Introduction
Врожденные иммунные клетки представляют собой существенную часть клеток внутри опухоли микроокружения и были связаны с злокачественности опухоли у пациентов , так и на животных моделях рака 1. В последнее время она стала более широкое признание , что хронические иммунные реакции играют важную роль в продвижении прогрессии опухоли, метастазирование и устойчивость к химиотерапиях 2. Макрофаги являются важными врожденные иммунные клетки , которые были показаны непосредственно регулируют реакцию опухолевых клеток к химиотерапии 3,4. Тем не менее, роль нейтрофилов, ключевых игроков врожденной иммунной системы, в регуляции ответа опухоли на лечение противораковым не известно. Цели этих протоколов использовать быстрый и надежного метода для разделения нейтрофилов из образцов крови ХЛЛ пациента и дифференцировать HL60 клетки вдоль гранулоцитарного пути для того, чтобы изучить их роль в регуляции чувствительности клеток лимфомы к анти-лимфомой агентов.
5 и действовать в качестве первой линии обороны против вторжения микроорганизмов 6. Нейтрофилы играют существенную роль в повышении эффективной врожденной иммунной реакции в дополнение к переменной эффекторных функций в ряде патологических состояний 7. Таким образом, быстрый и надежным способом изолировать нейтрофилы от других клеток крови, таких как метод разделения градиента плотности, необходим для исследований в лабораторных условиях . При использовании этого метода для выделения нейтрофилов будет способствовать дальнейшим исследованиям по нейтрофильных опосредованной иммунологических функций в естественных условиях и бывших естественных условиях.
Возможность получения чистых популяций нейтрофилов является важным первым шагом для исследования пациентов с иммунологическими заболеваниями 8. Плотность градиентный метод разделения является идеальным метод, в котором получают высокий выход клеток. метоd включает добавление градиента плотности раствора в нижней части трубки, содержащей разбавленную кровь человека с последующим центрифугированием при 300 г в течение 35 мин без перерыва. Кольцо из мононуклеарных клеток появляется в интерфейсе и нейтрофилы располагаются ниже первого. Этот метод имеет существенные преимущества по сравнению с другими доступными методами , такими как нейтрофильные комплекты изоляции , которые значительно дороже 9. Кроме того, изолирующий нейтрофилы из крови человека с помощью коммерческих наборов с использованием антител, направленных к поверхностным маркером, специфичного для нейтрофилов человека, увеличивает риск активации или дифференциации клеток. Плотность градиентный метод разделения позволяет выделение нейтрофилами в течение короткого периода времени. В течение той же стадии, одноядерные клетки также отделяют и извлекают. Это фундаментальный метод, в котором высокий выход чистого клеток получается для достижения функциональной целостности.
Для того, чтобы имитировать microenv опухолиironment, были выполнены эксперименты 3D. Учитывая короткий период полураспада нейтрофилов в пробирке, 3D - эксперименты со свежими нейтрофилах человека не являются окончательными. По этой причине, промиелоцитарного (HL60) клетки дифференцироваться в нейтрофилами как клетки с использованием дифференциацией индукторов диметилсульфоксид (ДМСО) и ретиноевой кислоты (RA). Использование дифференцированных HL60 клеток (HL60 Diff) предотвратит имеющих различные реакции нейтрофилов из - за изоляции от различных доноров.
В пробирке 3D модели культуры представляют собой промежуточную стадию между ин витро 2D моделей и в естественных условиях модели. В 2D-культуре, клетки распространяются на пластиковой поверхности, образуя неестественные вложения клеток на депонированные белки, которые денатурируют на этой синтетической поверхности. И наоборот, клетки в форме 3D культуры вложений естественной межклеточных Поскольку клетки и внеклеточного матрикса, они синтезируют являются природным материалом, к которому они присоединены.По этой причине модели 3D совместно культуры, особенно между раковыми клетками и другими типами клеток, которые были очень полезны для индикации их вклад в рост опухоли, ангиогенез и метастазирование. В результате, 3D культуры делают культуру клеток имитировать физиологические условия , которые существуют в естественных условиях 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выделение и Нейтрофильная Совместное культивирование с первичными лейкозных клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры проводились с одобрения комитета по этике больницы Lyon со всеми пациентами, подписывающих информированное согласие.
- Выделение первичных лейкозных клеток и нейтрофилы
- Собирают тюбика периферической крови на ЭДТА (1,8 мг ЭДТА на миллилитр крови) от больных с диагнозом хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ).
- Добавить каждые 15 мл крови в стерильный 50 мл пробирку и разбавляют 15 мл среды RPMI (разведение 1: 1), а затем осторожно и медленно добавляют 15 мл плотности раствора градиента к нижней части трубы без перемешивания фаз. Убедитесь, что раствор градиента плотности при комнатной температуре для подготовки.
- Центрифуга при 300 х г в течение 35 мин при комнатной температуре и без тормоза. Кровь следует разделить на четыре отдельные фазы , как показано на рисунке 1А, сверху вниз: тромбоциты и плазму, мононуклеаров (Wхите кольцо), раствор градиента плотности, гранулоциты и эритроциты.
- Собирают белое кольцо, которое представляет первичные лейкозных клеток с пластиковой пипетки Пастера и перехода на новую 50 мл трубки.
- Заполните трубку с PBS (содержит кальций и магний) до 50 мл, в целом и центрифуге при 300 г в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Ресуспендируют осадок с 5 мл PBS, а затем добавить PBS до 50 мл в общей сложности и центрифуге при 300 г в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Ресуспендируют осадок с полной средой RPMI (среды RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ глутамина, 100 ед / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина) для подсчета с использованием счетчика жизнеспособности клеток.
- Отберите верхние фазы, выходящие из фазы гранулоцитов и эритроцитах и добавляют PBS до 25 мл, затем добавляют 3% декстран в 0,9% NaClup до 50 мл в общей сложности. Смешайте труб 10 раз и держать их в течение 30 мин при комнатной температуре без перемешивания.
- Соберите верхний РБК-бедную нейтрофилы слоя А.d поместить их в чистую стерильную пробирку на 50 мл и центрифугируют пробирки при 300 г в течение 10 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют каждый осадок с 5 мл PBS затем добавить красный буфера для лизиса клеток до 50 мл в общей сложности.
- Хранить пробирки в темноте в течение 15 мин при комнатной температуре, то центрифуге при 500 г в течение 10 мин при комнатной температуре. Промыть гранулы с PBS (PBS добавляют до 50 мл в целом), а затем центрифуге при 500 г в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Ресуспендируют гранулы с полной средой RPMI для подсчета с использованием счетчика жизнеспособности клеток. Хранить 3 х 10 5 каждого типа клеток в 50 мкл PBS-FBS (4%) в 5 мл пластиковых труб для определения чистоты их выделения с использованием проточной цитометрии.
- Анализ Появления Морфологические изолированного клеточных популяций
- Для этого, ресуспендируют каждый 3 × 10 4 нейтрофилы и 3 х 10 4 мононуклеарных клеток в 150 мкл полной среды RPMI. Собрать стеклянные слайды, процеживают карты, а также образцы камер в цитоспина центрифуге, гарантируя, что тон центрифуге хорошо сбалансирована.
- Поместите каждый тип клеток в камеру для образца и цито-центрифуге при 750 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре Удалить слайды, фильтровальные карты и камеры образцов из центрифуги. Разберите осторожно, чтобы не повредить клетки на слайде. Выбросите фильтр карты и образцы камер.
- Пятно клеток с использованием набора для окрашивания Giemsa и сохранить слайды в течение 1 часа, чтобы высохнуть. Осмотрите клетки под микроскопом с увеличением 100X.
- Проверка чистоты выделенных клеток с помощью FACS
- Этикетка изолированных первичных лейкозных клеток с CD19 антителом против человека , конъюгированного с APC (5 мкл / 10 6 клеток). Этикетка очищенные нейтрофилы с смесью анти-антител человека , перечисленных в таблице 1 (5 мкл / 10 6 клеток). Инкубируйте клетки в темноте в течение 30 мин при 4 о С.
- Промывают клетки с 500 мкл PBS-FBS (4%) в центрифуге трубках при 300 г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Ресуспендируют каждый осадок в 200 мкл PBS-FBS (4%).
- Анализ на проточном цитометре, используя следующую оптическую конфигурацию: 488 нм лазер: FSC-A (488 нм), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 ВР), PerCP-Cy5.5 (695/40 ВР ), ПЭ (575/26 ВР); 633 нм лазер: APC (660/20 ВР), APC-Cy7 (780/60 ВР). Убедитесь, что компенсация цвета.
- Совместное культивирование первичных лейкозных клеток с аутологичными нейтрофилы
- Затравочного монокристалла 2 х 10 5 клеток / мл в одиночку или с аутологичной нейтрофилами при соотношении 1:10 в полной среде RPMI первичных лейкозных клеток. Для этого отрегулировать количество клеток путем разбавления суспензии клеток и добавить 2 х 10 5 клеток / мл первичных лейкозных клеток до 2 × 10 6 клеток / мл нейтрофилы. Тщательно перемешать.
- Добавьте 25 мкМ тирозинкиназы (Btk) ингибитор Брутона (ибрутиниб) к клеткам. Инкубируют в течение 24 ч при 37 ° С с 5% CO 2.
- Cell Harvest и анализ FACS
- CollECT клетки в 5 мл пластиковые пробирки для анализа FACS и центрифугировать трубках при 300 г в течение 5 мин при комнатной температуре. Промыть гранулы с 1 мл PBS-FBS (4%), а затем центрифуге при 300 г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Ресуспендируют гранулы в аннексина V и PI с использованием коммерческого набора и инкубировать клетки в темноте в течение 10 мин при комнатной температуре. Анализ на проточном цитометре с использованием стратегии стробирования фиг.2А и следующей оптической конфигурации: 488 нм лазер: FSC-A (488 нМ), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 ВР), PI (610 / 20 ВР). Убедитесь, что компенсация цвета.
2. Дифференциация HL60 клеток вдоль гранулоцитарного Pathway и их сокультивирования с RL лимфома В-клеток в 3D модели
- Дифференциация человеческого промиелоцитарного (HL60) клеток в нейтрофилами как клетки
- Отрегулируйте количество HL60 клеток до 3 × 10 5 клеток / мл затем добавьте 1 мкМ ретиноевой кислоты (RA) и 1,25% ДМСО , чтобы побудить их дифференциацию. Семенной каждый 3 х 10 5 2.
- Позже, сбора клеток и центрифугируют при 300 г в течение 5 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют клеток с полной средой RPMI для подсчета с использованием счетчика жизнеспособности клеток.
- Затем разбавленные суспензии клеток в полной среде RPMI , чтобы регулировать количество HL60 клеток до 3 х 10 5 клеток / мл и индуцируют снова их дифференцировку путем добавления 1 мкМ ретиноевой кислоты (RA) и 1,25% ДМСО. Семенной 3 × 10 5 клеток HL60 каждый на лунку в 48-луночный планшет и инкубируют в течение еще 48 ч при температуре 37 ° С с 5% CO 2.
- Анализ дифференциации HL60 (HL60 Diff)
- Сбора клеток и центрифугировать пробирки при 300 г в течение 5 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют осадок с полной средой RPMI для подсчета с использованием счетчика жизнеспособности клеток.
- Для анализа изменений в экспрессии маркеров клеточной поверхности с помощью проточной цитометрии. Поместите каждый 3 х 10 5 5 HL60 Diff клеток в 5 мл пластиковые пробирки для анализа FACS и центрифугировать трубках при 300 г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Ресуспендируют гранул в 50 мкл PBS-FBS (4%). Этикетка клетки с античеловеческой CD11b , конъюгированных с AF700 или CD38 античеловеческой , конъюгированного с APC (5 мкл / 10 6 клеток). Инкубируйте клетки в темноте в течение 30 мин при 4 о С.
- Промыть 500 мкл PBS-FBS (4%), а затем центрифуге при 300 г в течение 5 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют гранул в 200 мкл PBS-FBS (4%).
- Анализ на проточном цитометре с использованием стратегии стробирования фиг.3А и следующую оптическую конфигурацию: 488 нм лазер: FSC-A (488 нм), SSC-A (488 / 10BP); 633 нм лазер: APC (660/20 ВР), Alexa Fluor 700 (730/45 ВР).
- Чтобы проверить морфологические изменения в HL60 Diff, иммобилизации клеток на стеклах для микроскопического исследования.
- Для этого, ресуспендируют каждый 3 × 10
- Поместите каждый тип клеток в камеру для образца и цито-центрифуге при 1500 оборотах в минуту в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалить слайды, процеживают карты и камеры образцов из центрифуги. Разберите осторожно, чтобы не повредить клетки на слайде. Выбросите фильтр карты и образцы камер.
- Пятно клеток с использованием набора для окрашивания Giemsa и сохранить слайды в течение 1 часа, чтобы высохнуть. Осмотрите клетки под микроскопом с увеличением 100X.
- Для этого, ресуспендируют каждый 3 × 10
- 3-мерные (3D) Культура
Примечание: Убедитесь, что материалы, используемые в этом эксперименте, холодный и эксперимент проходит на льду.- Ресуспендируют каждые 5 х 10 4 клеток RL, либо по отдельности , либо в смеси с HL60 Diff Diff 1:10, с 300 мкл матрицы базальной мембраны с использованием 1 мл пипетки разрезать стерильным ножницами, чтобы расширить отверстие до приблизительно 2 до 3 мм. Избегайте пузырьков во время этого шага.
- Семенной каждые 300 мкл суспензии клеток / лунку в 24-луночный планшет. Избегайте пузырьков во время этого шага. Инкубируйте планшет в течение 30 мин при 37 ° С с 5% CO 2 , затем добавляют 1 мл полной RPMI среду для каждой лунки и инкубируют в течение 7 дней при температуре 37 ° С с 5% CO 2. Изменение среды каждые два дня. Добавьте 10 нМ винкристина в 5-й день.
- Анализ FACS
- Через 7 дней культивирования, аспирация средних и мыть каждую лунку с 1 мл охлажденного льдом PBS дважды. Добавьте 3 мл / лунку охлажденного льдом PBS-ЭДТА (5 мМ). Отделить гель из нижней части скважины путем соскоба с помощью нижней части 200 мкл кончика пипетки. Встряхните пластину осторожно на льду в течение 30 мин.
- Передача клеточной суспензии в стерильной 15 мл пробирку и встряхните пробирки осторожно ICе в течение еще 30 мин. Проверьте для появления однородной клеточной суспензии. (Если это не так, то трясти клетки в течение длительного времени или добавить больше PBS-EDTA).
- Центрифуга трубки при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Промыть гранулы с PBS затем центрифуги при 300 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Ресуспендируют с PBS-FBS (4%) и маркируют с CD19 антителом против человеческого , конъюгированное с РЕ-Cy7 и СD38 - антитело , анти-человеческий , конъюгированного с APC (5 мкл / 10 6 клеток). Инкубируют в темноте в течение 30 мин при 4 ° С ,
- Промыть 500 мкл PBS-FBS (4%), а затем центрифужные пробирки при 300 г в течение 5 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют клетки с аннексина V и PI с использованием коммерческого набора.
- Анализ на проточном цитометре с использованием стратегии стробирования фиг.4А и следующая оптическая конфигурация: 488 нм лазер: FSC-A (488 нМ), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 ВР), PI (610 / 20 ВР), PE-Cy7 (780/60 ВР); 633 нм лазер: APC (660/20 ВР). Убедитесь, что компенсация цвета.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Плотность градиентный метод разделения , описанный здесь обеспечивает первичные лейкозных клеток и нестимулированных нейтрофилы , выделенные из крови пациентов с ХЛЛ Фигура 1А представляет различные слои крови , полученные после центрифугирования в градиенте плотности (сверху вниз:. Тромбоциты и плазму, белое кольцо представляет собой одноядерные клетки, градиент плотности раствора, гранулоциты и эритроциты). Рисунок 1В и 1С показывают различия в морфологическом видимости между нейтрофилы (Multi-лопастным ядер клеток) и мононуклеарных клеток соответственно.
Результаты на рис 1D представляют прямого рассеяния (FSC) против бокового рассеяния (SSC) участка первичных лейкозных клеток (одноядерные клетки). Пометка это население с CD19 античеловеческой , конъюгированного с APC показывает полный сдвиг вправо гистограммы (рис 1E) только с однимпик, который указывает на то, что это население является положительным для CD19 и чистой. Нейтрофилы также ≥90% чистым , как проверено с помощью проточной цитометрии после мечения обособленные нейтрофилы смесью флуорохромом конъюгированный моноклональных антител , перечисленных в таблице 1. Рисунок 1F представляет FSC против SSC график рассеяния изолированных нейтрофилах , которые являются положительными для CD45 (рис 1G), положительный результат на CD15 и отрицательным для CD14 (рис 1H), положительный результат на обоих CD15 и CD16 (Рисунок 1I), положительным для CD16 и отрицательным для CD56 (рис 1J).
Рисунок 1. Анализ морфологических Появления и чистоты первичных лейкозных клеток и нейтрофилов , выделенных из крови пациентов. (А) Схематическое изображение представляет различные слои крови после плотности GRADIлор центрифугирование. (BC) Гимза окрашивания представляет морфологические различия между (B) и нейтрофилов (С) первичных лейкозных клеток (мононуклеарных клеток). Фотографии были взяты под микроскопом с 100х. (D) прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) участок представляет собой изолированный первичный лейкозных популяции клеток. (E) , изолированных первичных лейкозных клеток метили анти-CD19-APC и анализировали на экспрессию CD19. Красная линия указывает немеченых клеток и синяя линия указывает клетки , меченные анти-CD19-APC. (F) , FSC против SSC график рассеяния представляет собой изолированную популяцию нейтрофилов. (GJ) , выделенные нейтрофилы метили смесью антител , перечисленных в таблице 1 и анализировали на экспрессию (G) , CD45, (H) , CD14 и CD15, (I) , CD15 и CD16, (J) CD16 А.Н.d CD56. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Антигены | флюорохром | клон |
| CD14 | APC-Vio770 (Cy-7) | TÜK4 |
| CD15 | APC | VIMC6 |
| CD16 | FITC | VEP13 |
| CD45 | PerCP-Vio700 (Cy5.5) | 5B1 |
| CD56 | ЧП | AF12-7H3 |
Таблица 1. Флуорохром женные Очищенные моноклональные антитела , используется для проверки чистоты изолированных нейтрофилы. Все антитела были получены из Miltenyi Biotech.
рисунке диаграммы рассеяния 2А представляет ворота нейтрофилы и первичных лейкозных клеток. Нейтрофилы являются гораздо более зернистое, чем первичные лейкозных клеток, таким образом они появляются с более высоким SSC. Стробирование на первичных лейкозных клеток культивировали совместно с нейтрофилами в присутствии ибрутиниб, результаты показывают высокий процент живых клеток (фиг.2с, 84,8%) по сравнению с клетками , культивируемыми в одиночку (Фигура 2В, 53,1%). Окно графика на рисунке 2D показывает , что decreasе жизнеспособности клеток, индуцированного ибрутиниб была существенно тормозится наличием нейтрофилов (40,1 ± 3,1 против 60,1 ± 3,5, р <0,001, у 19 больных).
Рисунок 2. Аутологичный Нейтрофилы Защита первичных лейкозных клеток от ибрутиниб. Кровь отбирали у пациентов с диагнозом хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ). Первичные лейкозных клетки выделяли и культивировали отдельно или вместе с аутологичными нейтрофилы (N) в первичных лейкозных клеток: Nratio 1:10 в течение 24 ч, в присутствии или в отсутствие 25 мкМ ибрутиниб. Процент живых первичных лейкозных клеток (Annexiv V негатив / PI отрицательный) измеряли с помощью двойного окрашивания с аннексина V-FITC и PI, с последующим анализом проточной цитометрии. (А) прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) участок представляет ворота нейтрофилы и первичных лейкозных клеток. (Б) двумерная дот-блот показывает проценты живых и апоптотических первичных лейкозных клеток , культивируемых в одиночку и обрабатывали 25 мкМ ибрутиниб. (С) двумерная точка-блот показывает проценты живых и апоптотических первичных лейкозных клеток СО- культивировали с нейтрофилами и обрабатывали 25 мкМ ибрутиниб. (D) Box участок представляет собой процент живых первичных лейкозных клеток 19 пациентов. Данные выражены в виде среднего значения ± SD. *** р <0,001 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Короткий период полураспада нейтрофилов в пробирке делает их использование в 3D культуры безрезультатным. Дифференциация клеток HL60 вдоль гранулоцитарного пути индуцировали дифференцировки индукторов. Два разных параметра (выражение маркеры клеточной поверхности и морфологическое чанES) были использованы для измерения дифференциации HL60. FSC против SSC график рассеяния на рисунке 3А показывают , что HL60 клетки больше по размеру по сравнению с HL60 дифф клеток с более высоким FSC. Этикетировочное клеток (HL60 или HL60 Diff) с анти-CD11b человека антител , конъюгированных с AF700 и CD38antibody античеловеческой , конъюгированного с APC показывает увеличение CD11b и экспрессия CD38 (фигура 3В) после дифференцировки , которая является показателем гранулоцитарного дифференциацию. HL60 дифференциалов клетки также показывают морфологические изменения , обнаруженные появлением мульти-лопастные ядер (рис 3C).
Рисунок 3. Структурные параметры Дифференцированный HL60 клеток. (A) прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) участки представляют собой HL60 и HL60 дифференцированных клеток (HL60 различий). (B) HL60 и HКлетки дифференциалов L60 были помечены анти-CD11b-AF700 или анти-CD38-APC с последующей проточной цитометрии анализа. После того, как стробирования для каждой популяции клеток в FSC-A против SSC-график рассеяния (А), клетки анализировали на выражения CD11b или CD38. (С) HL60 клетки обнаруживают морфологические изменения в соответствии с дифференциацией по отношению к гранулоцитов. Фотографии были взяты под микроскопом с увеличением 100X. Жирный черная стрелка указывает мульти-лопастные ядра. Графики представляют пять независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Для того, чтобы проверить эффект HL60 клеток на дифф регуляции реакции RL клеток к винкристин в 3D - модели, клетки RL культивировали отдельно или с HL60 Diff в подвальном матрице мембраны в присутствии или в отсутствие винкристина в 10 нМ. Используя стратегию стробирования , показанную на рисунке 4A, обе популяции подвергаются дискриминации на основе экспрессии CD19 и CD38; RL клетки положительных для CD19 и HL60 дифф клеток , положительных по CD38. Стробирование на RL клетки культивировали совместно с HL60 дифф клеток в присутствии винкристина, результаты показывают высокий процент живых клеток (фиг.4С, 35,9%) по сравнению с клетками , RL , культивируемых в одиночку (рис 4В, 19,7%). Гистограмма на рисунке 4D показывает значительное увеличение доли живых клеток RL (CD19 положительная аннексина V отрицательная / PI отрицательный) в присутствии HL60 дифф клеток (19,5 ± 0,2 против 33,1 ± 1,0, р <0,001).
Рисунок 4. нейтрофилами как HL60 дифференциалов клетки Protect RL лимфома клетки от винкристина в 3D культуры. RL клетки культивировали отдельно или вместе с HL60 дифф клеток при RL: HL60 отношение Diff 1:10 в течение 7 дней в базальной мембраны матрицы. На 5-й день, винкристин (ВКМ) добавляли при концентрации 10 нМ. Сфероиды диссоциируют на 7 -й день , а клетки метили анти-CD19-PECy7 и анти-CD38-APC затем ресуспендировали с аннексина V-FITC и PI с последующим анализом методом проточной цитометрии. (А) прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (ССК) участок представляет ворота клеток RL и дифф клеток HL60. (в) двумерная точка-блот показывает проценты живых и апоптотических клеток RL , культивируемых в одиночку и обрабатывали 10 нМ винкристина. (с) двумерная dot- блот показывает процент живых и апоптотических клеток RL культивировали совместно с HL60 Diff и обрабатывают 10 нМ винкристина. (D) гистограмма представляет собой процент живых клеток RL. Данные выражены в виде среднего значения ± SD. *** Р ≤0.001.jove.com/files/ftp_upload/53846/53846fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанная здесь, эффективный, простой, быстрый и недорогой протокол для выделения нейтрофилов из крови человека с высокой степенью чистоты с использованием центрифугирование в градиенте плотности подход и в пределах той же стадии мононуклеарных клеток также отделяют и извлекают. Популяции изолированных клеток являются ≥90% чистоты.
Существует несколько методов для выделения нейтрофилами крови человека. К ним относятся подобные методы с использованием разрывных градиентов 11,12, или с использованием коммерческих наборов для выделения нейтрофилов положительной иммуно-магнитного отбора , в течение которого нейтрофилы иммуно-магнитного метят специфическими антителами , такие как CD16 античеловеческой затем нейтрофилы , обогащенных связывание CD16- положительных клеток на магнитной колонке 13. Коммерческие наборы с отрицательной селекции иммуно-магнитного также доступны в течение которого вся кровь или гранулоцитов подвеска маркированы с коктейлем из антител, которые связываются с клетками другой Thaп нейтрофилы 9 (то есть, комплексы антител , которые этикетке эритроциты, тромбоциты и нежелательные клетки , такие как CD2, CD3, CD9, CD19, CD36, CD56, гликофорина А и магнитных частиц декстрана покрытием), затем нейтрофилы , обогащенные элюции как антитело отрицательная часть клеток, которая не связывается на магнитной колонке. Кроме того, нейтрофилы могут быть выделены с помощью флуоресцентной сортировка клеток 14.
Некоторые методы, как было показано, чтобы обеспечить высокий выход чистого нейтрофилами, таких как положительный отбор иммуно-магнитными свойствами. Тем не менее, этот метод имеет недостатки по сравнению с градиентом плотности методами центрифугирования в связи с маркировки агентов, которые связываются на поверхности нейтрофилов, и это может потенциально могут изменить свою функцию путем индукции их активации или дифференцировки. Кроме того, используя положительный иммуно-магнитный метод отбора антитело-меченных нейтрофилов связываются на магнитной колонке для разделения и это также может повлиять на их функцию.Флуоресцентный сортировка клеток имеет еще одно ограничение, поскольку этот метод требует больше времени для сбора клеток, которые могут отрицательно влиять на выживаемость нейтрофилов из-за их коротким периодом полураспада.
градиент плотности методом центрифугирования очень сопоставимы и чистота нейтрофилов может превышать 90%, используя обе процедуры, но первый градиент два слоя, который является технически менее сложным по сравнению с облицовочной градиентом раствора, который состоит из 40%, 60% и 80% по объему / объем в PBS. Он был упомянут Swamydas и др. 15 , что перемешивающее интерфейсов градиента решения часто происходит из - за небольших различий в плотности между тремя слоями. Что касается негативных подходов отбора иммуно-магнитные, они также сообщили , чтобы быть эффективными для изоляции нейтрофильной с высокой степенью чистоты и жизнеспособности 9. Их преимущество по сравнению с положительным иммуно-магнитного отбора и флуоресцентной сортировка клеток является то, что нейтрофилыне имеет какой-либо маркировки агентов и не связываются с магнитной колонки, таким образом избегая активации клеток, но этот метод является гораздо более дорогим и требует больше времени по сравнению с методом в градиенте плотности.
Нейтрофилы обычно подвергаются быстрому спонтанному апоптозу как в пробирке и в естественных условиях 16,17. HL60promyelocyticcells сохраняют многие характеристики клеток - предшественников лейкоцитов человека, такие , как потенциал для прохождения дифференциации в нейтрофилы 18. В отличие от нейтрофилов, дифференциалов клетки HL60 не быстро подвергаются апоптозу и использовании этих клеток решает проблему наличия различных ответов нейтрофилов из - за их изоляции от различных доноров.
В последнее время 3D культуры становятся все более зрелыми и отношение к физиологии человека и животных, а также привлекательная модель для различных биологических исследований, особенно в области рака. Шаблон переход от 2D к 3D культуры прогрессирует быстро систь последнее более заметно при изучении различных патологических состояний , таких как рак 19. Существует растущее осознание недостатков 2D культуры , где добавление третье измерение среды той или иной ячейки имеет важное значение для того , чтобы принять более близкий взгляд на важность клеточных взаимодействий 20 и изучить различия в клеточном поведении и характеристиках. 3D культура создает среду , сходных с условиями в живом организме (например., Человека) приводит к более соответствующих исследований. Тем не менее, 3D-культура включает в себя сложное взаимодействие между различными партнерами, такими как клетки, внеклеточного матрикса и интерстициальных жидкостей, которые не присутствуют в 2D культуре. Таким образом, усилия будут необходимы для того, чтобы установить калибровку метода и рассчитывать на надлежащей лабораторной практики, а также эффективных поставок особенно коммерческие бренды, которые тщательно протестированы и отслеживаемые.
Микроокружение опухолисостоит из нескольких типов клеток, в том числе многих популяциях клеток иммунной системы, которые участвуют в и регулируют онкогенеза, метастазирование и ответ на противораковые агенты 21,22. Несколько исследований показали , что увеличение инфильтрации нейтрофилов в опухолях достоверно коррелирует с приобретенной устойчивостью к нескольким противораковых агентов , таких как анти-VEGF терапии 23,24. Кроме того, повышение в предварительной обработки число нейтрофилов у пациентов с метастатической клетки рака почки 25, а также наличие высокого уровня внутри опухолевой нейтрофилах у больных с различными солидными опухолями, 26 были предложены в качестве прогностическими факторами плохой выживаемости. Наше исследование показывает, что нейтрофилы могут играть определенную роль в защите лимфома В-клеток из противоракового агента-индуцированного апоптоза.
Таким образом, надежный и воспроизводимый метод, описанный здесь может быть использован любой лаборатории для сбора нейтрофилы и мононуклеарные клетки из гулакрови. Кроме того, дифференциация клеток HL60 вдоль пути гранулоцитарного представлена для того, чтобы избежать некоторых проблем, таких как нейрофильный гранулоцит быстрого спонтанного апоптоза. Эти подходы были использованы для изучения роли нейтрофилов по чувствительности клеток лимфомы к анти-лимфомой агентов, где нейтрофилы показывают защитное действие на клетки лимфомы против этих агентов с использованием 2D и 3D систем культуры. Эти подходы могут быть использованы для различных нейтрофильных функциональных исследований, которые должны углубить наше понимание нейтрофильной роль в биологии рака. В частности, этот метод может быть использован, чтобы лучше понять перекрестные помехи между нейтрофилами и опухолевыми клетками или между нейтрофилами и другими компонентами микросреды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium) | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
| N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine) | Life technologies | 25030-024 | |
| Penicillin streptomycin (Pen Strep) | Life technologies | 15140-122 | |
| Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib) | CliniSciences | A3001 | |
| Vincristine | EG labo | ||
| BD Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment |
| Red cell lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Ficoll (Pancoll) | PAN Biotech | P04-60500 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Euromedex | S3014 | |
| Annexing V-FLOUS staining kit | Roche | 11 988 549 001 | |
| Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit | Cosmos Biomedical | CB361550-0000 | |
| LSRII flow cytometry | BD Biosciences | ||
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | ||
| Leica DMR-XA microscope | Leica Microsystems | ||
| Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter | Nexcelom Bioscience |
References
- Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M.
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Di Carlo, E., et al. The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood. 97, 339-345 (2001).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).
- Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).
- Kelbaek, H. Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).
- Aynaud, M. -M., et al. Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A. J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).
- Ziòłkowska, K., et al. Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip. Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).
- Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers. J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).
- Behnen, M., et al. Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1. J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).
- Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -P. Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids. PloS One. 7, 44606 (2012).
- Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. , e50586 (2013).
- Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo. Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).
- Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D.
- Dalton, W. T., et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3. Blood. 71, 242-247 (1988).
- Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).
- Mantovani, A. Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword. New J. Sci. , 271940 (2014).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).
- Shojaei, F., Ferrara, N. Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells. Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).
- Liang, J., et al. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).
- Teramukai, S., et al. Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03. Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).
- Zhu, Q., et al. The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression. Cell Death Dis. 5, 1295 (2014).
