Abstract
Dendritik hücreler (DC), elde etme işlemi ve T-hücresi-aracılı bağışıklık başlatma molekülleri antijen antijenler sunmak için başta sorumlu profesyonel antijen sunan hücrelerdir. Dendritik hücreler çeşitli fenotipik ve fonksiyonel heterojen alt kümeleri ayrılabilir. Dalak dendritik hücrelerin üç önemli alt grupları, CD8α Pos ve CD8α Neg hücreleri plasmasitoid vardır. plazmasitoid DCler tip I interferon doğal üreticileri ve anti-viral T hücre bağışıklık için önemlidir. CD8α Neg DC alt MHC sınıf II antijen sunumu için özel olan ve merkezi bir CD4 T hücrelerini priming yer almaktadır. CD8α Pos DH'ler eksojen antijenler ve CD8 T hücresi priming çapraz sunumu için öncelikle sorumludur. CD8α Pos DC'ler özel bir T cel için CD1d moleküller glycolipid antijenlerin sunumu en verimli olduğu ortaya konmuşturdeğişmeyen doğal öldürücü T (iNKT) hücreleri olarak bilinen l nüfus. FLT-3 ligand uygulanması sonuçta murin modellerinde periferal lemfoid organlarda, dendritik hücrelerin genişlemesi ile sonuçlanır kemik iliğinden dendritik hücre progenitörlerinin göç sıklığını artırmaktadır. Farklı DC alt gruplarının in vivo yeterliliğini karşılaştırma hücre transferi deneylerinde kullanılmak için fonksiyonel dendritik hücrelerin çok sayıda saflaştırmak için bu model adapte edilmiştir.
Introduction
"Büyük yıldızsı (Yunan dendron) hücre" lenfoid organlara 1 bulunduğu gibi dendritik hücreler (DC) neredeyse kırk yıl önce keşfedildi. Birçok çalışma, DH'ler etkili naif T hücreleri, 2 stimüle tek antijen sunan hücreler olduğunu göstermiştir. Bu hücrelerin önemli bir fonksiyonu, antijen molekülleri üzerine alımı ve antijenlerin sunumu ve verimli işlem ve bunların yüklenmesidir. fare dalağı içinde DH'ler plazmasitoid geleneksel alt-grup halinde ayrılabilir. plazmasitoid DH'ler CD11c düşük ekspresyon ve B220 ve GR-1'in yüksek düzeyleri ile karakterize edilir. Onlar da yüzey işaretleyici mPDCA1 için pozitif ve reseptör 9 (TLR9) ligandların gibi ücretli cevaben interferon türü salgılar. Geleneksel DH'ler CD11c ve MHC sınıf II ekspresyonu için yüksektir. Bunlar, CD4, CD8α, DEC205, CD fenotipik işaretleyiciler yüzey ekspresyonu göre üç farklı alt-grup halinde ayrılabilen11b ve (33D1 antikoru tarafından tanınan DCIR2) dendritik hücre inhibitör reseptör 2 proteinleri 3,4. CD8α Pos DH'ler da CDC1 olarak bilinir, bu tür CD11b ve 33D1 olarak miyeloid belirteçler için DEC205 için olumlu, ama olumsuzdur. Ayrıca Cdc2 denilen CD8α Neg DC'ler, 33D1, CD11b ve CD4 pozitif ama DEC205 yoksundur. Çift negatif alt kümesi (CD4 ve CD8α hem yani negatif) nadirdir ve DEC205 ve 33D1 için negatiftir. Bu en karakterize alt kümesi ve CD8α Neg DC daha az farklılaşmış formu olabilir.
Çeşitli DC alt gruplarında Fenotipik farklılıklar da in vivo fonksiyonları uzanır. CD8α Neg DH'ler yüksek fagositik ve esas olarak CD4 T hücrelerinin 3 MHC sınıf II ile ekzojen antijen mevcut olduğu düşünülmektedir. Bunun aksine, CD8α Pos DH'ler MHC sınıf I çözünür protein antijeni için özel olanbir mekanizma çapraz sunum denir. Çapraz sunum sonucu bu DCler 5 aktivasyon durumuna bağlıdır, ve sitotoksik T hücrelerinin (CTL'ler) veya düzenleyici T hücrelerinin 6 2,7 gelişimi genişlemesine neden olabilir ya da. Enfekte apoptotik hücrelerinden türetilen antijen sunumu kuvvetli bir CTL karşılığı 9 indükler ise, büyük ölçüde T-hücreleri, 8 silme anti-DEC205-antikor-aracılı teslim sonuçları kullanılarak CD8α Sıra DH'lere antijenin hedefleme.
Peptit antijenlerinin tanınması ek olarak, bir memeli bağışıklık sistemi lipid ve glikolipit antijenler tanımak gelişmiştir. Bu antijenler, çeşitli memelilerdeki çok benzer formlarda mevcut MHC sınıf I-benzeri hücre yüzeyi proteinleridir CD1 molekülleri tarafından sunulmaktadır. Farelerde, CD1d adlandırılan yüksek derecede korunmuş CD1 molekülünün tek tip glikolipit antijenler 10 sunumundan sorumludur. büyük CD1d / glikolipid kompleksleri tanıyan T hücre popülasyonu değişmeyen NKT hücreleri (iNKT hücre) adı verilir. Bu hücreler, çeşitlilik 11 sınırlı TCRβ zincirleri ile eşleştirilmiş bir değişmeyen TCRα zinciri oluşan bir yarı-değişmez T hücresi reseptörü (TCR) ifade etmektedir. Çoğalmak ve aktive efektör T hücreleri olmak için ayırt etmek gerekir geleneksel T hücrelerinin aksine, iNKT hücreleri efektör nüfus olarak var ve glikolipid idaresi 12 sonra hızla yanıt başlar. fizyolojik olarak uygun yağ antigen sunan hücrelerin tanımlanması, aktif bir araştırma alanıdır ve bu tip B hücreleri, makrofajlar ve DCler olarak birkaç farklı hücre tipleri bu işlemi gerçekleştirmek için önerilmiştir. Bununla birlikte, DC'lerin CD8α Pos grubu fare iNKT hücreleri 13 ve CD8 T hücreleri 14 glikolipid aracılı çapraz astarlama alımını ve lipid antijenlerin sunumu aracılık birincil hücre olduğu gösterilmiştir.
farklı antijen sunan hücreler tarafından antijen oluşumunun verimliliğini karşılaştırmak için,> "ove_content, basit bir yaklaşım, bu tür hücre transfer deneyleri genellikle immünolojik çalışmalar yapılmaktadır naif ana Antigenin eşdeğer miktarlarda ile doldurulan. saflaştınlmış APC 'lerin farklı transfer etmektir. bu hücreler, toplam hücrelerin 15% 2'sinden azını oluşturan lenfoid organlarda olduğu gibi nadir nüfusu var çünkü Ancak, ex vivo antijen tedavi DC'ler transfer çalışmalarını gerçekleştirirken, zordur. donör hayvanlarda bu hücrelerin gelişimini arttırmak için bu nedenle gereklidir izole etme protokolleri şu etkinliğini geliştirmek için.Bilindiği gibi, PDC, CD8 Pos ve CD8 Neg DC alt kümeleri, ekspres fms bağlantılı reseptör tirosin kinaz 3 (Flt-3) oluşturulması için gerekli olan genel lenfoid ve ortak miyeloid progenitör. In vivo FLT-3 ligandı üzerine (Flt-3L) uygulama, emigratFlt-3, kemik iliği projenitör hücrelerin eksprese iyon periferal lemfoid organlarının artan tohum ve olgun DC döl 16 genişlemesi ile sonuçlanır artar. Flt-3 ifadesi B, T ve NK hücre farklılaşması yollara işlenmesi sırasında kaybolur. Bu nedenle, çok az değişiklikler Flt-3L uygulanması üzerine bu hücrelerde görülmektedir. DC popülasyonları benzer genişletme Flt-3L 17,18 sürekli sistemik düzeylerde temin edilmesi için basit ve ekonomik bir yöntem sağlar murin Flt-3L, salgılayan bir B16-melanom hücre hattı implantasyonu ile oluşturulan tümörleri taşıyan farelerde gözlenmiştir. Bu yaklaşımı kullanarak, bu şekilde büyük ölçüde daha sonraki deneyler için izole edilebilir, bu hücrelerin verimlerini büyük ölçüde artırmak, fare dalağı içinde normal DC alt-genişlemesini uyarmak için Flt-3L salgılayan B16 melanom hücreleri implantasyonundan göre bir protokol geliştirilmiştir . 14 gün deri altı im aşağıdaki - Biz sürekli 10 içinde bulmaktoplam dalak hücrelerinin% 60 - Flt-3 salgılayan tümör ekimi, fareler 40 oluşturacak DH'lerin belirgin zenginleşme ile splenomegali gelişebilir. Bu dalaklarından farklı DC alt-gruplar yüksek saflıkta Standard Bu alt-spesifik fenotipik işaretleyiciler kullanan ticari olarak temin edilebilen hücre saflaştırma kitleri kullanılarak izole edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış esaslara uygun olarak yapılır. sterilite gerektiren tüm işlemler bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmaktadır.
Farelerde B16.Flt3L Melanom 1. implantasyonu
- Kültür, 37 ° C'de% 10 CO2 ile birlikte DMEM ortamı içinde 0.5 x 10 6 hücre / ml'lik bir yoğunlukta T25 doku kültürü şişelerinde Flt-3 eksprese eden B16 melanoma hücre soyu. Hücreler ulaşana kadar ~% 90 izdiham (~ 20 saat) büyütün.
- sindirim tripsin hücreleri hasat. Aspire hücre kültür ortamı ve PBS ile yapışık hücrelere yıkayın. % 0.05 tripsin 5 ml ilave edilir ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edilir. Proteaz hazmı sönmesi için soğuk 20 ml bitmiş DMEM ortamı fetal dana serumu (FCS) ihtiva eden (4 ° C) ekleyin. hafifçe hücreleri kaldırın nazikçe yukarı ve aşağı pipetleme takip vurma.
- 300 santrifüj hücreleri toplamak4 ° C'de 10 dakika boyunca x g. Hemasitometre veya otomatik hücre canlılığı sayacı kullanarak hücreleri sayın. PBS içinde 10 8 hücre / ml'lik bir yoğunluğa yeniden süspanse edin.
- Deri altına enjeksiyon ile tümör hücreleri ile implant fareleri (C57BL / 6 ya da başka bir histo suşu) hücre süspansiyonu, 100 ul (10 7 hücre) ile boyun tabanına Machholz ve ark., 19 tarafından tarif edildiği gibi.
- organ için hayvanlar kurban edilmeden önce (12 gün - - çapı 10 mm, genellikle 7 2) tümör palpe veya görünür kadar büyümeye izin verin.
Tümör taşıyan fareler ile Dalak Tek Hücre Süspansiyon 2. Hazırlık
- izofluran aşırı dozda (>% 5 izofluran akış hızını ayarlamak ve durur nefes sonra poz en az 2 dakika devam) ile fareler anestezi. Ötenazi için kurumsal kurallarına göre servikal dislokasyon ile Flt-3 melanom tümör taşıyan fare Kurban.
- diSteril makas 20 yardımı ile aseptik teknik kullanılarak,% 70 etanol ve hasat dalak ile cilt sinfect.
- Biyogüvenlik kabini taşınması için steril bir Petri kabı içine dalak yerleştirin. steril koşullar altında burada tüm adımları uygulayın.
- taze Petri kabı dalak aktarın ve RPMI ortamı ile yıkayın. Bir neşter kullanılarak küçük (~ 0.2 cm 2) parçalar halinde dalak kesin. kolajenaz / DNaz çözeltisinin 10 ml'si ile 37 ° C'de 30 dakika süreyle inkübe edilir.
- 70 mikron hücre süzgecinden üzerine dalak dokusunun kısmen sindirilmiş süspansiyon dökün. 5 ml şırınga pistonu kullanarak süzgeçten ağı boyunca kalan doku parçaları sıkıştırın.
- taze ortam 10 ml örgü filtre yıkayın ve filtreyi atın. pelet hücreleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de süspansiyon santrifüjleyin.
- Süpernatant aspire ve RBC parçalama tamponu 2 ml hücre pelletini. RT f inkübeya da 10 dakika. tam RPMI ortamında 10 ml ekleyerek RBC parçalama tamponu Quench.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri. Uygun hacimde yeniden süspanse Fc Block antikoru (2.4G2) 20 ug / ml içeren bir hücre ayırma tamponu (örneğin, MACS) içinde 10 8 hücre / ml hücre yoğunluğu elde etmek için.
Dalak Tek Hücre Süspansiyon gelen plasmasitoid DC'ler, CD8α Pos DC'lerin ve CD8α Neg DH'lerin 3. saflaştırılması
., Tek bir hücre süspansiyonu dalak DC alt-izolasyonu, Şekil 1 'de gösterildiği gibi, bir çok-aşamalı bir işlemdir 4 bir ısıyı sürdürmek için önceden soğutulmuş tampon ve bir buzlu su banyosu kullanılarak, tüm adımları - 8 ° C: Not. Protokol aşağıdaki bölümde tüm reajan hacimleri 10 8 hücre / ml), dalak hücre süspansiyonu 200 ul bir ilk giriş için hesaplanır. Bu kadar ölçeklendirilebilir veyaaşağı ve orantılı ilk adım (3.1.1 ve 3.2.1) diğer reaktif (her zaman 1 x 10 8 hücre / ml yoğunlukta) hücre süspansiyonu hacmini değiştirerek ihtiyaca dayalı. buna göre tüm sonraki adımda reaktif hacimlerini ayarlayın. Örneğin, 1, 8 x 10 / ml dalak hücre süspansiyonu 100 ul ile başlayan tüm adımlarda yarısı belirtilen reaktif hacimlerini kullanımı.
- Plasmasitoid DC'ler izolasyonu (PDC)
- dalak hücre süspansiyonu 200 ul plazmasitoid DC İzolasyon kiti temin biyotin etiketli antikor kokteyli 300 ul ekle.
- İyice karıştırın ve 15 dakika buzlu su banyosunda enkübe edilir. askıya hücreleri korumak için, ve bağlayıcı antikor maksimize etmek için tüpü her 3 dakikada dokunun.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g santrifüj ile hücreler tampon sıralama 12 mi hücre ekleyin ve pelet. Süpernatant aspire bağlanmamış biotinlenmiş antikorlar kaldırmak için.
- hücreyi yeniden süspansehücre sıralama tampon 500 ul pelet. anti-biyotin antikor eşlenik boncuklar 300 ul ekle. Adımı tekrarlayın 3.1.2 ve 3.1.3.
- Süpernatant atılır ve hücre ayırma tamponu, 2 ml hücre pelletini. önceden soğutulmuş tamponlar kullanılarak oda sıcaklığında bu noktada tüm adımları.
- manyetik stand LS sütun sıralama taze manyetik aktive hücre yerleştirin. Yıkama ve hücre ayırma tamponu, 5 ml ile kolon dengeye.
- Sütun üzerine hücre süspansiyonu pipetle kolon yatağın yüzeyinin ortasına yavaşça uygulanması. akışı toplayın.
- hücre sıralama 10 ml tampon ile kolon yıkayın. gerçekleşen bu akışa toplamak ve adım 3.1.7 geçen akış ile birleştirir. PDC (FT1) aracılığıyla bu sütun akışında zenginleştirilmiştir.
- 2 ml hücre ayırma tamponu içinde 4 ° C, tekrar süspansiyon, 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile FT1 hücreleri pelet ve taze LS kolonu boyunca hücrelere geçme3.1.8 - adımları 3.1.6 tekrarlayarak. İki ardışık sütun bu kullanımı izole hücrelerin gelişmiş saflığını verir.
- 2 ml tam RPMI ile 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ve tekrar süspansiyon Pelet hücreleri. gerekli olana kadar buz üzerine yerleştirin.
- CD8α POS ve CD8α Neg DC'lerin izolasyonu
Not: Bu prosedürde ilk adım B, pDC, T ve NK hücrelerinin tükenmesi olduğunu.- Bütün dalak hücresi süspansiyonuna (adım 2.8 'de elde edilen 10 8 hücre / ml'lik 1 mi) ile başlayarak, CD8α Pos DC yalıtımı kitinde verilen biyotin-konjuge antikor kokteyli 100 ul ilave edin.
- İyice karıştırın ve 15 dakika buzlu su banyosunda enkübe edilir. hedef hücrelere biotin etiketli antikorların bağlanma maksimize etmek için tüp hafifçe her 3 dakikada dokunun.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler tampon sıralama 12 mi hücre ekleyin ve pelet. aspire süperilişkisiz biotinlenmiş antikorlar kaldırmak için yüzen.
- Hücre sıralama tampon 150 ul ve CD8α Pos DC yalıtımı kitinde verilen anti-biyotin boncuk 100 ul ekle. İyice karıştırın ve 15 dakika buzlu su banyosunda enkübe edilir.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler tampon sıralama 10 mi hücre ekleyin ve pelet.
- Yeniden süspanse 1 ml hücre ayırma tamponu içinde hücreler ve adımlar 3.1.8 boyunca 3.1.6 prosedüre uygun olarak taze bir LS kolonu üzerinden geçer.
- 2 (FT2) aracılığıyla işaretlenmemiş akışını toplamak ve sütun bakiyenin atın. Bu etiketsiz fraksiyon CD8α Pos ve CD8α Neg DC'ler için zenginleştirilmiştir.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile FT2 hücreleri Pelet.
- 1 ml hücre sıralama tampon hücreleri tekrar süspansiyon ve CD8α Pos DC izolasyon kiti sağlanan anti-CD8α konjuge manyetik boncuk 200 ul ekleyin.
- temsilci3.2.6 arasındaki adımları 3.2.2 yemek. Sütunun geçen akış CD8α Neg DC'ler için zenginleştirilmiş ve CD8α Pos DC'ler için tükenmiştir. Bu 3 (FT3) akışı etiketli.
- CD8α Pos DC'ler sütununda muhafaza Zehir için, mıknatıstan sütunu kaldırmak hücre sıralama tampon 5 ml ekleyin ve LS kolonu ile temin edilen bir piston kullanarak kolon matrisi temizlemek.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri. 1 ml hücre ayırma tamponu içinde aspire supernatant ve tekrar süspansiyon. akış atmak ve 3.2.11 gibi muhafaza hücreleri toplamak dışında, saflığını artırmak 3.1.8 için adımları 3.1.6 tekrarlayarak yeni bir LS sütun aracılığıyla yeniden yıkandı hücreleri çalıştırmak için.
- ST3 süspansiyondan CD8α Neg DC'ler arıtmak için, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile FT3 pelet ve hücre ayırma tamponu, 300 ul süspansiyon haline getirin.
- Anti-CD11c mag 100 ul ekleyinmanyetik boncuklar. İyice karıştırın ve 15 dakika buzlu su banyosunda enkübe edilir.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile 10 mi hücre sıralama tamponu ve pelet hücreleri ekleyin.
- Tekrarlayın 3.1.8 ile 3.1.5 adımları. CD8α Neg DH'ler pozitif CD11c boncuklar ile seçilir ve kolona bağlanmıştır. akış yoluyla çıkarılabilir.
- Saflaştırılmış CD8α Neg DCler toplamak için aşama 3.2.11 de tarif edildiği gibi kolon içinde alıkonur ve hücreler Zehir.
Antijen ve Hücre Transferi 4. Sıralı Yanan APC'ler
- Arıtma, canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek tripan mavisi dışlama 21. kullandıktan sonra canlı hücreleri saymak.
- tercih edilen antijen ile inkübe hücreleri. 100 nM konsantrasyonda 13 de glycolipid antijen denilen alfa-galaktozil seramid (αGalCer) analogları kullanın. Tipik haliyle, çok düşük attac kullanılarak 10 6 canlı hücre / kuyuda tam RPMI levhahment U tabanlı, 96 oyuklu plakalar hücre eki en aza indirir. 4 saat - 1, 37 ° C'de% 5 CO2 atmosferinde inkübe hücreleri.
- hafifçe birkaç kez pipetleme Hasat hücreleri. kesme kuvvetlerinin hücre hasarı en aza indirmek için geniş delik pipet uçları kullanın. PBS ile kuyu yıkayın ve hücre hasat üst düzeye çıkarmak için bu yıkar havuz.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de Pelet hücreleri ve PBS içinde arzu edilen bir yoğunluğa yeniden süspanse edin. Tipik olarak, alıcının, hayvan başına 200 ul 1.000.000 hücre enjekte edilir. konak hayvanların içine uygulanmadan önce canlılığı maksimize etmek hücreleri buz üzerinde tutun.
- Intravenöz farelere ya yanal kuyruk damarı ya da retro-orbital venöz pleksus yoluyla 19 hücreleri enjekte edilir. 1 ml şırınga üzerinde 27 G iğne kullanın ve fare başına 0.1 ml maksimum hacim enjekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu prosedürün sonucu implante melanoma hücreleri tarafından ifade fare Flt-3L DC alt kümeleri genişletilmesi dayanmaktadır. B16.Flt3L tümör C57BL / 6 fareden türetildi ve red nedeniyle tesis haline tümörün başarısızlığı önlemek için bu suş kökenli, hayvanlara implante edilmiş olmalıdır. Bazı durumlarda, yollar veya ilgi reseptörleri sinyal bilinen kusurları ile DC'ler elde etmek için genetik olarak modifiye edilmiş fareler kullanmak arzu edilebilir. Tümör gibi hayvanlarda farklı kinetik ile gelişebilir akılda tutmak önemlidir, bu yüzden inokülasyon yerinde görünüm ve palpasyonla dayalı tümör büyümesini izlemek için önemlidir. Tümör belirginleşmeye bir kez bizim deneyim, fareler taşıyan B16.Flt3L tümör sürekli tüm DC alt kümelerinden (Şekil 2A) genişlemesi ile ilişkilidir dalak hücreselliğinde belirgin bir artış göstermektedir. Bu, tipik olarak 2 ila 3 kat yükselmektedir bkzsaf hayvanlara kıyasla B16.Flt3L melanoma taşıyan fareler ile elde edilen toplam splenositlerin sayısı e. B hücrelerinin mutlak sayısında herhangi bir değişiklik için az ise kısmen DC sayısındaki artış, B hücrelerinin frekansı belirgin bir azalmaya katkıda bulunur. büyük bir genişleme (~ 15- mutlak numaraları 20-kat artış) bu farelerde geleneksel DC'ler için görülmektedir ilginçtir, plazmasitoid DC alt grubunda gözlemlenen küçük bir artış (yaklaşık 4 kat) vardır.
Farklı DC alt kümeleri tanımlamak için yolluk strateji Şekil 2A gösterilmiştir ve alt kümesi özgü fenotipik belirteçler (Şekil 2B) olarak B220, CD11b, CD11c ve CD8α ifadesi dayanmaktadır. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, aynı zamanda, bu alt-gruplarla ilgili DEC205, CD11b ve mPDCA1 ifadesini incelemişlerdir. Bu, sadece pDC alt kümesini mPDCA ile beklenen desen gösterir DEC ise 205 CD8α Pos DC'lerde yüksek ifade edilir ve CD11 b CD8α Neg DC'lerde en belirgin algılanır. Ayrıca protokol her adımında saflaştırılarak alt gruplarının her hücre frekanslarda değişiklikleri analiz (Şekil 3'te akış sitometrik veriler ayrıntılı örnekler, Şekil 2C 'de özetlenmiştir) anlatılacaktır. Tanımlanan dalak DC alt-izolasyonu çok adımlı bir işlemi (Şekil 1). plasmasitoid DC'ler saflaştırılması B, T, NK hücreleri ve konvansiyonel DC'ler gibi tüm istenmeyen popülasyonlarının tükenmesi sonra bu hücreleri zenginleştirmek için negatif seleksiyon dayanır. CD8α Pos DCS ve CD8α Neg DC'lerin saflaştırma T, B ve NK hücreleri yok olmasından sonra, bu hücrelerin pozitif seçim ile gerçekleştirilir. DC alt gruplarının her birinin, yüksek saflıkta (tipik olarak ~% 95), aynı zamanda, Şekil 3'te gösterilmiş olup, bu prosedür kullanılarak elde edilmiştir.
ve_content. "fo: keep-together.within Sayfa =" 1 "> yapılacak deneyler bağlı olarak, bu hücreler, arzu edilen bir antijen ile doldurulan ve immünolojik çalışmalar için histo-uyumlu fare ana aktarılabilir Buna ek olarak, bu hücreler de olabilir fizyolojik DC alt gruplarının uyarıcı veya düzenleyici faaliyetler in vivo çalışmalar için kullanılacak. 2 x 10 7 toplam splenositler başına saflaştırılmış DC alt grupları için hücre verimleri yaklaşık bir milyon PDC 2 milyon CD8α Pos DC'ler ve 4 milyon CD8α Neg DC'ler vardır.
Şekil DC'lere 1. izolasyonu. DH'lerin farklı alt izolasyonu için protokol çeşitli aşamaları gösteren bir şematik. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. >
B16.Flt3L Tümörlerinde ile Fare Dalak DC Alt Grupları Şekil 2. analizi. A) Ayırıcı stratejisi pDC'lerde (R1), CD8α Pos DCler (R5) ve CD8α Neg DC'lerin (R6). B) Farklı alt-gruplarla ilgili mPDCA1, 33D1, DEC205, CD11b'nin İfade tekabül eden hücre popülasyonlarının tanımlanması amacı görüntülenmiştir. Kapı R4 bulunan hücreler (lenfositler bir alt kümesi, B220, CD11c, CD11b negatif). Gününde farelerin dalaklarından izole bu markerlerin C) DC zenginleşme ve lenfosit alt ekspresyonunu yoksun bir kontrol popülasyonu olarak kullanılmaktadır naif farelerde bu hücre popülasyonlarının frekansı beyaz çubukları olarak gösterilmiştir ise B16.Flt3L melanom hücrelerinin aşılanmasından sonra 14, siyah çubuklar olarak bırakılmıştır arsa gösterilmiştir. Doğru arsa hücre sayıları aynı verileri görüntüler.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53824/53824fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Zenginleştirme Protokolün sırasında Splenik DC Alt Grupları Şekil 3. analizi. Taşıyan farelerin B16.Flt3L tümörden splenositlerin başlayarak popülasyonunda% 10 ila plazmasitoid DC (B220 yüksek ve CD11c düşük R1) A) zenginleştirilmesi sütununda% 95 saflık Bu sütundan elüt hücreleri edilmeyen kısım Not 1. akmasına dalaklarında ~% 33 bu nüfus. B) CD11c Yüksek konvansiyonel DC'lerin zenginleştirilmesi (CD8α pozitif ve negatif karışımı) tükenmiş B16.Flt3L melanoma taşıyan içinde ~% 78 tümör implantasyonundan 10 gün sonra farelerin 2 fraksiyonu boyunca akış. Sütun alıkonan 2 araziler, CD11c pozitif popülasyonlar parti gibi görünenally T, B ve NK hücreleri yok etmek negatif seçiminde DH'lerin önemli sayıda çıkarılması karşılık gelen bitmiş. CD8α Pos DClerin>% 95 saflık, anti-CD8 bağlanması verim için pozitif seçim ile 2 süspansiyon içinden akışın daha fraksiyonasyon. Bu geçen akış sonra>% 95 saf CD8α Neg DC'ler nüfusu, anti-CD11c'nin bağlanması verimli olumlu bir elemeye tabi tutuldu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dendritik hücrelerin T hücre yanıtlarının prime dahil sunan hücreler büyük profesyonel antijen olarak kabul edilmektedir. Onların ana fonksiyonu T hücrelerine sunum için antijenleri alarak ve işleyerek doku mikro incelemektir. Belirli DC alt gruplarının işlevini incelemek için, bu normal fenotip ve fonksiyonlarını koruyan bir yaklaşım kullanarak yeterli sayıda izole edilmesi gerekir. Çoğu protokolleri naif farelerin spesifik DC alt kümesi izolasyonu güveniyor. Bu hücreler az olduğu için, izolasyon prosedürleri verimli değildir ve hücrelerin az sayıda verir. Transfer çalışmaları ile yapılan çoğu deneyler hayvan başına hücrelerin en azından bu numarayı kullanırken 1 milyon CD8 pos DC'ler - örneğin, bir dalak sadece yaklaşık 0.5 verecektir. Bu nedenle, mevcut yöntemlerin önemli bir sınırlama donör farelerden ve büyük miktarlarda çok sayıda kullanmadan yeterli hücre sayıları izole yetersizlikreaktifler. Önerilen yöntem, esas olarak immünomanyetik saflaştırma adımları bir dizi kullanarak üç iyi bilinen DC alt kümesinin daha fazla sayıda saflaştırılmasını sağlayan büyük DC'ler genişletmek için Flt-3L salgılayan tümör yerleştirilmiş farelerin kullanarak bu sorunların üstesinden gelmektedir. Burada açıklanan protokol, bu nedenle en azından birkaç kat verim açısından mevcut yöntemlere göre önemli bir gelişme sağlar.
Birkaç uyarılar burada tarif edilen izolasyon protokolü için var. önemli bir sınırlama prosedürü yanlışlıkla kendi fenotip değiştirebilir bu hücrelerin izole etmek için kullanılmış olmasıdır. DH'ler endotoksin kirlenmesi ve fenotip ve işlevinde değişikliklere yol açabilir mekanik uyarıcılara karşı son derece hassastırlar. Bu tekniğin başka bir sınırlama DC alt kümelerini genişletmek için Flt-3L salgılanması güvenmektir. Bu Flt-3 reseptörü ifade etmeyen doku yerleşik DC alt-genişleme eksikliği ile sonuçlanır.
Burada açıklanan protokol ticari olarak temin edilebilen reaktifler kullanılarak hücre zenginleştirme dayanır. Hücre saflaştırma izolasyonu için kiti kullanılacak reaktiflerin tavsiye edilen birimleri içeren bir protokol ile birlikte gelir. Edilmiş tümör taşıyan farelerin hücre bileşimi saf farelerde (Şekil 2C) 'den önemli ölçüde farklıdır ve bu nedenle en iyi hücre saflık elde etmek için bizim tekniğinde kullanılan reaktifler için miktarda olarak var. DH'ler yapışmış hücreler ve sütun matrisine spesifik olmayan ekleyebilir. EDTA içeren tampon ile kolon Oda dengelenmesi hücre yapışmasını en aza indirir ve iki ardışık sütun üzerinde seri pasaj kullanımı ayrıca hücre saflığını artırır.
DH'ler yüksek yapışma hücreleri ve in vivo, genellikle yakın bir hücre-dışı doku matrisi ile ilişkilidir. verimini artırmak için, yeterli Tim için kolajenaz ve DNaz ile dalak dokusu sindirimi çok önemlidirE, bu hücrelerin, maksimum sayıda elde etmek için. Sindirime geçiyor ise dalak doku parçaları tamamen kollajenaz / DNaz I çözeltisi içinde batık emin olmak için de önemlidir. Bu hücreler yüksek endotoksin duyarlı olduğundan DC izolasyon başka kritik özelliği, izolasyon işlemi sırasında sıkı sterilite ve endotoksin içermeyen koşullar muhafaza etmektir. endotoksin içermeyen stoklarından taze hazırlanmış reaktif kullanın ve filtre kullanmadan önce tüm reaktifler sterilize edin. Tüm hücre izolasyon tamponları ve medya saptanabilir endotoksin ücretsiz olarak sertifikalı FCS ile takviye edilmelidir. Bu hücreler, aynı zamanda mekanik uyarıcılara ve bu hücrelerin olgunlaşma değiştirebilir tekrar mekanik uyarıya karşı çok duyarlıdır. Bazı mekanik kuvvet kolajenaz sindiriminden sonra, bir hücre süzgecinden doku zorlamak için gerekli olmasına rağmen, bu yavaşça mümkün olduğu kadar yapılmalıdır. Buna ek olarak, hücre kuvvetlice pipetleme possibl olduğunca kaçınılmalıdırE, geniş delikli pipet uçları kesme kuvvetleri en aza indirmek için kullanılır.
adoptif transfer modelinde DC'lerin spesifik alt kümeleriyle antijen sunumu ve T hücresi priming araştırılması için yararlıdır. Bununla birlikte, endojen DClere antijeni ile pulse edilmiş DC oluşabilir antijen transferi diğer çalışmalarda gösterilmiştir. Böylece, antijen darbeli hücreler tarafından başlatılan adaptif bağışıklık tepkisi "yakalanan" antijeni ve değil aktarılan APC başvuran endojen DC'lerin tarafından sunum yansıtabilir. İzole DC hazırlıkları ölü veya ölmekte hücreleri içeriyorsa transferi Bu tür katlanarak artar. Hücre canlılığını geliştirmek için önceden soğutulmuş tampon ile, steril koşullar kullanılarak, mümkün olduğunca hızlı bir şekilde DC yalıtımı ve transfer protokolü yürütecek önemlidir. Bu sırasında hücre eki en aza indirmek için düşük bağlanma hücre kültür plakaları içinde inkübe ile bu nedenle 4 saat gibi kısa bir antijen doldurulmasını süresi tercihBu adımı. Buna ek olarak, genişletilmiş kültür koşulu kültürlü DC'lerin olgunlaşma durumunu değiştirebilir ve adaptif transfer deneyleri 22 sonucunu etkileyebilir.
Özetle, dendritik hücre biyolojisi sadakatle in vivo fenotipik yansıtmak ve işlevsel ayrışma bu hücreleri incelemek için muazzam bir fırsat sağlar DC'ler oluşturmak için çok aktif bir araştırma alanı ve güvenilir bir yöntem geliştirilmesidir. Bu, DC fonksiyonlarını modüle edebilir, ancak hayvan modellerinde halinde sistemik olarak tatbik edilemez kimyasal içeren çalışmalar için özellikle önemli hale gelir. Bu kimyasallar ile ilgi ex vivo olarak izole DC alt kümelerini tedavi antijen sunumu yollarının mekanik ayrıntıları aydınlatmak yardımcı olabilecek bir pratik ve uygulanabilir bir yaklaşımdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
çalışmalar AIDS Araştırma Einstein Kanser Merkezi'nde (NIH / NCI CA013330) ve Merkezi (NIH / NIAID AI51519) tarafından desteklenen FACS çekirdek imkanları kullanılarak gerçekleştirilmiştir sitometri Bu çalışma, SAP Flow NIH / NIAID hibe AI45889 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies, Gibco | 25300-054 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936-250MG | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | |
| DNase I (dry powder) | QIAGEN | 79254 | |
| 200 proof ethanol | Thermo Fisher Scientific | 9-6705-004-220 | Used to prepare 70% ethanol |
| RBC lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11875-119 | |
| DMEM medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11995-073 | |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM non-essential amino acids | Life Technologies, Gibco | 11140-050 | |
| MEM essential amino acids | Life Technologies | 11130-051 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies, Invitrogen | 21985-023 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| HEPES | Life Technologies, Invitrogen | 15630 | |
| Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) | Life Technologies, Invitrogen | 20012-050 | |
| Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) | Life Technologies, Gibco | 14040-182 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution | Life Technologies | 15575-020 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11050 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Invitrogen | 15140-163 | |
| Trypan blue (dry powder) | Sigma-Aldrich | T6146-5G | Prepare 0.08% with PBS |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotech | 130-092-786 | |
| Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c | Miltenyi Biotech | 130-152-001 | |
| CD8αPos mouse DC isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-091-169 | |
| Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anti-mouse CD11c-FITC | BD Biosciences | 553801 | |
| Anti-mouse CD8α-PerCP | BD Biosciences | 553036 | |
| Anti-mouse B220-PE | BD Biosciences | 553090 | |
| 1 ml syringes | BD | 26048 | |
| 23 G1 needle | BD | 305145 | |
| 100 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 875712 | |
| Surgical instruments | Kent Scientific | INSMOUSEKIT | |
| Cell strainer (70 µm) | BD | 352350 | |
| Large Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm)) | Corning | 431097 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Magnetic stand MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Wide-bore 200 μl pipette tips | PerkinElmer | 111623 | |
| Corning ultra-low attachment 96-well plates | Corning | CLS3474-24EA | |
| 6-8 week old female C57BL/6 mice | Jackson Research Laboratories, Jax | ||
| Murine B16.Flt3L melanoma cell line | described by Mach et al., 2000 | ||
| Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M) |
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system. | ||
| Complete RPMI and DMEM media | Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media. | ||
| MACS buffer | Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). | ||
| FACS staining buffer | Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer | ||
| 10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml. |
This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use. |
References
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Dudziak, D., et al. Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo. Science. 315 (5808), 107-111 (2007).
- Belz, G. T., Nutt, S. L. Transcriptional programming of the dendritic cell network. Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).
- den Haan, J. M., Bevan, M. J. Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo. J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Yamazaki, S., et al. CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells. J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).
- Mukherjee, G., et al. DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1. Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).
- Melief, C. J. Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming. Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L.
- Benlagha, K., Bendelac, A. CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity. Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Arora, P., et al. A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens. Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).
- Semmling, V., et al. Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs. Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).
- Duriancik, D. M., Hoag, K. A. The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer's patches using flow cytometric analysis. Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).
- Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).
- Mach, N., et al. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).
- Vremec, D., Segura, E. The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen. Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Unit 1.9, Removal of lymphoid organs. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Vremec, D., et al. Maintaining dendritic cell viability in culture. Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).
