Summary
Hier präsentieren wir eine neuartige Ca 2+ -Imaging Ansatz unter Verwendung eines Biolumineszenz Reporter. Dieser Ansatz verwendet einen fusionierten Konstrukts GFP-Aequorin, das Ca 2+ bindet und emittiert Licht, wodurch die Notwendigkeit für Lichtanregung. Deutlich Dieses Verfahren ermöglicht lange kontinuierliche Bildgebung, Zugang zu tiefen Hirnstrukturen und hoher zeitlicher Auflösung.
Abstract
Funktionelle in-vivo-Bildgebung hat sich zu einem leistungsfähigen Ansatz, um die Funktion und Physiologie von Gehirnzellen und Strukturen von Interesse zu studieren. Vor kurzem wurde ein neues Verfahren zur Ca 2+ -Imaging Verwendung des Biolumineszenz-GFP-Reporter Aequorin (GA) ist entwickelt worden. Diese neue Technik beruht auf der Fusion von GFP und Aequorin Genen, wodurch ein Molekül in der Lage zum Binden von Calcium und - unter Zugabe von dessen Co-Faktor Coelenterazin - emittierende helle Licht, das durch ein Photon Sammler überwacht werden können. Transgene Linien Tragen des GFP-Aequorin-Gens für Mäusen und Drosophila erzeugt. Bei Drosophila wurde die GFP-Aequorin-Gen unter der Kontrolle des GAL4 / UAS Binärausdruck Systems für die gezielte Expression und Imaging im Gehirn platziert. Dieses Verfahren wurde später gezeigt, dass sie erfassen kann sowohl nach innen Ca 2+ -Transienten und Ca 2+ aus inneren speichert -released. Am wichtigsten ist es ermöglicht eine größere Dauer in eine kontinuierliche Aufzeichnung, Imaging in größerer Tiefe innerhalb des Gehirns, und die Aufzeichnung mit hoher zeitlicher Auflösung (bis zu 8,3 ms). Hier präsentieren wir die grundlegende Methode für die Verwendung von Biolumineszenz-Bildgebung zu erfassen und zu analysieren, Ca 2+ -Aktivität in den Pilzkörpern, die eine Struktur von zentraler Bedeutung für Lernen und Gedächtnis im Fliegenhirn.
Introduction
Die grundlegende Strukturierung und Funktion der Aktivitäten innerhalb des Gehirns und seiner diskreten Strukturen sind seit langem ein Gebiet intensiver Studie auf dem Gebiet der Neurowissenschaften. Vielleicht einige der frühesten erfolgreiche Ansätze verwendet werden, um dieses Problem zu beheben waren direkte physiologische Messung der Änderung in der elektrischen Aktivität - aber alternative Methoden, die Live-Darstellung von Spannungsänderungen, pH-Wert oder Calciumkonzentrationen (als Proxy für die Aktivität) zu ermöglichen haben zusätzliche Fähigkeiten gebracht die Untersuchung der neuronalen Aktivität 1. Bildgebungstechniken tragen eine Vielzahl von Vorteilen, wie reduzierte Invasivität und die Fähigkeit, im gesamten Gehirnstrukturen zu überwachen Aktivität. Außerdem bei Tieren mit gefügig Genetik einschließlich der Fruchtfliege Drosophila, die Entwicklung von genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren, wie Cameleon, GCaMPs und andere 1 haben Forscher erlaubt, einzelne Nervenzellen, neuronale Populationen und ganzer Gehirn überwachenStrukturen. Während traditionelle fluoreszierende Kalzium-bildgebenden Verfahren unter Verwendung GCaMPs (GFP an Calmodulin fusioniert) oder FRET (CFP und YFP an Calmodulin abgesichert) haben sich als nützliche Techniken eine gute räumliche und zeitliche Auflösung zu sein, die zugrunde liegende Prozess der Lichtanregung erzeugt einige Einschränkungen auf seine experimentelle Anwendungen. Aufgrund der Natur der Lichtanregung, Autofluoreszenz, Photobleaching und Phototoxizität unvermeidlich erzeugt wird, was folglich begrenzt die Tiefe der Strukturen, die abgebildet werden kann, die Dauer der Aufnahme sowie die Echtzeit-kontinuierliche Aufzeichnung. In anderen Worten muss Aufzeichnungen oft intermittierend durchgeführt werden, um diese unerwünschten Nebenwirkungen zu vermeiden.
Wegen dieser Probleme wurden zusätzliche alternative Verfahren der Calcium Bildgebung entwickelt. Einer der vielversprechendsten Methoden ist biolumineszierenden Bildgebung, die auf Licht, das durch eine enzymatische Reaktion nach der Calciumbindung hergestellt beruht. Bioluminescent-Bildgebung erfordert keine Lichtanregung und damit nicht die gleichen Schwierigkeiten wie herkömmliche Calcium Imaging zu erleben. Die Biolumineszenz Reporter Aequorin - von Aequorea victoria isoliert, das gleiche Quallen, von dem GFP wurde auch isolated- bindet Kalzium über seine drei EF-Hand-Strukturen und eine Konformationsänderung, die zur Oxidation von seinem Co-Faktor Coelenterazin und die Freisetzung von blauem Licht (λ = 469 nm) 2,3. Aequorin hat eine sehr niedrige Affinität für Calcium (K d = 10 & mgr; M), was es ideal für die Überwachung Calciumtransienten weil sie erzeugt nur wenig Hintergrundrauschen und nicht mit der intrazellulären Calcium-Puffersystem 4 eingreifen lässt. Obwohl Aequorin bereits verwendet wurde, um den Prozess der neuronalen Induktion im Xenopus-Ei 5 das erzeugte Licht zu überwachen, ist zu schwach, um für eine Echtzeitabbildung der neuronalen Aktivität verwendet werden. In dem Bemühen, diese Herausforderung, Philippe Br & Adresse# 251; lassen und Kollegen am Institut Pasteur erstellt ein genetisches Konstrukt Verschmelzen GFP und Aequorin Genen, imitiert den nativen Zustand in der Quallen 4. Dieses Fusions Genprodukt bindet Calcium wieder über die drei EF-Handstrukturen Aequorin, das eine Konformationsänderung führt zu Oxidation von Coelenterazin, die Energie strahlungslos auf die GFP überläuft. Diese Energieübertragung führt zur Freisetzung von grünem Licht (λ = 509 nm) von GFP anstelle von blauem Licht von Aequorin. Die Fusion von GFP und Aequorin verleiht auch höhere Proteinstabilität hilft das Fusionsprotein produzieren Licht 19-65 mal heller als allein 4 Aequorin. Unter Verwendung eines Biolumineszenz-Ansatz im Gehirn erweitert die aktuelle experimentelle Anwendung von Calcium-Bildgebung sowohl in Bezug auf die Dauer der kontinuierlichen Aufzeichnung und die Anzahl der Strukturen innerhalb des Gehirns, die aufgezeichnet werden können. Im Großen und Ganzen im Rahmen der bisherigen Arbeit es bedeutet, dass sowohl globale als auch eine größereVielzahl von regionalisierten "Aktivität" des Gehirns (über den Proxy von Calciumtransienten) überwacht werden. Noch wichtiger Aktivität kann mehr überwacht werden, in einem Echtzeit und kontinuierlicher Weise, die ohne weiteres eignet sich für die Ausübung der ein vollständiges Verständnis der Basisfunktion im Gehirn.
In den letzten Jahren haben unser Labor und andere transgene Fliegen, die das GFP-Aequorin unter der Steuerung des binären Expressionssystem (GAL4 / UAS-GFP-Aequorin) 5,6 exprimieren entwickelt. Wir GFP-Aequorin-Biolumineszenz durch natürliche Reize wie Duft 7,8 sowie suchten Zellkomponenten Modulieren Ca 2+ -Aktivität in den Pilzkörpern folgenden Acetylcholinrezeptorstimulation durch direkte nikotinischen Anwendung 9 erzeugte Datensatz Aktivität verwendet. Darüber hinaus haben wir auch verwendet GFP-Aequorin, um eine Reihe von experimentellen Fragen, die nicht in der Lage gewesen zu bisher angegangen werden, wie Langzeit-AdresseBildgebung der spontanen Calciumtransienten und Visualisierung von tieferen Hirnstrukturen 10. In jüngerer Zeit haben wir die GAL4 / UAS-System verwendet, um die Säuger-ATP-Rezeptor P2X 2 11 einen Kationenkanal, in den Projektionsneuronen (PNs) auszudrücken und verwendet die LexA System GFP-Aequorin in den Pilzkörpern exprimieren (MB247-LexA 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (a freundlicher Genehmigung von B. Pfeiffer, Janelia Bauernhof, USA). Dies ermöglichte es uns, die PNs durch Anwendung von ATP, das wiederum aktiviert den Pilzkörpern (a nachgeschalteten Ziel des PNs) zu aktivieren, die Nachahmung natürlicher Bedingungen, wie als Antwort auf eine Geruchsreiz. Insgesamt ist diese Technik kombiniert P2X 2 und GFP-Aequorin erweitert die experimentellen Möglichkeiten. Im Großen und Ganzen bietet es die Möglichkeit, die Aktivitätsmuster im Gehirn besser zu verstehen, die Einleitung neuer Studien darüber, wie verschiedene Reize und Störungen können die basalen Strukturierung der Aktivitäten zu ändern.
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Protocol
1. Herstellung der Proben
- Herstellung von Lösungen und Einrichten
- Pflegen Sie alle Drosophila melanogaster Linien bei 24 ° C auf Standard-Lebensmittelmedium. Rear und halten sie in geringer Dichte in der Ampulle, standardisierte Größe und das Gewicht von Fliegen zu erzeugen.
- In 10 jungfräulichen Weibchen mit 10 Männern in einem Fläschchen, lassen Sie sie sich paaren und übertragen Sie alle 2 Tage in ein frisches Röhrchen. Dann wurden 10 Tage später, als die Fliegen beginnen zu schlüpfen, ernten die Fliegen jeden Tag. Halten Sie eine genaue Aufzeichnung der im Alter von den Fliegen und halten sie in gutem Zustand.
- Am Tag 3, trennen Sie die Männchen von den Weibchen und halten die Weibchen 20 Fliegen pro Fläschchen. Nehmen Sie die Fliegen bei 4 oder 5 Tage alt.
- Vorbereitung Ringerlösung mit den folgenden Konzentrationen: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM HEPES und 36 mM Saccharose und den pH-Wert der Lösung genau 7.3. Bereiten Perfusionslösungen von 25 μ; M Nikotin und 100 mM KCl in Ringer-Lösung.
- Bereiten 1.000 ul Pipettenspitze: mit einer Rasierklinge Form Spitze bis schräg (ca. 35 ° vom Ende der Spitze), und entfernen Sie überschüssige Base über 1 ½ Zentimeter von der Spitze.
- Vorbereitung Kasten für die Lagerung (23 cm x 17 cm x 8,5 cm) der Probe während der Inkubation. Legen Sie zwei Schwämme (12 cm x 8 cm x 3 cm) mit Wasser gesättigt in Boden unter einem kleinen Rack Gerät [auf Probe Austrocknung zu verhindern], um die Proben auf ihre Vorbereitung abgeschlossen zu platzieren.
- Bereiten Fliegen Proben, so dass sie mindestens 1 Kopie des UAS-GFP-Aequorin und eine Kopie eines Gal4 Linie Expression von GFP-Aequorin zu fahren. OK107 Gal4 Linie (eine Linie die Expression vor allem in den Pilzkörpern) mit UAS-GFP-Aequorin in dieser Zubereitung gekreuzt.
HINWEIS: Das Innere der Box muss wasserfest sein und die Außenseite muss Licht in Box, um den Abbau von Coelenterazin während der Inkubation zu verhindern blockieren.
- Pflegen Sie alle Drosophila melanogaster Linien bei 24 ° C auf Standard-Lebensmittelmedium. Rear und halten sie in geringer Dichte in der Ampulle, standardisierte Größe und das Gewicht von Fliegen zu erzeugen.
- Preptung von Proben
- Eis anästhesiert Drosophila indem sie in eine Glasampulle und auf Eis für 2 min zu halten, bevor sie an der gekühlten Petrischale zur Positionierung in der Pipettenspitze bewegt. Bereiten Pipettenspitzen auf leicht angefeuchteten Filterpapier in 100 ml Petrischale auf Eis unter dem Dissektionsmikroskop.
- Vorsichtig mit einer Pinzette Ort fliegen Innenseite Pipettenspitze.
- Mit einem Pinsel vorsichtig schieben und ausrichten fly so dass der Kopf vollständig über den Rand der Spitze und der Rückenbereich ist teilweise durch den Abschnitt während der Spitzenformung (2B) entfernt ausgesetzt.
- Kombinieren eine kleine (ungefähr 3-4 & mgr; l) Abschnitte der beiden Komponenten des Dentalkleber. Tragen Sie den Klebstoff vorsichtig um die vorderen und hinteren Kopf und Hals auf und rund um die Pipettenspitze Kante - die Vermeidung der Krone des Kopfes. Lassen Sie den Kleber trocken für 2 min.
- Platz Pipettenspitze mit geklebten fly durch Loch im Aufnahmeraum (2D) und Gen-tly drücken, um an Ort und Stelle zu sichern.
- Kombinieren Sie die beiden Komponenten der Silikonkleber (ungefähr 3-4 & mgr; l). Leim auf der flachen Seite der Kammer entlang der Kante, wo die Kammer und Pipettenspitze treffen, um Leck von der Ringerlösung zu verhindern. Lassen Sie den Kleber trocken für 2 min.
- Präparation
- Bringen Sie Klebeband über die Perfusionskanal kurzen Kante und sich an der Rückseite der Kammer.
- Zeigen Kammer mit Fliege auf Dissektion Block unter dem Mikroskop wiederum auf Leuchtstofflampe. Pipettieren 1 ml Ringer-Lösung in die Kammer.
- Verwenden Sie feine chirurgische Messer, um Nagelhaut entfernen. Machen parallele Einschnitte von der Rückseite des Kopfes, um anten Region. Dann entlang der Kante des Auges geschnitten dann einen senkrechten Schnitt über Antenne, welche die früheren Inzisionen. Einen endgültigen Schnitt parallel zu der an der Rückseite des Kopfes. Mit den feinen scharfen Pinzette Kutikula (2C) zu entfernen.
- Verwenden Sie feinen scharfen Pinzette vorsichtig greifen eind entfernt ausgesetzt klar abgeschlagen Atemwegsgewebe, bis das Gehirn und [fluoreszierenden] Pilzkörper wird übersichtlich visualisiert.
- Verwenden Sie ultra-scharfen Pinzette vorsichtig greifen und kneifen abdeckt Gehirn, um für die Permeation des Coelenterazin ermöglichen neuroepithelialen Gewebe.
HINWEIS: Alternativ Papain kann die Neuroepithels 9 permeabilisiert werden. - Unter Verwendung einer Pipette, waschen zweimal mit Ringer-Lösung, um alle Fremdkörper aus Präparation und Ort Probe im dunklen Kasten zu entfernen.
- Pipette 1 ml Ringer-Lösung, die 5 uM benzyl-Coelenterazin in die Kammer. Schließen Sie die Box und lassen Inkubation mit Coelenterazin bei RT für ein Minimum von 2 Stunden.
2. Imaging
- Konfiguration
- Starten Sie die Aufnahme-System: Schalten Sie Mikroskop, Computer, Kamera und Entwässerungssystem und stellen Raum Umweltkontrollen bis 25 ° C.
- Offene Measurement and Automation Explorer-Programm auf dem Computer. Klicke auf “ Geräte und Schnittstellen ", doppelklicken Sie dann auf" NI Motion Devices "und schließlich klicken Sie rechts auf" PCI-7334 "und wählen Sie" Gerät initialisieren ".
- Öffnen Photon Imager. Neuen Ordner anlegen und benennen erste Aufnahmedatei. Kamera darf -80 ° C zu erreichen, bevor System wird funktionieren.
- Richten Sie Perfusionssystem - fügen KCl, Nikotin und Ringer-Lösung zu Lagerstätten und so das jeder Lösung Entladungen bei 2 ml / min einzustellen. Mit Lösung Ringer vor Beginn der Experiments waschen.
- Bereiten Probe
- Platz Bildgebung Montageblock Teller auf dem Berg unter dem Mikroskop zu 5fache Vergrößerung und legen Perfusion Rohr in den Kanal durch Punktion.
- Set Mikroskop Fluoreszenzmodus dann Zentrum und bringen Pilzkörper (MBS) in den Fokus. Passen Sie auf 20X und Wiederzentrum und Fokus.
- Position Drainagevorrichtung über Drainagebecken, Höhe einstellen des Drainage Shunt so dass die Spitze ist nur Above-Pool, und führen Ringer-Lösung für 30 Sekunden, um das Abfließen zu gewährleisten.
- Pull-Down-Schild den Inhalt vor Licht abzudichten Gerät. Unter Verwendung des automatisierten Systems in Photonen-Imager Feineinstellungen, um den Fokus und nehmen Sie ein Referenzfluoreszenzbild der MBs.
- Aufnahme
- Einstellen Photonengeschwindigkeit auf gewünschte Aufnahmegeschwindigkeit (von 50 ms bis zu 1 s oder mehr). Photonen-Modus auswählen und offener Blende. Nehmen Genotyp, Geschlecht, Alter und Probennummer im Log-Einträge. Stellen Sie die Position ROI Boxen über Kelch und Zellkörper (CCB) und mediale Lappen durch Klicken auf die ROI-Boxen und Ziehen bei gedrückter Steuerungs.
- Record Grundlinie für etwa 5 bis 10 min (je nach Wunsch).
- Gelten Nikotin für 1 min. Beachten Sie, Start / Stopp in log. Mit Ringerlösung für 5 min waschen.
- Warten Sie 5 Minuten für die Wiederherstellung und bereiten KCl Protokolleintrag und Timer.
- Gelten KCl für 1 min. Beachten Sie, Start / Stopp in log. Mit Ringerlösung während 1 min waschen.
- SchalterFluoreszenzmodus, nehmen Sie endgültige Fluoreszenzbild und schalten Sie Ringerlösung.
- Drücken Sie auf "Stop". Dialogfeld werden Sie gefragt, zum Ausschalten des Systems. Wählen Sie "Nein", um die Aufnahme fortzusetzen.
- Öffnen Schild, verschieben Drainagesystem, Schaltlinsenobjektiv bis 5X, entfernen Perfusion Rohr. Entfernen Probe / Aufnahme Gericht aus Stufe reinigen 20X Linse durch Spülen und zweimal wischen Sie das Objektiv mit Wasser.
- Drücken Sie die Play-Taste weiß am oberen Rand des Programmfensters, um die nächste Aufzeichnung zu starten.
3. Analyse und Video Creation
- Auszug Photonenwerte
- Öffnen Sie das Photon-Analyse-Programm (zB Photon Viewer) und offene erste Probentabellendatei.
- Wählen Sie die Display-Steuerung Registerkarte. Wählen Sie die ROI, indem Sie auf die Region bei gedrückter Steuerungs. Passen Sie Größe, Ausrichtung und Form der Bereiche von Interesse, um GFP beleuchtet CCB und mediale Lappen umfassen.
- Fügen Sie einen Zusatzal ROI, indem Sie auf und auf "ROI definieren" und Ziehen auf dem Bildschirm, um die neue ROI erstellen.
- Wählen Sie die "Movie", um Photonen-Video zu spielen. Stellen Sie "s Breite" und "sec Schritte" nach Wunsch. Nachstellen ROI Platzierung wie nötig.
- Wählen Vertreter Screenshots der GFP-Fluoreszenz, Nikotin Antwort und KCl Antwort. Crop Screenshots und Bild Paste in eine Präsentationsfolie zur späteren Analyse und Vergleich.
- Passen Sie sowohl die "s Breite" und "sec Schritt", um die Aufnahmegeschwindigkeit in Sekunden. Wählen Sie Länge von Analyse, indem graue Markierungen auf obere Platte an der Halterung Region vor Stimulus Initiierung und unmittelbar nach Ansprechen Ende.
- Wählen Sie "Suspend Blick während des Spielens" Presse "<< REW" und drücken Sie "PLAY>". Wählen Sie die Registerkarte "Zählrate Chart" und passen Einheiten wie gewünscht und Linienfarben, um ROI Farbe.
- Wenn die Analyse abgeschlossen istDrücken Sie "Export Zählratendaten". Wählen Sie Screenshots von kombinierten Aufnahmen CCB und mediale Lappen Region von Interesse von jeder Seite. Crop Screenshots und Bild Paste in einem Objektträger mit Reaktions Bilder. Diese Folie wird später in der endgültigen Analyse verwendet werden.
- Beispiel Analyse: eine Methode zur Analyse der extrahierten Photonendaten detailliert
- Öffnen Sie das Tabellenkalkulationsdateien in "Zählrate Exporte" -Ordner.
- Formatieren Sie die Zellen der ersten Spalte mit der Zeit, um die Zeit in Stunden und Minuten angezeigt.
- Verweisen Sie auf das entsprechende Schieber für die Probe. Entfernen Sie alle Werte außer den Spalten für die Zeit und die beiden Vertreter ROIs.
- Bestimmen Sie Nikotin-Stimulation Startzeit - im Protokolleintrag Datei im Haupt Ordner- Zusatzdaten vor der Inbetriebnahme oder Highlight-Wert zu entfernen.
- Finden höchste / Spitzenwert sowohl für CCB und mediale Keule und Zeichen / Highlight.
- Bestimmen Sie Antwort Start- und Endzeit für beideCCB und mediale Lappen durch die Schaffung einer Schätzung unter Verwendung von Zeitpunkt aus entsprechenden grafisch dargestellt Reaktion auf Folie und wählen Sie Ist-Wert von Wertewandel in der Nähe zu diesen Punkten. Streichen den Bereich zwischen diesen Punkten in sowohl der CCB und mediale Lappen. Alternativ können Sie einen Makro-9.
- Kombinieren Sie alle Proben einer Versuchsgruppe auf einem neuen Arbeitsblatt.
- Richten Sie am Gipfel durch die Bestimmung der Zeilenwert ist für jede CCB Spitzenwert. Subtrahieren Sie die unteren Werte von höchsten Zeilenwert um ungefähre Zeilenwert, wo die Probe Daten müssen erneut kopiert werden, zu bestimmen. Stellen Sie sicher, dass alle Spitzenwerte ausgerichtet sind.
- Kopieren Sie das Blatt zweimal und entweder der medialen Lappens Spalten oder die CCB Spalten Erstellen von Seiten von nur CCB oder medialen Lappens Werte zu löschen.
- Daten zu entfernen, nachdem die alle CCB Antworten wurden beendet. Erstellen Sie vier Zeilen markiert Gesamt Photonen, Antwortlänge (Dauer), Peak-Amplitude und Antwortlatenz. Kopiere den wieder unter den Originalen.
- Verwenden Sie die Funktion SUMME, um insgesamt Photonen während der Reaktion zu bestimmen. Verwenden Sie die COUNT-Funktion, um Länge der Antwort zu bestimmen. Kopieren und verbinden höchsten Wert Zelle zu Spitzenamplitudenwert zu bestimmen. Verwenden Sie COUNT-Funktion - vom Beginn der Perfusion von Nikotin zu Beginn der Reaktion zu wählen - den Antwortlatenzzeit zu bestimmen.
- Copy-Werte mit Hilfe der Verknüpfungsfunktion und mehrfach (alle außer Spitzenamplitude) durch Aufzeichnung Geschwindigkeit in Sekunden.
- Bar / box Graphen kann für berechneten Parameter wie Total Photonen, Spitzenamplitude und Antwortlänge erzeugt werden, wenn dies gewünscht wird (Bsp .: 5B, C, D).
- In der Spalte nach der Rohdaten Photonenreaktion, der Mittelwert der Rohdatenpunkte für jeden Zeitpunkt unter Verwendung von Durchschnittsfunktion. Wenn mit einer Säule zur Festlegung der Standardfehler des Mittelwerts (SEM) gewünschten folgen, für jeden der gemittelten Photonenwerte zu einem Zeitpunkt.
- Verwenden Sie die durchschnittliche Spalte, um eine durchschnittliche Antwort profil konstruierene [Graph] für die CCB Probengruppe. Wählen Sie dazu die Spalte die Angabe der Zeit wie die x-Achse Werte und die Spalte des durchschnittlichen Photonenwerte als der y-Achse und schließlich die Streudiagrammerstellung Werkzeug auswählen.
- Wiederholen dieses Analyseverfahren mit den Daten aus den medialen Lappen.
- Erstellen von Images für das Video
- Offene Photonen Betrachter.
- Wählen Sie die Display-Steuerung Registerkarte. Klicken Sie auf ROI bei gedrückter Steuerungs auszuwählen, zu entfernen und / oder zu minimieren, ist es.
- Ändern "sec Breite" (Akkumulationszeit), wie gewünscht, den Inhalt jedes Rahmens zu bestimmen.
- Ändern "sec Schritt", um die Überlappung der einzelnen Frames zu definieren.
- Wählen Sie "Export Blick während des Spielens" Presse "<< REW" und dann "PLAY>". Die Bilder für das Video wird an den "Blick Exporte" Ordner als eine Reihe von PNG-Dateien exportiert werden.
- Eine Methode für Video c: Verwenden von Virtual Dub Video zu machen,reation detaillierten
- Erstellen Sie einen neuen Ordner mit dem Namen "resultats" in der Ordneransicht Exporte mit den Bildern.
- Bringen Sie script (renommer.VBS) in den Ordner mit Bildern.
- Klicken Sie doppelt auf renommer.VBS zu laufen.
- Bilder werden automatisch numerisch umbenannt und auf "resultats" Ordner kopiert werden.
- Offene VirtualDub.exe.
- Wählen offenen Video-Datei - wählen Sie zuerst eine Bild (nachfolgenden Bildern wird automatisch geladen).
- Wählen Sie Video - wählen Framerate wie gewünscht einzustellen.
- Wählen Sie Video - wählen Kompression wählen Cinepak Codec von Radius.
- In Datei wählen Sie Speichern als AVI-Video wird automatisch erstellt.
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Representative Results
Die Fusion der GFP zu Aequorin erlaubt uns, unsere Region von Interesse vor der Biolumineszenz-Bildgebung durch Anregung von GFP in Fluoreszenzmodus am Mikroskop (Abbildung 3A, 4A, 6A, 6E) zu visualisieren. Eine der einfachsten Möglichkeiten, um die Pilzkörper zu stimulieren, durch Aktivierung der ionotropen nikotinischen Acetylcholinrezeptoren. Obwohl Acetylcholin ist der endogene Ligand dieses Rezeptors haben wir gefunden, dass Nikotin erzeugt reproduzierbarer Antworten in den Pilzkörpern. Dies ist zum Teil, weil sie vom Benutzer ausdrücklich nikotinischen Acetylcholinrezeptoren und somit durch Nikotin kann man die Aktivierung der muskarinische Acetylcholinrezeptoren anderswo im Gehirn exprimiert zu vermeiden. Darüber hinaus ist das Nikotin stabiler als die Acetylcholin, und ermöglicht somit eine bessere und zuverlässigere Reizkontrolle. Eine typische Antwort beginnt mit der schnellen Aktivierung von sowohl den Kelch, Zellkörper (CCB) und mediale Lappen (ML) (siehe Abbildung 4A für markierte Bild). Im Allgemeinen der CCB Reaktion dauert länger und weist einen größeren biolumineszente Reaktion als die Lappen, wie in den aufeinanderfolgenden Platten des Antwort gezeigt (3C-H). 4B zeigt eine 10 sec Akkumulation von Photonen bei einer zeitlichen Auflösung von 100 ms aufgezeichnet (10 Hz) während der Spitze der Antwort auf eine 1 min Perfusion von 25 & mgr; M Nikotin. Nach Auswaschen und Wiederherstellungsdauer von 10 min eine zweite Stimulation einer 1 min Perfusion von 100 mM KCl eingeleitet (4C, E), die uns um die Lebensfähigkeit unserer Stichprobe bestätigen können. Die quantitativen Reaktionen können durch Auswahl ROI während der Analyse in Photon-Viewer analysiert werden. Durchführung der Analyse in Photonen Zuschauer produziert sowohl Graphen Anzeige der Anzahl der Photonen in ausgewählten ROI über die Zeit (4D und E) emittiert sowie exportierbare Tabellen dieser Werte. 4D ist ein Blutzuckerwerle der durch Photonen Viewer Auftragen der in der ROI 2 [grün] emittierten Photonen (rechts CCB) und ROI 4 [blau] (rechte mediale Lappen) erzeugten Graphen. Ähnliche Daten für die KCl Reaktion in 4E dargestellt. Die exportierten Daten können verwendet werden, um den Verlauf der Reaktion (5A) zu rekonstruieren, sowie zusätzliche Daten über verschiedene Parameter wie Dauer, Spitzenamplitude und die Gesamtreaktion (5B-D) zu extrahieren. Kürzlich mit den Gal4-UAS und LexA-Systemen haben wir ein Verfahren zum Hervorrufen einer natürlichen Reaktion entwickelt. Kurz gesagt wird das ATP-abhängigen P2X 2 Kationenkanals in den Projektionsneuronen (PNs) exprimiert und GFP-Aequorin (GA) ist in den Pilzkörpern ausgedrückt - ein Ziel der PNs; Dies ermöglicht es uns, gezielt die PNs wenn Anwendung von ATP, die wiederum, produzieren kann Antwort im Pilzkörper (Abbildung 6) zu erregen.
Abbildung 1. Merkmale der Biolumineszenz Reporter (GFP-Aequorin). (A) Schematische Darstellung der GFP und Aequorin Fusionsgens mit vorgeschalteten Aktivierungssequenz. (B) Modell der Emission von blauem Licht von Aequorin als Reaktion auf hohe Ca 2+. (C) Modell der grünen Lichtemission durch GFP-Aequorin als Reaktion auf hohe Ca 2+. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Versuchsaufbau. (A) Fly in Pipettenspitze positioniert. (B) Ein Beispiel für eine ausreichende Klebetechnik Stabilisierung des Kopfes und Abdichten des Bereichs zwischen der Flugkörper und Pipettenspitze. (C) Schematische Darstellung der Dissektion zu Kopfkapsel zu öffnen. (D) 1 ml Kammer am Halteblock mit Perfusion Rohr eingeführt. Gesamtkammerabmessungen: Länge: 7,4 cm, Breite 2,7 cm, Höhe: 0,55 cm. Innenraum Abmessungen: Länge: 1,7 cm, Breite 1,4 cm, Höhe: 0,35 cm, und der Radius der Kammeröffnung: 0,1 cm. (E) Ansicht von Fliegenkopf zeigt GFP-positiven Signal in den MBs: niedrig schwachem Licht mit Fluoreszenz nach der Entfernung der Nagelhaut aus OK107 getriebenen GFP-Aequorin abgeleitet. (F) Mikroskop mit Photonenkamera und Perfusionssystem. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Repräsentative Reaktion auf 25 & mgr; M Nikotin im Pilzkörper. (A) Fluoreszenz-Bilddas GFP-Aequorin-Expression in den Pilzkörpern in GA2 / +; OK107 / + Steuerfliegenhirn (Maßstab = 50 um). (B) Peak-Biolumineszenz-Reaktion in den Pilzkörpern. (C) vor der Stimulierung. (D) Anfang des Antwort. (E) Peak-Ansprechen. (F) Fortsetzung CCB Antwort. (G) Fallen CCB Antwort. (H) Ende der Reaktion (BH: Maßstabsbalken = 33 & mgr; m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Repräsentative Analyse von Probenaufnahme (A) Fluoreszenzbild der Pilzkörper des GA2 / +;. OK107 / + Kontroll Fliegen mit vier ROIs über die CCB und mediale Lappen ausgewählt (Skala bar = 50 um). (B) 10 sec Akkumulation der biolumineszenten Reaktion auf 25 & mgr; M Nikotin - Reaktions Photons von 100 ms aufgezeichnet. (C) 10 sec Akkumulation von biolumineszenten Reaktion auf 100 mM KCl bei 100 msec aufgezeichnet. (D) Diagramm der aufgezeichneten Anzahl von Photonen, während Nikotin Antwort innerhalb ROI 2 und 4 emittiert dabei das Recht CCB und mediale Lappen auf. (E) Grafik der aufgezeichneten Anzahl von Photonen während KCl Antwort innerhalb ROI 2 und 4 Abdeckung der rechten CCB und mediale Lappen bzw. emittiert. In d und e entspricht der linken Y-Achse, um die Gesamtzahl der Photonen im gesamten Sichtfeld, während die rechte Y-Achse entspricht der Photonen innerhalb der ROI. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Vertreter Parameter Analyse von Probenaufnahme Vertreter excel Analyse der Biolumineszenz-Reaktion auf Nikotin Aktivierung der Pilzkörper im GA2 / +;. OK107 / + Kontroll fly. (A) Photon Reaktion im Laufe der Zeit in CCB und mediale Lappen. (B) Dauer der Antworten in der CCB und mediale Lappen. (C) Höchster Photon-Wert (maximale Amplitude) während der Reaktion innerhalb der CCB und mediale Lappen. (D) Gesamt Photonen innerhalb CCB und mediale Lappen der gesamte Antwort. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Zwei unterschiedliche Reaktion in Pilzkörper nach der Stimulation des PNs through ATP und P2X 2. Probe 1 Fliege ausdrücken P2X 2 in PNs und GFP-Aequorin im Pilzkörper (GH146 / +; P2X 2 / MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (ad) (A) Fluoreszenzbild der Pilzkörper mit ROIs (Skala. bar = 50 & mgr; m). (B) Bioluminescent Bild der Spitzenempfindlichkeit innerhalb Pilzkörper nach Aktivierung der PNs von P2X 2 mit 500 & mgr; M ATP stimuliert, vor allem in medialen Lappen beobachtet. (C) Bioluminescent Bild der Spitzen KCl Antwort. (D ) Zeitverlauf der Photonenemission innerhalb ROI Regionen in der gesamten Reaktions Probe 2 fly ausdrücken P2X 2 in PNs und GFP-Aequorin im Pilzkörper (GH146 / +;. P2X 2 / MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (eh ) (F) Bioluminescent Bild der induzierten Antwort in den Pilzkörpern folgenden a. (E) Fluoreszenzbild mit ROIs (Maßstab = 50 um).ctivation der PNs von P2X 2 stimuliert mit 1 mM ATP, in beiden Lappen und CCB. (G) Bioluminescent Bild der Spitzen KCl Antwort. (H) Zeitverlauf der Photonenemission innerhalb ROI Regionen in der gesamten Antwort. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das kürzlich entwickelte Biolumineszenz basierende GFP-Aequorin hier vorgestellte Ansatz ermöglicht in vivo funktionelle Aufnahme von Ca 2+ -Aktivität in verschiedenen Neuronen sowie wenn gewünscht, mit anderen Arten von Zellen, wie zum Beispiel Nierensternzellen nach Cabrero et al. 2013 5.
Modifikationen, Fehlersuche, zusätzliche Komponenten und kritischen Schritte
Drosophila Haltung
GFP-Transgen Aequorin (pG5A) 4 wurde in die pUAST Vektor eingesetzt, um drei unabhängige Transformlinien 6 zu erstellen. Alle Linien wurden auf ihre Biolumineszenz getestet, und alle waren in der Lage, die in vivo Ca 2+ -Aktivität 6 reagieren. Doch neuere Experimente haben darauf hingewiesen, dass die GA2 Linie auf dem dritten Chromosom inseriert erzeugt robusteres Signal als die GA1 Zeile eingefügt on das zweite Chromosom. Hier wurden die repräsentativen Ergebnisse unter Verwendung von UAS-GA2 gekreuzt mit der MB-spezifische Linie OK107 erhalten. Darüber hinaus wurde kürzlich B. Pfeiffer eine GFP-Aequorin-Konstrukt unter der Kontrolle des regulatorischen Elements 20XUAS (20X-G5A-2) platziert erzeugt, und dieses Konstrukt wurde in unserem Labor validiert. Kurz gesagt, es gibt ein sehr starkes Signal, stärker als unsere Standard-GA2, die daher effizienter und sinnvoll, die Ca 2+ -Aktivität in tieferen Strukturen des Gehirns, wie das Ellipsoid-Körper weiter zu überwachen. Darüber hinaus kann es auch nützlich zum Abbilden geringe Mengen von Neuronen oder Axonterminalen (synaptische Kontakte) betragen.
Die Vorbereitungen für Imaging
Obwohl der Verschluss darf Eis beim Positionieren und Verkleben anästhesiert werden, ist es wichtig, die Zeit auf dem Eis zu minimieren. Fliegen sollte in eine Glasampulle, bevor sie dem Kaltpetrischale bewegt, überführt und auf Eis für 2 min gehalten werdenzur Positionierung in der Pipettenspitze. Wir haben festgestellt, dass ausgedehnte Zeitdauer der Anästhesie verringert die Überlebensfähigkeit der Probe und kann die Antwort zu dämpfen. Optimalerweise halten wir die Zeit des Eises Anästhesie unter 5-10 min.
Taping und Kleben sind wichtige Schritte. Es ist entscheidend, um die Fliege den Kopf an Ort und Stelle für die Präparation und Bildgebung zu sichern sowie um eine Leckage von der Ringerlösung in die Pipettenspitze und / oder aus der Aufnahmekammer zu verhindern. Dentalkleber (und zu einem geringeren Ausmaß die Silikonkleber) werden klebrig und anschließend beginnen, sobald die beiden Komponenten vereinigt werden, zu trocknen. Daher ist es wichtig, den Leim rasch gelten für schwache Bindung und Verklumpen des Klebers zu vermeiden. In einigen Fällen haben wir bemerkt, dass alternative Sorten von Klebeband und Kleber, die bei Berührung mit der Ringerlösung kann Verunreinigungen in der Ringerlösung, die die Fliege und seine Reaktion beeinflussen können, zu lösen, vor allem so für Experimente gewidmet zu ter studieren des olfaktorischen Systems, mit verschiedenen Gerüchen. Folglich seien Sie vorsichtig, wenn Sie hier alternative Materialien (siehe Werkstoffe für bestimmte Sorten die wir verwenden).
Verschiedene Formen von Coelenterazin haben, um seine Aktivität zu optimieren, wie die Geschwindigkeit der Lichtemission, Ca 2+ -Affinität (Empfindlichkeit) oder die Intensität der Lichtemission 12 entwickelt. Beispielsweise ist das native Coelenterazin stabiler, so besser geeignet für Langzeitabbildungs mehreren Stunden, während der Benzyl-Coelenterazin (auch als H-Coelenterazin) ergibt eine schnellere und höhere Lichtemission mit kürzeren Halbwertszeit. Weitere Informationen zu verschiedenen Formen von Coelenterazin finden Sie auf der Web-Adresse in der Materialliste.
Imaging
Biolumineszenz-Signale können mit einem Elektronenvervielfacher-CCD-Kamera überwacht werden, sich auf einem Mikroskop ausgestattet (EM-CCD, auf -80 ºC abgekühlt). Dieses Setup muss be in einem engen dunklen Kasten untergebracht, um eine unerwünschte (Dauerlicht) Kontamination zu vermeiden. Die in dieser Handschrift beschriebene Setup verwendet eine 20X Tauch Objektiv ermöglicht ein Sichtfeld von 400 x 400 & mgr; m (512 x 512 Pixel). Zur Verbesserung Störabstand wurden Daten mit einer 0.100 s Integrationszeit (10 Hz) erfaßt und 2 x 2 Binning verwendet wurde (1 Pixel = 1,2 x 1,2 um). Um Daten erfassen und zu speichern, wobei jedes detektierte Photon zugeordnet war x, y-Koordinaten, und einem Zeitpunkt. Zwischen 500 und 600 nm Wellenlänge, der EM-CCD-Kamera (siehe genaue Beschreibung in der Materialliste) eine Quanteneffizienz von 96%.
Einer der wichtigsten Parameter für die in vivo-Hirnscanner ist die zeitliche Auflösung. Bis jetzt sind die meisten Fluoreszenz basierenden Ca 2+ -Imaging Technik wie GCaMP und Came stellt eine zeitliche Auflösung von etwa 4 Hz (250 ms / Bild). Kurzem Biolumineszenz basierende GFP-Aequorin wir konnten Raïse die Aufnahmezeit von bis zu 100 ms / frame mit der EMCCD-Kamera und sogar bis zu 120 Bilder / s (8,3 ms / frame) mit der Elektronenvervielfacher ICDD Kamera 10. Bei dieser zeitlichen Auflösung nähert sich der der elektrophysiologischen Techniken (im Bereich von etwa 1 ms). Während eine hohe zeitliche Auflösung ist informativ und entscheidend für die Untersuchungen, die synaptische Transmission und Stimulus induzierten Aktivität gewidmet, aber wesentliche verlängert langsamer Ca 2+ -kinetics tritt auch in Nervenzellen, beispielsweise die Ca 2+ -Freisetzung aus intrazellulären Ca 2+ -Speicher (für einen Überblick: Berridge et al, 2003 13.). Für diesen letzteren Typ ist eine langsamere zeitliche Auflösung noch annehmbar, während umgekehrt, sie erfordern in der Regel eine bessere Ca 2+ -Affinität von dem Sensor erkannt wird. Diese Anforderung mit GFP-Aequorin worden, um die Freisetzung der intrazellulären Ca 2+ -Speicher am Axonterminal des olfaktorischen recept detektierenors Neuronen 7,8. Alternativ, abhängig von den gewünschten experimentellen Bedingungen konnte langsamer Erfassungszeit verwendet werden. Zum Beispiel im Lang O / N-Aufnahmen haben wir eine 2 sec Integrationszeiten aufgrund der großen Anzahl von Datenpunkten gesammelt (Minocci et al., 2013) verwendet. Kurz gesagt, ist eine praktische Funktion mit der Biolumineszenz, dass die zeitliche Auflösung können leicht nach den gewünschten Versuchsbedingungen angepasst werden.
Alternative Kammern (Setup-Fliege) wurden entwickelt, um die Ziele des Experiments zu erleichtern. Zum Beispiel für die Studien auf der Basis natürlicher Geruchsreiz, die Antenne muss freigehalten werden, damit ein Ansatz, wie die von A. Fiala 14 entwickelt, eignet sich am besten (wir einen ähnlichen Ansatz für Murmu et al. 2010 verwendet). Kurz gesagt wird bei diesem Ansatz ist der Fliegen tethered (geklebt) auf einem minutien Stift am Hals, der an einem Kunststoffdeckplättchen, die ein kleines Loch geklebt wird. Eine Dichtung geschaffenum die Oberseite des Kopfes der Fliege. Danach wird ein Tropfen der Rufton auf den Kopf aufgebracht, und der Kopf Kapsel seziert. Derart sind die Antennen frei gehalten und sind um Gerüche zu messen. Ähnlich wird für die Langzeit-Aufzeichnung, wie O / N oder sogar einige Tage 10 die Fliege muss frei von Einschränkung wie möglich gehalten werden, und in einigen Fällen zugeführt (beispielsweise mit einer Kapillare Papier in einer 5% Glucose getränkt Lösung). Unter diesen Umständen Fiala Ansatz ist auch besser geeignet als der Ansatz in der blauen Pipettenspitze (Schnorcheln Methode).
Alle Arzneimittelanwendungen können extern mit einem 6-fach Multi-Ventile Schwere Durchblutungssystem gesteuert werden. Die Strömung kann mittels volumetrischer Perfusion Regler vor jeder Aufzeichnungssitzung für einen Fluss von 2 ml / min kalibriert gesteuert werden. Drainagevorrichtung extrahiert Flüssigkeit bei einer Rate von 2 ml / min von der Aufzeichnungskammer über Peristaltikpumpe ermöglicht einen kontinuierlichen Fluss.
ImEinige Bedingungen, aufgrund von teuren Kosten für das Medikament und / oder die Menge an Wirkstoff zu verwenden, möchte man nur geringe Mengen an Verbindungen anzuwenden. Somit ist es notwendig, in dem Bad nicht durch Perfusionssystem direkt anwenden. In diesem Fall muss der Verschluss bei diesem Vorgang geschlossen werden, um das Licht Kontamination zu vermeiden.
Analyseverfahren
Zählungen pro Sekunde oder Zählungen pro Sekunde pro Koordinate haben sowohl von unserer Gruppe für die Analyse verwendet. Zählungen pro Sekunde ist vielleicht am besten für helle Reaktionen ganz Strukturen wohin Zählungen pro Sekunde geeignet und je Koordinate (was eine Normalisierung der Antworten auf die Größe des ROI darstellt) ist am besten geeignet und genau für kleine Populationen von Zellen. Beide können leicht in der Analyse-Software ausgewählt werden.
Eines der wichtigsten Vorteile der Verwendung des Biolumineszenz-Ansatz ist der Weg, der (x, y, t Parameter erfasst und gespeichert werden die Datenjeweils emittierten Photonen). Tatsächlich, während alle anderen bildgebenden Verfahren verwendet Standardmodus als erworbenes Vollbild (in der Regel in einem TIFF-Format), die mit diesem System erwirbt wir nur die relevanten und signifikantes Signal, indem nur die Pixel-Koordinaten, die bei einer durch das Licht aktiviert wurden, zuvor festgelegte Zeitdauer (die der Erfassungszeit oder zeitliche Auflösung entspricht). Folglich ist die Speicherung der Daten wirklich "Licht" im Vergleich zu dem Speicher ein Vollbild, und folglich ist es leichter, die Daten zu analysieren. Für die Datenanalyse, verwenden wir eine zugehörige Software (Photon-Viewer), die Einstellung der Akkumulationszeit können nach Wunsch. Dann kann die Anzeige eines Bildes der Signale wie in einem Ziel überzeugend dargestellt die Daten nach Wunsch eingestellt werden. Parallel werden die Ergebnisse mit der gleichen Auflösung Zeit als ihre Akquisitionszeit quantifiziert.
Bedeutung und biologische Anwendungen der Biolumineszenz-Bildgebung
Wie oben biolumineszierenden Calcium Imaging erwähnt bietet drei Hauptvorteile fluoreszierende Calciumbildgebungstechniken: (1) eine tiefere Regionen des Gehirns kann abgebildet werden, (2) Bilderzeugung kann kontinuierlich für längere Zeitspannen, wie mehrere Stunden, wie O / N und sogar in einigen auftreten Fällen bis zu zwei Tagen, und (3) in jüngerer Zeit, mit höherer zeitlicher Auflösung, bis zu 120 Bilder / s (8,3 ms). Die wichtigste Einschränkung der Biolumineszenz-Ansatz ist aufgrund seiner Unverträglichkeit mit konfokalen Beleuchtung, die folglich uns nicht erlauben, die genaue Tiefe (z-Plan) der aktivierten Strukturen oder Neuronen zu bestimmen.
Der erste Vorteil der Biolumineszenz-Bildgebung, Bildgebung von Hirnregionen, wurde zuvor im Jahr 2007 von der Abbildung einer hohen Kalium induzierten Calcium-Reaktion in der Ellipsoid Körper (EB), eine tiefe Struktur in der Mitte des Gehirns befindet, ohne vorherige gezeigt elektrophysiologische oder funktionelle Berichte 6 Ca 2+ -Aktivität im eb nach Anwendung von Picrotoxin (einem Blocker des GABA A -Rezeptoren) zeigt, dass die GABA-erge Ring-Neuronen des eb sind in der Tat hemmende Neuronen (beschrieben :. Windel et al, Artikel eingereicht).
Der zweite Vorteil, länger und kontinuierlicher Zeiterfassung, wurde in mehreren Studien aus unserem Labor ausgenutzt. Geruchsstimulation verwendet worden, um die Aktivität der Nervenzellen des Gehirns in früheren Studien 11,15,16 untersuchen. Verwendung längerfristig Bildgebung jedoch unser Labor ist es gelungen, die zuvor nicht gemeldeten Änderungen in der Kinetik in den olfaktorischen Rezeptorneuronen, um Gerüche zu zeigen. In der ersten Studie von Murmu et al. (2010) zeigten, dass während kurzer Geruchsreize (1-3 sec) zeigten ähnliche Kinetik und eine moderate Amplitudendifferenz eine längere Geruchsreiz (5 sec) verursacht eine wesentlich größere Amplitude als auch eine Änderung der Kinetik / structure der Antwort, die auf die intrazelluläre Calcium-Speichern zurückgeführt wurde. Eine anschließende Untersuchung zeigte, dass, während 5 aufeinanderfolgenden Anwendungen der 1 Sek Geruchsimpulse bei Abständen von 5 min hatte die Calcium-Reaktion nicht ändert, die Länge des Stimulus bis 5 sec führte zu progressive Dämpfung der Reaktion, was auf einen Anpassungsprozess. Außerdem erschien diese Anpassung Phänomen durch GABAerge Regulierung der zuvor identifizierten Kalziumspeichern 8 eingeleitet werden. Wichtig ist diese Daten belegen auch, dass in diesem experimentellen Bedingungen kann der GFP-Aequorin Ca 2+ -Sensor erkannt und verfolgt das Calcium aus intrazellulären Ca 2+ -Speicher freigesetzt. Eine weitere einzigartige Studie aus unserem Labor verwendet Biolumineszenz-Bildgebung O / N, um die basale (spontan) Aktivität in den gesamten neuronalen und glialen Populationen im Gehirn sowie die Aktivität in den Pilzkörpern 10 aufzuzeichnen. Diese Aufnahmen offenbart überraschende Spontanaktivität in antEnnal mechanosensorischen und Kraftzentrum (AMMC) und Antennallobus. Darüber hinaus unerwartete Zell autonome Aktivität in der Gliazellen während der Nacht auftreten. Im Pilzkörper identifiziert die Studie sowohl punktförmige Aktivität und zwei markanten Gipfeln, ein kurzer und ein langer, deren Inzidenz mit dem Alter 10 geändert.
In der jüngsten Studie in unserem Labor haben wir Biolumineszenz-Bildgebung, um die Auswirkungen der Manipulation der Sekundärsignalmoleküle in Speicher verwickelt ist, und welche sie die Calcium-Reaktion in den Pilzkörpern 9 beeinflussen. Denn obwohl dunce und rutabaga wurden vor mehr als 30 Jahren identifiziert und sind dafür bekannt, den Pegel von cAMP zu regeln, deren in vivo-Wirkungen auf die zelluläre und physiologische Mechanismen und insbesondere auf die Ca 2+ -Antwort noch weitgehend unbekannt. Mit der GFP-Aequorin Ansatz haben wir in der Lage, gleichzeitig aufnehmen sowohl den Kelch (die dendritische structurn) und die Zellkörper sowie die axonale Projektionen auf der Ebene der Lappen, und erlaubt so den Pegel und die Kinetik der Reaktion in den verschiedenen Abteilen dieses hoch komplexe Struktur korrelieren.
Die jüngste Anwendung entwickeln wir ahmt eine natürliche Reaktion durch künstlich Aktivierung neuronaler Populationen präsynaptischen an der Struktur von Interesse. Um dies zu tun wir ausdrücken, P2X 2-Rezeptor, ein Ligand-gesteuerten Kationenkanal, der in Reaktion auf ATP ist, in der präsynaptischen Neuron und exprimieren GFP-Aequorin in der postsynaptischen neuronalen Population. Die Trennung dieser beiden Elemente in verschiedenen Neuronenpopulationen erfordert zwei getrennte Expressionssysteme. Zu diesem Zweck ein LexA-Konstrukt, das GFP-Aequorin erzeugt wurde. In unseren Vorversuchen mit diesem System haben wir P2X 2 in einer Teilmenge der PNs mit der Gal4-GH146 mit UAS-P2X 2 und GFP-Aequorin im Pilzkörper zum Ausdruckmit der LexA MB247 Linie kombiniert mit LexA-13X-GFP-Aequorin. Wir haben erfolgreich Calciumantworten mit Stimulationen von 1 mM ATP zu der P2X 2 -Rezeptor im PNS (Figur 6) aufgenommen im Pilzkörper.
Im Ergebnis hat das Biolumineszenz-GFP-Aequorin Ansatz nützlich erwiesen bei der Aufzeichnung des Stimulus induzierten Ca 2+ -Aktivität, die analog zu anderen Ca 2+ -indicators sein. Aber noch wichtiger ist, es ermöglicht auch die Detektion von spontanen Ca 2+ -Aktivität im Gehirn. Dieser Ansatz eröffnet Zukunftsmöglichkeiten für Langzeitversuche und gesamte Bildgebung des Gehirns, die die Tiefe der unser Verständnis der physiologischen Erscheinungen und Aktivitätsmuster im Gehirn erhöhen können.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCl | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl2 | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1,000 µl Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | hand made | ||
| incubation box | hand made | ||
| forceps (No. 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | hand made | ||
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5 mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80 °C) |
| Microscope | Nikon | Eclipse-E800 | |
| immersion objective lens | Nikon | 20X Fluor .5w | |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | leica dissection scope and florescent lamp | |
| tight dark box | Science Wares | Custom built by Science Wares | |
| peristaltic pump | Gilson | Minipuls 2 | |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
References
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