Introduction
50年間に及ぶ研究の豊かな歴史は、血管組織の機械的特性を定量化する上で注目されています。これらの研究は、血管内デバイスの有効性/互換性を評価するための基礎を提供する、私たちはより良い血管の生理学的および病理学的行動の両方を理解することを可能にし、設計された血管の設計および製造における援助は1-6を構築します。軟組織と機械的特性の構成的モデリングの機械的応答の正確な測定は、本質的に、ほとんどの組織の種類によって示さ機械的異質、異方性、および非線形性のために挑戦しています。また、実験的な測定は、多くの場合、地元の機械的試験の過程でサンプルグリップ界面に導入された複雑さ（ すなわち、曲げ、摩擦、応力集中、涙）と組織が 生きている動物から切除された後の機械的特性の必然的な移行によって混乱しています。 </ P>
一軸引張試験は、固体材料で作られた試料上で実行することができる最も簡単な機械的試験の中で、多くの場合、血管組織の機械的応答を評価するために使用されます。これらの実験の結果は、両方のネイティブおよび改変された組織源のために有用な予備的な情報を提供し、血管壁7-11の機械的挙動に特定の治療、疾患状態、または薬理学的化合物の効果を比較するために使用することができます。
軟組織の一軸性の機械的試験は、典型的には、最も一般的には犬の骨または7,8,12-14リング状であり、比較的均一な幾何学的形状、を有するサンプルに対して行われます。しかし、これらの理想化されたジオメトリからの大きな逸脱が原因で検査システム内の組織の解剖、分離、およびクランプに関連する課題に発生する可能性があります。幾何学における任意の不均一性は、最終的には、不均一応力とひずみを生じさせますサンプルは実際のサンプル形状だけでなく、（グリップに対して）サンプルサイズと材料9,15,16の機械的性質に依存する不均一性の程度と、一軸延伸に供されるフィールド。磁場不均一性が重要である場合には、相対的なグリップ位置に基づいて、試料の歪みの計算は不正確と機械的挙動を評価するため、したがって不十分な基礎です。
ビデオ分析システムは広く、多くの場合、試料表面17,18に印加される高コントラスト色素マーカーを使用して、軟組織のひずみを測定するために使用されてきました。デジタル画像相関、変形前後の試験片の表面にグレーレベル強度値を比較することにより、全視野面の歪みを測定する光学計量技術は、ビデオと一緒に使用されてきた軟組織19-21の分析。デジタル画像相関のいくつかの利点がinterferometrに比べて存在します測定のために使用することができるICの方法。まず、非接触測定技術としては、測定システムは、試料に影響を及ぼしている方法による材料特性を変更するの交絡の影響を最小限に抑えます。第二に、それはそれほど厳格な測定環境を必要とし、他の方法よりも感度、解像度のより広い範囲を有します。第三に、全視野を捕捉する能力に恵まれて、この技術は、平均とローカル機械的応答の両方を特徴付けることができます。この方法の詳細については、読者は、Suttonの22本を参照することをお勧めします。
試料表面のひずみ場を得るために、2次元デジタル画像相関法（2D-DIC）を使用することができます。要するに、標本の画像は無負荷、様々なロードされた状態で撮影されています。最初の画像は、後続の計算のためのメッシュを形成する部分集合（M×M画素）と呼ばれる小さな正方形に分割され、2Dの歪み場。変形した試料中の各四角形の位置は、画像マッチングアルゴリズムを用いて得られます。各正方形の動きは次いで多項式フィッティングまたは有限要素補間を含む種々の方法を介して、変形勾配および株を導出するために使用することができ、変位場を得、画像ごとの画像、追跡されます。現在の原稿では、一軸引張試験および2D-DICの統合により、ネイティブの血管組織の表面歪み場の評価のための詳細な方法論を提供しています。
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Protocol
注：以下の手順は、コロンビアのサウスカロライナ大学、サウスカロライナ州での制度的動物実験委員会によって承認されたプロトコルの一部として行われました。
1.組織の取得と解剖
- 組織切開する前に、すべての手術器具を滅菌します。オートクレーブ手術用はさみ、ファイン標準の鉗子と同様に15分間15 PSIの圧力及び121℃の温度下での外科手術用ブレード。
- 地元の食肉処理場から無傷の大動脈で新鮮なブタの一組（7ヶ月のランドレースの男性60〜70 kg）の腎臓を取得します。バック氷冷1％のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液中で実験室に輸送組織。
- すぐに到着時に、手術用ハサミとピンセットを用いて周囲の組織から腹部大動脈を隔離します。
- PBS（pH7.2）で満たした50ミリリットル注射器を用いて容器を3回洗浄します。ハサミやピンセットを使用して、POSSと同じくらい血管周囲組織を取り除きますサンプルの完全性を損なうことなくible。
- 垂直容器の中央部分に鋭利なカミソリの刃を配置し、それが容器の長手方向軸に対して垂直であることを確認してください。かみそりの刃を持つ3つの連続した円周方向のカットを適用することにより、約20mmの幅の2つのリングのサンプルをそれぞれ作成します。
- 垂直ブレードが、半径方向に配向されるように、一つの環試料に鋭利なカミソリの刃を配置します。一軸機械的試験用の短冊状のサンプルになりラジアルカットを得るために、急性の力を適用します。 100ミリメートルのガラスペトリ皿にサンプルを置き、表面斑点のアプリケーションまで、PBS中に沈めます。第二のリングサンプルについて繰り返します。
表面スペックルパターンの2作成
- 圧力弁にエアブラシを接続します。
- ノズル径は60-100ミクロン（適切な範囲のスペックルを得るためにエアブラシのノズル径を調節する必要があります）予備試験から決定します。
- エアブラシの重力フィーダーに黒の組織マーキング染料の約2ミリリットルを注ぎます。
- 約0.5メートル離れたサンプルからエアブラシを置きます。
- ペトリ皿からサンプルを削除します。 100 PSIの噴霧圧力の下で約5秒間のサンプルの内膜表面上の組織マーキング染料をスプレーしてください。スペックルパターンは、均一試料表面を覆っていることを確認するために3回繰り返します。
実験3.パフォーマンス
- 組織接着剤を使用したプラスチック製のストリップ（幅1cm×1センチ長さ×0.5センチメートル厚さ）にサンプルの両端を接続します。組織まな板の上にサンプルを置きます。それが平らになるようにサンプルを置き、デジタルノギスを使用して、その大きさを測定します。
- 機械的試験のためのシステム制御を開始します。システムでは、「設定」タブにあるタスクバーの「波形」を選択し、ホーム画面を制御します。
- 広告-4ミリメートル（システム内の指定された初期位置に対する4ミリメートル拡張子）への機械的試験機の上部のグリップの位置だけ。静かに機械的試験機の上部のグリップに（3.1の試料に取り付けられている）つのプラスチック片を固定し、試料を自由にハングアップすることができます。サンプルおよび上部グリップの間の距離が2mm未満であることを保証するために、デジタルキャリパーを使用します。
- サンプルの自由端は、拡張子なしで確保できるように、手動で下側グリップの位置を調整します。静かに機械的試験機の下側グリップへの試料の自由端に取り付けられたプラスチック片を固定します。
- サンプルと下側グリップの間の距離が2mm未満であることを保証するために、デジタルキャリパーを使用します。システム負荷セルをゼロ。サンプルの長さを測定し、グローバル周株の計算のための基準長としてこれを使用しています。
- 機械的な試験プロトコルを入力します。トンで使用されるプロトコル彼のデモは0.01ミリメートル/秒の変位速度で18％のサンプルの長さを延長4一軸変位サイクルを必要とします。
- 断続的に、それは水和ままであることを保証するために、残りの試験プロトコルを通じてサンプルにPBSを噴霧。
- ロードフレームから1.5メートルに位置している三脚にカメラ（5メガピクセルのカメラ、100ミリメートルレンズ、3.49ミクロンのピクセルサイズ）をマウントします。カメラと試料表面が深さの利用可能な最低の場にカメラを設定し、視野全体にフォーカスがあるように、その配置を操作することにより、垂直であることを確認します。
- 画像キャプチャソフトウェアを開きます。
- オプション "を選択システム」の「PGR-2」を選択します。
- 分析しようとする画像を保存するプロジェクトパスを選択します。
- 「タイムスクエア」アイコンをクリックして、5秒として取得間隔を指定します。
- サンプルの明確なビューを取得するように露出、開口数、レンズのフォーカスを調整。
- サンプルの十分な照明を提供するために、LEDの位置を調整します。
- 試料表面の画像を取得する画像キャプチャソフトで「スタート」アイコンをクリックします。
- 画像解析ソフトウェアを開きます。
- 得られた画像をインポートします。個々のスペックルを拡大し、その後、この個々のスペックル内の画素数をカウントします。
注意：代表的な黒スペックルを識別します。同様の高い値を有して、スペックルの両側の画素間の直線距離としてスペックルサイズを定義します。許容可能なスペックルサイズに関しては、典型的なスペックルの幅を横切る画素数が3ピクセル以上でなければなりません。 、可能な限り測定の空間分解能を向上させるために、ほとんどのスペックルは、スペックルの幅を横切っていない以上5-7ピクセルを持っている必要があります。したがって、この場合の典型的なスペックルは、直線寸法で最大で最も小さく、23ミクロンで10ミクロンの間の範囲です。適切なサブセットを決定するために、サイズ、典型的なサブセットは、その幅方向の少なくとも3白と黒の3スペックルを持っている必要があります。典型的なスペックルは、直線寸法の5ピクセルである場合、各31x31サブセットは、直線寸法で、少なくとも105ミクロンであろう。サブセットの中心間の間隔は、直線寸法の少なくとも1/6でなければなりません。このように、31x31のサブセットサイズのため、距離は直線距離で18ミクロンを表し、5ピクセルです。 - スペックルパターンの品質を確認した後、同時にテストを開始するには、画像キャプチャソフトウェアでは、システム内の「ファイル名を指定して実行」アイコンと「スタート」アイコンをクリックします。
- カメラと画像キャプチャソフトウェアを使用して、テスト全体で一連の画像をキャプチャします。
実験後の4のクリーンアップ手順
- バイオハザードバッグに捨てたサンプルを置き、袋を閉じます。適切な処分のためのサウスカロライナ大学の環境衛生・安全（EHS）の部門を呼び出します。
- リン酸を準備蒸留水に洗剤消毒剤の1:64希釈率との自由消毒液。 20分間この溶液中に手術器具を浸します。
- 蒸留水で完全に4.2で説明した項目をすすぎます。ペーパータオルを使用してツールを乾燥した後、70％エタノール溶液でそれらをスプレー。もう一度ペーパータオルを使用して手術器具を乾燥および外科ツールボックスにそれらを戻します。
ローカルひずみ場を測定するために5.画像解析
- 画像解析ソフトウェアを開きます。
- 分析する必要があるすべての画像を選択し、「スペックル画像」タブをクリックします。
- 長方形ツールをクリックして、第1の画像内の関心領域を選択します。
- サブセットのサイズは41×41ピクセル、ステップサイズ5ピクセルを入力してください。
- ソフトウェアで分析]タブをクリックして起動し、最適化された8-トラップとして補間を選択します。ガウスとしてゼロ正規化差の二乗とサブセットの重みオプションとしての基準を選択します。
- ソフトウェアのデフォルトとしてのしきい値オプションを設定します。
- スタート分析]タブで後処理サブタブをクリックします。オプションの歪み計算をクリックして、ソフトウェアのデフォルトにフィルタのフィルタのサイズと種類を残します。テンソル型ラグランジュを選択します。
- データタブを選択し、表面の歪場を可視化するために任意の解析した画像を選択します。
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Representative Results
血管組織の傾斜一軸延伸試験から取得した機械的データは、与えられた変位速度で適用されるサンプルの変位との関係負荷対で構成されています。本研究では、一軸機械的試験と併せて、2D-DICは、種々の変形状態に直交する方向における試料の表面ひずみ場を測定するために使用されます。血管組織の粘弾性性質は、機械的なプレコンディショニングの前に荷重 - 変位曲線におけるヒステリシスの注目すべき程度によって明らかにされます。ヒステリシスは徐々に（ 図1）を減少される、機械的試験の再現性を促進し、弾性力学的応答を得るためには、組織は、複数のロード・アンロードサイクルを経て予め調整されます。極めて慎重に試料調製及び実装にもかかわらず、2D-DICの測定は、得られた内膜表面のひずみ場は、両方で非常に不均一であることを実証します円周方向及び長手方向。予想されたように、地元の周ひずみの値が適用されたサンプルの変位に伴って増加します。円周方向ひずみパターンの不均一性は、一般的にローカル株（ 図2）のグリップの影響を反映して、サンプル・グリップ界面付近と比較して、試料の中央付近の低い値が得られます。試料を徐々に拡張されるように、長手方向に、試料内膜表面上の得られた不均一な圧縮歪みが大きくなり、得られた歪み場は、周方向（ 図3）と比較して不均質のより顕著度を示します。直交方向における表面歪場の変動（CV）の係数が選択実験状態における電界の不均一性の程度を反映するように計算された、単調増加サンプル延長（ 表1）に減少することが見出されました。
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一軸引張試験のための血管組織サンプルの図1。実験前処理。長方形のサンプルは、再現可能な弾性応答を得るために3つのロード・アンロードサイクルで前処理されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
興味のサンプル領域内に 2 周ひずみ場を 図 。 （A）斑点サンプル内膜表面の代表例と関心の識別されたエリア。増加で利息の識別された領域内（B）ローカル周歪みεYY（％）適用されたグローバル周株（左から右へ、1.6％から9％〜18％に増加）のレベル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
興味のサンプル領域内の 図3. 縦ひずみ場。（A）斑点サンプル内膜表面の代表例と関心の識別されたエリア。 （左から右への1.6％から9％から18％に増加し、）適用されるグローバル周ひずみの増加レベルでの関心の識別された領域内（B）ローカル縦歪みεXX（％）。 ご覧になるにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。
表歪み場の変化の1係数 。両方の円周方向（εのYY）のサンプル内膜表面の歪み場の変動（CV）と縦（εxxの ）適用グローバル周ひずみの選択レベルでの方向の係数。
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Discussion
以前の研究は、試料株18,20,21,23,24を評価するために 、色素追跡ビデオ方法の広い範囲を使用していますが、私たちの現在の目的は、評価のための2D-DICと結合一軸引張試験に総合的な方法論を提供することです表面は、血管組織試料に菌株。サンプルは一軸負荷を受けるように、高解像度のカメラと、社内の画像解析ソフトウェアを用いて、歪み場は、所定の表面領域内で測定することができます。血管組織の機械的試験に特に関連する、提示技術は、直接順に構成材料の特性の同定を可能に平坦な二軸方向試験において表面歪を評価するために適合させることができます。
デジタル画像相関分析を容易にするために、スペックルパターンは、試料表面に塗布されます。斑点のために利用塗料は容易にほとんどの軟部組織表面に付着する組織マーキング色素です。達成するためにコントラストの良い品質とスペックルパターン、60-100ミクロンの最適なスペックルサイズの適切な密度及び0.5メートルの距離は、エアブラシ噴霧ノズル径とサンプルとエアブラシの間の距離を調整することによって実現されます。使用スペックルサイズは、得られた測定値23,25の分解能に直接関係しています。各スペックルは、許容可能な画像相関を得るために少なくとも3-5の画素でサンプリングされなければなりません。ビューの22ミリメートル×18ミリメートルフィールドと利用スペックルサイズを考えると、提示された実験の分解能は9ミクロン/ピクセルです。
血管組織26,27のための準静的変形平衡状態の系列を得るために、0.01ミリメートル/秒の負荷速度は、機械的試験のために使用されます。カメラと高忠実度のロードセルは、両方の振動に非常に敏感であるため、実験中に最小限の動きがあるはずです。小、剛体カメラ/標本の動きが発生することがあります場合でもあり、w病気2D-DICに基づく測定を混乱させる。同様に、サンプルの変形は、このように、それは、PBSは、2D-DICの精度を促進するためのテストを介して印加されることが重要である、組織の脱水のために発生する可能性があります。
2D-DICは、要求仕様は、サブセットのサイズと画像マッチングアルゴリズム22で使用されるステップサイズを含みます。ごくわずかなバイアスと、正確な結果を得るためには、少なくとも3つの黒と白の3スペックルは、少なくとも3-5ピクセルによってサンプリング各スペックルと、各サブセットで存在すべきです。出力内の各データポイントは、情報は、実験の空間分解能とみなさサブセットサイズ（41x41ピクセル）に対応するボックスにわたって平均提供します。ステップサイズの点で2つのデータ点の間の距離は、この実験では5画素です。スペックルの変位/表面歪の測定の精度を最大にするために、8タップスプライン補間法は、正確なサブピクセル強度値を得るために適用されます。 8タップのメタODは、4タップまたは6タップ補間フィルタのいずれかを用いて得られた結果と比較した場合、菌株を得るためにいくらかより高い精度を有します。それは、照明におけるスケールの変化の影響を受けないので、相関基準「正規化差の二乗は「マッチングのために選択された（例えば、変形したサブセットが基準より30％明るいとき）。この選択は、ソフトウェアのデフォルトの選択であり、通常、柔軟性の最適な組み合わせを提供し、28の結果。部分集合内の画素が照合処理に重み付けされる方法を制御するサブセットの重み付けは、ガウス分布として選択されます。均一な重みで、サブセット内の各画素を均等に考えられています。ガウス重みは、空間分解能と変位分解能の最適な組み合わせを提供します。
表面の歪み場の変動係数は、社内画像分析ソフトウェアを用いて計算され、歪みの不均一性の程度を定量化するために使用しました。 COEF両方の円周方向と縦方向の歪場の変動ficientは、以前に他の血管の組織タイプ（未発表の結果）に類似した機械的試験で観察されている増加グローバル周株で減少しました。この永続的な傾向に基づいて、表面歪み場が十分にグローバルとローカルの測定値が収束するような拡張機能のいくつかの重要度の上に均質化することができることを期待するのが妥当です。しかし、それによって、構成材料の特性を正確に同定するための局所的なひずみ測定の使用をサポートし、この臨界値は、組織とサンプル固有のものである可能性があります。
いくつかの制限が当社の提示方法論と結果の適切な解釈のために考慮されなければなりません。私たちは、グローバル周ひずみの適度な範囲を規定するので、両方の円周方向と縦方向の私たちの実現局所ひずみの大きさが有意に低かったです 生体内で見られた値よりも。また、我々は、単一のサンプルの方向の下で一軸機械的応答を評価するため、血管組織29,30の構成材料の特性を識別するための十分なデータが生成されます。しかし、私たちの目的は、ブタ大動脈の総合的な機械的な分析を行うことではなく、軟組織の一軸機械試験にカップルの2D-DICに実験プロトコルを実証することはありません。本明細書に提示される技術は、容易に二軸機械的試験、したがって血管組織31-33の構成機械的特性の定量化に拡張することができます。 2D-DICメソッドは、試料表面に対応する平面ひずみ場をキャプチャします。試料は、平面から変形する、または試料が非平面形状である場合（例えば、血管）、立体視画像と3D-DIC技術は、総合的な歪み測定23,25に適用することができる時。
本原稿は、一軸引張試験およびデジタル画像相関を統合するための方法に関する詳細な情報を提供する要約NTは ">天然の血管組織の機械的応答を特徴づけるために、この研究で提示された方法は、容易に他のネイティブの機械的な特徴付けのために適合させることができますそして、軟組織だけでなく、ソフトヒドロゲル/高分子材料を設計し、試料表面のひずみ場は機械的試験中に有意な異質性を示す場合に特に便利です。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、利害の潜在的な競合がありません。
Acknowledgments
ソフトウェアおよび技術サポートは、相関ソリューションズ株式会社（www.correlatedsolutions.com）の礼儀でした。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Uniaxial tensile mechanical tester | Enduratec | 3230 AT/HR | |
| Blue tissue marking dye | http://www.ebay.com/itm/Tissue-Marking-Dye-in-Bottles-2oz-Bottle-1-ea-/201193551510?pt=LH_DefaultDomain_0&hash=item2ed811f696 | ||
| Sprayer | Anest-iwata | CM-B | Custom Micron B |
| Camera | Point Grey | GS2-GE-50S5M-C | |
| Lens | Tokina | AT-X M100 | |
| Vascular tissue | Caughman Inc | ||
| 0.9% Sodium Chloride Injection PBS | BAXTER HEALTHCARE CORP. | ||
| Vic_snap | Correlated Solutions | ||
| Vic_2D | Correlated Solutions | ||
| Wintest 4.1 | Bose ElectroForce | ||
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| Disinfectant | Fisher Scientific | 04-355-13 | Decon BDD Bacdown Detergent Disinfectant |
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