Summary
Med det murine ABC transportør Bcrp1 (ABCG2) som et eksempel, i-silico protokoller præsenteres for at detektere alternativ promotoranvendelse i gener udtrykt i musevæv, og vurdere funktionaliteten af de alternative promotorer identificeret ved anvendelse reporter assays.
Abstract
Genekspression i forskellige væv er ofte styret af alternative promotorer, der resulterer i syntesen af mRNA med unikke - sædvanligvis utranslaterede - første exoner. Bcrp1 (ABCG2), det murine ortholog af ABC transportør Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), har mindst fire alternative promotere, der er udpeget af de tilsvarende fire alternative første exoner produceres: E1U, E1A, E1B, og E1C. Heri in-silico protokoller præsenteres til at forudsige alternativ promotoranvendelse for Bcrp1. Desuden er reporter analysemetoder beskrevet at producere reporterkonstruktioner til alternative initiativtagere og bestemme funktionaliteten af formodede initiativtagere opstrøms for de alternative første exoner, der er identificeret.
Introduction
Mere end halvdelen af menneskelige gener er reguleret af alternative initiativtagere 1. Hver alternativ promotor kan indeholde regulatoriske elementer, der kan være forskellige fra dem i andre alternative promotorer. Promotoren (r) anvendes i en væv kan afvige fra dem, der anvendes i en anden væv. For eksempel er det muligt, at aktivering af en given signalvej kan udløse den alternative promotor til et gen anvendes i en væv, men har ingen virkning på eller undertrykke en separat alternativ promotor til det samme gen, der er udnyttet i et andet væv.
Ekspression af Bcrp1 genet styres af alternative initiativtagere. Bcrp1 er den murine ortholog af human brystcancer Resistance Protein (BCRP) genet. BCRP er en ATP-bindende kassette (ABC) transportør formelt udpeget ABCG2 2, 3. Som en apikal plasmamembranprotein, at BCRP / Bcrp1 funktioner udstrømning til en lang række naturlige og miljøfremmede substrater
I begyndelsen af arbejde at forstå reguleringen af BCRP udtryk i normale og neoplastiske celler, blev 5 'hurtig opformering af cDNA ender (5'-RACE) analyse af BCRP mRNA udført for at bestemme dens nøjagtige transkriptionelle startsted 13. Ikke alene var flere transkriptionel start- sites fundet; også stødte var tre alternative former af det første exon, som i BCRP er utranslateret. Disse alternative første exoner - udpegede E1a, E1b, E1c - blev udtrykt forskelligt i en række humane væv. To yderligere første exon varianter blev opdaget i en BLAST-søgning af den humane EST database ved hjælp det andet exon af BCRP 13. Fire kampe afslørede en første exon> 70 kb opstrøms fra exon 2, som blev betegnet E1u; fire andre kampe afslørede BCRP mRNA, manglede en første exon helt, som blev betegnet E1- 13. Tilstedeværelsen af alternative leader exons anses for at være en manifestation af alternativ promotoranvendelse 14.
Hos mus er fire alternative første exoner af Bcrp1 beskrevet, der kan svare til alternative promotere, der styrer Bcrp en transskription i forskellige mus væv; disse exoner / promotorer betegnes E1U, E1A, E1B og E1C, og er placeret ca. 70, 58, 15, og 5 kb opstrøms fra Bcrp1 exon 2 5, 15. E1A mRNA isoform viste sig at være fremherskende i Murine hæmatopoietiske stamceller, hjerte, lunge, milt og hjerne, mens E1B isoform blev udtrykt i musetarm, føtale leverceller, og erythroide precursorceller i knoglemarv 5, 15. Promotoren opstrøms fra E1B blev vist at være den væsentligste alternativ promotor regulerer Bcrp1 transkription i musetarm, reguleret i det mindste delvis ved phospho-cyklisk-AMP-responselement bindingsprotein (p-CREB) og et CREB responselement unik for denne alternative Bcrp1 promotor 16. Den E1C mRNA isoform udtrykkes overvejende i voksen murin lever og nyre 5. Den E1U isoform kan ikke påvises i de fleste testede bortset murine testis, hvor det er den fremherskende isoform udtrykt 5 væv. Bcrp1 udtrykt i rotte testikler findes i både somatiske (endotelceller tætte sammenføjninger, peritubulære myoid celler og Sertoli-celler) og kimceller (i seminifere endotel, hvor det kan beskytte sene spermatider 4). Den region opstrøms fra E1U indeholder et funktionelt respons element for steroidogene faktor-1 (SF-1) 5. Bcrp1 mRNA og protein er markant reduceret i testiklerne af Sertoli cellespecifikke SF-1 knockout-mus, hvilket antyder, at Bcrp1 ekspression i murine Sertoli-celler styres af SF-1 5.
De protokoller præsenteret detalje metoder til at opdage alternative første exoner af Bcrp1 i-silico, og at etablere luciferase-baserede reporter analyser for formodede initiativtagere opstrøms fra de alternative første exoner identificeret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. in silico Forudsigelse af Alternative Første exoner Bcrp1 Brug af BLAST Analyse af Mouse EST-database
Bemærk: Denne protokol beskriver, hvordan man søger musen udtrykt sekvens tag (EST) database for EST'eme med sekvens lighed med exon 2 af Bcrp1 (som indeholder det translationelle startsted), og derefter hvordan at tilpasse de matchende EST-sekvenser til genomiske sekvenser at fastslå deres placering i musen Bcrp1 gen i forhold til 5'-enden af Bcrp1 exon 2.
- Anskaf sekvens for mus Bcrp1 exon 2 ved at indtaste mRNA henvisningen sekvens ID (NM_011920.3) i søgevinduet af Ensembl Genome Browser 17, skal du klikke på "GO". I det næste skærmbillede skal du vælge en fuld-længde sekvens (indeholder 16 exons):
- I det næste skærmbillede ( "Udskrift-baserede Display"), skal du vælge "16 Exon." Dette vil vise et skærmbillede, der indeholder den sekvens af alle exons af Bcrp1. Exon 2 af Bcrp1 vil læse "59 -AAAGGC ... TATCAA-3 ' "De opnåede vil svare til dem, der vises i henvisning 18 resultater..
- Klik på "Hent sekvens" valgmulighed. I næste skærmbillede, skal du vælge FASTA format, og klik derefter på "Preview". I det næste skærmbillede, kopiere Preview sekvens af exon 2 i klippebordet.
- Naviger til BLAST hjemmeside 19 på National Center for Biotechnology Information (NCBI) hjemmeside 20.
- Vælg "Mouse" genom. Indsæt exon 2 sekvens fra klippebordet i søgefeltet.
- Vælg "EST'erne" fra databasen dropdown, optimere for "meget lignende sekvenser," og derefter vælge "BLAST." Kør tid vil tage et par minutter. Når BLAST løb er færdig, vil den "Results" side vises.
- Under "Beskrivelser" position af "Results" side, skal du vælge "ALL" og derefter på "Download" og derefter "FASTA (kompletsekvens) "i dropdown, og vælg derefter" Fortsæt "En .txt fil vises,. åbne og kopiere hele filen ind i klippebordet Den .txt fil indeholder sekvenser af alle EST'erne med høj sekvens lighed med musen Bcrp1 exon2. men ikke deres position i forhold til exon 2 i Bcrp1 genet.
Bemærk: En analyse foretaget den 15. april 2015 identificerede 14 murine EST'er, der på linje med Bcrp1 exon 2. Disse er anført i tabel 1.
- Identificere placeringen af EST-sekvensen, der er 5 'til exon 2 i Bcrp1 genet. Musen Bcrp1 genet er lokaliseret i kromosom 6 contig NC_000072.6 (GI: 372.099.104).
- På BLAST hjemmeside under "Specialized Blast" position, skal du vælge "Juster to (eller flere) sekvenser ved hjælp af BLAST (bl2seq)."
- Indsæt tekstfilen fra klippebordet i søgefeltet, og indtast 372099104 i emnesekvensen kassen. Optimer til "meget lignende sekvenser" under programmetudvælgelse, og køre BLAST.
- Når resultaterne vises, se alignments grafisk ved at klikke på "Grafiker" i "Alignments" vinduet. Brug højre og venstre pile og zoom til at fokusere på Bcrp1 / ABCG2 og sekvensopstillinger.
- Gem sekvensopstillinger: vælge "ALL" i feltet "Beskrivelser", derefter under "Download" dropdown vælge "Hit tabel (CSV)," og derefter klikke på "Fortsæt". Denne fil indeholder sekvensen alignment af Bcrp1 exon 2 og tilpasningen af alle EST-sekvenser med sekvenslighed til Bcrp1 Exon2 forhold til nummereringen af nucleotiderne i musen kromosom 6 contig. Hver fulde EST-sekvens kan generere multiple alignments udspændende regioner 5 'og 3' til exon 2 inklusive sekvenser, der overlapper med Bcrp1 exon 2.
- Som positionen af 5'-enden af exon 2 vil svare til nukleotid 58.655.638 i kromosom 6 contig, betegne dette som+1, Og derefter beregne positionen af partielle sekvenser af hver EST 5 'til 58.655.638. Resultaterne for de 14 EST'er er angivet i tabel 1.
Bemærk: Vær omhyggelig med at analysere EST-sekvenser, der er 5 'til en (dvs. har en negativ nukleotid værdi) som potentielle første exons. For eksempel i to af de EST'er, der på linje med Bcrp1 exon 2 vist i tabel 1 (AI647825 og AI664571) den resterende sekvens var 3 'til exon 2.
2. Evaluering af Bcrp1 Alternative promotorfunktion
- Design af reporter konstruerer for Bcrp1 E1U, E1A, E1B og E1C initiativtagere
- Brug af sekvens af E1U opnået fra at søge EST-databasen, udpege de første 5 'nukleotid af E1U som en.
- Opnå en bakteriel kunstigt kromosom (BAC) klon af muse kromosom 6, der indeholder den Bcrp1 / ABCG2 gensekvens og sekvensen mindst 100 kb opstrøms forBcrp1 / ABCG2 gen (se liste over materialer og udstyr).
- Identificere en egnet reporter vektor, såsom den luciferasereporterplasmid pGL3-Basic.
- Bestemme de multiple kloningssteder i reporter vektoren. Kpnl, Sacl, Mlu1, Nhel, Smal, Xhol, Bglll og Hindlll er restriktionsendonuclease-sites i det multiple kloningssite af pGL3-Basic vektor, i 5 'til 3' orientering.
Bemærk: Rækkefølgen af fordøjelse sites er tilgængelig fra produktkataloger af virksomheder, der producerer de restriktionsenzymer. - Identificer alle fordøjelse steder i E1U exon og 2 kb område 5 'af E1U hjælp softwareprogrammer såsom DNA5. Identificere mindst to fordøjelse sites i pGL3-Basic multiple kloningssite, der ikke findes i E1U eller 2 kb opstrøms region.
Bemærk: Sørg for at vælge et multipelt kloningssted restriktionssted til den fremadrettede primer, der er opstrøms for en valgt til den reverse primer for at sikre, at indsatsen will være i den korrekte orientering.
- Forbered frem og bak primere til PCR, der indeholder sekvenser for de valgte pGL3-grundlæggende multiple kloningssite restriktionsendonukleasesteder bruger kommercielle gen / primer syntese tjenester eller primer valg-software (se liste over materialer og udstyr). Vælg en fremadrettet primer placeret ~ 2 kb opstrøms for E1U sekvens og en revers primer inden for E1U sekvensen. De anvendte primere i forfatternes tidligere arbejde indarbejdet en Sad sted i den forreste primer, og et NheI sted i omvendt primer, og forstærkes den genomiske region fra ca. -1906 til at +64 med de første 5 'nukleotid af E1U angivet som + 1 (se trin 2.1.1 ovenfor), og er forsynet med henvisning 16.
- PCR forstærke E1U genomisk region ved hjælp af disse primere, 0,01 til 1 pg af BAC, og PCR Master mix indeholder high-fidelity Taq-polymerase (se liste over materialer og udstyr) med denaturering ved95 ° C i 30 sek, derefter 35 til 40 cykler af PCR, med forlængelse ved 72 ° C (2 min), og annealing og smeltetemperaturer baseret på smeltende egenskaber ved de anvendte primere.
Bemærk: Brugen af high-fidelity Taq-polymerase er afgørende for sekventering promotorregioner, der har høj GC-indhold. Hvis der bruges større genomiske DNA fragmenter, såsom en BAC som template, kan den sekundære struktur af det genomiske DNA gør det vanskeligt for PCR-primere til at binde. Hvis dette problem opstår, kan der opnås bedre PCR resultater, hvis den lange genomiske DNA-template forskydes forsigtigt ved lydbehandling før PCR-reaktionen. - Kontrollere længden af det amplificerede PCR-produkt ved sammenligning imod en 1 kb DNA-stige ved 0,8% TAE agarosegelelektroforese.
- PCR forstærke E1U genomisk region ved hjælp af disse primere, 0,01 til 1 pg af BAC, og PCR Master mix indeholder high-fidelity Taq-polymerase (se liste over materialer og udstyr) med denaturering ved95 ° C i 30 sek, derefter 35 til 40 cykler af PCR, med forlængelse ved 72 ° C (2 min), og annealing og smeltetemperaturer baseret på smeltende egenskaber ved de anvendte primere.
- Fordøje PCR produktet opnået og pGL3-Basic vektor, ved anvendelse af restriktionsendonucleaserne specifikke for de restriktionsspaltning sites indført i fremad- og revers-primere, som pr instructions følger med begrænsning fordøjelsesenzymer.
- Rens fordøjelsen reaktioner ved hjælp af kommercielle SV Gel og PCR Clean-Up Systems kit (se liste over materialer og udstyr), efter sættet protokol 21.
- Verificere fordøjelse og linearisering af vektoren ved at sammenligne den mod den uslebne vektor ved anvendelse af agarosegelelektroforese, derefter skåret og oprense det fordøjede vektor-DNA-båndet. Måle koncentrationen af det oprensede PCR-produkt og det oprensede vektor under anvendelse af UV-spektrometri (se liste over materialer og udstyr).
- Rens fordøjelsen reaktioner ved hjælp af kommercielle SV Gel og PCR Clean-Up Systems kit (se liste over materialer og udstyr), efter sættet protokol 21.
- Forbered E1U reporter konstruktionen ved at ligere det rensede, restriktionsenzym fordøjet PCR-produkt og pGL3-Basic ildflueluciferase reporter vektor (indeholdt i reporter assay kit, se liste over materialer og udstyr) på indsatsen: vektor forhold på 11, 21 og 31, ved hjælp af "T4 DNA-ligase hurtig ligering kit" som pr kit instruktioner 22, hvorved der frembringes den E1U reporter konstruktion, opkaldt pGL3-E1U.
- Brug pGL3-E1U plasmid at transformere bakterier til klonalt udvide pGL3-E1U følgende instruktioner i TA kloning kit (se liste over materialer og udstyr).
- Bekræft orientering og fidelity af insertet ved sekvensanalyse.
- Forbered reporter konstruerer for E1A, E1B og E1C bruge lignende metode som for E1U. Bekræft troskab af indsatserne ved sekventering som i afsnit 2.1.5.2.
Bemærk: De promotor- indsatser til E1A, E1B og E1C bør være ca. -1875 / + 10, -1847 / + 60, og -1904 / + 83 forhold til den første 5'nukleotid (betegnet +1) i E1A, E1B, eller E1C hhv.
- Reporter assaymetoder
Bemærk: Generel strategi reporter assays: den formodede promotor (5 'opstrøms region) af et gen indsættes i det multiple kloningssted af en tom "reporter" vektor, som indeholder et "reporteR-genet "(f.eks ildflueluciferase) nedstrøms fra det multiple kloningssted. Vektoren transficeres derefter i eukaryote celler, som udtrykker genet af interesse. De trans-virkende faktorer, der fremmer ekspression af genet af interesse i disse celler bør aktivere promotoren i den transficerede reporter vektor, forårsager ekspression af ildflue-luciferase, som let kan kvantificeres med en luminescens-assay.- Vælge den passende cellelinje bruge til reporter assay.
Bemærk: For at evaluere aktiviteten af E1U alternative promotor reporterkonstruktion, er det nødvendigt at transficere at konstruktion i celler, som udtrykker Bcrp1 under kontrol af E1U promotoren. Den TM4 murine Sertolicellen linje (se liste over materialer og udstyr) udtrykker Bcrp1 protein og Bcrp1 mRNA indeholdende E1U, samt E1A, E1B, og E1C fem. Som en negativ kontrol, overveje anvendelse af en cellelinje, der ikke udtrykker Bcrp1 protein eller mRNA. - Kultur på TM4 ceLLS i 24-brønds plader ved en indledende densitet på 200.000 celler / brønd i en 1: 1 blanding af Hams F12 medium og Dulbeccos modificerede Eagles medium med 1,2 g / l natriumbicarbonat, 15 mM HEPES suppleret med 5% hesteserum, 2,5% føtalt bovint serum, penicillin (100 IE / ml) og streptomycin (100 ug / ml), ved 37 ° C, 5% CO2, som tidligere beskrevet 5.
- Seks timer efter anbringelse af cellerne i kultur, transficere cellerne med 0,2 ug af tomme pGL3-basisk vektor eller med 0,2 ug pGL3-vektor indeholdende -1906 / + 64 E1U eller -1875 / + 10 E1A- eller -1847 / + 60 E1B eller -1904 / + 83 E1C Bcrp en sletning konstruere sammen med 4 ng pRL-TK (en Renilla luciferase-udtrykkende vektor) som intern kontrol, ved hjælp af et kommercielt DNA transfektion kit og fabrikantens protokol 23 (se liste over materialer og udstyr) .
- 30 timer efter transfektion, fjerne vækstmediet fra cultured transficerede celler. Vask cellerne en gang med 200 pi PBS, derefter fjerne vaskeopløsningen.
- Mål ildflue og Renilla luciferaseaktivitet under anvendelse af et kommercielt kit ifølge producentens protokoller 24.
- Udtrykke aktiviteten for hvert rør som forholdet mellem den ildflueluciferaseaktivitet, divideret med det indre (Renilla luciferase) kontrol; samlede resultater sædvanligvis udtrykt som aktiviteten af hver reporter konstruere forhold til den for celler transficeret med den tomme pGL3 Basic Vector, som gives værdien 1.
- Vælge den passende cellelinje bruge til reporter assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identifikation af Bcrp en alternativ promotor udnyttelse i mus testikel ved analyse af leder exons
Når databasen EST hos NCBI blev probet (april 2015) ved at følge trinene skitseret i protokol 1, fandt de EST'er, der var sammenhængende med 5'-enden af exon 2 i Bcrp 1 mRNA er vist i tabel 1, sammen med deres position i genomisk DNA i forhold til starten af exon 2. En EST afledt fra C57BL / 6J mus testis, der er sammenhængende med exon 2 i Bcrp 1-mRNA har sekvenser i genomisk DNA 70 kb opstrøms fra exon 2, svarende til E1U (tabel 1). Tilsvarende blev EST'er svarende til E1A, E1B, og E1C detekteret. At bemærke er, at de to EST'er, der svarer til E1C også indeholdt E1B splejset til 5 'enden af E1C. Placeringen af disse forudsagte første exons iforhold til Bcrp1 exon 2 på muse kromosom 6 er vist i figur 1.
Evaluering af Bcrp 1 alternativ promotorfunktion
Typiske luciferase analyseresultater svarende til E1U, E1A, er E1B og E1C promotor--luciferase reporterkonstruktioner transficeres ind TM4 murine Sertoli-celler (se afsnit 2.2) er vist i figur 2A.
I tidligere arbejde blev en SF-1 respons element forventes at være i E1U promotor fem. Hvis dette formodede SF-1 responselement er involveret i reguleringen af Bcrp1 transkription i mus testikel, vil derefter mutation (som beskrevet i et tidligere papir 5) i nævnte responselement i E1U promoter reporter konstrukt reducere luciferaseaktiviteten produceret af denne konstrukt når transficeret indTM4 celler. Resultater af et typisk forsøg er vist i figur 2B. Det muterede konstrukt viser lavere luciferaseaktivitet end den ikke-muterede konstrukt, med aktivitet sammenlignelig med den tomme pGL3-basisk vektor, selv i celler med tvungen ekspression af SF-1 (beskrevet i et tidligere papir 5). Tvungen ekspression af SF-1 øger aktiviteten af den ikke-muterede konstrukt, men ikke i den muterede én.
Figur 1. Diagram af den genomiske tilpasning af EST'er med sekvensidentitet Bcrp1 exon 2 med murint kromosom 6. Disse opstillinger blev identificeret i en dbEST BLAST-søgning udført i april blev 2015. Fire forskellige alignments fundet, svarende til Bcrp1 alternative første exoner E1U, E1A, E1B, og E1C. Dette tal er gengivet fra en tidligere publikation 5. 
Figur 2. (A) Reporter assay for Bcrp1 promotorer E1U, E1A, E1B, og E1C i Balb / C Sertoli celleafledte TM4 celler. Data er udtrykt som luminescens af ildflueluciferase normaliseret til den af Renilla luciferase, ved brug af metoder, der er beskrevet i afsnit 2. De viste observationer er middelværdien og standardafvigelsen af tre forskellige eksperimenter, udført på forskellige dage. Stjernen angiver en signifikant forskel fra den tomme pGL3 vektorkontrol ved hjælp af t-test (P <0,01). Dette tal er gengivet fra en tidligere publikation 5. (B) Virkninger af mutation af SF-1 respons element i Bcrp1 E1U reporter konstruere på luciferaseaktivitet. Bcrp1 reporter konstruerer med den formodede SF-1 binding region (muteret eller un-muterede) blev transficeret ind TM4 celler med (SF-1 transficeret) og uden (vektor transficeret) den tvungen ekspressionen af SF-1. De data vist er den gennemsnitlige af 3 forskellige forsøg, udført på forskellige dage; fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelser. For hvert eksperiment blev individuelle assays udført in duplo. I figuren (A) angiver en signifikant forskel fra den tomme vektor pGL3-kontrol (P <0,05) ved anvendelse af t-test, (B) angiver en statistisk signifikant forskel sammenlignet med E1U promotorkonstruktionen hjælp af t-test (P < 0,05). Dette tal er gengivet fra en tidligere publikation 5. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Blast søgning af musen EST databasen mod sekvensen af den anden exon af Bcrp1 25 -28. Klik her for at se en større version af denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hovedparten af metoderne og repræsentative resultater, der præsenteres, er beskrevet i tidligere arbejde med titlen "B crp1 transkription i muse testis styres af en promotor opstrøms for en hidtil ukendt første exon (E1U) reguleret af steroidogene faktor-1", som blev offentliggjort i 2013 5 . Foruden de repræsentative resultater afbildet her, den tidligere papir billede estimater af alternativ første exon udnyttelse under anvendelse 5'-RACE PCR og RT-PCR-metodik. Endvidere in-silico identifikation af en formodet SF-1 responselement i promotor opstrøms fra E1U blev gennemført, og chromatin immunoprecipitation (chip) assays viste, at SF-1 bundet til det formodede SF-1 responselement. Funktionelle undersøgelser viste, at i murine Sertoli-celler, er Bcrp 1 transkription kontrolleres af SF-1 via SF-1 responselement i E1U promotoren. Disse funktionelle undersøgelser omfattede opregulering af SF-1 i TM4 celler ved transfection eller ved anvendelse af en histondeacetylaseinhibitor (vorinostat), hvilket resulterede i forøget ekspression af Bcrp 1 E1U mRNA, og en stigning i Bcrp 1-protein samt aktivitet af BCRP 1 E1U promotor i en reporter assay. Endelig disse undersøgelser viste, at i testikler fra voksne Sertoli-celle specifikke SF-1 knockout-mus, udtrykkene for Bcrp en E1U mRNA, alt Bcrp en mRNA, og Bcrp1 protein blev markant formindsket 5. Det samme arbejde rapporterede også ekspressionsmønstre for Bcrp1 mRNA-isoformer i en række forskellige murine væv, herunder nyre, lever, testis, hjerne, hjerte, lunge, muskel og milt 5.
De her beskrevne protokoller - ved hjælp af vævsspecifik regulering af Bcrp 1 som model - give en letkøbt eksperimentel ramme for at optrævle den transkriptionelle kompleksitet ethvert gen at bestemme dens differentialekspression i forskellige væv eller celleundertyper. Det skal understreges, at de er fremstillet af de protokoltrin beskrevet for in-silico evalueringer resultater kan være tidsafhængig, da de forskellige hjemmesider, der huser softwaren og databaser, der bruges, kan være genstand for ændringer. Den i-silico metode præsenteres her udnytter søge EST-databasen (dbEST) som rapporteret tidligere 29, som anslås, at ca. 18% af alle menneskelige gener i EST datasættet ansætte alternative initiativtagere. Søgning på dbEST kan undervurdere alternative første exons, fordi andre forskere - ved hjælp af en metode, "oligo-capping" til at producere 1,8 millioner 5'-end sekvenser af cDNA fra mange humane væv - var i stand til at identificere formodede transkriptionelle start- sites for menneskelige gener og skøn at 52% af de humane RefSeq gener undersøgte var muligvis reguleret af alternative initiativtagere 1. Interessant sidstnævnte undersøgelse viste, atvæv, som udnyttede formodede alternative promotere mest var testiklerne og hjernen; endvidere fandt de, at gener, der koder proteiner relateret til signaltransduktionsveje var mere tilbøjelige til at ansætte vævsspecifikke alternative promotorer 1. På trods af de nævnte ulemper, dbEST analyser giver et groft overblik over 5'-UTR-forbrug til et bestemt gen i flere væv med minimal indsats.
Selvom dbEST analyse giver en letkøbt indblik i alternativ første exon brug, anbefaler vi at udføre 5 'hurtig opformering af cDNA ender (5'-RACE) analyse for at kontrollere første exon brug i et væv eller cellelinje under efterforskning. Kommercielle kits er tilgængelige for 5'-RACE, med detaljerede og enkle procedurer, som producenten (se liste over materialer og udstyr). Selvom noget tidskrævende, giver 5'-RACE undersøgelser faktiske estimater af tilstedeværelsen samt sekvensen af alternative første exons i mRNA af interesse; Endvidere kan også påvises tilstedeværelsen af flere transkriptionelle startsteder 13. For at sikre tilstrækkelig repræsentation, er sekventering af mindst 15 til 25 kloner påkrævet. Før sekventering, er det vigtigt at fjerne kontaminerende vektorsekvenser fra 5 'RACE-produkter. Hvis dette ikke sker, kan BLAST analyse mislykkes fuldstændigt at påvise en sekvens alignment med musen genom. Når første brug exon er etableret, kan resultaterne 5'-RACE bruges til at validere efterfølgende kvantitative RT-PCR-analyser for alternative første exons. Generelt forfatternes tidligere arbejde viste, at der er god sammenhæng mellem procentdelen af første exon mRNA kloner inddrives af 5'RACE og procentdelen af PCR-produkt udvindes i en bestemt alternativ første exon fra det samme væv eller cellelinie 5. Desuden blev god korrelation fundet mellem aktiviteterne i luciferase promotorkonstruktioner for alternative Bcrp1 initiativtagere ennd ekspressionen af det tilsvarende alternativ første exon i en bestemt cellelinie 5.
I søgen efter vævsspecifik alternativ promotor brug, hvis der anvendes hele organer, skal man være opmærksom på, at de alternative initiativtagere / første exoner fundet vil afspejle vævet heterogenitet af orglet såsom glandulær elementer, blodkar, stroma, etc. For eksempel testiklerne er en blanding af somatiske (Leydig, Sertoli, myoid, og endotel) celler og reproduktionsmateriale (haploide) celler, samt vaskulatur. At probe for vævsspecifik første exon ekspression, vil det være nødvendigt at isolere specifikke væv fra organerne.
Der er rapporteret andre fremgangsmåder til identifikation af alternative promotoranvendelse og regulering; Men disse kræver næste generation sekventering og bioinformatik computing kan analysere den store mængde af data, der produceres. Disse metoder omfatter hele transcriptosome sekventering (RNA seq), og chip-seq afhistoner såsom H3K4me3, som binder fortrinsvis til initiativtagere 30. Selvom disse metoder kan være dyrt at udføre de-novo, når fokus er på ekspression af nogle få specifikke gener og væv, kan udvinding af eksisterende data være en mere praktisk fremgangsmåde.
Assayene til estimering promotoraktivitet præsenteres her ansætte pGL3-basisk vektor, som indeholder et multipelt kloningssted region opstrøms for ildflue-luciferase-genet. Promotor aktivitet måles ved produktionen af ildflueluciferase, som er let kvantificeres, efter tilsætning af cofaktorer og en selvlysende substrat, ved måling af luminescens i en kommerciel luminometer (se liste over materialer og udstyr). De relaterede pGL4 vektor kan bringes til at indeholde selekterbare markører (fx neomycin, hygromycin, puromycin), muliggør produktion af stabilt transficerede celler. Protokollerne givet i dette papir udnytter transient transfektion. Typisk reporter assays for promotER aktivitet færdig med at bruge co-transfektion med en vektor, der konstitutivt udtrykker Renilla (Sea Pansy) luciferase (pRL-TK), at kontrollere for variationer i celle nummer og effektiviteten af transfektion. Et kritisk trin i etableringen af en promotor analyse for et givet gen er at være sikker på, at genet af interesse udtrykkes i cellelinjen, der er transficeret med reporter konstrukt. For det andet, når alternativ promotoranvendelse er til stede, er det vigtigt at anvende promotoren konstruktion, der svarer til den alternative første exon udtrykkes i cellelinjen transficeres. For eksempel, skal du ikke forvente at se luminescens for E1U promotor konstruktion, der er transficeret ind i celler, der udtrykker Bcrp1 udelukkende under kontrol af E1B promotoren. Alternativt, som en negativ kontrol, transfektion af reporteren konstrukt i en cellelinie, som ikke udtrykker genet eller mRNA isoform af interesse bør resultere i ingen produktion af ildflueluciferase.
consequences af alternative promotoranvendelse omfatter produktion af det samme protein, produktion af proteiner med forskellige N-termini, eller produktion af forskellige proteiner 29. I tilfælde af Bcrp1 / BCRP, flere (vævs- eller celletype-specifik) promotorer styre produktionen af det samme protein. En lignende mønster for CYP19 (aromatase) gen 29, 31. Protokollerne præsenteres her giver de grundlæggende trin et kan bruge til at dechifrere i et væv eller cellelinie de komplekse mekanismer for transkriptionel kontrol af et protein af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Douglas D. Ross og University of Maryland, Baltimore holde patentrettigheder for menneskers BCRP.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Merit anmeldelse Awards til Douglas D. Ross og til Arif Hussain fra Institut for Veterans 'Affairs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep - isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 | |
References
- Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
- Doyle, L. A., et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).
- Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).
- Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis--an unexpected turn of events. Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).
- Xie, Y., et al. Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1. Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).
- Maliepaard, M., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).
- Fetsch, P. A., et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).
- Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain. Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).
- Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue. Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).
- Xiong, H., et al. ABCG2 is upregulated in Alzheimer's brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides. J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).
- Woodward, O. M., et al. Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).
- Huls, M., et al. The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane. Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).
- Nakanishi, T., et al. Novel 5' untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage. Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).
- Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).
- Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters. J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).
- Natarajan, K., et al. Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine. Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).
- Ensembl Genome Browser. , http://Ensembl.org (2015).
- Transcript-based Display from Ensembl. , http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822 (2015).
- Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST) homepage. , http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome (2015).
- National Center for Biotechnology Information (NCBI). , http://www.ncbi.nlm.nih.gov (2015).
- Promega. Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System - INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT. , (2009).
- New_England_Biolabs. Quick Ligation Kit Protocol - M2200S. , (2014).
- Roche. XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol - Manual version 1.0). , (2010).
- Promega. Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay. , (2009).
- Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
- VanBuren, V., et al. Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set. Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).
- Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).
- Okazaki, Y., et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).
- Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends Genet. (11), 640-648 (2009).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
- Bulun, S. E., et al. Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue. Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).
