Summary
MRP4는 세포 이동에 최근에 밝혀 역할 등 다양한 주기적 뉴클레오티드 종속 신호 이벤트를 조절한다. 우리는 섬유 아세포 이전의 미세 조정 조절에 중요한 역할을 고유 MRP4의 상호 작용 체의 식별 결과 MRP4의 하류 분자 표적을 해명하기 위해 직접하지만, 다각적 인 접근 방법을 설명합니다.
Abstract
약제 내성 단백질 4 (MRP4)은 막 수송의 ATP 결합 카세트 가족의 일원이며, 주기적 뉴클레오티드의 내생 유출 수송이다. 세포 내 사이 클릭 염기 농도를 조절함으로써, MRP4는 세포 이동을 포함한 다수의 환상 뉴클레오티드 - 의존성 세포 사건을 조절할 수있다. 이전에는 MRP4의 부재, 섬유 아세포 세포가 세포 내 환상 뉴클레오티드의 더 높은 수준을 함유 빠르게 마이그레이션 수 보였다. 이러한 발견의 기본 메커니즘을 이해하기 위해서, 우리는 직접 아직 다각적 인 접근 방식을 채택했다. 먼저, 질량 분광법에 의해이어서 면역을 사용 MRP4 과발현 세포 시스템에서 MRP4 잠재적 상호 작용 단백질 복합체를 격리. MRP4의 상호 작용 체에 고유 한 단백질을 식별 한 후, 우리는 신호 전달의 맥락에서 이러한 단백질 - 단백질 상호 작용의 역할을 탐구하는 독창성 통로 분석 (IPA)을 이용했다. 우리는 포를 밝혀세포 이동에 MRP4의 효과의 주요 중재자로 세포 이동에 MRP4 단백질 복잡하고 확인 F - 굴지의 tential 역할. 이 연구는 또한 철새 현상의 핵심 선수로 캠프 및 cGMP의의 역할을 강조했다. 높은 콘텐츠 현미경을 사용하여, 우리는 세포 마이그레이션 분석을 수행하고 섬유 아세포의 이동에 MRP4의 효과가 완전히 캠프에 의존 키나제 A (PKA)의 액틴 세포 골격 또는 억제의 중단에 의해 폐지되는 것을 관찰했다. 실시간 마이그레이션 셀에 변조 신호 시각화하기 위해, 우리는 PKA 활성을 측정하기위한 FRET 기반 센서를 활용 발견, Mrp4 마이그레이션의 첨단 근처 더 편광 PKA 활동의 존재 - / -에 비해 섬유 아세포, Mrp4 + / 섬유 아세포를 +. 이것은 차례로 피질 액틴 형성을 증가 이전의 과정을 증대. 우리의 접근 방식은 MRP4 하류 작용하는 단백질의 식별을 가능하게하고 이상 우리에게 제공섬유 아세포 마이그레이션 MRP4 의존 조절에 관여하는 메커니즘의보기.
Introduction
세포 이동은 복잡한 여러 단계의 프로세스입니다. 연구는 이주 세포 중 선행 및 후행 가장자리에 편광되는 것으로 나타났습니다. 셀 몸이 앞으로 이동하는 세포 외 기질에 부착함으로써, 리딩 엣지가 필요한 견인을 제공합니다. 마지막으로, 가장자리 자료를 후행 후면 첨부 파일 및 마이그레이션주기 1, 2를 완료합니다.
효율적인 세포 이동에 대한 세포 편광은 세포 내 신호의 공간 분리에 의해 조절된다. 이러한 캠프와 같은 셀룰러 두 번째 메신저는 미세 조정 방향 셀 마이그레이션 3,4에 필요한 신호 이벤트의 구획화을 중재. 최첨단 캠프와 캠프에 의존 키나제 PKA 활동의 우선 축적은 방향성 세포 이동 5,6의 핵심 역할을한다. 이러한 라스 관련 C3의 보툴리눔 독소 기판 (RAC) 및 세포 분열 조절 단백질 (42) 동족체 또는 Cdc42, PK 작은 GTP 아제를 인산화함으로써,A는 최첨단 액틴 관련 단백질 2/3 ARP (2/3)를 활성화하고 lamellipodia 7-9의 형성을 유도한다. PKA는 항 - 캡핑 화제 인산화, 혈관을 확장하여 막 신축 10,11의 진동주기를 조절하는, 인 단백질 (VASP)를 자극.
막 - 결합 유출 운송 (3)에 의해 전) 합성 아데 닐 레이트 사이 클라 제, 포스 포에 의해 ⅱ)의 악화, 그리고 ⅲ) 교통으로 : 세포에서 캠프 레벨은 세 가지 주요 프로세스에 의해 조절된다. 다제 내성 단백질 4 (MRP4), 순환 뉴클레오티드의 내생 유출 수송 등의 막 수송, 기능의 ATP 바인딩 카세트 (ABC) 가족의 일원. 따라서, MRP4는 세포 내 캠프 수준을 조절할 수 있으며, 캠프에 의존하는 세포는 11 ~ 13 신호. - / -, 섬유 아세포는 순환 뉴클레오티드의 상대적으로 높은 수준을 포함하고 빠른 C를 마이그레이션 우리는 이전 Mrp4에 있음을 보여 주었다Mrp4 + / + 섬유 아세포 (14)에 ompared. 우리는 또한 섬유 아세포 이전에 주기적 뉴클레오티드의 이상성 효과를보고했다. 이전의 연구에 근거하고 Mrp4는 우리의 발견 - / - 섬유 아세포 마이그레이션 과정 중 더 편광 캠프를 포함, 우리는 섬유 아세포의 이동이 MRP4 매개 규제 캠프 의존한다는 가설을 세웠다. 하류 메커니즘을 이해하기 위해 직접 아직 다각적 접근했다.
관련 및 MRP4와 상호 작용의 단백질을 식별하기 위해, 우리는 이상 MRP4을 표현하는 HEK293 세포에서 MRP4 함유 고분자 복합체를 면역. 질량 분석기를 사용하여, 우리는 여러 MRP4 - 상호 작용하는 단백질을 확인하고 독창성 통로 분석 (IPA)를 사용하여 자신의 상호를 분석 하였다. IPA는 (구조 및 기능 모두) 단백질 - 단백질 상호 작용을 분석하고 특히 생리와 병리에 자신의 기여를 탐구하는 유용한 도구입니다문헌과 실험 증거 (15, 16)에 따라 이벤트. IPA는 캠프 및 cGMP의 분자 (17) 신호 키 어디 F-액틴은 세포 이동의 맥락에서 MRP4의 주요 다운 스트림 대상이라고 지적했다. 이러한 데이터는 더 높은 콘텐츠 현미경으로 확인 하였다. 높은 콘텐츠 현미경 캡처하고보다 편리하고 정확하고 높은 처리량 방법 (18) 이러한 세포 이동과 같은 세포 행동을 분석 할 수 있습니다. 고 함량 현미경 데이터는 섬유 아세포 이동에 MRP4의 효과가 완전히 PKA 17 액틴 세포 골격 또는 억제의 중단에 폐지되어 보였다.
또한, 우리는 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 실시간으로 세포를 이전에 PKA 역학을 모니터링 PKA 센서 기반의 사용. FRET 기반 키나제 센서는 일반적으로 CFP와 YFP의 형광 19-21에 의해 형벌 특정 인산화 기판 펩타이드로 구성되어 있습니다. pmAKAR3는 향상과 나된다mbrane는 forkhead 관련 도메인 1 (FHA1)와 PKA 기판 순서 LRRATLVD 5,22를 포함 FRET 기반 PKA 센서를 대상으로. PKA 촉매 서브 유닛이 증가하여 pmAKAR3의 인산화는 CFP와 YFP (19) 사이의 신호를 FRET. 센서로 지질 개질 영역의 삽입은 특히 막 구획 23, PKA 역학 모니터링 세포막에 타겟팅.
pmAKAR3를 사용하여, 우리는 증명이 Mrp4 마이그레이션의 첨단 - / - 결과적으로 세포의 리딩 엣지 (17)의 대뇌 피질 굴지의 형성을 증가 Mrp4 + / + 섬유 아세포,보다 더 편광 PKA의 활성을 나타내 섬유 아세포. 함께, 이러한 이벤트는 MRP4의 부재에서 더 나은 휴대 편광 빠르게 방향 세포 이동의 결과. 우리의 구체적이고 직접적인 방법은 MRP4 주요 다운 스트림 대상을 식별하는 중요한을 제공하지만, 같은섬유 아세포 마이그레이션 MRP4 의존 규제의 아직 미개척기구.
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Protocol
1. 독창성 통로 분석
- 업로드 단백질 상호 작용 체의 데이터 집합
- 자신의 고유 한 유전자 식별자 (질량 분석 데이터를 얻을으로 바람직 유전자 기호 및 유전자 식별 번호)와 스프레드 시트에 대한 관심의 단백질 / 유전자를 삽입합니다.
- 유전자 식별 번호에 대한 스프레드 시트에서 하나의 컬럼과 관측 값에 대한 하나의 컬럼을 지정합니다 (예 :., 접어 변화 또는 p 값). 열 머리글을 볼 수있는 '열 머리글을 포함'옵션을 선택합니다.
- 업로드 데이터 세트 탭을 클릭하고 위에서 언급 한 스프레드 시트를 선택하여 IPA의 데이터 집합을 업로드합니다. 유연한 형식 탭을 선택하고 유전자 식별자의 적절한 범주를 선택합니다.
참고 : 데이터 세트의 유연한 형식은 업로드에 대한 형식 사양을 극복한다. - 데이터 집합이 나타나면, ID 및 관찰 열을 선택합니다. 확인 대량 특검팀에 의해 식별 단백질 (MRP4의 상호 작용 체의 모든ectrometry) 데이터 집합 요약 탭을 선택하여 매핑됩니다. 데이터 집합 이제 원하는 분석을위한 준비가되어 있습니다.
- 데이터 분석
참고 :이 연구에 사용 된 IPA 기능의 부분적인 사용이 설명되어 있습니다.- 고유 식별자로 자신의 유전자 이름으로 MRP4의 상호 작용 체를 업로드 한 후, 새를 클릭 IPA 소프트웨어의 왼쪽 상단 메뉴의 핵심 분석을 선택합니다.
- 실험 종류에 따라 강도의 발현 컷오프 값을 설정 ((100)의 강도 값은 분석을 위해 권장).
- 제어 및 실험 조건이 참여하고 비교 분석을 수행 할 필요가있는 경우 데이터 세트 파일의 일부로 포함 할 경우 데이터 집합을 준비하는 동안 식의 접이식 변화를 계산한다 (1.5 배 변화의 컷 - 오프 값은 일반적으로 분석을 권장합니다 ).
주 : 코어 분석 종료 후, 해석의 여러 부분을 얻을 수있다. 첫 번째 탭은 일의 요약 정보를 보여줍니다전자는 전체 분석과 다른 사람의 사이에서 최고 정식 경로, 상류 규제, 분자 및 세포 기능 및 네트워크를 제안한다; 모든 신뢰 수준 (p 값)에 기초하여 계산 된 P 값의 오름차순으로 배열. - 그림으로 중첩 교차 이야기를 보여 (열린 경로 옵션을 사용하여) 주요 정식 경로와 같은 큰 분자 네트워크를 열고 신호 전달 경로에 영향을 미쳤다.
majorly의 p 값에 따라 포함되는 정식 경로의 목록을보고 하였다 (p <0.05 중요한 것으로 간주된다).
참고 : 표준 경로에 대한 중요성 값은 오른쪽 꼬리 피셔의 정확한 시험에 의해 계산된다. 중요성은 혼자 우연에 의해 정식 경로로 데이터 세트에서 분자 협회의 확률을 나타냅니다. - 각 경로에 관여하는 단백질의 목록 중 입력 단백질 (질량 분석에 의해 식별 MRP4의 상호 작용 체)를 확인합니다.
참고 :이 OPTIO를 사용하여N, 상기 셀룰러 네트워크 액틴 세포 골격 신호 입력 단백질이 맞지 주요 영향 경로 및 방법 (도 1)는 것을 관찰 하였다. 이 방법은 분자 네트워크 밀접하게 관련된 시험 단백질에 의해 영향을받을 수있는 식별 할 수 있습니다. - 잠재적 포커스 분자의 수에 기초하여 특정 단백질 네트워크에 연결되어있는 상단 질환 및 기능을 식별하는 분석에서 네트워크 탭을 사용한다.
, 스코어 값이 네트워크 등의 일부로서 결정되는 공지 된 단백질에 기초하여 주어진 문헌 지식 및 실험 증거를 통해 셀룰러 조립 조직 네트워크 및 데이터 세트로부터 식별되는 분자를 집중하고, 네트워크의 일부가된다 :. 참고 . 이제부터, 네트워크는 포커스 분자의 수에 기초하여 처음에 여과 얻는다.
2. 높은 콘텐츠 현미경
- 세포의 준비
주 : 모든 세포 배양 작업은 수평 유동 세포 배양 후드 아래 시행 하였다.- 상처 치유 분석을위한 마이크로 플레이트 96 웰을 사용합니다.
- 코트 (PBS에서 재구성) 1 % 피브로넥틴 용액으로 마이크로 플레이트, 2 시간 동안 37 ° C에서 표준 CO 2 인큐베이터에서 접시를 유지한다.
- - / -과 Mrp4 + / + 마우스 배아 섬유 아세포 (MEFs에) 인큐베이터에서 25 cm² 세포 배양 플라스크에서 성장, 4 배 트립신 EDTA 용액 1ml를 사용하여 5 분 동안 세포를 PBS로 1 회 세척하고,를 Trypsinize Mrp4 제거합니다.
- 완전 배지와 완전 배지 5ml에이를 재현 탁 (DMEM은 10 % FBS와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 함유) 세포를 세척 하였다.
- 우물에서 피브로넥틴 솔루션을 대기음. 혈구 세포를 이용하여 카운트하고 각 웰에 (셀 수는 세포 유형에 따라 최적화 될 필요가있다) 30,000 세포 종자.
- 표준 100 % 합류로 세포 성장CO 24 시간 동안 37 ° C에서 2 배양기.
- 만들기 상처
- 모든 우물이 솔루션으로 가득해야합니다. 상처 제작 도구의 손상을 방지하기 위해 PBS로 사용하지 않는 우물을 입력합니다 (예 :., WoundMaker).
- 100 % 세포의 합류를 확인한 후, 상기 금속 기판에 상처 제작 공구 내부의 96 웰 플레이트를 놓고 아래 96- 웰 핀 블록을 누른다.
- 어떤 빠질 세포를 제거하고 완전 배지 100 μl를 추가 PBS로 세포를 세 번 씻으십시오.
- 시험 화합물을 추가 - H-89 (50 μM 1 : 완전한 미디어 DMSO에 50 mM의 주식을 사용하여 1,000 희석) 또는 Latrunculin B (1 μM 1 : DMSO에 1 mM의 주식을 사용하여 전체 미디어와 1,000 희석)이 단계에서 .
- 37 ° C에서 독자 내부의 분석 플레이트를 놓고 실험 기간 동안 마이그레이션을 모니터링 할 수 있습니다.
- 모니터링 셀 마이그레이션
참고 : 셀 마이그레이션 현미경 및 소프트웨어 홍보를 사용하여 측정 하였다하이 콘텐츠 현미경 시스템 ovided. 상처 자동 현미경으로 모니터하고 소프트웨어에 의해 등록되도록 96 웰 마이크로 플레이트의 용도.- 일정 검색 탭을 사용하여 마이그레이션 분석에 대한 분석 플레이트를 매 시간마다 스캔 소프트웨어를 설정합니다. 적어도 15 분 전에 평형화 촬상을 허용하도록 리더 내부 분석 플레이트를 배치 한 후 시작 시간을 선택한다.
- 트레이를 선택하고 선종 (96 웰 마이크로 플레이트) 실험 유형 (스크래치 상처)를 선택합니다.
- 10X 목표를 선택하고, 위상차 영상 매개 변수를 선택합니다. 편집 스캔 패턴 옵션을 사용하여 스캔 할 필요가있는 우물을 선택합니다.
- 속성 탭을 선택하고 접시 맵을 설정하여 치료 그룹 및 복제를 지정합니다. 스캔은 실험 조건에 따라 언제든지 정지 될 수있다.
- 데이터 분석
- 스캔이 완료되면 분석 판의 용기보기 탭을 선택합니다. 지분석 작업 유틸리티를 선택 출시 새로운 분석 작업에 오.
- 작업 유형으로 스크래치 상처를 설정하고 분석 (24 시간 시점 0 시점)의 시간 범위를 선택합니다.
- 선택 우물은 우물에 한 번의 클릭으로 분석을 위해 선택하고 분석을 시작하려면 '확인'을 클릭합니다. 분석이 완료되면, 그래픽 그래프 옵션으로 수출을 사용하여 각 시점에서 각 웰에 대한 상대 상처 밀도 (RWD) 데이터를 시각화.
- 각각의 잘보기 이미지 탭을 사용하여 서로 다른 시간 포인트에 해당하는의 위상 대비 이미지 세트를 볼 수 있습니다. 판지도를 클릭하여 특정 잘 선택한 시간 범위 탭에서 특정 시점을 선택하고보기 이미지 탭을 클릭합니다.
3. 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)
- 세포의 준비
- (2.1 절에 설명 된대로)와에 보관 1 % 피브로넥틴 용액 100 ㎕와 코트 35mm 유리 바닥 요리2 시간 동안 37 ° C에서 표준 CO2 인큐베이터.
- 완전 배지에 HEK293 세포의 플레이트 종자 동수의 피브로넥틴 용액 (10,000 세포 / 플레이트) 대기음.
- 24 시간 동안 37 ° C에서 표준 CO 2 배양기에서 피브로넥틴 코팅 유리 바닥 요리 60 ~ 70 %의 합류로 세포를 성장.
- 형질
- 제조업체의 지시에 따라 상용 형질 전환 시약을 사용하여 모든 일시적 형질 감염을 수행한다.
- 나누어지는 각 35mm 요리에 대한 두 개의 1.5 ml의 멸균 원심 분리기 튜브에 완전한 매체의 250 μL.
- 하나의 튜브와 5 μL의 DNA (pmAKAR3 또는 pmAKAR3-TA)의 2 μg의 다른 튜브에 형질 전환 시약 (2.5은 DNA 농도를 배)를 추가합니다.
- 실온에서 20 분 동안 튜브를 인큐베이션 한 다음 형질 감염 시약을 함유하는 튜브로 희석 DNA 옮긴다.
- 철저하게 혼합하고 37 부화또 다른 30 분 동안 C를 °.
- 셀 오프 매체를 기음과 PBS로 한번 씻어. 세포에 10 % FBS를 함유하는 항생제없이 DMEM F-12 배지 1 ㎖를 추가한다.
- 각 플레이트의 세포 미디어와 DNA 지질 복합체의 507 μl를 추가 부드럽게 혼합하고, 48 시간 동안 37 ° C에서 CO 2 배양기에서 유지. 각각의 접시에 10,000-50,000 세포에 대한 DNA (1 μg의 / μL 주) 5 ㎕를 지질의 2 μg의를 사용합니다.
- 라이브 셀 이미징
- 형질 감염 48 시간 후, 행크의 균형 잡힌 염 용액으로 두 번 성장 배지를 제거하고 세포를 세척 (HBSS은 37 ℃ 예열 기음). 사용자 정의 만든 37 ° C의 내부 FRET 영상에 대한 반전 넓은 필드 현미경 시스템에서 세척 된 세포에 1.9 ㎖의 HBSS의 최종 볼륨을 추가하고 마운트 챔버를 유지했다.
이 시스템에서, 여기 광은 50 %의 광 transmiss와 감광 필터 감쇠 300 W 크세논 램프에 의해 제공된다 : 참고이온. - 60X 목표를 사용합니다. 수동으로 세포에 초점 현미경을 사용하여보기의 최적의 필드를 설정합니다. 소프트웨어에 초점 "F"옵션을 사용하여 컴퓨터 화면에 뷰의 선택한 필드를 활성화합니다. FRET 측정을 수행하기위한 적절한 필터 집합 (a 25분의 430 nm의 여기 필터, 더블 이색 성 빔 스플리터 설정 CFP / YFP 필터, 및 두 개의 발광 필터 FRET 대 (30분의 470 내지위한 CFP 및 30분의 535 나노 미터)을 선택 수동으로.
- 처음 열 불소 탭을 클릭 한 다음 채널 옵션 CFP / YFP / FRET에 확인하여 형광을 시각화합니다. 카메라 탭의 강화 도구를 사용하여 신호 강도를 향상.
- 신호 강도의 포화를 회피 pmAKAR3 또는 pmAKAR3-TA 발현 세포를 선택. FRET 측정을 시작 캡처 창을 사용하십시오.
- 시간 경과 옵션 및 설정 30 초 간격으로 30 분 동안 한 번 스캔을 선택합니다. 프렛 옵션을 확인하고 100 밀리 초에서 노출 시간을 설정합니다. 이미지 레이블를 입력D의 Enter 키를 눌러 측정을 시작하기 시작합니다.
- 다섯 시점과 기준의 확립 후, 30 분의 총 세포를 플레이트에 영향을주지 않고 세포 포스 콜린 25 μM (HBSS 100 ㎕ 희석 에탄올 중 10 μM 스톡, 5 μL)를 첨가하고, 감시한다.
- 형질 감염 48 시간 후, 행크의 균형 잡힌 염 용액으로 두 번 성장 배지를 제거하고 세포를 세척 (HBSS은 37 ℃ 예열 기음). 사용자 정의 만든 37 ° C의 내부 FRET 영상에 대한 반전 넓은 필드 현미경 시스템에서 세척 된 세포에 1.9 ㎖의 HBSS의 최종 볼륨을 추가하고 마운트 챔버를 유지했다.
- 데이터 분석
참고 : 데이터 분석을 위해 사용 비율 계량 계산 모듈을.- 이미지 창 왼쪽에있는 선택 도구를 클릭하고 드롭 다운 메뉴에서 고체 사각형을 선택합니다. 셀 무료 영역에서 이미지 필드에 사각형을 드래그하고 마우스 오른쪽 배경 공제의 목적을 위해 배경으로 설정하도록 클릭합니다.
- 마스크로 이동 옵션 '새 마스크를 만들'사용합니다. 선택 도구로 이동하여 수동으로 측정하여 선택 셀 주위에 마스크를 그릴 드롭 다운 메뉴에서 펜을 선택합니다. 조건 당 적어도 4-6 셀을 선택합니다.
- 마스크 탭을 선택하고 마스크 통계를 수행합니다.
- '전체 마스크'를 확인 교차 채널 옵션을 선택 기증자 정규화 FRET (N-FRET) (FRET / CFP)를 확장합니다. 상기 n 값은 FRET 세포막의 PKA 활동 나타낸다.
- 룩업 테이블과 규모 표시 줄을 주석을 사용하여 타임 스탬프를 추가합니다.
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Representative Results
섬유 아세포 이동에 MRP4의 효과를 연구하기 위해, 우리는 높은 함량 현미경 (14)을 이용하여 상처 치유 검정을 사용 하였다. 정확한 상처에서 격리 MEFs에의 합류 단일 층에 만들어진 하나 Mrp4 - / - 또는 Mrp4 + / + 마우스, 이미지는 24 시간 동안 1 시간 간격으로 촬영 하였다. Mrp4 + / + MEFs에 (그림 2)에 비해 MEFs에 - / - 우리는 Mrp4에 대한 높은 이동 속도를 관찰했다. Mrp4 + / + MEFs에이 상처를 덮도록 약 20 시간을 요구하는 반면, MEFs에 - / - 상처가 완전히 Mrp4 미만 15 시간 치유되었다.
세포 마이그레이션의 첨단에서 PKA 활동의 편광 축적 방향 마이그레이션을위한 핵심 초기 이벤트입니다. PKA 활동이 실시간으로 날기에 모니터링 할 수있다g PKA 5,17에 대한 pmAKAR3 FRET 기반의 센서. PKA 활동에 대한 pmAKAR3의 특이성을 확인하기 위해, 우리는 PKA의 기판 영역에서 쓰 레오 닌 - 투 - 알라닌 돌연변이를 포함하기 때문에 25 μm의 포스 콜린과 PKA 인산화에 응답 불가입니다 pmAKAR3 또는 점 돌연변이 pmAKAR3-TA를 과발현하는 HEK293 세포 치료 , 캠프 유도 에이전트 14. 우리는 pmAKAR3를 과발현 세포에서 FRET 신호의 증가를 찾았지만, pmAKAR3-TA를 과발현 세포는 (그림 3) 변화가 없었다. 기초는 수준도 pmAKAR3-TA를 발현하는 세포에 비해 pmAKAR3를 발현하는 세포에 대한 더 높았다 FRET. 이러한 데이터는 pmAKAR3가 PKA 활동에 대한 매우 구체적인 것을 지적했다.
요약하면, 프로토콜 절에 설명 된 방법은 특정 셀룰러 이벤트와 관련된 기작을 연구하는 유용한 도구이다.
그림 1 :. MRP4 상호 작용 체의 독창성 통로 분석 (IPA)를 사용하여 IPA 액틴 세포 골격 경로는 MRP4의 상호 작용 체에 의해 영향을받는 주요 표준 경로 중 하나로 확인되었다. 발표 굴지 신호 네트워크가 연결된 단백질 (흰색)과 문학과 실험 증거에서 유추 MRP4의 상호 작용 체 (핑크)에서 확인 된 단백질과의 상호 통신을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. 그림 2 : 상처 치유 높은 콘텐츠 현미경을 사용하여 분석을 Mrp4 + / + 및 Mrp4 - / - 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs에)는 fibrone 성장했다96 웰 요리를 CTIN은 코팅하고, 단일 층의 상처는 96 핀 상처 메이커를 사용하여 정밀하게 만들어졌다. 서로 다른 시간 지점에서 대표 이미지를 10 배 확대로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 : 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 pmAKAR3 센서를 사용 PKA 활동의 측정을 기반 N-FRET 대표적인 의사 - 컬러 화상을 60X 배율 전과 포스 콜린 처리 후 pmAKAR3 센서 pmAKAR3-TA 센서로 형질 HEK293 세포. 도시 (상단 패널). 각 패널의 이미지는보기 같은 분야에서 캡처되었다. 컬러 바는 N-FRET의 크기를 나타냅니다. 선 그래프 (아래 패널) treatmen 후 N-FRET 수준의 변화를 나타낸다포스 콜린와 t. 데이터는 적어도 3 개의 독립적 인 실험의 평균을 나타낸다 (± SEM 평균, N = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 11668-027 | |
| DMEM | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11965-092 | |
| IncuCyte Zoom | Essen BioScience | ||
| 96-well IncuCyte Image-Lock microplates | Essen BioScience | 4493 | |
| Latrunculin B | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | L5288 | Stock in DMSO |
| H-89 | Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY) | BML-EI196 | Stock in DMSO |
| 35 mm glass-bottomed dishes | (MatTek Corporation; Ashland, MA) | P35G-1.5-20-C | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | F1141 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985-088 | |
| FRET microscopy system | Olympus inverted microscope (IX51) | ||
| CCD camera | Hamamatsu, Japan | ORCA285 | |
| SlideBook software 5.5 | Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO) | ||
| Ingenuity Pathway Analysis software | IPA, QIAGEN Redwood City, | ||
| Forskolin | Tocris (Ellisville, MO). | 1099 | Stock in 100% EtOH |
| DMEM F-12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11330-057 | |
| HBSS | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 14025-134 | |
| Excel | Microsoft | ||
| PBS | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 10010-023 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Invitrogen(Carlsbad, CA) | R-001-100 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 15140-122 |
References
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- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Arora, K., et al. Compartmentalization of cyclic nucleotide signaling: a question of when, where, and why? Pflugers Arch. 465 (10), 1397-1407 (2013).
- Howe, A. K., Baldor, L. C., Hogan, B. P. Spatial regulation of the cAMP-dependent protein kinase during chemotactic cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (40), 14320-14325 (2005).
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