Abstract
Обнаружение малых концентраций молекул до предела одной молекулы имеет влияние в таких областях, как раннее выявление заболевания и фундаментальных исследований на поведение молекул. Холост методы обнаружения молекулы обычно используют этикетки, например, люминесцентных меток или квантовых точек, однако, этикетки не всегда доступны, увеличить стоимость и сложность, и может возмутить изучаемые события. Оптические резонаторы появились в качестве перспективного средства выявления одиночных молекул без использования меток. В настоящее время маленькая частица детектируется не-plasmonically повышенной жки оптического резонаторной системы в виде раствора в 25 нм полистирола сфера 1. Мы разработали метод, известный как частоту захвата оптического Whispering Evanescent резонатор (цветок), что может превзойти этот предел и достичь обнаружение одной молекулы без наклеек в водном растворе 2. Как сила сигнала шкалы с объемом частиц, наша работа представляет собой> 100x improvemeнт в сигнала к шуму (SNR) в течение текущего уровня техники. Вот процедуры за ЦВЕТОК представлены в целях повышения его использование в этой области.
Introduction
Одна молекула эксперименты обнаружения полезны для уменьшения количества анализируемого вещества, используемого в биосенсоров, для раннего выявления заболевания, и для изучения фундаментальных свойств молекул 3. Такие эксперименты, как правило, выполняется с использованием этикетки, однако, этикетки не всегда возможно получить для определенного белка, увеличивают стоимость, могут нарушать изучаемые события, и может быть неудобным, особенно для реального времени на месте экспериментов или точка-of диагностика по уходу.
В настоящее время золотым стандартом для этикеток без биодатчиков является поверхность плазмонного резонанса 4, однако коммерческий поверхностного плазмонного резонанса системы обычно имеют типичную нижний предел обнаружения на порядок нМ. Недавно, оптические резонаторы появились как перспективной технологии для biodetection одна молекула этикетки без 5. Оптический работы резонаторы на основе долгосрочных (нс) заключение света 6,7. Свет evanescentlyв сочетании в этих устройствах, как правило, с помощью оптического волокна. Когда длина волны света, проходящего через волокно соответствует резонансной длины волны резонатора, свет эффективно пары к резонатору. Это в сочетании света полное внутреннее отражает внутри полости резонатора генерирующего мимолетную поле в непосредственной близости от окружности резонатора. Как частицы попадают эванесцентной поле и связываются с резонатором, резонансной длины волны резонатора изменяется пропорционально объему частицы 8.
С точки зрения способности обнаружения, микросфер резонаторы были ранее использованы для детектирования единичных вируса гриппа А частицы (100 нм) 9,10. Недавно plasmonically повышенной микросфер оптические резонаторы были использованы для выявления одного сыворотки бычьего альбумина молекулы 11 и 8-мерных олигонуклеотида 12, однако этот подход ограничивает область захвата частиц до 0,3 мкм 2 в DEвице. Большие биосенсоры площадь захвата идеально подходят для максимизации шансов обнаружения частиц. Текущие решение на основе меток без биодатчиков технологии с большими (> 100 мкм 2) областях захвата были ограничены обнаружения частицы полистирола ≥ 25 нм.
Мы разработали этикетки без системы биодатчиков на основе оптической технологии, известной как резонатор захвата частоты оптического Whispering Evanescent резонатор (цветок) 13 (рисунок 1), который способен с временным разрешением обнаружения одиночных молекул в растворе. ЦВЕТОК использует длительный срок службы фотонную microtoroid оптических резонаторов в сочетании с частотой блокировки управления с обратной связью, сбалансированного обнаружения и вычислительной фильтрации для обнаружения мелких частиц вплоть до отдельных белковых молекул. Использование захвата частоты позволяет системе всегда отслеживать переключени резонанс microtoroid в виде частиц связываются, без необходимости подметать или сканировать длину волны лазера в течениебольшие диапазоны. Принципы цветочных могут быть использованы для повышения возможности обнаружения других методов, включая плазмонного усиления. В дальнейшем, процедуры для выполнения ЦВЕТОК описаны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Экспериментальная установка и образец Подготовка
- Изготовление microtoroids помощью литографии, травления и плавки процедуру, как описано выше 6. Изготовление microtoroids поверх кремниевой пластины (чип), что, как правило, имеют большой диаметр 80-100 мкм, и малую диаметр 2 мкм.
- Расслабьтесь примерно метр одномодового оптического волокна (125 мкм оболочки, 4.3 мкм Диаметр модового) от его волокна катушку.
- В середине развернутом части оптического волокна, полосы небольшой сегмент (2,5 см) полимерного покрытия вокруг оптического волокна с использованием устройства для зачистки. Примечание: Эта часть оптического волокна, который будет использоваться, чтобы evanescently пара света в microtoroid.
- Очистите зачищенный волокна с изопропанол алкоголя и безворсовой салфеткой.
- Держите эту часть волокна на месте с помощью держателя волокно из магнитных зажимов.
- Тонкие лишен волокно ~ 500 нм по MELTINг и потянув помощью факел водорода и два шаговых двигателей, движущиеся в противоположных направлениях при 60 мкм / мин. Поместите оптического волокна внутри верхней части пламени, которая должна быть ~ 10 мм в высоту. Остановка потянув волокна, когда передача по волокну останавливается колебания, которые могут быть проверены либо визуально (наблюдая свет, рассеянный вбок от волокна мигают) или при подключении волокна на фотодиод, который прикреплен к осциллографу ,
- Клив один конец оптического волокна и вставьте его в голом адаптер волокна. Поместите этот конец волокна на вход фотоприемника.
- Волоконно пара другой конец волокна к катушке лазера с помощью волоконно-оптического ответвителя.
- Поместите microtoroid чип на вершине держателя образца (нержавеющая сталь, 37,8 мм х 6,4 мм х 3,2 мм), используя либо эпоксидную смолу или двусторонний скотч.
- Установите держатель образца на вершине этапе позиционирования, который состоит из 3-осевой нано-позиционирования (пanocube) этап (список оборудования) на вершине 3-оси микрометра. Выполните все эксперименты на пневматическим изолированных оптическом столе, чтобы минимизировать вибрации.
- Грубый позиция чип образец с использованием 3-оси микрометра.
- Совместите microtoroid содержащих чип параллельно оптического волокна с использованием нано-позиционный. Примечание: Выровнять microtoroid на расстоянии одной длины волны входного света (~ 633 нм). Для визуализации этого процесса используют два столбца изображений (трубка с линзой объектива и камеры, см список оборудования), расположенный на верхней и на стороне чипа.
- Оптимизация поляризации лазерного света, направленного через оптическое волокно с использованием контроллера поляризации в линии (см список оборудования) с ручкой для регулировки поляризации. Примечание: Оптимальное поляризации достигается, когда измеренное падение в передаче оптического волокна появляется узкая. Соблюдайте этот провал на экране осциллографа (см шаг 2,2 для более подробной информации).
- Строитьобразец камере epoxying покровным стеклом на этапе выборки с использованием стекла микроскопа в качестве разделителя. Примечание: корпус из оргстекла охватывающих весь настройку могут быть полезны для минимизации воздушных потоков. Небольшое отверстие должно быть оставлено, чтобы позволить раствору перекачиваемой при помощи трубки.
- Термически равновесие суспензий частиц или одной молекулы водные растворы для ≥ 1 час на водяной бане РТ (~ 500 мл). Примечание: Образцы разводили до желаемой концентрации в микроцентрифужных пробирках с помощью связанных буферы, указанные от производителя, например, PBS или HEPES. Если нет связывания события не обнаружены, увеличивают концентрацию соли в буфере.
- Вихревой частиц растворов, содержащих кратко (1 мл) в течение ~ 2 сек.
- Вводят растворы, содержащие частицы в отборную камеру на 1 мл / мин с использованием 1 мл шприца.
- После того как образец палата заполнено, отключите шприцевой насос.
- Подождите 30 сек, прежде чем данные записи, чтобы минимизироватьпоследствия механических колебаний в результате потока жидкости, что может повлиять на точность измерения.
2. Частота замок
- Вторичное пару тороида к оптическому волокну, перемещая держатель образца с nanopositioner, поскольку муфта будет нарушен из-за впрыска жидкости.
- Расположить резонансную длину волны microtoroid путем сканирования входного лазера с компьютерным управлением с помощью различных длин волн. Выполните этот шаг, посылая сигнал треугольной формы волны напряжения к пьезоэлектрическому элементу лазера в контроллере, который регулирует длину волны лазера. Выполнение экспериментов с использованием видимого света (635 нм ± 2,5 нм), поскольку есть низкое поглощение света в воде на этой длине волны.
- Измерение пропускания света через оптическое волокно, подключив выход оптического волокна в автоматическом сбалансированный фотоприемника. Включите выход фотоприемника в осциллографе с помощью кабеля BNC. Соблюдайте Оп осциллограф, что на резонансной длине волны microtoroid, передачи по оптическому волокну падает.
- Приложить выход фотоприемника к основному входу захвата частоты контроллера с обратной связью (см список оборудования) с помощью кабеля.
- Запустите частоты блокировки контроллера обратной связи в режиме AUTOLOCK использованием топ-оф-пик замок с дрожащих частотой 2 кГц и амплитудой колебаний с длиной волны от 19 фм. Эмпирически установить пропорционально-интегрально-дифференциальный настройки в окне программного обеспечения с использованием катализаторов Циглера-Николс правила настройки 14. Примечание: Эти значения нужно только установить один раз в начале всех экспериментов.
- Авто-блокировки длины волны лазера с резонансной длиной волны microtoroid. Выполните этот шаг после заполнения камеры пробы. Примечание: Если сдвиг длины волны слишком велика, то контроллер обратной потеряет замок и автоматическое переключение в режим сканирования для того, чтобы найти расположение резонансной длине волны. Это оспсы для длины волны смещается больше, чем примерно одной ширины линии (по крайней мере, 600 фм для всех исследованных систем здесь).
- Запишите вывод контроллера обратной связи на частоте 20 кГц с использованием 24-битного сбора данных карты. Экспорт данных в текстовый файл с помощью программного обеспечения сбора данных.
3. Обработка и анализ данных
- Преобразование Фурье данных в MATLAB.
- Низкий передавать данные, используя "кирпич-стена" фильтр с обрезанием на 1 кГц, чтобы удалить введенной сглаживания частоты 2 кГц (см Справочная код файла Скриншот 1).
- В вычислительном выемка фильтровать данные с использованием размера окна 16 Гц. Примечание: Это делается для удаления известных источников шума, в данном случае, 60 Гц шум электронная линия и ее гармоники, а также 100 Гц (исходя из лазерного драйвера) и его гармоники (см Справочная код файла Скриншот 1).
- Преобразование, обратное преобразование Фурье данные обратно во временную область.
- Медиана-фильтр данные, используя окноразмер 1001 образцов (см Справочная код файла Скриншот 2).
- Найдите шаг изменения в резонансной длине волны, используя ступенчатый алгоритм нахождения Kerssemakers др. 15.
- Генерировать гистограммы амплитуды каждой стадии связывания.
- Рассчитать размер частиц с помощью уравнения. (1) (см Обсуждение).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Частица связывания события четко видно, как шаг, как изменения в резонансной длины волны microtoroid течением времени (рис 2А). Высоты этих шагов приведены в виде гистограммы на рис 2B. Цифры 2-4 показывают типичные следы от связывания экзосом (nanovesicles), 5 нм кремнезема бусы, и отдельные человеческие интерлейкина-2 молекулы, соответственно. Тот факт, что ступенчатые события масштабирования с размером частиц показывает, что этот метод был выполнен правильно. Это может быть проанализирована путем генерирования гистограммы высот ступенек (Фигура 2В) и сравнение максимальной высоты шага наблюдается теоретическим расчетам, как описано ниже.
Рисунок 1. Блок-схема системы тороидального зондирования. Свет от перестраиваемого диодного лазера расщепляется ш Ith части посланного через оптическое волокно, что пары света в тороида, а другая часть поступает непосредственно в один вход автоматического сбалансированный фотоприемника. Выход оптического волокна направляется во второй вход автоматического сбалансированы фотоприемника. Выход фотоприемника отправляется на контроллер с обратной связью, который модулирует свет лазера, чтобы найти значение резонансной длины волны microtoroid. Как частицы связываются с тороида, резонансная частота смены. Разница между длиной волны лазера и резонансной длины волны microtoroid отправляется пропорционально-интегрально-дифференциальный контроллер, который позволяет лазер в соответствии с длиной волны тороида, как быстро и как можно более гладко. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенное Версия этой фигуры.
p_upload / 53180 / 53180fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Резонанс изменение длины волны с течением времени, как 20 нм шарики связываться с поверхностью microtoroid. (А) Сдвиг резонансной длины волны microtoroid с течением времени, как 20 нм бисером связываться с поверхностью. (Б) Гистограмма высот (амплитуд) на каждом шаге волны резонансного события. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Резонанс изменения длины волны с течением времени, как отдельные экзосомы связываться с поверхностью microtoroid. Отдельные события связывания рассматриваются как дискретные изменения (шагов) в резонансной длины волны с течением времени."> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Резонансные изменение длины волны с течением времени, как 5 нм кремнезема бисера связываться с поверхностью microtoroid. Частицы прилипают к поверхности тороида с помощью пассивного адсорбции. Частиц связывающие события рассматриваются как дискретные шаги в резонансной длине волны тороида с течением времени. Десорбция частицы рассматривается как вниз шаг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Резонанс изменение с течением времени, как длина волны ИЛ-2 молекул связываться с поверхностью microtoroid. Макромолекулярных связывания событиярассматриваются как дискретные шаги в резонансной длине волны в течение времени. Эти шаги похожи на те, на рисунке 4, как два типа частиц имеют примерно одинаковый размер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как связывает частицы, резонансная длина волны (λ) тороида увеличивается. Если частица отвязывается, резонансная длина волны соответственно уменьшается (событие шаг вниз). Диаметр частиц (г) может быть определена с помощью гистограмм амплитуды каждого шага длин волн. Высота каждого шага волны изменяется в связи с колебаниями размера частицы и связанного из-за расположения на microtoroid где частица связывается. Максимальное изменение резонансной длине волны (высота ступени) возникает, когда частицы связываются в экваторе microtoroid где электрическое поле (Е 0, макс) является максимальным. Это максимальная высота шаг (Δλ) связан с диаметром частиц через уравнения. (1) 8, где а есть радиус частиц, D является диэлектрической постоянной на основе показателя преломления связанной частицы и окружающих его сред, V м представляет собой объем режим светодиодныет в microtoroid определяется путем моделирования конечных элементов 2, и Е 0 (Р С) представляет собой амплитуду электрического поля на экваторе частиц также определяется на конечные моделирования элементов:
Инверсия уравнения. (1) показывает, что сила сигнала (Δλ) весы с объемом частиц (а 3). Наш коэффициент диэлектрических определяется как:
где показатель преломления окружающих сред, и показатель преломления частицы. Теоретические оценки размера частиц на основе уравнения (1), а также дополнительные гистограмм и размера калРасчеты, которые представлены в 2, 16.
ЦВЕТОК могут быть изменены для более быстрого отслеживания за счет увеличения частоты, при которой частота блокировки контроллер с обратной связью отслеживает длину волны microtoroid. Процедура обработки данных может быть изменена с помощью скользящего среднего вместо медианного фильтра, и связывающие события могут быть восстановлены, однако медианный фильтр вызывает шаг ребра, чтобы быть лучше сохраняются. Ограничения этого метода включают в себя тот факт, длина волны сдвиг microtoroid на частицу связывания зависит от того, где на резонатор земель частиц. Таким образом, подтверждение связывание одной частицы зависит от генерации гистограммы числа дискретных связывающих событий. Если нет отдельных связывания событий не обнаружено увеличение концентрации соли в растворителе помогает.
Значение этого метода в отношении существующих методов является то, что нет этикетки не требуется допросить молекулу-мишень.Селективное связывание, однако, требует функционализации датчик с антителами. Другие преимущества включают в себя тот факт, что, поскольку microtoroid резонаторы имеют большие площади захвата по сравнению с высокой чувствительностью методов поверхностного плазмонного резонанса, события частиц связывания, более вероятно, чтобы произойти. Кроме того, из-за цветок не требует флуоресцентные метки, которые, возможно, photobleach, цветок способен длинных (> 10 сек) измерений с быстрой (в миллисекундах) временного разрешения.
Критические шаги в протоколе включают в себя согласование оптического волокна конус с microtoroid. После того, как тороид погружается в жидкость, слишком много движения волокна через жидкости может вызвать конус сломать, положив таким образом конец эксперимента. Цветок в ее нынешней формулировке поэтому непригодны для экспериментов по временной шкале часов. Кроме того, как только microtoroid был погружен в жидкость и частицы связываются, добротность (Q), безвозвратно падает на шкале времени часов и пик лocking в конечном итоге может стать нестабильной. В этой ситуации новое устройство не требуется. Потому что мы трепетать наши частоты лазера в очень небольшом диапазоне вокруг резонансного пика, цветок не одновременно сканировать по всей резонанса и, следовательно, не измерить изменения в добротности в режиме реального времени, как частицы связываются. Глядя на коэффициент качества до и после связывания всего лишь несколько частиц, мы не видим значительного ухудшения добротности. Мы ожидаем, что это потому, что оригинальные нетронутые тороиды имеют относительно низкую добротность (Q загружалась в воде ~ 1x10 5 -5x10 6).
Отметим, что лазерно-индуцированный шум колебание вычитается с использованием автоматического сбалансированный фотоприемник. Мы минимуму колебания оптического волокна с тороида путем размещения волокна в непосредственном контакте с microtoroid. Кроме того, если параметры PID не установлены правильно, появится колебания, то есть, система не будет быстро и accuratЭлай сдвиги длин волн трек. Циглера-Николса правила настройки могут быть использованы, чтобы правильно установить настройки ПИД 14. Следуя процедурам, описанным здесь, должно быть возможно обнаружить и размер наночастиц в диапазоне от сотен нанометров до нескольких нанометров, в том числе отдельных биологических молекул.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tunable diode laser | Newport | TLB-6300 | |
| Laser controller | Newport | TLB-6300-LN | |
| Frequency locking feedback controller | Toptica Photonics | Digilock 110 | |
| Auto-balanced photoreceiver | Newport | Model 2007 | |
| In-line polarization controller | General Photonics | PLC-003-S-90 | |
| 24-bit data acquisition card | National Instruments | NI-PCI-4461 | |
| Recombinant human interleukin-2 | Pierce Biotechnology | R201520 | |
| 20 nm polystyrene beads | Thermo Scientific | 3020A | |
| NanoCube XYZ Piezo Stage | Physik Instrumente | P-611.3 | |
| Optical table | Newport | VH3660W-OPT | |
| Objective lens for imaging column | Navitar Machine Vision | 1-60228 | |
| Imaging column (adaptor tube) | Navitar Machine Vision | 1-60228 | |
| High-Res CCD camera for imaging column | Edmund Industrial Optics | NT39244 |
References
- Lu, T., et al. High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).
- Su, J., Goldberg, A. F. G., Stoltz, B. Label-free detection of single nanoparticles and biological molecules using microtoroid optical resonators. Light: Science and Applications. , (2016).
- Knight, A. Single molecule biology. , Elsevier/Academic. (2009).
- Jonsson, U., et al. Real-time biospecific interaction analysis using surface plasmon resonance and a sensor chip technology. BioTechniques. 11, 620-627 (1991).
- Vollmer, F., Arnold, S. Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules. Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).
- Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip. Nature. 421, 925-928 (2003).
- Vahala, K. J.
- Arnold, S., Khoshsima, M., Teraoka, I., Holler, S., Vollmer, F. Shift of whispering-gallery modes in microspheres by protein adsorption. Opt. Lett. 28, 272-274 (2003).
- Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. Single virus detection from the reactive shift of a whispering-gallery mode. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20701-20704 (2008).
- He, L., Ozdemir, S. K., Zhu, J., Kim, W., Yang, L. Detecting single viruses and nanoparticles using whispering gallery microlasers. Nat Nano. 6, 428-432 (2011).
- Dantham, V. R., et al. Label-free detection of single protein using a nanoplasmonic-photonic hybrid microcavity. Nano Lett. 13, 3347-3351 (2013).
- Baaske, M. D., Foreman, M. R., Vollmer, F. Single-molecule nucleic acid interactions monitored on a label-free microcavity biosensor platform. Nat Nanotechnol. 9, 933-939 (2014).
- Su, J. Label-Free Single Exosome Detection Using Frequency-Locked Microtoroid Optical Resonators. ACS Photonics. (9), 1241-1245 (2015).
- Åström, K. J., Murray, R. M. Feedback systems : an introduction for scientists and engineers. , Princeton University Press. (2008).
- Kerssemakers, J. W., et al. Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution. Nature. 442, 709-712 (2006).
- Su, T. -T. J. Label-free detection of single biological molecules using microtoroid optical resonators. , California Institute of Technology. (2014).
