Abstract
Мониторинг движения членистоногих часто требуется, чтобы лучше понять динамику популяции, связанные, разгон модели, предпочтения растений-хозяев, и другие экологические взаимодействия. Членистоногие, как правило, отслеживаются в природе помечая их с уникальным знаком, а затем повторно собирать их в пространстве и времени, чтобы определить их возможности расселения. В дополнение к реальным физическим тегов, таких как цветной пыли или краски, различные виды белков оказались очень эффективными для маркировки членистоногих экологических исследований. Белки могут быть введены внутри и / или снаружи. Белки могут быть обнаружены на пойманных членистоногих с белком конкретных иммуноферментного анализа (ELISA). Здесь мы опишем протоколов внешне и внутренне пометки членистоногих с белком. Два простых экспериментальные примеры продемонстрированы: (1) внутренний знак белок представлен насекомого путем предоставления содержанием белка, обогащенного и (2) внешний знак белка местноpplied к насекомым с использованием медицинской распылитель. Мы тогда связать шаг за шагом руководство бутерброда и косвенных методов ELISA, используемых для обнаружения белка знаки на насекомых. В этой демонстрации, различные аспекты приобретения и обнаружения белковых маркеров на членистоногих для марки-релиз-повторной поимки, марки-захвата и типы самостоятельной знак захвата исследований обсуждаются, наряду с различными способами, что процедура immunomarking Был адаптированы к широкий спектр задач исследования.
Introduction
Отслеживание перемещений членистоногих вредителей, естественных врагов (паразитов и хищников) и опылителей в природе имеет важное значение для лучшего понимания, как улучшить экосистемные услуги. Ключевым компонентом для большинства типов разгона исследований, имеющих надежный способ, чтобы отметить членистоногих (ы) интересов. Разнообразие материалов (например, краски, красители, цветные пыли, теги, редкие элементы, белки) были использованы, чтобы отметить членистоногих, чтобы оценить их динамику народонаселения, разгон возможности, кормление поведения и другие экологические взаимодействия 1,2.
Адекватность используемого маркера для любого заданного рассеивания исследований будет зависеть от типа исследования, проводимого. Есть три основных категоризация для маркировки членистоногих: (1) знак-релиз-повторной поимке (МРТ), (2) отметка-захвата, и (3) самостоятельно знак-захвата. Для разметки релиз-повторной поимке исследования, следователь, как правило, отмечает членистоногих вместе в laboratoры и освобождает их в центральной точке поля. Членистоногих затем отбили на различных пространственных и временных интервалов с помощью различных устройств сбора (например, чистый развертки, вакуумные, липкая ловушка) 3,4,5. В повторно пойманной особи затем проверяют на конкретный знак, чтобы отличить освобожден от родных лиц. Для исследования знака захвата, следователь, как правило, применяется знак непосредственно в поле, используя распыления (например, рюкзак распылителя, стрелы и сопла распылителя). Лучшие маркеры для исследования марка захвата недороги и легко наносится на среду обитания членистоногих в. Для исследования самостоятельно знак захвата, следователь, как правило, применяется знаки на членистоногих приманки 6,7 или гнездо входа 8. В свою очередь, членистоногие знаменует собой внутренне пожирая заметное приманку или внешне "чистки" против отметки, когда он выходит из гнезда.
Как упоминалось выше, многие виды маркеров были намиред пометить различные членистоногих. Тем не менее, очень немногие являются полезными для всех трех этих разгона исследовательских категорий. Развитие процедуры белок immunomarking был крупный прорыв для маркировки насекомых. Immunomarking ставит метку белка на членистоногих внутри или снаружи, который, в свою очередь, обнаруживает анти-белка специфического иммуноферментного анализа (ИФА). Первые маркеры, такие белковые были использованы кроличьим иммуноглобулином (IgG) и куриный IgG / IgY 9,10. Они оказались очень эффективными знаки для МРТ и исследования самостоятельно знак захвата (см обсуждения). К сожалению, IgG / IgY белки являются дорогостоящими, и поэтому не подходит для исследований знак захвата и большинство видов исследований самостоятельно знак захвата. Впоследствии, ИФА обнаружения белка второго поколения были разработаны для белков, содержащихся в куриных яиц белых (альбумин), коровье молоко (казеин) и соевого молока (ингибитор трипсина белок). Каждый анализ обладает высокой чувствительностью, конкретными, и, самоеважно, использует белки, которые значительно дешевле, чем белков IgG / Igy 11. Эти белки оказались эффективными для МРТ, марки-захвата, и исследования самостоятельно знак захвата (см обсуждения).
В этой статье мы опишем, и продемонстрировать, как проводить исследования белков Все хранения лабораторией. Такие исследования являются первым этапом исследований, необходимых для любого типа поля рассеивания исследования. В частности, важно, что следователи знают, как долго знак будут сохранены на целевых видов членистоногих, до начала разгона на поле исследований. Здесь мы опишем и продемонстрируем, как внутренне и внешне отметить насекомых для МРТ, Марк-захват, и само знак-захвата исследования типа поля. Затем мы продемонстрируем, как определить наличие отметок с косвенными и сэндвич-ИФА.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Внутренний Марк, хранения, и порядок обнаружения
- Внутренняя процедура маркировки
- Соберите насекомых интересов (п ≈ 100 человек) из лаборатории колонии выращенных на искусственном диеты или с поля и делятся на две чистые контейнеры выращивания.
- Поставьте обычный 20 мл диеты пакет (без опознавательных знаков негативное отношение управления) в одном из контейнеров. Дополнение второй 20 мл искусственного диеты пакет с 1,0 мл 1,0 мг / мл куриного IgG / решения IgY, тщательно перемешать и поместить его в другую емкость.
Примечание: Если насекомое интерес не имеют искусственный рацион, знак может быть помещен на или в какой-либо диеты, как правило, они выдержаны по (например, зеленая фасоль, яйца, моли вода, сахар, мед). - Разрешить насекомые возобновить свою деятельность подачи в течение 24 часов.
- Процедура удержания внутреннего знак
- Удалить диета пакеты из каждого контейнера и поставить насекомых жIth другого источника пищи, чтобы поддерживать их в течение продолжительности эксперимента (например, зеленые бобы).
- Сбор когорту (п = 20) ежедневно насекомых (или в любой желаемый промежуток времени) от каждой обработки и немедленно заморозить при -20 ° С.
- Сэндвич процедура ИФА
- Добавить 50 мкл кроличьего анти-куриный IgY первичного антитела, разбавленного 1: 500 в трис-солевой буферный раствор (TBS) в каждую лунку чистого ELISA микропланшет и инкубировать в течение как минимум 1 часа при комнатной температуре (примечание: микропланшетов также можно инкубировать O / N при 4 ° С).
- Откажитесь от антитела из пластины и блокировать каждую лунку по 300 мкл 1,0% обезжиренного сухого молока решения для 30 мин.
- В ожидании предыдущих этапов инкубации поместите замороженные насекомых индивидуально в 1,6 мл микропробирок 1,0 мл TBS.
- Измельчите каждый насекомое с чистой пестиком до полного гомогенизировали и добавить 100 мкл каждого образца в отдельной лунке ELISAпластина. Разрешить образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Добавить 100 мкл отрицательного (только ТБС) и положительных (яичные белки в TBS) управления в скважинах в первом столбце каждой ELISA пластины. Кроме того, добавить 100 мкл отрицательного контроля насекомых (без опознавательных знаков) насекомых к 8 скважин в последнем столбце каждой пластины (рис 1). Разрешить контрольные образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Обратите внимание, что шаблон приводится на рис 1 это шаблон мы используем для наших стандартных анализов. Размещение образцов в скважинах на усмотрение исследователя.
- Промыть каждую лунку три раза забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) -tween, а затем добавить 50 мкл кроличьего антитела против IgG-куриного / IgY, конъюгированного с пероксидазой хрена, разбавленного 1: 10000 в 1% растворе молока и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Промыть каждую лунку три раза PBS-Tween и добавить 50 мкл тетраметилбензидина (ТМВ) подложки в каждую лунку.
- Через 10 мин, читать скважинс микропланшетов спектрофотометра, установленного на длине волны 650 нм.
Рисунок 1. схема, показывающая стандартизированные обозначения, используемые для также типичного 96-луночного ELISA микропланшет. Каждая пластина содержит 7 скважин, посвященные Трис-солевом буфере отрицательных контролей (TBS), хорошо выделенные для положительного контроля белка (поз Ctrl), 80 отдельные скважины, посвященные пойманных насекомых (образец 1 ... 80), и 8 лунок, посвященных немаркированных (негативных) управления насекомых (отр Ctrl 1 ... 8). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
2. Внешний Марк, хранения, и порядок обнаружения
- Внешний маркировка процедура
- Соберите насекомых интересов (п ≈ 100физические лица) из лаборатории колонии или из области и месте в двух 1.0 л пластиковые контейнеры с отверстием диаметром 2,5 см ударил из стороны каждого контейнера.
- Спрей насекомых в первом контейнере с 1,0 мл ЦТ 2 O (отрицательный контроль) лечения с использованием медицинского распылителя. Спрей насекомых во втором контейнере с 1,0 мл 5,0% раствора яичного белка куриного использованием медицинской распылитель.
- Прикрепите шланг распылителя к стандартной розетке лаборатория воздуха, а затем вставьте рот распылитель в 2,5 см отверстие контейнера. Затем поверните на выходе воздуха постепенно, пока распылитель не производит пар.
- Продолжить распыления (маркировка), пока раствор яичных белков не было обойтись (прибл. 2-5 мин).
- Удалить распылитель и поместите пробку в отверстие пластикового контейнера. Разрешить насекомые стоять при комнатной температуре в пока раствор не полностью высох.
- Процедура удержания внешнего знак
- Поместите каждую лечение сухих насекомых в отдельный чистый контейнер выращивания, чтобы избежать дальнейшего воздействия знака.
- Добавить еду и воду в чистых емкостях для поддержания насекомых на протяжении исследования.
- Сбор когорту (п = 20) насекомых из каждой обработки ежедневно и немедленно заморозить при -20 ° С.
- Косвенное процедура ИФА
- Поместите замороженные насекомых индивидуально в 1,6 мл микропробирок и добавить 1,0 мл TBS.
- Замочите образцы в течение 1 часа на орбитальном шейкере набор на 120 оборотов в минуту.
- Добавить отрицательные и положительные элементы управления, как описано в шаге 1.3.5.
- После замачивания, пипетки 100 мкл аликвоты из каждой пробы в одну из 80 назначенных образцов скважин на новой 96-луночный ELISA пластины, как показано на рисунке 1 Разрешить образцы инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре (примечание:. Микропланшеты могут быть также инкубировали O / N при 4 ° С).
- Вымойте лунки три разаPBS-Tween и затем добавить 300 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина (PBS-BSA) в каждую лунку.
- Через 30 мин при комнатной температуре дважды промывали PBS-Tween.
- Добавить 50 мкл кроличьего анти-яичного альбумина первичного антитела, разбавленного 1: 8000 в PBS-BSA-Silwet (0,05%) к каждой лунке и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Промыть каждую лунку три раза PBS-Tween, а затем добавить 50 мкл козьего антитела против кроличьего IgG-конъюгированного с пероксидазой хрена, разбавленного 1: 2000 в PBS-BSA-Silwet (0,05%) в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Промыть каждую лунку три раза PBS-Tween и добавить 50 мкл субстрата ТМВ в каждую лунку.
- Через 10 мин чтения лунки микропланшетов спектрофотометра, установленного на длине волны 650 нм.
Анализ данных 3.
- Рассчитать среднее значение абсорбции 8 негативных насекомых управления на каждом ELISA пластины, а затем рассчитать стандартное отклонение на основе объединенных отрицательных контролей сюдам все ELISA пластины данного исследования 12.
- Добавить в шесть раз объединенных стандартное отклонение к среднему, полученного для каждого ELISA пластины чтобы получить положительный ELISA пороговое значение. Любой образец насекомых получая абсорбцию равную или большую, чем это значение, считается положительным на наличие отметки белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Внутренняя маркировка:
Результаты теста внутренней удерживания знак, показаны на рис 2А. Рассчитанная ИФА критический порог значение было 0,054. В целом (все четыре даты образец в сочетании), насекомые, обработанные без белка дали последовательно низкие значения ELISA (X = 0,038 ± 0,002, N = 80). С другой стороны, все насекомые подается белок, обогащенный диеты дали последовательно сильные значения ELISA (X = 0,475 ± 0,221, N = 80).
Внешний маркировка:
Результаты внешнего испытания удерживания знак, показаны на рис 2B. Рассчитанная ИФА критический порог значение было 0,082. В целом, насекомые местно отмечены только с водой, дали последовательно низкий ELIЗначения SA (X = 0,048 ± 0,007, N = 80). С другой стороны, все насекомые местно со значком раствора яичные белки дали последовательно сильные значения ELISA (X = 0,746 ± 0,232, N = 80).
Рисунок 2. Среднее (± SD) ИФА значения оптической плотности (А) насекомых, отмеченных внутри с курицей IgY и (б) насекомых, отмеченных внешне с курицей яичные белки (альбумин). Черные полосы средних значений ± SD ИФА оптической плотности, полученных в результате немаркированных насекомых. Насекомое размер выборки для каждой ежедневной обработки белка 20 человек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Порядок immunomarking членистоногих белок был впервые описан почти четверть века назад 9. С тех пор, эта процедура была приспособлена для изучения расселения модели широкого спектра членистоногих, использующих и внутренне и внешне управляемые IgG / IgYs. Эти белки оказались стойких маркеров для широкого спектра видов насекомых проверенных сих пор. Тем не менее, как упоминалось выше, главное ограничение на использование IgG / IgYs том, что они очень дороги. Следовательно, IgG / IgYs полезны только для МРТ и само маркировка исследований типа, где крупные партии насекомых могут быть отмечены в небольшом пространстве или знаки могут быть включены в рацион или приманки. Здесь мы обеспечили простой демонстрацию того, как внутреннее знак можно вводить путем подачи целевого насекомого искусственного диеты, обогащенной куриный IgG / IgY. В свою очередь, IgG / IgY детектировали с использованием сэндвич-ELISA с. Эта система может быть особенно выгодно для исследователей, которые уже использоватьдиета, которая содержит куриные яйца с анализа естественно обнаружить IgG / IgY найти в яйцах. Кроме того, небольшие количества IgG / IgY белка можно вводить местно на насекомых с помощью медицинской распылитель, описанный выше (фиг.3А). Распылитель был впервые использован для массового марка очень деликатных и крошечных паразитоидов с кроликом IgG для типа МРТ исследования 3. С тех пор другие методы были использованы для введения IgG / Igy знаки с членистоногими для разгона исследований. Например, духи распылитель был использован, чтобы применить IgG / МГГ знаки на других паразитоид видов 13,14. Другие внутри отмечены различные насекомые, кормя их (т.е. самостоятельно маркировка) кролика IgG помечены мед или сахар 14,15 воды 16 (3В). Наконец, Бейкер и др. 7 кормили картон для термитов, которая была пропитанных кролика IgG (рис 3C). Эти термиты легко самостоятельно отмечен как они заглатывании с наживкой едупитания.
Рисунок 3. Различные методы, используемые для администрирования белка знак: (A) деликатные паразитоиды помечается с курицей IgY использованием медицинской распылитель, (б) паразитоид кормления на кролика IgG-обогащенный раствор меда, (C) термитов кормления на IgG-обогащенный картона кролика приманки, (D) медоносные пчелы самостоятельно маркировки с сухим молоком, как они идут через напыления устройством, установленным на входе в улей, (E) родные насекомые помечается с молоком в хлопковом поле, используя обычный трактор распылитель Рог, (F ) родные насекомые помечается с курицей яичных белков с стрелы и сопла распылителя, установленного на устройстве квадроцикле, (G) родных насекомых в полосе люцерны помечается с курицей яичных белков с заднейПакет спрей устройство, и (Н, I) родной насекомых люцерны помечается с курицей яичных белков с использованием воздушных аппликаторы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
IgG / IgY белки не только был использован для изучения насекомых разгон. Они также используются для отслеживания трофические связи в членистоногих пищевой цепи. Хаглер и Дюран 17 впервые предложил концепцию маркировки добычу с IgG / IgY и, в свою очередь, проводит IgG / IgY-конкретное содержание сэндвич кишечника ELISA на хищников, которые потребляли заметное добычу. Эта методика недавно получила популярность среди исследователей анализа кишки, потому что это менее утомительным и дорогостоящим, чем проведение добычу конкретных ELISA или полимеразной цепной реакции (ПЦР) типа анализа молекулярных содержимого кишечника (см Хаглер 18 и Fournier и др. 19 для обзоров гое плюсы и минусы различных методов анализа кишка). В последнее десятилетие, immunomarking техника добычей был использован для определения подачи активность хлопка хищников на кролика IgG-вредителей отмечены 18,20,21, трофаллаксиса и пищевые взаимоотношения в термита колоний, используя кролика IgG-обработанный источник бумаги 22 пищевых продуктов, granivory из членистоногих сборки по инвазивным одуванчика семян сорняков, отмеченные кролика IgG 23, клоп цены хищничества на IgG обозначенных hornworms томатов, собранных на участках, подвергнутых различным полухимического лечения 24 и хищник поглощать деятельность на IgG / IgY отмеченное падалью 25.
Второе поколение обнаружения белка косвенных ИФА были разработаны почти десять лет назад. Эти ИФА были разработаны специально для обнаружения белков, содержащихся в "вне-шельф" пищевых продуктов, таких как яйца альбумина белка в куриных яиц белых, соевый ингибитор трипсина белка в соевом молоке, и казеинав коровьем молоке. Белковые immunomarkers второго поколения оказались полезными для MRR, марки-захвата и самостоятельно марки типа исследований. Например, Ирвин и др. 26 показали, что это было возможным местно отметить нежные паразитоидов с этими вне-шельфа белков. Кроме того, Хаглер и др. Показали, что 8,27 пчелы могут самостоятельно знак с яичным белком и крупного рогатого скота молочных сухих порошков, как они выходят через белка дозатора, установленного на входе в улей (рис 3D). Пожалуй, наиболее творческое использование белка маркировка участие ориентации корова похлопывает с яичными белками, используя реактивный распылитель 28. В свою очередь, лицо летать взрослых приобрела уверенность в знак они вышли из их куколки и вышла корова погладить.
Наиболее важной характеристикой белковых immunomarkers второго поколения является то, что они легко доступны в массовых количествах и на долю от стоимости IgG / МГГ белков 11. Эта функция имеет REVolutionized путь всей зоне обозначение типа захвата Исследования проводятся. В частности, исследователи теперь имеют надежный метод быстро и равномерно тегов членистоногих более обширных областей в области с использованием широкого спектра обычным оборудованием буровой спрей (рис 3E). Например, насекомые-вредители были отмечены непосредственно в садах и полях, используя портативный ручной пистолет типа опрыскиватели 29,30, тракторные приводом AIRBLAST опрыскиватели 31,32 и противоскользящие опрыскиватели 33. Хортон и др. 34 использовали электрическое устройство распыления, установленный на вездеходе, чтобы точно определить приложения яичные белки в насекомых, населяющих покровных культур, внедренные в грушевого сада (рис 3F). Точно так же, Swezey др. 5,35 использовал рюкзак распылитель, чтобы применить точные приложения куриных яиц белых с рядами с люцерны ловушки урожая (предпочтительный растения-хозяина), встроенного в органически выращенный области клубники, чтобы отметить вредителя и его естественных врагов (
Некоторые пользователи порядке знак захвата второго поколения изменили первоначальную процедуру несколько, чтобы удовлетворить их конкретные потребности исследований. Тип кузова и размер тон направлены насекомое, вместе со своими поведенческими характеристиками, будет диктовать объем и концентрацию, необходимую марки и, как знак вводят 37. Кроме того, метод, используемый, чтобы вернуть насекомых в области будет зависеть от этих факторов. На сегодняшний день, почти каждый метод (например, липкие ловушки, развертки сети, пылесосы) для сбора насекомых успешно используется для сбора насекомых, отмеченные 3,5,8,11,29,31,32,35,38. Тем не менее, из-за экстремальных чувствительностей ИФА обнаружения белка, мы подчеркиваем, что большое внимание должно быть принято для того, чтобы немаркированные образцы не загрязняются во время процессов сбора или сортировки 38.
Первоначальное исследование 11, что описано второе поколение белковых систем маркировки (например, яичного альбумина, казеина молока и сои ингибитор трипсина) сообщили, факторы, влияющие на чувствительность анализа может меняться в зависимости от типов маркера. В частности, они показали, что DIFИсточники ных вода, добавки (ПАВ), и даже тип ELISA пластины, используемой пострадавших (положительно или отрицательно) анализа. Кроме того, что изучение и последующие исследования 37,39,40 показали, что три белка анализы обнаружения знак варьироваться в эффективности. Яичный белок маркера сохраняется дольше, чем молока маркера, который был оставлен дольше, чем соевого молока маркера. Эти результаты подчеркивают важность удержания марки тестирование белка на любой насекомого, до начала полевых исследований. Кроме того, эти второе поколение косвенные ИФА иногда показывают низкий уровень фонового шума с определенными типами насекомых (например, травоядные) (чел.) OBS. Это фоновый шум может быть уменьшен путем добавления 100 мкл перекиси водорода в каждую лунку пластины ELISA в течение 30 мин между стадией 2.3.4 и 2.3.5 Шаг в протоколе выше (неопубликованные данные)..
Следует отметить, что косвенные ИФА, используемые для обнаружения белковых меток второго поколенияочень эффективны при обнаружении белка на насекомых, пропитанных в буфере выборки. Тем не менее, косвенные ИФА не так эффективны, как бутерброд ELISA на выявление внутренних знаки белка или добычу белки на насекомых. Исследования показали, что косвенные ИФА не так эффективно, как сэндвич ИФА на выявление белка в гомогенизированных образцов насекомых 34,41.
Важным фактором любой ELISA является то, что процедура часто показывает пластину-для-пластины (объясняется главным образом изо дня в день эффектов работает анализе) изменчивость 42,43. Поэтому очень важно, чтобы каждый ELISA пластины включает в себя: (1) один или несколько TBS только отрицательные контроли, (2) один или более TBS + Протеиновый положительных контролей, и (3) по меньшей мере восемь отрицательных контролей насекомых (например, лиц, известных не содержат отметку белка). Только TBS, TBS + белок, и насекомые отрицательные контроли уверяют, что буфер не является источником ошибки, реагенты работают должным образом,го, что нет никаких белков в насекомого, которые пересекают реагируют с реагентами ELISA соответственно. Кроме того, насекомые отрицательные контроли необходимы для расчета значения ELISA (пороговые смотри ниже). Конструкция пластины показано в этой демонстрации включены 7 TBS заготовок, 1 белок + TBS положительного контроля (в первом столбце) и восемь отрицательных контролей (в последнем столбце) на каждой пластине ELISA (рисунок 1).
Другим важным фактором при обработке данных ELISA, чтобы определить пороговое значение, чтобы забить насекомое на наличие или отсутствие отметки белка. Метод, первоначально предложенная Stimmann 44 за совершение рубидия маркировку насекомых определяется как средний уровень маркера в бассейн немаркированных насекомых плюс три раза стандартного отклонения немаркированных лиц. Этот метод также был использован в качестве обычного способа счет насекомых на наличие белка знаков 9,17. Тем не менее, в некоторых CASES, исследователи интуитивно выбирается более консервативных пороговых значений, чтобы уменьшить вероятность получения ложных срабатываний. Самый простой способ, чтобы просто добавить от четырех до шести стандартных отклонений к среднему значению отрицательного контроля вместо трех 18,34. Более сложный способ дополнительно уменьшить вероятность получения ложных срабатываний была предложена Sivakoff соавт. 12. Этот метод предполагает вычисления среднего значения абсорбции из восьми негативных насекомых управления на каждом ELISA пластины, а затем вычисления стандартного отклонения на основе объединенных отрицательных контролей из всех ELISA пластины данного исследования.
В целом, это надежный метод, чтобы пометить членистоногих решающее значение для успеха большинства разгона исследований. Различные методы были использованы, чтобы отметить членистоногих с белками на протяжении последних двух десятилетий. Белок immunomarking и обнаружение знаков относительно простой и недорогой и очень гибкой для множества Studies. Будущие пользователи техники immunomarking должны гарантировать, что их методика подходит к специфике их исследования. Концентрация и объем отметки необходимы, и как применяется знак будет зависеть от таких факторов, как поведение, типа и размеров тела целевых видов 40.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Упоминание торговых наименований или коммерческих продуктов в данной публикации исключительно в целях обеспечения конкретной информации и не подразумевает рекомендацию или одобрение со стороны Министерства сельского хозяйства США. Министерство сельского хозяйства США равные возможности и работодателем.
Acknowledgments
Финансирование было предоставлено USDA КРИС 5347-22620-021-00D и, в частности, по сельскому хозяйству и продовольственной исследовательская инициатива конкурентной грант №. 2011-67009-30141 от USDA Национальный институт продовольствия и сельского хозяйства. Мы благодарны за техническую поддержку Johanna Нассиф. Мы также поблагодарить Пола Бейкер, Дэвид Хортон, Диего Ньето, и Фрэнсис Sivakoff для обеспечения некоторых изображениях, используемых на рисунке 3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Food storage container (for insect rearing) | Rubbermaid/Tupperware | Various sizes | Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window |
| Small volume nebulizer (Micro Mist) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well. |
| Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap | Continental Lab Products | 4445.X | Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids. |
| Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid) | RPI Corp. | 145746 | This design is nice because it doesn't crowd the tubes. |
| Dispenser, repeater | Eppendorf | 4982000322 | Anything similar will help speed up the dispensing. |
| Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml | Kimble Chase | 749521-1500 | Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse. |
| BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) | BD | 351172 | |
| Ovation pipette, manual (20-200 µl) | VistaLab | 1057-0200 or 1070-0200 | Any similar type will work. This model is ergonomic. |
| Reservoirs, sterile reagent | VistaLab | 4054-1000 | Anything similar will work. |
| Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | If you had to pick one electronic model, this size is most useful. |
| Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Anything similar will work. |
| Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Anything similar will work for manual plate washing. |
| Microplate reader with absorbance detection | Molecular Devices | SpectraMax 250 | Anything similar will work. |
| Chicken IgG/IgY | United States Biological | I1903-15R | Also available from other sources |
| Egg whites | Grocery store | “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. | Mix 5 ml with 95 ml dH2O for 5% solution |
| Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g/L to make TBS |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g/L for PBS |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1.14 g/L for PBS |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0.2 g/L for PBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0.2 g/L for PBS |
| Tween 20, EIA grade | Sigma-Aldrich | P1379 | Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved. |
| PBS with 1% BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Mix 1 packet in 1 L dH2O |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 µl in 50 ml TBS |
| Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) | Grocery store | Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution | |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 µl in 1 L of 1% milk |
| Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA |
| Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000) | Sigma-Aldrich | A6154 | Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer | Lehle Seeds | VIS-01 | Add as last ingredient |
| TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate | SurModics | TMBW-1000-01 |
References
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
- Lavandero, B. I., Wratten, S. E., Hagler, J. R., Jervis, M. A. The need for effective marking and tracking techniques for monitoring the movements of insect predators and parasitoids. Int. J. Pest Manage. 50 (3), 147-151 (2004).
- Hagler, J. R., Jackson, C. G., Henneberry, T. J., Gould, J. Parasitoid mark-release-recapture techniques: II. Development and application of a protein marking technique for Eretmocerus spp., parasitoids of Bemisia argentifolii. Biocontrol Sci. Techn. 12 (6), 661-675 (2002).
- Blackmer, J. L., Hagler, J. R., Simmons, G. S., Henneberry, T. J. Dispersal of Homalodisca vitripennis (Homoptera: Cicadellidae) from a point release site in citrus. Environ. Entomol. 35 (6), 1617-1625 (2006).
- Swezey, S. L., Nieto, D. J., Hagler, J. R., Pickett, C. H., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Dispersion, distribution and movement of Lygus.spp. (Hemiptera: Miridae) in trap-cropped strawberries. Environ. Entomol. 42 (4), 770-778 (2013).
- Hagler, J. R., Baker, P. B., Marchosky, R., Machtley, S. A., Bellamy, D. E. Methods to mark termites with protein for mark-release-recapture and mark-capture studies. Insect. Soc. 56 (2), 213-220 (2009).
- Baker, P. B., et al. Utilizing rabbit immunoglobulin G protein for mark-capture studies on the desert subterranean termite, Heterotermes aureus (Synder). Insect. Soc. 57 (2), 147-155 (2010).
- Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Machtley, S. A., Van Deynze, A. Foraging range of honey bees, Apis mellifera, in alfalfa seed production fields. J. Insect Sci. 11 (1), 1-12 (2011).
- Hagler, J. R., Cohen, A. C., Bradley-Dunlop, D., Enriquez, F. J. A new approach to mark insects for feeding and dispersal studies. Environ. Entomol. 21 (1), 20-25 (1992).
- Hagler, J. R. Field retention of a novel mark-release-recapture method. Environ. Entomol. 26 (5), 1079-1086 (1997).
- Jones, V. P., Hagler, J. R., Brunner, J., Baker, C., Wilburn, T. An inexpensive immunomarking technique for studying movement patterns of naturally occurring insect populations. Environ. Entomol. 35 (4), 827-836 (2006).
- Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Threshold choice and the analysis of protein marking data in long-distance dispersal studies. Methods Ecol. Evol. 2 (1), 77-85 (2011).
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. An immunomarking technique for labeling minute parasitoids. Environ. Entomol. 27 (4), 1010-1016 (1998).
- Janke, J., et al. Serological marking of Pnigalio agraules (Hymenoptera: Eulophidae) for field dispersal studies. J. Pest Sci. 82 (1), 47-53 (2009).
- DeGrandi-Hoffman, G., Hagler, J. R. The flow of incoming nectar through a honey bee (Apis mellifera L.) colony as revealed by a protein marker. Insect. Soc. 47 (4), 302-306 (2000).
- Peck, S. L., McQuate, G. T. Ecological aspects of Bactrocera latifrons (Diptera: Tephritidae) on Maui, Hawaii: Movement and host preference. Environ. Entomol. 33 (6), 1722-1731 (2004).
- Hagler, J. R., Durand, C. M. A new method for immunologically marking prey and its use in predation studies. Entomophaga. 39 (3), 257-265 (1994).
- Hagler, J. R. An immunological approach to quantify consumption of protein-tagged Lygus hesperus by the entire cotton predator assemblage. Biol. Control. 58 (3), 337-345 (2011).
- Fournier, V., Hagler, J. R., Daane, K., de Leòn, J., Groves, R. Identifying the predator complex of Homalodisca vitripennis (Hemiptera: Cicadellidae): A comparative study of the efficacy of an ELISA and PCR gut content assay. Oecologia. 157 (4), 629-640 (2008).
- Hagler, J. R. Development of an immunological technique for identifying multiple predator--prey interactions in a complex arthropod assemblage. Ann. Appl. Biol. 149 (2), 153-165 (2006).
- Mansfield, S., Hagler, J. R., Whitehouse, M. A comparative study of the efficiency of a pest-specific and prey-marking ELISA for detection of predation. Entomol. Exp. Appl. 127 (3), 199-206 (2008).
- Buczkowski, G., Wang, C., Bennett, G. Immunomarking reveals food flow and feeding relationships in the eastern subterranean termite, Reticulitermes flavipes (Kollar). Environ. Entomol. 36 (1), 173-182 (2007).
- Lundgren, J. G., Saska, P., Honĕk, A. Molecular approach to describing a seed-based food web: The post-dispersal granivore community of an invasive plant. Ecol. Evol. 3 (6), 1642-1652 (2013).
- Kelly, J. L., Hagler, J. R., Kaplan, I. Semiochemical lures reduce emigration and enhance pest control services in open-field augmentation. Biol. Control. 71, 70-77 (2014).
- Zilnik, G., Hagler, J. R. An immunological approach to distinguish arthropod viviphagy from necrophagy. BioControl. 58 (6), 807-814 (2013).
- Irvin, N. A., Hagler, J. R., Hoddle, M. S. Laboratory investigation of triple marking the parasitoid, Gonatocerus ashmeadi (Hymenoptera: Mymaridae) with a fluorescent dye and two animal proteins. Entomol. Exp. App. 143 (1), 1-12 (2011).
- Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Van Deynze, A., Martin, J. A method for distinctly marking honey bees, Apis mellifera, originating from multiple apiary locations. J. Insect Sci. 11 (143), 1-14 (2011).
- Peck, G. W., Ferguson, H. J., Jones, V. P., O'Neal, S. D., Walsh, D. B. Use of a highly sensitive immunomarking system to characterize face fly (Diptera: Muscidae) dispersal from cow pats. Environ. Entomol. 43 (1), 116-122 (2014).
- Boina, D. R., Meyer, W. L., Onagbola, E. O., Stelinski, L. L. Quantifying dispersal of Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) by immunomarking and potential impact of unmanaged groves on commercial citrus management. Environ. Entomol. 38 (4), 1250-1258 (2009).
- Lewis-Rosenblum, H., Tawari, X. M. S., Stelinski, L. L. Seasonal movement patterns and long-range dispersal of Asian citrus phyllid in Florida citrus. J. Econ. Entomol. 108 (1), 3-10 (2015).
- Krugner, R., Hagler, J. R., Groves, R. L., Sisterson, M. S., Morse, J. G., Johnson, M. W. Plant water stress effects on the net dispersal rate of the insect vector, Homalodisca vitripennis (Germar) (Hemiptera: Cicadellidae), and movement of its egg parasitoid, Gonatocerus ashmeadi Girault (Hymenoptera: Mymaridae). Environ. Entomol. 41 (6), 1279-1289 (2012).
- Klick, J., et al. Distribution and activity of Drosophila suzukii in cultivated raspberry and surrounding vegetation. Entomol. Exp. App. , (2015).
- Basoalto, K., Miranda, M., Knight, A. L., Fuentes-Contreras, E. Landscape analysis of adult codling moth (Lepidoptera: Tortricidae) distribution and dispersal within typical agroecosystems dominated by apple production in Central Chile. Environ. Entomol. 39 (5), 1399-1408 (2010).
- Horton, D. R., Jones, V. P., Unruh, T. R. Use of a new immunomarking method to assess movement by generalist predators between a cover crop and tree canopy in a pear orchard. Amer. Entomol. 55 (1), 49-56 (2009).
- Swezey, S. L., Nieto, D. J., Pickett, C. H., Hagler, J. R., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Spatial density and movement of the Lygus spp. parasitoid Peristenus relictus (Hymenoptera: Braconidae) in organic strawberries with alfalfa trap crops. Environ. Entomol. 43 (2), 363-369 (2014).
- Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Relative dispersal ability of a key agricultural pest and its predators in an annual agroecosystem. Biol. Control. 63 (3), 296-303 (2012).
- Slosky, L. M., Hoffmann, E. J., Hagler, J. R. A comparative study of the retention and lethality of the first and second generation arthropod protein markers. Entomol. Exp. App. 144 (2), 165-171 (2012).
- Hagler, J. R., Machtley, S. A., Blackmer, F. A potential contamination error associated with insect protein mark-capture data. Entomol. Exp. App. 154 (1), 28-34 (2015).
- Hagler, J. R., Jones, V. P. A protein-based approach to mark arthropods for mark-capture type research. Entomol. Exp. App. 135 (2), 177-192 (2010).
- Hagler, J. R., Naranjo, S. E., Machtley, S. A., Blackmer, F. Development of a standardized protein immunomarking protocol for insect mark-capture dispersal research. J. Appl. Entomol. 138 (10), 772-782 (2014).
- Hagler, J. R. Variation in the efficacy of several predator gut content immunoassays. Biol. Control. 12 (1), 25-32 (1998).
- Clark, M. F., Adams, A. N. Characteristics of microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34 (3), 475-483 (1977).
- Crowther, J. R. The ELISA guidebook. , Humana Press. Totowa, NJ. (2001).
- Stimmann, M. W. Marking insects with rubidium: Imported cabbageworm marked in the field. Environ. Entomol. 3 (2), 327-328 (1974).
