérieure à environ une largeur de raie (au moins 600 FM pour tous les systèmes étudiés ici).
7. Enregistrez la sortie du contrôleur de rétroaction à 20 kHz en utilisant une carte d'acquisition de données 24 bits. Exporter les données dans un fichier texte via le logiciel d'acquisition de données.

3. Traitement des données et de l'analyse

1. Transformée de Fourier les données dans MATLAB.
2. Passe-bas les données à l'aide d'un "mur de briques" filtre avec une coupure à 1 kHz pour éliminer la fréquence de vibration imposée de 2 kHz (voir code supplémentaire Fichier d'écran 1).
3. Encoche calcul de filtrer les données en utilisant une taille de fenêtre de 16 Hz. Note: Ceci est fait pour éliminer les sources connues de bruit, dans ce cas, 60 Hz bruit de ligne électronique et ses harmoniques, ainsi 100 Hz (en venant du pilote laser) et ses harmoniques (voir code supplémentaire Fichier d'écran 1).
4. Transformée de Fourier inverse les données dans le domaine temporel.
5. Filtre médian les données en utilisant une fenêtretaille de 1001 échantillons (voir code supplémentaire Fichier d'écran 2).
6. Repérez des changements progressifs dans la longueur d'onde de résonance à l'aide de l'algorithme de recherche de l'étape-Kerssemakers et al. ^15.
7. Générer des histogrammes de l'amplitude de chaque étape de liaison.
8. Calculer la taille des particules en utilisant l'équation. (1) (voir la discussion).

Results

Événements de liaison des particules sont clairement vu que les changements de pas semblable à la longueur d'onde de résonance de la microtoroid au fil du temps (figure 2A). Les hauteurs de ces étapes sont présentés sous forme d'histogramme à la figure 2B. Les figures 2-4 montrent des traces représentatives de la liaison des exosomes (de nanovésicules), des billes de silice de 5 nm, et simples humains interleukine-2 molécules, respectivement. Le fait qu...

Discussion

Comme une particule se lie, la longueur d'onde de résonance (λ) du tore augmente. Si une particule délie, la longueur d'onde de résonance diminue en conséquence (un événement step-down). Le diamètre des particules (d) peut être déterminée par des histogrammes de l'amplitude de chaque étape de longueurs d'onde. La hauteur de chaque étape de la longueur d'onde varie en raison de variations de la taille des particules lié et en raison de l'emplacement sur le microtoroid où la particule se lie. La...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser à diode accordable	Newport	TLB-6300
Contrôleur laser	Newport	TLB-6300-LN
Contrôleur de rétroaction à verrouillage de fréquence	Toptica Photonics	Digilock 110
Photorécepteur auto-équilibré	Newport	Model 2007
Contrôleur de polarisation en ligne	General Photonics	PLC-003-S-90
Carte d’acquisition de données 24 bits	National Instruments	NI-PCI-4461
Interleukine-2 humaine recombinante	Pierce Biotechnology	R201520
billes de polystyrène 20 nm	Thermo Scientific	3020A
NanoCube XYZ Piezo Stage	Physik Instrumente	P-611.3
Table optique	Newport	VH3660W-OPT
Lentille d’objectif pour colonne d’imagerie	Navitar Machine Vision	1-60228
Colonne d’imagerie (tube adaptateur)	Navitar Machine Vision	1-60228
Caméra CCD haute résolution pour colonne d’imagerie	Edmund Industrial	Optics NT39244