Summary
Her presenterer vi en ny Ca 2+ -imaging tilnærming ved hjelp av en selvlysende reporter. Denne fremgangsmåten benytter et smeltet konstruksjon GFP-aequorin som binder til Ca2 + og sender ut lys, noe som eliminerer behovet for lett magnetisering. Betydelig denne metoden tillater lang sammenhengende bildebehandling, tilgang til dype strukturer i hjernen og høy tidsoppløsning.
Abstract
Funksjonell in vivo avbildning har blitt en kraftig tilnærming for å studere funksjonen og fysiologi av hjerneceller og strukturer av interesse. Nylig ble en ny metode for Ca 2+ -imaging bruker bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) har blitt utviklet. Denne nye teknikken bygger på blanding av de GFP og aequorin gener, produsere et molekyl som er i stand til å binde kalsium og - med tillegg av sin kofaktor coelenterazine - å sende ut lys som kan overvåkes via et foton samler. Transgene linjer som bærer GFP-aequorin genet er blitt generert for både mus og Drosophila. I Drosophila har GFP-aequorin genet er plassert under kontroll av en GAL4 / UAS binære uttrykk system som tillater målrettet ekspresjon og avbildning i hjernen. Metoden har senere blitt vist å være i stand til å detektere både innover Ca 2 + -transients og Ca 2+ -released fra indre butikker. Viktigst det åpner for en større varighet i kontinuerlig opptak, bildebehandling på større dyp i hjernen, og opptak ved høye time oppløsninger (opp til 8,3 ms). Her presenterer vi de grunnleggende metode for å bruke selvlysende bildebehandling for å registrere og analysere Ca 2+ -activity innenfor sopp organer, en struktur sentralt for læring og hukommelse i flue hjernen.
Introduction
Den grunnleggende mønster og funksjon av aktiviteten i hjernen og dens diskrete strukturer har lenge vært et område med intens studie innen nevro. Kanskje noen av de tidligste vellykkede tilnærminger brukes til å løse dette problemet var direkte fysiologiske målinger av endringen i elektrisk aktivitet - men alternative metoder som gjør at levende avbildning av endringer i spenning, pH eller kalsiumkonsentrasjoner (som proxy for aktivitet) har brakt flere evner til studiet av neuronal aktivitet en. Avbildningsteknikker har et bredt spekter av fordeler som redusert invasivitet og evnen til å registrere aktivitet i hele strukturer i hjernen. Videre i dyr med medgjørlig genetikk inkludert frukt fly Drosophila, utvikling av genetisk kodet kalsium indikatorer, som Cameleon, GCaMPs og andre en har tillatt forskere til å overvåke enkeltnerveceller, nevronale populasjoner og hele hjernenstrukturer. Mens mer tradisjonelle fluorescerende kalsiumavbildningsmetoder ved bruk av GCaMPs (GFP smeltet til calmodulin) eller FRET (CFP og YFP smeltet til calmodulin) har vist seg å være nyttige teknikker gir god romlig og tidsmessig oppløsning, den underliggende prosessen med lett magnetisering skaper noen begrensninger på sin eksperimentelle applikasjoner. På grunn av beskaffenheten av lys eksitasjon, autofluorescens, foto-bleking, og fototoksisitet er uunngåelig produsert, som dermed begrenser dybden av de strukturer som kan avbildes, varigheten av opptak, så vel som den virkelige tid kontinuiteten av opptaket. Med andre ord må opptak ofte utføres periodisk for å unngå disse uønskede bivirkninger.
På grunn av disse utfordringene, har flere alternative metoder for kalsium bildebehandling blitt utviklet. En av de mest lovende metodene er selvlysende avbildning, som er avhengig av lys som produseres gjennom en enzymatisk reaksjon etter kalsiumbindende. Bioluminescent bildebehandling krever ikke lys eksitasjon og dermed ikke opplever de samme problemene som vanlig kalsium bildebehandling. Bioluminescent reporter aequorin - isolert fra Aequorea victoria, det samme manet som GFP ble også isolert-binder kalsium via sine tre EF hånd strukturer og gjennomgår en konformasjonsendring, som fører til oksidasjon av sin kofaktor coelenterazine og utgivelsen av blått lys (λ = 469 nm) 2,3. Aequorin har en svært lav affinitet for kalsium (Kd = 10 pM) som gjør det ideelt for overvåking av kalsium transienter fordi det gir svært lite bakgrunnsstøy og ikke interfererer med den intracellulære kalsiumbuffersystem 4. Selv aequorin har tidligere blitt brukt til å overvåke prosessen med nevrale induksjon i Xenopus egg 5 lyset som produseres er for svak til å brukes for sanntids avbildning av neuronal aktivitet. I et forsøk på å møte denne utfordringen, Philippe Br &# 251; la og kolleger ved Pasteur Institute opprettet en genetisk konstruksjon fusing GFP og aequorin gener, etterligne naturlige tilstand innenfor maneter fire. Dette fusjons genprodukt binder kalsium igjen via de tre EF-hand strukturer av aequorin, som gjennomgår en konformasjonsendring som fører til oksidasjon av coelenterazine, som overfører energi ikke-strålings til GFP. Denne energien overføre resulterer i utslipp av grønt lys (λ = 509 nm) fra GFP, i stedet for blått lys fra aequorin. Sammensmeltingen av GFP og aequorin gir også større protein stabilitet hjelpe fusjonsproteinet produsere lys 19 til 65 ganger sterkere enn aequorin alene 4. Ved hjelp av en selvlysende tilnærming i hjernen utvider dagens eksperimentelle anvendelse av kalsium bildebehandling både når det gjelder varigheten av kontinuerlige opptak og antall strukturer i hjernen som kan tas opp. I store trekk i sammenheng med tidligere arbeid, betyr det at både globalt og en størrerekke regionalized "aktivitet" i hjernen kan overvåkes (gjennom proxy av kalsium transienter). Enda viktigere aktivitet kan overvåkes for lenger, i sanntid og kontinuerlig basis, som lett lar seg i jakten på en fullstendig forståelse av basal funksjon i hjernen.
I de siste årene har vår lab og andre utviklet transgene fluer uttrykker GFP-aequorin under kontroll av den binære uttrykk system (GAL4 / UAS-GFP-aequorin) 5,6. Vi har benyttet GFP-aequorin bioluminescens å registrere aktivitet produsert av naturlige stimuli som duft 7,8, samt studert de cellulære komponenter som modulerer Ca 2+ -activity i sopp organer følgende acetylcholin reseptor stimulering ved direkte påføring nikotin 9. I tillegg har vi også brukt GFP-aequorin å løse en rekke eksperimentelle spørsmål som ikke har vært i stand til å bli tatt opp tidligere, som langsiktigavbildning av spontane kalsium transienter og visualisering av dypere strukturer i hjernen 10. Mer nylig har vi brukt GAL4 / UAS system for å uttrykke pattedyr ATP reseptoren P2X to 11 et kation kanal, i projeksjons nevroner (PNS) og brukt Lexa systemet til å uttrykke GFP-aequorin i sjampinjong organer (MB247-Lexa, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (a courtesy of B. Pfeiffer, Janelia Farm, USA). Dette har tillatt oss å aktivere PNS ved anvendelse av ATP, som i sin tur aktiverer de sopplegemene (et nedstrøms målet for PNS), etterligne flere naturforhold, slik som respons på en stimulus lukt. Totalt denne teknikken kombinerer P2X 2 og GFP-aequorin utvider de eksperimentelle muligheter. Grovt det gir mulighet for bedre å forstå mønstre av aktivitet i hjernen, initiere nye studier om hvordan ulike stimuli og forstyrrelser kan endre basal mønster av aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klargjøring av prøver
- Utarbeidelse av løsninger og sette opp
- Opprettholde alle bananflue linjer ved 24 ° C på standard mat medium. Bakre og holde dem ved lav tetthet i flasken for å generere standardisert størrelse og vekt av fluer.
- Tilsett 10 jomfruelige kvinner med 10 menn i et hetteglass, la dem parre seg og overføre dem hver 2 dager til en frisk hetteglass. Så 10 dager senere, når fluene begynner å ELukk, høste fluer hver dag. Hold en nøyaktig oversikt over alder av fluer og holde dem i god stand.
- På dag 3, skille hannene fra hunnene og holde hunnene 20 fluer per hetteglass. Spill fluene på 4 eller 5 dager gammel.
- Forbered Ringers løsning med de følgende konsentrasjoner: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES og 36 mM sukrose, og juster pH av løsningen til nøyaktig 7,3. Forbered perfusjon oppløsninger på 25 μ; M nikotin og 100 mM KCl i Ringers løsning.
- Forbered 1000 mL pipette tips: ved hjelp av et barberblad form tips til en skrå (ca 35 ° fra slutten av tuppen) og fjerne overflødig grunnlag utover 1 ½ centimeter fra spissen.
- Forbered boks for lagring (23 cm x 17 cm x 8,5 cm) av prøven under inkubasjon. Plassere to svamper (12 cm x 8 cm x 3 cm) mettet med vann i bunnen [for å hindre at prøven uttørking] under et lite stativ apparat for å plassere prøvene på som deres fremstilling er fullført.
- Forbered fluer prøver slik at de inneholder minst ett eksemplar av UAS-GFP-aequorin og ett eksemplar av en Gal4 linje å kjøre uttrykk for GFP-aequorin. OK107 Gal4 linje (en linje kjøring uttrykk hovedsakelig i sopp organer) er krysset med UAS-GFP-aequorin i dette preparatet.
MERK: Innsiden av boksen må være vanntett og utsiden må blokkere lys inn boksen for å hindre nedbrytning av coelenterazine under inkubasjon.
- Opprettholde alle bananflue linjer ved 24 ° C på standard mat medium. Bakre og holde dem ved lav tetthet i flasken for å generere standardisert størrelse og vekt av fluer.
- PrepFraskilling av prøver
- Ice bedøve Drosophila ved å overføre det til en glassflaske og holde på is i to minutter før han ble flyttet til kjølt petriskål for posisjonering i pipettespissen. Forbered pipettespisser på lett fuktet filterpapir i 100 ml petriskål på is under disseksjon mikroskop.
- Forsiktig med pinsett sted fly innsiden av pipettespissen.
- Ved hjelp av en børste forsiktig presse og justere fly slik at hodet er helt utenfor kanten av tips og rygg regionen er delvis eksponert ved seksjonen fjernes under tips shaping (figur 2B).
- Kombiner en liten (omtrent 3-4 ul) i partier av de to komponentene i tann lim. Påfør lim nøye rundt foran og bak hode og hals ned til og rundt pipettespiss kanten - unngå kronen av hodet. La limet tørke i 2 min.
- Plasser pipettespissen med limt fly gjennom hullet i opptak kammeret (figur 2D) og gently trykke på for å sikre plass.
- Kombinere de to komponentene av silisium lim (ca. 3-4 ul). Påfør lim på den flate siden av kammeret langs kanten der kammeret og pipettespissen møtes for å forhindre lekkasje av Ringers løsning. La limet tørke i 2 min.
- Disseksjon
- Påføre tape over perfusjonen kanal med kortsiden og som strekker seg til baksiden av kammeret.
- Plasser kammer med flue på disseksjon kloss under mikroskop sving på lysrør. Pipettér 1 ml Ringers løsning inn i kammeret.
- Bruk fin kirurgisk kniv for å fjerne skjellaget. Gjør parallelle snitt fra baksiden av hodet til antennal regionen. Deretter kuttet langs kanten av øyet deretter foreta en vinkelrett snitt over antenne kobler de tidligere snitt. Foretar en endelig snitt parallelt med det på baksiden av hodet. Bruk den fine skarpe pinsett til å fjerne skjellaget (Figur 2C).
- Bruk tynne skarpe pinsett for å forsiktig gripe end fjerne eksponert luft vev til hjernen og [fluorescerende] sopp kroppen er tydelig visualisert.
- Bruk ultra-skarp pinsett til å nøye forstå og klemme neuroepithelial vev som dekker hjernen for å tillate gjennomtrengning av coelenterazine.
MERK: Alternativt papain kan brukes til å permeabilize neuroepithelia 9. - Ved hjelp av en pipette, vaske ut to ganger med Ringer løsning for å fjerne eventuelle rester fra disseksjon og sted prøven i den mørke boksen.
- Pipettér 1 ml Ringer-oppløsning inneholdende 5 mM benzyl-coelenterazine inn i kammeret. Lukke boksen og tillater inkubering med coelenterazine ved romtemperatur i minst 2 timer.
2. Imaging
- Setup
- Start opptak system: slå på mikroskop, datamaskin, kamera og avløpssystemet og sette rommet miljøkontroller til 25 ° C.
- Åpne Måling og Automatisering Explorer program på datamaskinen. Klikk på & #8220; Enheter og grensesnitt ", og dobbeltklikk på" Ni Motion Devices "og til slutt Høyreklikk på" PCI-7334 "og velg" starter enheten ".
- Åpne Photon Imager. Opprett ny mappe og navn første innspilling fil. Kameraet må nå -80 ° C før systemet vil fungere.
- Sett opp perfusjon system - legg KCl, nikotin, og Ringers løsning reservoarer og justere slik at hver løsning utslipp på 2 ml / min. Vask med Ringer løsning før du starter eksperimentet.
- Forberede prøven
- Place bildebehandling montere blokk rett på fjellet etter mikroskop med 5x forstørrelse og sett perfusjon rør inn kanalen gjennom punktering.
- Satt mikroskop for å fluorescerende modus deretter sentrum og ta sopp organer (MBS) i fokus. Juster til 20X og re-senter og fokus.
- Posisjon drenering-apparat over dreneringsbasseng, juster høyden på drenering shunt slik at spissen er bare above basseng, og kjøre Ringers løsning i 30 sek for å sikre tilstrekkelig drenering.
- Trekk ned skjold for å stenge av apparatet mot lys. Bruk av automatiserte system i foton imager foreta mindre justeringer av fokus og ta et referanse fluorescerende bilde av MBs.
- Innspilling
- Juster foton hastigheten til ønsket opptakshastighet (fra 50 ms opp til 1 sek eller mer). Velg foton modus og åpne lukkeren. Record genotype, kjønn, alder og prøvenummer i loggoppføringene. Juster posisjon ROI bokser enn beger og cellelegemer (CCB) og medial lapper ved å klikke på ROI boksene og dra mens du holder kontrollen.
- Record baseline i omtrent 5 til 10 min (etter ønske).
- Gjelder nikotin i 1 min. Oppmerksom på start / stopp i loggen. Vask med Ringer løsning for 5 min.
- Vent 5 min for utvinning og forberede KCl loggen og tidsur.
- Påfør KCl i 1 min. Oppmerksom på start / stopp i loggen. Vask med Ringer løsning i 1 min.
- Bytte omtil fluorescerende modus, ta endelige fluorescerende image, og slå av Ringers løsning.
- Trykk på "Stop". Dialogboks vil be om å slå av systemet. Velg "Nei" for å fortsette innspillingen.
- Åpne skjold, flytte dreneringssystemet, bytte objektiv objektiv til 5X, fjerne perfusjon tube. Fjern prøven / opptak rett fra scenen, rydde av 20X objektiv ved å skylle og tørke linsen to ganger med vann.
- Trykk den hvite play-knappen øverst i programvinduet for å starte neste innspilling.
3. Analyse og Video Creation
- Pakk foton verdier
- Åpne foton analyseprogram (f.eks Photon Viewer) og åpne første prøven regneark.
- Velg fanen vise kontroll. Velg ROI ved å klikke på regionen mens du holder kontrollen. Justere størrelse, orientering og formen på områder av interesse å omfatte GFP opplyst CCB og mediale fliker.
- Legg et tilleggal ROI ved å klikke "Definer ROI" og klikke og dra på skjermen for å opprette den nye ROI.
- Velg "Movie" -kategorien for å spille foton video. Juster "sec bredde" og "sec skritt" som ønsket. Omstille ROI plassering etter behov.
- Velg representative skjermbilder av GFP fluorescens, nikotin respons og KCl respons. Crop skjermbilder og lime bildet inn i en presentasjon lysbilde for senere analyse og sammenligning.
- Justere både "sec bredde" og "sec steg" til opptakshastighet i løpet av sekunder. Velg lengde på analyse ved å flytte grå markører på toppanelet til braketten regionen før stimulus initiering og like etter respons slutt.
- Velg "Suspend utsikt mens du spiller" trykk "<< REW" og trykk "PLAY>". Velg fanen "Count Rate Chart" og juster enheter som ønsket og linje farger for å matche ROI farge.
- Når analysen er ferdig, Trykk på "Export Count Rate data". Velg skjermbilder av kombinert opptak CCB og medial lobe regionen av interesse fra hver side. Crop skjermbilder og lime bildet inn i et lysbilde med respons bilder. Denne glide senere vil bli brukt i endelige analysen.
- Eksempel Analyse: en metode for analyse av ekstraherte foton data detaljert
- Åpne regnearkfiler i "tellerate Eksport" -mappen.
- Formater cellene den første kolonnen tid til å vise klokkeslett i timer og minutter.
- Referere til tilsvarende sklie for prøven. Fjern alle verdier unntatt kolonner for tiden og de to representative ROIs.
- Bestem nikotin stimulering starttid - tilgjengelig i loggen fil i hoved Mapper fjerne flere data før start eller høydepunkt verdi.
- Finn høyeste / toppverdi for både CCB og medial lapp og mark / høydepunkt.
- Bestem respons start- og sluttidspunkt for bådeCCB og medial lapp ved å opprette et estimat bruker tid poeng fra tilsvarende fremstilt grafisk respons på lysbildet og velg virkelig verdi ved endring i verdier i tilknytning til disse punktene. Markere regionen mellom disse punktene i både CCB og mediale fliker. Alternativt kan du bruke en makro 9.
- Kombiner alle prøver av en eksperimentgruppe på et nytt regneark.
- Juster på topp ved å bestemme raden verdi for hver CCB toppverdien. Trekk fra de lavere verdier fra det høyeste rad verdi for å bestemme omtrentlig rad verdi der at utvalgsdata må recopied til. Kontroller at alle toppverdier er justert.
- Kopier arket to ganger og slett enten mediale lobe kolonner eller CCB kolonner lage sider med bare CCB eller medial lobe verdier.
- Fjern data etter at alle CCB svarene er avsluttet. Lag fire rader merket Totalt Fotoner, Response Lengde (varighet), Peak Amplitude og Response Latency. Kopier og lim inn denne igjen under originalene.
- Bruk SUM-funksjonen for å bestemme de totale fotoner under svaret. Bruk ANTALL-funksjonen for å bestemme lengden på respons. Kopier og knytte høyeste verdien celle for å avgjøre peak amplitude verdi. Bruk COUNT funksjon - å velge fra begynnelsen av perfusjonen av nikotin til starten av responsen - å bestemme Response Latency.
- Kopi verdier ved hjelp av linking funksjon og multipliser (alle unntatt peak amplitude) av opptakshastighet i løpet av sekunder.
- Bar / boks grafer kan være skapt for beregnede parametere som Total Fotoner, Peak Amplitude og Response Lengde, hvis det er ønskelig (ex .: figur 5B, C, D).
- I kolonnen etter rådata foton respons, gjennomsnittlig rå datapunktene for hvert tidspunkt ved hjelp av gjennomsnitt funksjonen. Dersom det er ønskelig å følge en kolonne bestemme standardfeil av middelverdien (SEM), for hver av gjennomsnittsverdiene ved et foton tidspunkt.
- Bruk den gjennomsnittlige kolonne for å konstruere en gjennomsnittlig svartid profile [Graf] for CCB utvalgsgruppe. For å gjøre dette velger du kolonnen angi tid som x-aksen verdier og kolonnen av gjennomsnittlig foton verdier som y-aksen og til slutt velge scatterplot grafen etableringen verktøyet.
- Gjenta denne fremgangsmåten analysen med data fra de mediale fliker.
- Lage bilder for video
- Åpne foton seer.
- Velg vise kontroll fanen. Klikk på ROI mens du holder kontrollen for å velge, fjerne og / eller minimere den.
- Endre "sec bredden" (opphopning tid) etter ønske for å bestemme innholdet av hver ramme.
- Endre "sec trinn" for å definere overlapping av hver ramme.
- Velg "eksport utsikt mens du spiller" trykk "<< REW" og deretter "PLAY>". Bildene for videoen vil bli eksportert til "View eksport" -mappen som en serie av PNG-filer.
- Ved hjelp av Virtual Dub å lage video: en metode for video creation detaljert
- Opprett en ny mappe som heter "resultats" i visningen eksporten mappen som inneholder bildene.
- Ta script (renommer.VBS) inn i mappen med bilder.
- Dobbelklikk på renommer.VBS å kjøre.
- Bildene vil automatisk bli omdøpt numerisk og kopieres til "resultats" -mappen.
- Åpne VirtualDub.exe.
- Velg åpent videofil - velg det første bildet (påfølgende bildene vil automatisk laste).
- Velg video - velg bildefrekvens justere etter behov.
- Velg video - velg komprimering velge Cinepak Codec av radius.
- Velger i fil Lagre som AVI videoen vil bli opprettet automatisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sammensmeltingen av GFP til aequorin tillater oss å visualisere vår region av interesse før bioluminescent avbildning gjennom eksitasjon av GFP i fluoriserende modus på mikroskop (figur 3A, 4A, 6A, 6E). En av de enkleste måtene å stimulere sopp organer er gjennom aktivering av ionotrope nikotin acetylkolinreseptorer. Selv acetylkolin er den endogene ligand for denne reseptor har vi funnet at nikotin gir mer reproduserbare responser hos sopp organer. Dette er delvis fordi de spesifikt uttrykker de nikotiniske acetylkolinreseptorer, og således ved hjelp av nikotin kan vi unngå aktivering av de muskarine acetylcholin-reseptorer uttrykt andre steder i hjernen. Videre er nikotin mer stabil enn acetylkolin, og således muliggjør en bedre og mer pålitelig stimulus kontroll. En typisk reaksjon starter med den raske aktivering av både beger, celle-legemene (CCB) og mediale fliker (ml) (se Figur 4En for merket bilde). Vanligvis CCB reaksjon varer lenger og oppviser en større bioluminescent respons enn flikene som vist i de etterfølgende paneler av respons (figur 3C-H). Figur 4B viser en 10 sek akkumulering av fotoner som er tatt opp på en tidsmessig oppløsning på 100 ms (10 Hz) under toppen av en respons på et 1 min perfusjon med 25 uM nikotin. Etter en utvaskingsperiode og gjenvinning av 10 min en andre stimulering av en 1 min perfusjon av 100 mM KCl startes (figurene 4C, E), som gjør det mulig for oss å bekrefte vår levedyktigheten til prøven. De kvantitative tiltak kan analyseres ved å velge ROI under analysen i foton viewer. Kjører analysen i foton viewer produserer både grafer som viser antall fotoner som slippes i utvalgte ROI over tid (figur 4D og E) samt eksporteres regneark av disse verdiene. Figur 4D er en example av grafene produsert av foton seer plotte fotoner som sendes ut i ROI 2 [green] (høyre CCB) og ROI 4 [blue] (høyre mediale fliker). Lignende data for KCl responsen vist i figur 4E. De eksporterte dataene kan brukes til å rekonstruere kurven for responsen (figur 5A) så vel som for å trekke ut ytterligere data om forskjellige parametere så som varighet, toppamplitude, og total respons (figur 5B-D). Nylig hjelp Gal4-UAS og Lexa systemene vi har utviklet en metode for å utløse en mer naturlig reaksjon. Kort fortalt er det ATP-gated P2X to kasjon kanal uttrykt i projeksjons nevroner (PNS) og GFP-aequorin (GA) er uttrykt i sopp organer - et mål av PNS; Dette tillater oss å selektivt opphisse PNS om anvendelse av ATP, som kan i sin tur gi respons i sopp organer (Figur 6).
Figur 1. Kjennetegn på Bioluminescent Reporters (GFP-aequorin). (A) Skjematisk av GFP og aequorin fusjonsgen med oppstrøms aktivering sekvens. (B) Modell av blått lysemisjon ved aequorin i respons til høye nivåer av Ca 2+. (C) Modell av grønt lys utslipp av GFP-aequorin i respons til høye nivåer av Ca 2+. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Experimental satt opp. (A) Fly posisjonert i pipette tips. (B) En illustrasjon av tilstrekkelig liming teknikk å stabilisere hodet og forsegle området mellom fluelegeme og pipettespiss. (C) Skjematisk av disseksjon å åpne hodet kapsel. (D) 1 ml kammer på å holde blokk med perfusjon rør inn. Totalt kammer dimensjoner: lengde: 7,4 cm, bredde: 2,7 cm, høyde: 0,55 cm. Indre kammer dimensjoner: lengde: 1,7 cm, bredde: 1,4 cm, høyde: 0,35 cm, og radien av kammeret hullet: 0,1 cm. (E) Utsikt over flua hode viser GFP-positive signal i MBs: lav svakt lys med fluorescens avledet fra OK107-drevet GFP-aequorin etter fjerning av skjellaget. (F) mikroskop med foton kamera og perfusjon system. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Representant respons på 25 mikrometer nikotin i sopp organer. (A) Fluorescent bilde avGFP-aequorin uttrykk i sopp organer i GA2 / +; OK107 / + kontroll fly hjernen (skala bar = 50 mikrometer). (B) Peak bioluminescent respons i sjampinjong organer. (C) før stimulering. (D) Start på respons. (E) Peak respons. (F) Fortsatt CCB respons. (G) Falling CCB respons. (H) Slutt på respons (BH: skala bar = 33 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Representant analyse av prøven opptaket (A) Fluorescent bilde av sopp kroppen av GA2 / +;. OK107 / + kontroll fly med fire ROI er valgt i løpet av de CCB og mediale lapper (skala bar = 50 um). (B) 10 sek opphopning av bioluminescent respons på 25 mikrometer nikotin - foton respons bokført til 100 msek. (C) 10 sek akkumulering av bioluminescerende reaksjon på 100 mM KCl innspilt på 100 msek. (D) Diagram over registrerte antall fotoner som sendes ut i løpet av nikotin svar innen ROI er 2 og 4 som dekker høyre CCB og mediale lapper hhv. (E) Diagram over registrerte antall fotoner som sendes ut i løpet av KCl svar innen ROI er 2 og 4 som dekker de rette CCB og mediale fliker, henholdsvis. I d og e, tilsvarer den venstre Y-aksen til det totale antall fotoner innenfor hele synsfeltet, mens den høyre Y-aksen tilsvarer fotoner innenfor ROI. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Representative parametere analyse av prøven opptak representant excel analyse av bioluminescent respons på nikotin aktivering av sopp kroppen i GA2 / +;. OK107 / + kontroll fly. (A) Photon respons over tid i CCB og mediale fliker. (B) Varighet av reaksjoner i CCB og mediale fliker. (C) Høyeste foton verdi (maks amplitude) i løpet svar innen CCB og mediale fliker. (D) Totalt fotoner innenfor CCB og mediale fliker av hele svaret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. To forskjellige svar på sopp organer etter stimulering av PNS through ATP og P2X to. Eksempel en flue uttrykker P2X 2 i PNS og GFP-aequorin i sopp organer (GH146 / +; P2X 2 / MB247-Lexa, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (ad) (A) Fluorescent bilde av sopp organer med ROI-tallet (skala. bar = 50 mikrometer). (B) Bioluminescent bilde av maksimal respons i sopp organer etter aktivering av PNS etter P2X to stimulert med 500 mikrometer ATP, observert hovedsakelig i mediale fliker. (C) Bioluminescent bilde av peak KCl respons. (D 2 / MB247-Lexa, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (eh P2X;) Tid løpet av foton emisjon innen ROI regioner, gjennom responsen Sample to fly uttrykke P2X 2 i PNS og GFP-aequorin i sopp organer (GH146 / +. (F) Bioluminescent bilde av den induserte respons i soppen organer etter en). (E) Fluorescent bilde med ROI-tallet (skala bar = 50 mikrometer).ctivation av PNS av P2X to stimulert med 1 mM ATP, både i fliker og CCB. (G) Bioluminescent bilde av peak KCl respons. (H) Tid løpet av foton emisjon innen ROI regioner, hele svaret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nylig utviklet bioluminescent-baserte GFP-aequorin tilnærming som presenteres her muliggjør in vivo funksjonelle opptak av Ca 2+ -activity i forskjellige neuroner, samt om ønsket, i andre slags celler slik som nyre stelceller som rapportert i Cabrero et al. 2013 5.
Modifikasjoner, feilsøking, tilleggskomponenter, og kritiske trinn
Drosophila Husbandry
GFP-aequorin transgenet (pG5A) 4 ble satt inn i vektoren for å skape pUAST tre uavhengige transformlinjer 6. Alle linjer ble testet for deres bioluminescens, og alle var i stand til å svare på de in vivo Ca 2+ -activity 6. Men nyere eksperimenter har påpekt at GA2 linje inn på den tredje kromosom genererer mer robust signal enn GA1 linje satt on det andre kromosomet. Her ble de representative resultater oppnådd ved hjelp av UAS-GA2 krysset med MB-spesifikke linje OK107. Videre nylig B. Pfeiffer har generert et GFP-aequorin konstruksjon plassert under kontroll av 20XUAS regulerende element (20X-G5A-2), og denne konstruksjon har blitt validert i vårt laboratorium. I korthet, det gir et meget sterkt signal, sterkere enn vår standard GA2, som derfor bør være mer effektiv og nyttig for ytterligere å overvåke Ca 2+ -activity i dypere strukturer i hjernen, slik som ellipsoide-legemet. I tillegg kan det også være nyttig for å avbilde små mengder av nerveceller eller i axon terminalene (synaptiske kontakter).
Forberedelser til Imaging
Selv om fly må is bedøvet under posisjonering og liming, er det viktig å minimere tiden på is. Fluer skal overføres til en glassflaske og holdt på is i 2 minutter før den ble beveget til den nedkjølte petriskålfor posisjonering i pipettespissen. Vi har lagt merke til at lengre tidsperiode av anestesi reduserer levedyktigheten av prøven, og kan svekke responsen. Optimalt, holder vi den tiden av isen anestesi under 5-10 min.
Taping og liming er kritiske trinn. Det er avgjørende for å sikre fly hodet i stedet for disseksjon og avbildning, samt for å hindre lekkasje av Ringers løsning inn i pipettespissen, og / eller ut av opptakskammeret. Dental lim (og i mindre grad silikon lim) blir klebrig, og deretter begynner å tørke så snart som de to komponentene kombineres. Derfor er det viktig å påføre limet raskt for å unngå svak binding og klumping av limet. I noen tilfeller har vi lagt merke til at alternative varianter av tape og lim, når du er i kontakt med Ringers løsning, kan frigjøre forurensninger inn i Ringers løsning som kan påvirke fly og dens respons, spesielt så for eksperimenter dedikert til tHan studerer av luktsystemet, ved hjelp av ulike lukter. Derfor må du være forsiktig her hvis erstatte materialer (se materialer for spesifikke varianter vi bruker).
Flere forskjellige former for coelenterazine har blitt utviklet for å optimalisere dets aktivitet for eksempel hastigheten til lysemisjon, Ca 2+ -affinity (følsomhet), eller intensiteten av lysemisjon 12. For eksempel er den opprinnelige coelenterazine mer stabil, og dermed bedre egnet for langtids avbildning som flere timer, mens den benzyl-coelenterazine (også kalt h-coelenterazine) resulterer i en raskere og høyere lysemisjon med kortere halveringstid. For mer informasjon om ulike former for coelenterazine, se web-adresse i Materials List.
Imaging
Bioluminesens signaler kan overvåkes med en elektron multiplikator CCD-kamera (EM-CCD, avkjølt til -80 ° C) montert på et mikroskop. Dette oppsettet må be plassert inne i en tett mørk boks for å unngå uønsket (ambient) lys forurensning. Oppsettet er beskrevet i dette manuskriptet bruker en 20X nedsenking-objektiv som tillater et synsfelt på 400 x 400 mikrometer (512 x 512 piksler). For å forbedre signal-til-støy-forhold, ble data ervervet med en 0,100 sek integrasjonstid (10 Hz), og 2 x 2 binning ble anvendt (1 piksel = 1,2 x 1,2 um). Til å erverve og lagre data, ble hvert oppdaget foton tildelt x, y-koordinater og et tidspunkt. Mellom 500 og 600 nm bølgelengde, er EM-CCD-kamera (se nøyaktig beskrivelse i Materialer List) har et kvantumutbytte på 96%.
En av de mest avgjørende parametre for den in vivo funksjonelle avbildning av hjernen er tidsmessig oppløsning. Opp til nå, de fleste av fluorescens-baserte Ca 2+ -imaging teknikk, slik som GCaMP og Came gir en tidsmessig oppløsning på ca. 4 Hz (250 msek / ramme). Nylig, med bioluminescens basert GFP-aequorin har vi vært i stand til Raise oppkjøpet tid opp til 100 msek / ramme med EMCCD kamera og med opp til 120 bilder / sek (8,3 ms / ramme) med elektron multiplier ICDD kameraet 10. Ved dette tidsoppløsningen nærmer seg den til de elektrofysiologiske teknikker (i området fra ca 1 millisekunder). Mens høy tidsoppløsningen er både informativ og avgjørende for studiene dedikert til synaptisk overføring og stimulans indusert aktivitet, utvidet saktere likevel viktig Ca 2+ -kinetics også skjer innen nevroner, for eksempel Ca 2+ utgivelse fra intracellulære Ca 2 + -stores (for en gjennomgang: Berridge et al 2003 13.). For denne sistnevnte type, er en langsommere tidsmessig oppløsning fremdeles er akseptabel, mens omvendt, at de generelt krever en bedre Ca 2+ -affinity fra sensoren som skal påvises. Dette kravet er oppnådd med GFP-aequorin å oppdage utgivelsen av intracellulære Ca 2+ -stores på axon terminalen lukte receptORS nevroner 7,8. Alternativt, avhengig av de ønskede forsøksbetingelsene, langsommere innhentingstiden kan benyttes. For eksempel, i lang O / N innspillinger, har vi brukt en 2 sek integrasjons ganger på grunn av det store antallet innsamlede datapunktene (Minocci et al., 2013). I korte trekk, er en praktisk funksjon med Bioluminescens at tidsoppløsningen kan enkelt justeres i henhold til de ønskede forsøksbetingelser.
Alternative kamre (fly oppsetts) har blitt utviklet for å forenkle målene for forsøket. For eksempel, for de studier basert på naturlig lukt stimulans, antennen må holdes fri, derfor en tilnærming som den utviklet av A. Fiala 14 er best egnet (vi brukte en lignende tilnærming for Murmu et al. 2010). I korthet, i denne metoden, er det fly bundet (limt) på en minutien tapp i halsen, som er limt til en plastdekkglass inneholdende et lite hull. En tetning opprettesrundt toppen av hodet på flua. Deretter blir en dråpe ringe avsatt på hodet, og hodet kapselen dissekert. På en slik måte, er antennene holdes fri og er tilgjengelig til å oppfatte lukt. Tilsvarende, på lang sikt opptak, som O / N eller dagene 10 flue trenger å være så fri for begrensning som mulig, og i noen tilfeller tilføres (for eksempel med en kapillær papir dyppet i en 5% glukose løsning). Under disse omstendigheter Fiala tilnærming er også bedre egnet enn tilnærmingen i det blå pipettespiss (snorkeling metoden).
Alle stoffet applikasjoner kan styres eksternt ved hjelp av en 6-veis multi-ventiler tyngdekraft perfusjon system. Flyten kan styres ved hjelp av volumetriske perfusjon regulatorer kalibrert før hver innspilling sesjon for en strøm av 2 ml / min. Drenering apparat trekker væske med en hastighet på 2 ml / min fra opptakskammeret via peristaltisk pumpe som tillater en kontinuerlig strøm.
Ivisse forhold, på grunn av dyre kostnadene for medikamentet og / eller mengden av legemiddel i bruk, vil man gjerne å anvende bare små mengder av forbindelser. Således er det nødvendig å bruke den direkte i badet i stedet for via perfusjonssystemet. I dette tilfellet lukkeren må være lukket under denne prosess for å unngå lys forurensning.
Analysemetoder
Tellinger per sekund eller tellinger per sekund per Koordinasjon har begge blitt brukt av vår gruppe for analyse. Tellinger per sekund er kanskje best egnet for lyse responser i hele strukturer, mens tellinger per sekund og per koordinere (som representerer en normalisering av svarene til størrelsen på ROI) er best egnet og nøyaktig for små populasjoner av celler. Begge kan lett bli valgt i analyseprogramvare.
En av de viktigste fordelene ved å bruke Bioluminescens tilnærming er den måten som er kjøpt og lagres dataene (x, y, t parametere avhver slippes ut fotoner). Faktisk, mens andre imaging teknikker som brukes standardmodus som en ervervet hele bildet (som regel i en tiff-format), med dette systemet, får vi bare relevant og viktig signal ved å lagre bare de pikselkoordinater som har blitt aktivert av lyset under en pre-fast varighet av tiden (som tilsvarer den innhentingstiden eller tidsoppløsning). Følgelig, er lagringen av data virkelig "light" i forhold til lagrings et fullstendig bilde, og følgelig gjør det lettere å analysere dataene. For dataanalyse, bruker vi en tilhørende programvare (foton viewer), som tillater innstilling av opphopning tid som ønsket. Deretter visning av et bilde av signalene kan justeres etter ønske i et mål for å overbevisende presentere dataene. Parallelt resultatene er kvantifisert med samme oppløsning tid enn anskaffelses tid.
Betydning og biologiske anvendelser av bioluminescent bildebehandling
Som nevnt ovenfor bioluminescent kalsium avbildning har tre prinsipielle fordeler med fluorescerende kalsiumavbildningsteknikker: (1) en dypere områder av hjernen kan avbildes, (2) avbildning kan skje kontinuerlig for lengre varigheter som flere timer, for eksempel O / N, og til og med i noen tilfeller opp til to dager, og (3) mer nylig, med en høyere tidsmessig oppløsning, opp til 120 ramme / sek (8,3 ms). Den største begrensningen av bioluminescent tilnærmingen er på grunn av sin inkompatibilitet med konfokalt belysning, som dermed ikke tillate oss å fastslå den nøyaktige dybde (z-plan) av de aktiverte strukturer eller nerveceller.
Den første fordelen med selvlysende avbildning, avbilding av dype områder av hjernen, ble tidligere demonstrert i 2007 ved avbildning av et høyt kalium indusert kalsium-respons i ellipsoiden legemet (eb), en lav struktur som ligger i midten av hjernen, uten forutgående elektrofysiologiske eller funksjonelle rapporter 6 2+ -activity i eb etter påføring av pikrotoksin (en blokkering av GABA A-reseptorer) som viser at gabaergic ringnerveceller i eb er faktisk hemmende nerveceller (beskrevet i .: Bleie et al, artikkel sendt).
Den andre fordelen, lengre og sammenhengende tidsregistrering, er blitt utnyttet i flere studier fra vårt laboratorium. Lukt stimulering har vært anvendt for å undersøke aktiviteten av hjernens nerveceller i tidligere studier 11,15,16. Bruke lengre sikt bildebehandling, derimot, har vår lab kunnet vise tidligere urapporterte endringer i kinetikk innenfor olfactory reseptor nerveceller til lukt. Den første studie av Murmu et al. (2010) viste at mens korte lukt stimuli (1-3 sek) oppviste lignende kinetikk og en moderat forskjell i amplitude, en lengre lukt stimulus (5 sek) forårsaket en meget større amplitude, samt en endring i kinetikk / structure av responsen som ble tilskrevet intracellulære kalsium butikker. En senere studie viste at mens 5 suksessive anvendelser av 1 sek lukt pulser ved 5 minutters intervaller ikke endre sin kalsium-respons, noe som øker lengden av stimulus til 5 sekunder førte til progressiv dempning av responsen, noe som tyder på en tilpasningsprosess. Videre denne tilpasningen fenomenet synes å være initiert av GABAergic regulering av tidligere identifiserte kalsium butikker 8. Viktigere disse dataene viser også at i denne eksperimentelle tilstand, kan GFP-aequorin sin Ca 2+ -sensor oppdage og følge kalsium frigjøres fra intracellulære Ca 2 + -stores. En ekstra unik studie fra vår lab brukes bioluminescent bildebehandling O / N for å spille inn basal (spontan) aktivitet i hele nevronale og gliaceller bestander i hjernen samt aktivitet i sjampinjong organer 10. Disse opptakene viste overraskende spontan aktivitet i maurennal mechanosensory og motorsenteret (AMMC) og antennal lapp. Videre uventet celle autonom aktivitet i gliaceller forekommende i hele natt. Innenfor sopp kroppen studien identifisert både punctate aktivitet og to karakteristiske topper, en kort og en lang hvis forekomst endret med alderen 10.
I den siste studien i vår lab, brukte vi bioluminescerende bildebehandling for å undersøke effekten av manipulasjon av sekundære signalmolekyler involvert i minnet, og hvordan de påvirker kalsium svar innen sopp organer 9. Faktisk, selv dunce og kålrot ble identifisert mer enn 30 år siden, og er kjent for å regulere nivået av cAMP, deres in vivo effekt på cellulære og fysiologiske mekanismer og spesielt på Ca 2+ -response fortsatt i stor grad ukjent. Med GFP-aequorin tilnærming, har vi vært i stand til samtidig å ta opp både beger (dendrittiske Struktureringes) og celle-legemer, så vel som de aksonale projeksjoner på nivået av lobene, og dermed tillater oss å korrelere nivået og den kinetiske av responsen i de forskjellige avdelinger av dette meget kompleks struktur.
Den siste søknaden vi utvikler etterligner en naturlig reaksjon gjennom kunstig aktive neuronpopulasjoner presynaptiske til strukturen av interesse. For å gjøre dette vi uttrykke P2X 2-reseptoren, en ligand-gated cation kanal som reagerer på ATP, i den presynaptiske nervecellen og uttrykke GFP-aequorin i den postsynaptiske nevronale befolkningen. Segregering av disse to elementer i forskjellige nevronale populasjoner krever to separate ekspresjonssystemer. For dette formål en Lexa konstruere inneholder GFP-aequorin har blitt opprettet. I våre foreløpige eksperimenter med dette systemet vi har uttrykt P2X to i et delsett av PNS bruker Gal4-GH146 med UAS-P2X 2 og GFP-aequorin i sopp kroppenbruker Lexa MB247 linje kombinert med Lexa-13X-GFP-aequorin. Vi har nå registrert kalsiumrespons hos sopp legeme med stimuleringer av 1 mM ATP til P2X 2-reseptoren i PNS (figur 6).
Som konklusjon, har Bioluminescens GFP-aequorin metode vist seg å være nyttige ved opptak av stimulus induserte Ca2 + -activity, analogt med andre Ca 2 + -indicators. Men enda viktigere, også tillater det påvisning av spontan Ca 2+ -activity i hjernen. Denne tilnærmingen åpner opp fremtidige muligheter for langsiktig eksperimenter og hele avbildning av hjernen som kan øke dybden av vår forståelse av de fysiologiske fenomener og aktivitetsmønstre i hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCl | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl2 | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1,000 µl Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | hand made | ||
| incubation box | hand made | ||
| forceps (No. 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | hand made | ||
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5 mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80 °C) |
| Microscope | Nikon | Eclipse-E800 | |
| immersion objective lens | Nikon | 20X Fluor .5w | |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | leica dissection scope and florescent lamp | |
| tight dark box | Science Wares | Custom built by Science Wares | |
| peristaltic pump | Gilson | Minipuls 2 | |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
References
- Martin, J. -R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).
- Baubet, V., et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).
- Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943 (2013).
- Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).
- Martin, J. -R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2 (3), e275 (2007).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Réal, E., Martin, J. -R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105 (2011).
- Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).
- Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).
- Lima, S. Q., Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
- Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).
- Fiala, A., Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003 (174), PL6 (2003).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303 (5656), 366-370 (2004).
