Abstract
Le cellule dendritiche (DC) sono cellule professionali presentanti l'antigene principalmente responsabili per l'acquisizione, l'elaborazione e la presentazione di antigeni sulla presentanti l'antigene molecole di avviare l'immunità T-cellulo-mediata. Le cellule dendritiche possono essere separati in diversi sottoinsiemi fenotipico e funzionalmente eterogenee. Tre sottogruppi importanti delle cellule dendritiche della milza sono plasmacitoidi, cellule CD8α Pos e CD8α Neg. Le cellule dendritiche plasmacitoidi sono produttori naturali di interferone di tipo I e sono importanti per l'anti-virale immunità cellulo T. Il sottoinsieme CD8α Neg DC è specializzata per MHC di classe II presentazione dell'antigene ed è coinvolto nel centro di adescamento cellule T CD4. Il CD8α Pos DC sono i principali responsabili per la cross-presentazione di antigeni esogeni e priming delle cellule T CD8. I CD8α Pos DC hanno dimostrato di essere più efficace in occasione della presentazione degli antigeni glicolipidici da molecole CD1d ad un cel T specializzataL popolazione noto come T (iNKT), le cellule natural killer invarianti. La somministrazione di Flt-3 ligando aumenta la frequenza della migrazione dei progenitori delle cellule dendritiche dal midollo osseo, in ultima analisi, con conseguente espansione delle cellule dendritiche in organi linfoidi periferici in modelli murini. Abbiamo adattato questo modello per purificare un gran numero di cellule dendritiche funzionali per l'utilizzo in esperimenti di trasferimento di cellule per confrontare competenza in vivo di diversi sottoinsiemi DC.
Introduction
Le cellule dendritiche (DC) sono stati scoperti quasi quarant'anni fa come il "grande stellate (dendron greco) cella" trovata negli organi linfoidi 1. Molti studi hanno dimostrato che le cellule dendritiche sono le uniche cellule che presentano l'antigene in grado di stimolare efficacemente le cellule T naive 2. Una delle principali funzioni di queste cellule è l'assorbimento e la presentazione di antigeni e la loro elaborazione efficiente e carico di questi su molecole presentanti l'antigene. In milza del mouse, DC può essere separato in plasmacitoidi e sottoinsiemi convenzionali. Le cellule dendritiche plasmacitoidi sono caratterizzati da una bassa espressione di CD11c e alti livelli di B220 e Gr-1. Essi sono anche positivo per il marcatore mPDCA1 superficie ed interferone di tipo I in risposta a pedaggio like receptor 9 (TLR9) ligandi secernono. I DC convenzionali sono alti per CD11c e MHC di classe II espressione. Essi possono essere suddivisi in tre sottogruppi distinti in base alla superficie espressione di marcatori fenotipici quali CD4, CD8α, DEC205, CD11b e delle cellule dendritiche del recettore inibitorio 2 (DCIR2, riconosciuto dal anticorpo 33D1) proteine 3,4. I CD8α Pos DC sono noti anche come CDC1, sono positivi per DEC205, ma negativo per i marcatori mieloidi, come CD11b e 33D1. Il CD8α Neg DC, chiamato anche CDC2, sono positivi per 33D1, CD11b e CD4, ma mancano DEC205. Il sottoinsieme negativo doppio (vale a dire, negativo sia per CD4 e CD8α) è relativamente rara, ed è negativo per DEC205 e 33D1. È il sottoinsieme almeno caratterizzati e può essere una forma meno differenziata di CD8α Neg DC.
Differenze fenotipiche nei diversi sottoinsiemi DC estendono anche alle loro funzioni in vivo. Il CD8α Neg DC sono altamente fagocitosi e si pensa di presentare l'antigene esogeno principalmente attraverso MHC di classe II a cellule T CD4 3. Al contrario, i CD8α Pos DC sono specializzati per la presentazione dell'antigene proteina solubile in MHC di classe Iin un meccanismo chiamato cross-presentazione. Il risultato di cross-presentazione dipende dallo stato di attivazione di queste cellule dendritiche 5, e può sia portare alla espansione delle cellule T citotossiche (CTL) o lo sviluppo di cellule T regolatorie 6 2,7. Targeting di antigene di CD8α Pos DC utilizzando i risultati di consegna anti-DEC205-mediata da anticorpi in gran parte nella eliminazione delle cellule T 8, mentre la presentazione di antigeni derivati da cellule apoptotiche infettate induce una forte risposta CTL 9.
Oltre al riconoscimento di antigeni peptidici, il sistema immunitario dei mammiferi è evoluto per riconoscere lipidico e antigeni glicolipidi. Questi antigeni sono presentati da molecole CD1, che sono MHC di classe proteine di superficie cellulare i-like che esistono in molteplici forme legate in vari mammiferi. Nei topi, un unico tipo di molecola altamente conservata CD1 chiamato CD1d è responsabile per la presentazione di antigeni glicolipidi 10. Il sindaco popolazione di cellule T che riconoscono CD1d / complessi glicolipidici è chiamato cellule NKT invarianti (cellule iNKT). Queste cellule esprimono un recettore semi-invariante delle cellule T (TCR) composto da una catena TCRα invariante che è associato con catene TCRβ che hanno limitato la diversità 11. A differenza delle cellule T convenzionali che hanno bisogno di proliferare e differenziarsi per diventare cellule T effettrici attivate, le cellule iNKT esistono come una popolazione effettrici e iniziano a reagire rapidamente dopo la somministrazione glycolipid 12. L'identificazione di cellule che presentano l'antigene fisiologicamente rilevanti dei lipidi è un'area attiva di ricerca, e di diversi tipi di cellule distinte, come B cellule, i macrofagi e le cellule dendritiche sono state proposte per svolgere questa funzione. Tuttavia, è stato dimostrato che il sottoinsieme CD8α Pos delle DC è la cellula primaria mediazione captazione e presentazione di antigeni lipidici alle cellule del mouse iNKT 13 e glycolipid mediata cross-priming di cellule T CD8 14.
ove_content "> Per confrontare l'efficienza di presentazione dell'antigene da diverse cellule presentanti l'antigene, un approccio semplice è quello di trasferire diversi tipi di APC purificate pulsate con quantità equivalenti di antigene in host naive. esperimenti di trasferimento cellulare di questo tipo sono spesso eseguite per studi immunologici. Tuttavia, l'esecuzione di studi trasferimento con ex vivo antigene trattata DC è impegnativo, poiché queste cellule esistono popolazioni come rare in organi linfoidi in cui costituiscono meno del 2% delle cellule totali 15. è pertanto necessario migliorare lo sviluppo di queste cellule in animali donatori per aumentare l'efficienza di protocolli di isolamento.E 'noto che il linfoide comune e progenitori mieloidi comuni, che sono necessari per la generazione di PDC CD8 Pos e sottoinsiemi CD8 Neg DC, fms legati espresso recettore tirosin-chinasi 3 (Flt-3). Al momento in vivo Flt-3 ligando (Flt-3L) amministrazione, emigratione di Flt-3 che esprimono cellule progenitrici del midollo osseo è aumentato, con conseguente aumento della semina organi linfoidi periferici e l'espansione della loro progenie matura DC 16. L'espressione di Flt-3 è perso durante impegno per la B, i percorsi di differenziazione delle cellule T o NK. Pertanto, solo alterazioni minime sono osservati in queste cellule con la somministrazione Flt-3L. Espansione simile nelle popolazioni DC è osservata in topi portatori di tumori generati da impianto di una linea di cellule di melanoma B16-secernenti murino Flt-3L, che fornisce un metodo semplice ed economico per fornire livelli sistemici sostenuti di Flt-3L 17,18. Usando questo approccio, abbiamo sviluppato un protocollo basato su l'impianto di cellule B16-melanoma secernenti Flt-3L per stimolare l'espansione di tutte le normali sottoinsiemi DC nella milza del mouse, quindi aumentando notevolmente le rese di queste cellule che possono essere isolate per esperimenti successivi . Abbiamo costantemente troviamo che entro 10 - 14 giorni dopo im sottocutaneopiantagione del tumore secernente Flt-3, i topi sviluppano splenomegalia con marcata arricchimento delle DC per costituire 40 - 60% delle cellule totali milza. Da queste milza, diversi sottoinsiemi DC possono essere isolati con elevata purezza utilizzando standard di kit di purificazione delle cellule disponibili in commercio che utilizzano marcatori fenotipici specifici sottoinsieme.
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Protocol
Gli esperimenti sugli animali sono fatte secondo le linee guida approvate dal comitato istituzionale cura e l'uso di animali (IACUC). Tutte le procedure che richiedono la sterilità sono eseguite in un armadio biosicurezza.
1. Impianto di B16.Flt3L melanoma nei topi
- Culture l'espressione B16 linea cellulare di melanoma Flt-3 in T25 fiasche di coltura tissutale con una densità di 0,5 x 10 6 cellule / ml in terreno DMEM completo con il 10% di CO 2 a 37 ° C. Crescere fino a quando le cellule raggiungono ~ 90% di confluenza (~ 20 ore).
- Raccogliere le cellule dalla tripsina digestione. terreni di coltura delle cellule Aspirare e lavare le cellule aderenti con PBS. Aggiungere 5 ml di 0,05% tripsina e incubare per 5 min a 37 ° C. Aggiungere freddo 20 ml completo DMEM (4 ° C) contenente siero fetale di vitello (FCS) per spegnere la digestione proteasi. Sollevare le cellule off battendo leggermente seguita pipettando gentilmente su e giù.
- Raccogliere le cellule per centrifugazione a 300xg per 10 min a 4 ° C. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore vitalità cellulare automatizzata. Risospendere ad una densità di 10 8 cellule / ml in PBS.
- Topi Implant (C57BL / 6 o altro ceppo istocompatibili) con cellule tumorali per via sottocutanea come descritto da Machholz et al. 19 alla base del collo con 100 ml di sospensione cellulare (10 7 cellule).
- Lasciare che il tumore di crescere fino palpabili o visibili (2 - 10 mm di diametro, solitamente 7 - 12 giorni) prima di sacrificare animali per l'espianto di organi.
2. Preparazione di splenica cellulare Sospensione Singola da tumore Bearing Mice
- Anestetizzare i topi con una dose eccessiva di isoflurano (regolare flusso di isoflurano a> 5% e continuare l'esposizione di almeno 2 minuti dopo smette di respirare). Sacrificare il melanoma tumore del mouse Flt-3 cuscinetti da dislocazione cervicale secondo le linee guida istituzionali per l'eutanasia.
- disinfect la pelle con il 70% di etanolo e la raccolta della milza con tecnica asettica con l'ausilio di forbici sterili 20.
- Posizionare la milza in una piastra di Petri sterile per il trasporto al cabinet biosicurezza. Eseguire tutti i passi da qui in condizioni sterili.
- Trasferimento milza per un piatto fresco di Petri e lavare con RPMI. Tagliare la milza in piccoli pezzi (~ 0,2 centimetri 2) utilizzando un bisturi. Incubare per 30 minuti a 37 ° C con 10 ml di soluzione di collagenasi / DNasi.
- Versare la sospensione parzialmente digerito del tessuto della milza su un colino cella di 70 micron. Comprimere i frammenti di tessuto rimanenti attraverso le maglie del filtro utilizzando una siringa da 5 ml stantuffo.
- Lavare il filtro a rete con 10 ml di mezzo fresco e gettare il filtro. Centrifugare la sospensione a 300 xg per 10 min a 4 ° C per sedimentare le cellule.
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 2 ml di tampone di lisi RBC. Incubare a RT Fo 10 min. Placare il tampone di lisi RBC con l'aggiunta di 10 ml di terreno completo RPMI.
- Agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere in volume adeguato per raggiungere densità cellulare di 10 8 cellule / ml nella cella di smistamento tampone (ad esempio, MACS) contenente 20 mg / ml di anticorpi Fc-blocco (2.4G2).
3. Purificazione di plasmacitoidi DC, CD8α Pos DC e CD8α Neg DC da milza cellulare Sospensione Singola
Nota: Isolamento dei sottoinsiemi DC spleniche di sospensione singola cellula è una procedura multi-step come illustrato in figura 1 eseguire tutte le fasi utilizzando tampone pre-raffreddato e un bagno di acqua ghiacciata per mantenere la temperatura a 4 - 8 ° C.. Tutti i volumi di reagenti nella sezione seguente del protocollo sono calcolati per un ingresso iniziale di 200 ml di sospensione cellulare della milza a 10 8 cellule / ml). Questo può essere scalata verso l'alto ogiù in base alle proprie esigenze modificando il volume di sospensione cellulare (sempre ad una densità di 1 x 10 8 cellule / ml) e altri reagenti proporzionalmente nella fase iniziale (3.1.1 e 3.2.1). Regolare i volumi di reagenti in tutte le fasi successive di conseguenza. Ad esempio, se si parte con 100 ml di sospensione cellulare splenica a 1 x 10 8 / ml, utilizzare metà dei volumi di reagente indicati in tutti i passaggi.
- L'isolamento di plasmacitoidi DC (PDC)
- Aggiungere 300 ml di cocktail di anticorpi biotina marcata con fornito nel plasmacitoidi Kit di isolamento DC a 200 ml di sospensione cellulare della milza.
- Mescolare accuratamente e incubare nel bagno di acqua ghiacciata per 15 minuti. Toccare il tubo ogni 3 minuti per mantenere le cellule in sospensione, e per massimizzare legame dell'anticorpo.
- Aggiungere 12 ml cell sorting tampone e agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante per rimuovere gli anticorpi biotinilati non legati.
- Risospendere cellapellet in 500 ml di buffer di ordinamento delle cellule. Aggiungere 300 ml di anti-biotina perline anticorpo-coniugato. Ripetere il passaggio 3.1.2 e 3.1.3.
- Gettare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 2 ml di tampone di ordinamento delle cellule. Eseguire tutti i passaggi da questo punto in poi a temperatura ambiente usando tamponi pre-raffreddato.
- Posizionare una nuova cella di attivazione magnetico ordinamento colonna LS nel supporto magnetico. Lavare ed equilibrare colonna con 5 ml di tampone di ordinamento delle cellule.
- Pipetta la sospensione cellulare in colonna, applicando delicatamente al centro della superficie del letto della colonna. Raccogliere il flusso attraverso.
- Lavare la colonna con 10 ml di tampone di ordinamento delle cellule. Raccogliere questo flusso attraverso e si combinano con il flusso attraverso dal punto 3.1.7. PDC sono arricchiti in questo flusso della colonna attraverso (FT1).
- Agglomerare le cellule da FT1 per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C, risospendere in 2 ml di cellule tampone di smistamento e passare le cellule attraverso una colonna LS frescaripetendo i punti 3.1.6 - 3.1.8. Questo uso di due colonne sequenziali produce una maggiore purezza delle cellule isolate.
- Cellule pellet per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere con 2 ml di RPMI completo. Mettere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Isolamento di CD8α Pos e CD8α Neg DC
Nota: Il primo passo in questa procedura è la deplezione delle cellule B, PDC, T e NK.- A partire con tutta la sospensione di cellule della milza (1 ml di 10 8 cellule / ml ottenuti nella fase 2.8), aggiungere 100 ml di cocktail di anticorpi biotina coniugato fornito nel kit di isolamento CD8α Pos DC.
- Mescolare bene e incubare nel bagno di acqua ghiacciata per 15 minuti. Toccare il tubo delicatamente ogni 3 min per massimizzare il legame degli anticorpi biotina marcata con le loro cellule bersaglio.
- Aggiungere 12 ml cell sorting tampone e agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare eccellentenatant per rimuovere gli anticorpi biotinilati legati.
- Aggiungere 150 ml di tampone di smistamento delle cellule e 100 ml di perline anti-biotina forniti nel kit di isolamento CD8α Pos DC. Mescolare bene e incubare nel bagno di acqua ghiacciata per 15 minuti.
- Aggiungere 10 ml di cellule di smistamento tampone e agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Risospendere le cellule in tampone di smistamento 1 ml di cellule e passare sopra una colonna LS fresco in base alla procedura dei passi 3.1.6 tramite 3.1.8.
- Raccogliere il flusso senza etichetta attraverso 2 (FT2) ed eliminare il retentato colonna. Questa frazione senza etichetta si arricchisce per CD8α Pos e CD8α Neg DC.
- Agglomerare le cellule in FT2 per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Risospendere le cellule in tampone di smistamento 1 cella ml e aggiungere 200 ml di-CD8α anti-sfere magnetiche coniugate forniti nel kit di isolamento CD8α Pos DC.
- rappresentantemangiare passi 3.2.2 tramite 3.2.6. Il flusso attraverso la colonna si arricchisce per CD8α Neg DC e impoverito per CD8α Pos DC. Questo è etichettato flusso attraverso 3 (FT3).
- Per eluire il CD8α Pos PVS trattenuto in colonna, rimuovere la colonna dal magnete, aggiungere 5 ml di tampone di smistamento cellulare e spurgare la matrice colonna utilizzando lo stantuffo fornito con la colonna LS.
- Agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante e risospendere in tampone di smistamento 1 ml di cellule. Per aumentare la purezza, eseguire le cellule eluiti nuovo attraverso una colonna LS fresca ripetendo i punti da 3.1.6 a 3.1.8, ad eccezione di scartare il flusso attraverso e raccogliere le cellule conservate come in 3.2.11.
- Per purificare il CD8α Neg DC dalla sospensione FT3, pellet la FT3 mediante centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere in 300 microlitri di tampone di ordinamento delle cellule.
- Aggiungere 100 ml di anti-CD11c MAGperline tiche. Mescolare bene e incubare nel bagno di acqua ghiacciata per 15 minuti.
- Aggiungere smistamento cellule tampone e pellet 10 ml di cellule mediante centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Ripetere i passaggi 3.1.5 tramite 3.1.8. Il CD8α Neg DC vengono selezionati positivamente con perline CD11c e sono legato alla colonna. Il flusso attraverso può essere scartato.
- Eluire le cellule conservate nella colonna come descritto al punto 3.2.11 per raccogliere il purificato CD8α Neg DC.
4. Pulsing APC con gli antigeni e trasferimento di cellule
- Contare le cellule vive dopo la purificazione mediante trypan esclusione blu da 21 a distinguere le cellule vive e morte.
- Incubare le cellule con l'antigene di scelta. Utilizzare analoghi di antigene glycolipid chiamato alfa-galactosyl ceramide (αGalCer) a 100 concentrazioni nM 13. In genere, la piastra 10 6 cellule vitali / bene in mezzo completo RPMI con ultra-low Attachment U-bottom piastre da 96 pozzetti per ridurre al minimo l'adesione cellulare. Incubare le cellule in CO 2 atmosphere 5% a 37 ° C per 1 - 4 hr.
- Celle di raccolta pipettando delicatamente diverse volte. Utilizzare ampi suggerimenti foro pipette per ridurre al minimo i danni cellulari da forze di taglio. Lavare i pozzetti con PBS e in comune questi lavaggi per massimizzare la raccolta delle cellule.
- Agglomerare le cellule a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere alla densità desiderata in PBS. In genere, iniettare 1 milione di cellule in 200 microlitri per destinatario degli animali. Mantenere le cellule in ghiaccio per massimizzare la redditività prima della somministrazione in animali ospiti.
- Iniettare cellule per via endovenosa in topi sia attraverso il vano coda laterale o il plesso venoso retro-orbitale 19. Utilizzare un ago G 27 su una siringa da 1 ml e iniettare un volume massimo di 0,1 ml per topo.
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Representative Results
L'esito di questa procedura si basa sull'espansione di sottoinsiemi DC da murino Flt-3L espressa dalle cellule di melanoma impiantati. Il tumore B16.Flt3L è stato derivato da un C57BL / 6 del mouse, e dovrebbe essere impiantato in animali con quello sfondo sforzo al fine di evitare il fallimento del tumore per stabilirsi a causa di rifiuto. In alcuni casi, può essere desiderabile utilizzare topi geneticamente modificati per derivare DC con difetti noti vie di segnalazione o recettori di interesse. È importante tenere presente che il tumore può svilupparsi con differenti cinetiche in tali animali, quindi è importante controllare la crescita tumorale basato su aspetto e la palpazione al sito di inoculazione. Nella nostra esperienza, una volta che il tumore è palpabile, il tumore B16.Flt3L cuscinetto topi dimostrano costantemente un marcato aumento della cellularità milza che correla con l'espansione di tutti i sottoinsiemi DC (Figura 2A). Noi di solito vedere un 2 a 3 volte increase del numero di splenociti totali ottenuti da topi di melanoma fruttiferi B16.Flt3L rispetto agli animali ingenuo. L'aumento del numero di DC in parte contribuisce alla apparente riduzione della frequenza delle cellule B, mentre non vi è poco o nessun cambiamento nel numero assoluto di linfociti B. È interessante notare che, mentre una grande espansione (~ 15 ei aumento di 20 volte nel numero assoluto) viene osservato per DC convenzionali in questi topi, c'è solo un modesto aumento (circa 4 volte) osservato nel plasmacitoidi sottoinsieme DC.
La strategia di gating per identificare diversi sottoinsiemi DC è mostrato in Figura 2A e si basa sull'espressione di B220, CD11b, CD11c e CD8α come marcatori fenotipici specifici sottoinsieme (Figura 2B). Abbiamo anche studiato DEC205, CD11b ed espressione mPDCA1 su questi sottoinsiemi come mostrato nella Figura 2B. Questo mostra lo schema previsto, con mPDCA solo sul sottoinsieme PDC mentre dicembre 205 si esprime fortemente sulla CD8α Pos DC e CD11b viene rilevato più prominente sul CD8α Neg DC. Abbiamo anche analizzato le alterazioni frequenze di cella per ciascuno dei sottoinsiemi purificate ad ogni passo del protocollo qui descritto (riassunto nella Figura 2C, con esempi dettagliati dei dati di citometria di flusso della figura 3). L'isolamento dei sottoinsiemi DC spleniche descritte in questo metodo è una procedura multi-step (figura 1). Purificazione di cellule dendritiche plasmacitoidi si basa sulla selezione negativa per arricchire queste cellule dopo l'esaurimento di tutte le popolazioni indesiderate come B, T, cellule NK e DC convenzionali. Purificazione della CD8α Pos DC, e CD8α Neg DC è eseguita da selezione positiva di queste cellule dopo l'esaurimento delle cellule T, B e NK. L'elevata purezza di ciascuno dei sottoinsiemi DC ottenuta utilizzando questa procedura (tipicamente ~ 95%) è illustrato anche nella figura 3.
ve_content. "fo: keep-together.within-page =" 1 "> A seconda degli esperimenti da eseguire, queste cellule possono essere pulsati con un antigene desiderato e trasferiti in istocompatibili host murini per Studi immunologici Inoltre, queste cellule possono anche essere utilizzati per studi in vivo di attività di stimolo e regolamentari di sottoinsiemi DC fisiologici. i rendimenti delle celle per i purificati sottoinsiemi DC a 2 x 10 7 splenociti totali sono circa un milione di pDCs, 2 milioni CD8α Pos DC e 4 milioni CD8α Neg DC.
Figura 1. Isolamento delle cellule dendritiche. Uno schema che illustra le varie fasi del protocollo per l'isolamento di diversi sottoinsiemi di cellule dendritiche. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. >
Figura 2. Analisi di splenici DC sottoinsiemi nei topi con tumori B16.Flt3L. A) strategia di gating è illustrata per individuare le popolazioni di cellule corrispondenti a pDCs (R1), CD8α Pos DC (R5) e CD8α Neg DC (R6). B) Espressione di mPDCA1, 33D1, DEC205 e CD11b su diversi sottoinsiemi. Le cellule contenute nel cancello R4 (un sottoinsieme di linfociti, negativi per la B220, CD11c, CD11b) sono utilizzati come una popolazione di controllo manca l'espressione di questi marcatori C) arricchimento relativo di DC e sottopopolazioni linfocitarie isolati da la milza di topi a giorno. 14 dopo l'inoculazione delle cellule di melanoma B16.Flt3L è mostrato nella trama sinistra come barre nere, mentre la frequenza di queste popolazioni di cellule in topi naive è mostrata come barre bianche. La trama destra visualizza gli stessi dati come il numero di cellule.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53824/53824fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Analisi delle splenici DC sottoinsiemi Durante arricchimento protocollo. A) l'arricchimento di cellule dendritiche plasmacitoidi (B220 High e CD11c Bassi, R1) dal 10% della popolazione di partenza di splenociti da B16.Flt3L tumore cuscinetto topi al ~ 95% di purezza nella colonna fluire attraverso 1. Si noti che le cellule retentato eluiti da questa colonna sono esauriti di questa popolazione. B) arricchimento delle DC convenzionali (in CD11c alta, misto di CD8α positivo e negativo) da ~ 33% la milza di B16.Flt3L melanoma-cuscinetto topi il giorno 10 dopo l'impianto del tumore al ~ 78% in il flusso attraverso 2 frazione. Nella colonna retentato 2 terreni, le popolazioni positive CD11c sembrano essere partially impoverito, corrispondente alla rimozione di un numero considerevole di DC durante selezione negativa deplezione delle cellule T, B e NK. Ulteriore frazionamento del flusso attraverso 2 sospensione con selezione positiva per anti-CD8 rese vincolanti> 95% di purezza del CD8α Pos DC. Il flusso attraverso di questo è stato poi sottoposto a selezione positiva per il legame di anti-CD11c, producendo una popolazione di> 95% puro CD8α Neg DC. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le cellule dendritiche sono accettati per essere il principale antigene professionale, presentando le cellule coinvolte nella adescamento di risposte delle cellule T. La loro funzione principale è quella di rilevare il microambiente del tessuto riprendendo e l'elaborazione di antigeni per la presentazione di cellule T. Al fine di studiare la funzione di specifiche sottopopolazioni DC, questi devono essere isolati in numero sufficiente usando un approccio che mantiene loro normale fenotipo e funzioni. La maggior parte dei protocolli si basano su l'isolamento di specifica sottoinsieme CC da topi naive. Poiché queste cellule sono rari, le procedure di isolamento non sono efficienti e producono un basso numero di cellule. Ad esempio, una milza produrrà solo circa 0,5 - 1 milioni DC CD8 pos, mentre maggior parte degli esperimenti effettuati con studi trasferimento utilizzano almeno questo numero di cellule per animale. Pertanto, un importante limitazione dei metodi esistenti è l'incapacità di isolare il numero di cellule sufficiente senza utilizzare un gran numero di topi donatori e notevoli volumidei reagenti. Il nostro metodo supera sostanzialmente questi problemi utilizzando topi impiantati con un tumore secernente Flt-3L per espandere notevolmente PVS, permettendo purificazione numero molto maggiore dei tre ben riconosciuto sottoinsieme DC utilizzando una serie di fasi di purificazione immunomagnetiche. Il protocollo qui descritto prevede quindi un grande miglioramento rispetto metodi esistenti in termini di rese di almeno diverse volte.
Esistono Qualche distinguo per il protocollo di isolamento qui descritto. La limitazione principale è che la procedura utilizzata per isolare queste cellule potrebbero inavvertitamente modificare il loro fenotipo. DC sono squisitamente sensibili alla contaminazione endotossine e stimoli meccanici che possono portare a cambiamenti nella loro fenotipo e funzione. Un altro limite di questa tecnica è la dipendenza Flt-3L secrezione per espandere sottoinsiemi DC. Il risultato è la mancanza di espansione nel tessuto residenti sottoinsiemi DC che non esprimono il recettore Flt-3.
Ilprotocollo qui descritto si basa su arricchimento cellulare utilizzando reagenti commercialmente disponibili. Il kit per l'isolamento di purificazione cellulare dotato di un protocollo che contiene i volumi consigliati di reagenti da utilizzare. La composizione delle cellule del tumore cuscinetto topi è totalmente diverso da quello di topi naive (Figura 2C), e quindi abbiamo modificato i valori per i reagenti utilizzati nella nostra tecnica per ottenere la purezza cellulare ottimale. Le cellule dendritiche sono cellule aderenti e possono allegare alla matrice colonna non specifico. Equilibrazione del letto colonna con tampone contenente EDTA minimizza l'adesione cellulare, e l'uso di passaggio seriale su due colonne consecutive migliora ulteriormente la purezza delle cellule.
Dendritiche sono cellule altamente aderenti e in vivo sono generalmente strettamente associata alla matrice di tessuto extracellulare. Per aumentare la resa, è molto importante per digerire il tessuto splenico con collagenasi e DNasi una sufficiente time per estrarre un numero massimo di queste cellule. E 'anche importante assicurarsi che i frammenti di tessuto splenici sono completamente immersi nella soluzione di collagenasi / DNasi I, mentre in fase di digestione. Un'altra caratteristica fondamentale di isolamento DC è quello di mantenere la massima sterilità e condizioni di assenza di endotossine nel corso della procedura di isolamento, dal momento che queste cellule sono altamente reattivo endotossine. Utilizzare i reagenti appena preparati dalle scorte senza endotossine, e filtro sterilizzare tutti i reagenti prima dell'uso. Tutti i buffer di isolamento delle cellule e dei media dovrebbero essere integrati con FCS che è certificato per essere liberi di endotossina rilevabile. Queste cellule sono anche molto sensibili agli stimoli meccanici e ripetuta stimolazione meccanica può alterare lo stato di maturazione di queste cellule. Anche se è necessaria una certa forza meccanica per forzare il tessuto attraverso un colino cella dopo collagenasi digestione, questo dovrebbe essere fatto il più delicatamente possibile. Inoltre, vigorosa pipettaggio delle cellule dovrebbe essere evitato il più possible, e larga pipetta foro punte dovrebbero essere utilizzati per ridurre al minimo le forze di taglio.
Il modello di trasferimento adottivo è utile per le indagini di presentazione dell'antigene e priming delle cellule T da specifici sottoinsiemi di cellule dendritiche. Tuttavia, è stato dimostrato in altri studi che trasferiscono di antigene possono verificarsi da antigene pulsato DC a DC endogene. Quindi, la risposta immunitaria adattativa istigata dalle cellule antigene pulsata può riflettere presentazione da DC endogene che presentano l'antigene "catturati" e non quello di trasferire APC. Questo tipo di trasferimento è esponenzialmente aumentata se gli isolati preparati DC contengono le cellule morte o morenti. È quindi importante effettuare l'isolamento e trasferimento protocollo CC più rapidamente possibile, utilizzando condizioni sterili con buffer pre-raffreddata a migliorare la sopravvivenza cellulare. Abbiamo scelto un periodo relativamente breve antigene pulsazione di 4 ore per questo motivo, con incubazione in piastre di coltura cellulare a basso legame di minimizzare l'adesione cellulare durantequesto passaggio. Inoltre, esteso condizione cultura può alterare lo stato di maturazione delle DC in coltura, e può influenzare l'esito degli esperimenti trasferimento adottivo 22.
In sintesi, la biologia delle cellule dendritiche è una zona molto attiva di ricerca, e lo sviluppo di un metodo affidabile per generare cellule dendritiche che rispecchiano fedelmente il loro fenotipica in vivo e divergenza funzionale fornisce un'immensa opportunità di studiare queste cellule. Questo diventa particolarmente importante per gli studi che coinvolgono sostanze chimiche che possono modulare le funzioni di DC, ma non possono essere somministrati per via sistemica in modelli animali. Trattare gli isolati sottoinsiemi DC di interesse ex vivo con queste sostanze è un approccio pratico e fattibile che può aiutare a chiarire i dettagli meccanicistici di percorsi di presentazione dell'antigene.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NIAID concessione AI45889 a SAP di citometria a flusso studi sono stati effettuati utilizzando FACS strutture di base supportati dal Einstein Cancer Center (NIH / NCI CA013330) e Centro per l'AIDS Research (NIH / NIAID AI51519).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies, Gibco | 25300-054 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936-250MG | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | |
| DNase I (dry powder) | QIAGEN | 79254 | |
| 200 proof ethanol | Thermo Fisher Scientific | 9-6705-004-220 | Used to prepare 70% ethanol |
| RBC lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11875-119 | |
| DMEM medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11995-073 | |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM non-essential amino acids | Life Technologies, Gibco | 11140-050 | |
| MEM essential amino acids | Life Technologies | 11130-051 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies, Invitrogen | 21985-023 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| HEPES | Life Technologies, Invitrogen | 15630 | |
| Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) | Life Technologies, Invitrogen | 20012-050 | |
| Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) | Life Technologies, Gibco | 14040-182 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution | Life Technologies | 15575-020 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11050 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Invitrogen | 15140-163 | |
| Trypan blue (dry powder) | Sigma-Aldrich | T6146-5G | Prepare 0.08% with PBS |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotech | 130-092-786 | |
| Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c | Miltenyi Biotech | 130-152-001 | |
| CD8αPos mouse DC isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-091-169 | |
| Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anti-mouse CD11c-FITC | BD Biosciences | 553801 | |
| Anti-mouse CD8α-PerCP | BD Biosciences | 553036 | |
| Anti-mouse B220-PE | BD Biosciences | 553090 | |
| 1 ml syringes | BD | 26048 | |
| 23 G1 needle | BD | 305145 | |
| 100 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 875712 | |
| Surgical instruments | Kent Scientific | INSMOUSEKIT | |
| Cell strainer (70 µm) | BD | 352350 | |
| Large Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm)) | Corning | 431097 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Magnetic stand MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Wide-bore 200 μl pipette tips | PerkinElmer | 111623 | |
| Corning ultra-low attachment 96-well plates | Corning | CLS3474-24EA | |
| 6-8 week old female C57BL/6 mice | Jackson Research Laboratories, Jax | ||
| Murine B16.Flt3L melanoma cell line | described by Mach et al., 2000 | ||
| Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M) |
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system. | ||
| Complete RPMI and DMEM media | Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media. | ||
| MACS buffer | Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). | ||
| FACS staining buffer | Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer | ||
| 10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml. |
This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use. |
References
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