A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopie op hoge snelheid met meerdere kleuren

Abstract

Optische super-resolutie beeldvorming met gestructureerde verlichting microscopie (SIM) is een belangrijke technologie voor de visualisatie van processen op moleculair niveau in de chemische en biomedische wetenschappen. Hoewel commerciële SIM systemen zijn systemen die op maat zijn ontworpen in het laboratorium commerciële systemen beter presteren dan deze eigenlijk ontworpen voor gebruiksgemak en algemene toepassingen, zowel qua beeldvorming betrouwbaarheid en snelheid. Dit artikel geeft een uitgebreide gids voor het opbouwen van een SIM dat gebruik maakt totale interne reflectie (TIR) ​​verlichting en kan imaging up to 10 Hz in drie kleuren met een resolutie van 100 nm. Door de combinatie van SIM en TIRF, het systeem beter beeldcontrast dan concurrerende technologieën. Om deze specificaties te bereiken worden verschillende optische elementen die gebruikt worden om automatische controle over de polarisatietoestand en de ruimtelijke structuur van de verlichting licht mogelijk te maken voor alle beschikbare excitatie wavelengths. Volledige details over de hardware-implementatie en controle worden gegeven aan synchronisatie tussen excitatielicht patroon generatie, golflengte, polarisatie staat, en de camera controle te bereiken met de nadruk op het bereiken van maximale overname frame rate. Een stap-voor-stap protocol voor het systeem uitlijnen en kalibratie wordt gepresenteerd en de haalbare verbetering resolutie gevalideerd op ideale testmonsters. De mogelijkheid om video-rate super-resolutie beeldvorming wordt gedemonstreerd met levende cellen.

Introduction

In de afgelopen halve decennium heeft super-resolutie microscopie gerijpt en verhuisde van gespecialiseerde optica labs in de handen van de bioloog. Commerciële microscoop oplossingen bestaan ​​voor de drie belangrijkste varianten voor het bereiken van de optische super-resolutie: enkel molecuul localisatie microscopie (SMLM), gestimuleerde emissie uitputting microscopie (STED), en gestructureerde verlichting microscopie (SIM) ^1,2. SMLM zoals Photoactivated Localization Microscopy (PALM) en stochastische optische reconstructie microscopie (Storm) hebben de meest populaire technieken geweest, grotendeels te danken aan de eenvoud van de optische opstelling en de belofte van hoge ruimtelijke resolutie, gemakkelijk tot 20 nm. Maar super-resolutie microscopie via single molecule lokalisatie wordt geleverd met een intrinsieke trade-off: de ruimtelijke resolutie haalbaar is afhankelijk van het verzamelen van een voldoende aantal individuele fluorofoor lokalisaties, vandaar beperking in de tijd resolutie. Imaging dynamisch proceses in levende cellen wordt derhalve problematisch als een voldoende beweging van de structuur van belang bewegingsartefacten voorkomen terwijl het verwerven genoeg lokalisatie gebeurtenissen in die tijd om een ​​beeld te reconstrueren moeten proeven. Om aan deze eisen te voldoen, zijn levende cellen SMLM demonstraties de vereiste toename fluorofoor photoswitching tarieven verkregen door aanzienlijke verhoging van de excitatie energie, en dit leidt weer tot fototoxiciteit en oxidatieve stress, waardoor monster overlevingstijden en biologische relevantie ³ beperkt.

Een duidelijk voordeel van STED over zowel SIM-kaart en SMLM is dat het kan afbeelding met super-resolutie in dikke monsters, bijvoorbeeld laterale resolutie van ongeveer 60 nm werd bereikt in organotypische brain slices tot een diepte van 120 pm ^4. Imaging op zo'n diepte met één doel implementaties van SMLM of SIM is niet haalbaar, maar wordt mogelijk met zowel single-molecule licht plaat of rooster licht blad microscopy ^5. Video-rate STED is ook aangetoond en gebruikt om synaptische vesikel mobiliteit kaart, hoewel dit tot nu toe beperkt tot kleine gezichtsveld ⁶ beeldvorming.

Voor toepassingen in de celbiologie en zelfassemblage reacties moleculaire ^7-12 die beeldvorming met hoge tijdsresolutie gedurende vele tijdstippen vereisen gestructureerde verlichting microscopie (SIM) kan geschikt als het is niet afhankelijk van de fotofysische eigenschappen van een bepaald fluorescentie sonde. Desondanks inherent voordeel van SIM, tot nu toe het gebruik ervan is voornamelijk beperkt tot gefixeerde cellen of langzaam bewegende processen beeldvorming. Dit komt door de beperkingen van commercieel beschikbare SIM systemen: het verwerven framesnelheid van deze instrumenten beperkt door de rotatiesnelheid van de rasters gebruikt om de vereiste sinusvormige verlichtingspatronen en de polarisatie optiek handhaven genereren. De nieuwste generatie van commerciële SIMinstrumenten zijn in staat om snel imaging, maar ze zijn onbetaalbaar om alle, maar de centrale imaging faciliteiten.

Dit protocol geeft een indicatie voor de bouw van een flexibel SIM voor het afbeelden snelle processen in dunne monsters en nabij het basale oppervlak van levende cellen. Er werken in totaal interne reflectie fluorescentie (TIRF) om een verlichting patroon dat niet dieper dan ongeveer 150 nm in de steekproef ¹³ die sterk vermindert de achtergrond van de focus signaal doordringt te genereren. Het idee van het combineren SIM met TIRF is bijna zo oud als SIM zelf ¹⁴ maar niet experimenteel gerealiseerd vóór 2006 ^15. Eerste in vivo verkregen beelden met TIRF-SIM werden gerapporteerd in 2009 ¹⁶ bereiken beeldfrequenties van 11 Hz tot tubuline en kinesine visualiseren dynamiek, en twee kleuren TIRF-SIM-systemen zijn gepresenteerd ^17,18. Meest recent, een gids voor de bouw en het gebruik van een enkele kleur twee-beam SIM system werd gepresenteerd met frame rates tot 18 Hz ^19,20.

De set-up hier gepresenteerde kan SIM superresolutie imaging op 20 Hz in drie kleuren, waarvan er twee worden gebruikt in TIRF-SIM. Het gehele systeem is opgebouwd rond een omgekeerde microscoop frame en gebruikt een gemotoriseerde xy translatietrap met een piëzo-Z platform. De sinusvormige excitatiepatronen vereist TIRF-SIM genereren het gepresenteerde systeem maakt gebruik van een ferroelektrische ruimtelijke lichtmodulator (SLM). Binaire raster patronen worden op de SLM en de resulterende ± 1 ordes van diffractie worden gefiltreerd, geconcentreerd en doorgegeven in de TIR ring van de objectieflens. De noodzakelijke faseverschuivingen en rotaties van de roosters worden aangebracht door het weergegeven beeld SLM veranderen. Dit protocol beschrijft hoe te bouwen en af ​​te stemmen zo'n excitatie pad, worden de uitlijning van de emissie-pad, en presenteert de monsters voor een optimale afstemming. Het ook De schriftgeleerden de problemen en uitdagingen het bijzonder op hoge snelheid TIRF-SIM over polarisatie controle en synchronisatie van componenten.

Ontwerp Overwegingen en beperkingen

Voor montage van de TIRF SIM-systeem in dit protocol, zijn er verscheidene ontwerpbeperkingen overwegen, die keuze van optische componenten te bepalen. Alle afkortingen van optische componenten zie figuur 1.

Ruimtelijke lichtmodulator (SLM)

Een binaire ferroelektrische SLM wordt in deze opstelling als het in staat is een milliseconde patroon schakelen is. Grijstinten nematische SLM kan worden gebruikt, maar deze bieden sterk verminderd schakeltijden. Elke in- of uitschakelen pixel in een binaire fase SLM zal verlenen of een π of 0 faseverschuiving om de invallende vlakke golffront, dus als een periodiek raster patroon wordt op de SLM zal werken als een fase-diffraktieraster.

ent "> totale interne reflectie (TIR)

TIR bereiken en produceren een verdwijnende veld, moet de invalshoek van de excitatie stralen bij de glas-monsterscheidingsvlak groter dan de kritische hoek te . Dit stelt de minimale invalshoek vereist, en dus ook de maximale afstand, of periode van de verdwijnende verlichting patroon. De maximale invalshoek (De acceptatiehoek) wordt beperkt door de numerieke apertuur (NA) van de objectieflens die berekend kan worden uit de definitie . Dit bepaalt de minimale patroon haalbare afstand aan aan de Abbe formule die NA en de golflengte koppelt tot het minimum patroon afstand (dwz. De TIR ring) en waarin de twee brandpunten excitatie nauwkeurig worden gepositioneerd en nauwkeurig geroteerd om elke verlichtingspatroon te genereren.

Reconstructie van TIRF-SIM beelden vereist de aankoop van minimaal drie faseverschuivingen per omwenteling patroon daarom de SLM patroon periode moet deelbaar zijn door 3 (zie figuur 1). Bijvoorbeeld, een periode van 9 pixels voor 488 nm belichting en 12 pixels voor 640 nm belichting. Voor een uitgebreide bespreking van de SLM patroon ontwerp, met inbegrip van sub-pixel optimalisatie van de patroon spatiëring gebruiken geschoren roostersZie het eerdere werk van Kner et al. ¹⁶ en Lu-Walther et al. ²⁰ De positie van de twee excitatie brandpunten moet in de TIR ring voor alle golflengten, maar de diffractiehoek van de ± 1 orden van de SLM golflengte afhankelijk. Voor standaard SIM kan veelkleurige beeldvormende worden bereikt door het optimaliseren van de rasterperiode van de langste golflengte en tolereren verlies in prestatie voor de korte kanalen. Voor TIRF-SIM echter geoptimaliseerd voor één golflengte betekent dat de andere golflengte brandpunten niet meer onder de TIR ring. Bijvoorbeeld met behulp van een rasterperiode van 9 pixels voldoende is om TIRF voor 488 nm, de foci bij 95% van de diameter van de rug opening binnen het TIR ring, maar 640 nm die periode zouden de brandpunten buitenpositie de opening. Daarom moet verschillen pixelpatroon tussenruimtes worden gebruikt voor elke excitatiegolflengte.

De uitlijning van de TIRF-SIM excitatie padextreem gevoelig is voor kleine veranderingen in de positie van de dichroïsche spiegel (DM4 in figuur 1) in de microscoop lichaam, veel meer dan bij conventionele SIM. Gebruik van een roterend filter kubus carrousel wordt niet aanbevolen, in plaats daarvan een enkel multi-band dichroïsche spiegel, die in een vaste positie specifiek voor de excitatie golflengten gebruikte gehouden en gemaakt. Het is essentieel dat alleen de hoogste kwaliteit dichroïsche spiegels worden gebruikt. Deze vereisen dikke substraten van tenminste 3 mm, en worden vaak aangeduid als "platte imaging" door de fabrikanten. Alle andere substraten leiden tot ondraaglijke aberratie en verslechtering van het beeld in TIRF-SIM.

polarisatie controle

Om TIRF-SIM bereiken moeten de polarisatietoestand van het excitatielicht roteert synchroon met het verlichtingspatroon zodat blijft azimutaal gepolariseerd in de doelstelling pupilvlak ten opzichte van de optische as (dwz. s-gepolariseerde). Aanpassing van de polarisatiecontrole optica zal afhangen van de specifieke optische element gebruikt, bijvoorbeeld een Pockels cel ^21, of een halve golfplaat bij een motorisch draaibare fase ^22. In dit protocol een custom vloeibaar kristal variabele retarder (LCVR) wordt gebruikt, die full-wave (2π) retardance verschaffen via golflengtegebied 488-640 nm omdat hiermee snel (~ msec) schakelen. Bij gebruik van een vloeibaar kristal retarder is het essentieel om een ​​hoge kwaliteit component: standaardcomponenten zijn meestal niet stabiel genoeg om een ​​constante retardance geven over de lengte van de belichting tijd, die leidt tot dispersie van het verlichtingspatroon en lage modulatie contrast . Vloeibare kristallen vertragers zijn ook sterk afhankelijk van de temperatuur en vereisen ingebouwde temperatuurregeling.

Synchronisatie

De lasers worden gesynchroniseerd met de SLM. Binaire ferroelektrische SLM intern evenwicht door sbeheksen tussen een op de staatstelevisie en uit staat. De pixels alleen optreden als halve golf platen in zowel hun aan of uit staat, maar niet tijdens de interframe schakeltijd. Daarom de lasers moet alleen worden ingeschakeld in het aan / uit-toestand via de LED activeringssignaal van de SLM een vermindering van patroon tegenstelling voorkomen door het tussenstadium van de pixels. Een akoesto-optische modulator (AOM) kan ook worden gebruikt als een snelle sluiter als de lasers niet digitaal worden gemoduleerd.

Keuze van lenzen

Op basis van deze beperkingen, de gewenste verkleining van de SLM vlak op het monstervlak om het gewenste verlichtingspatronen kan worden bepaald. Dit maakt de berekening van de focale lengten van de twee lenzen L3 en L4 in het beeld relais telescoop en de excitatie condensorlens L5. In dit systeem wordt een 100X / 1.49NA olie-immersie objectieflens wordt gebruikt bij 488 nm en 640 nm excitatie en gebruikt dus brandpuntsafstand van 300 en 140 mmvoor L4 en L3 en 300 mm voor L5, wat een totaal verkleining van 357x, wat overeenkomt met een SLM pixelgrootte van 38 nm op het monstervlak. Met deze combinatie van lenzen, SLM rasterperiodes van 9 voor 488 nm belichting en 12 pixels voor 640 nm patroon tussenruimte van 172 en 229 nm te geven aan het monster, overeenkomend met invalshoeken van 70 ° en 67 ° respectievelijk. Een glas-water grensvlak, de kritische hoek is 61 °, en is onafhankelijk van de golflengte, dus beide patroon afstanden mogelijk TIRF excitatie voor beide golflengten. Een objectieflens voorzien van een correctie kraag is nuttig voor correctie van sferische aberraties geïntroduceerd door variaties in dikte dekglaasje, of indien deze werkt bij 37 ° C.

Beeldreconstructie

Zodra ruwe simgegevens is verkregen is een kwestie van rekentijd voor super opgeloste beelden in een tweestapsproces genereren. Enerzijds het verlichtingspatroon te worden bepaaldelke afbeelding en ten tweede moet de componenten van de SIM spectrum worden gescheiden en op geschikte wijze gecombineerd dat een daadwerkelijk OTF drager (zie figuur 6, bijvoegsels) verdubbelen.

Precieze kennis van de geprojecteerde verlichtingspatronen het grootste belang, aangezien de super opgelost frequentiecomponenten hebben ongemengde zo nauwkeurig mogelijk artefacten veroorzaakt door de resterende delen van overlappende componenten te voorkomen. We bepalen de verlichtingspatroon parameters a posteriori uit de ruwe beeldgegevens volgens de procedure geïntroduceerd door Gustafsson et al. ²³ Kortom, een set van verlichting parameters die een genormaliseerde tweedimensionale sinusoïde beschreven moet worden gevonden voor elk van de excitatiepatronen :

Hierbij en beschrijven de pony contrast en het patroon respectievelijk startfase van elke individuele afbeelding m. De componenten van de golfvector, en , Alleen veranderen met de verschillende oriëntaties van de patroon en kan overigens gelijkblijvende verondersteld te zijn. Om grof bepalen van de componenten van de golf vector een kruiscorrelatie ruwe beeld spectra wordt uitgevoerd, wordt geraffineerd door toepassing subpixel verschuift naar een van de kruis-gecorreleerde beelden om de overlap te optimaliseren. Dit gebeurt via vermenigvuldiging van real-space fase gradiënten dat leiden tot een subpixel verschuiving in frefrequentie-ruimte. Merk op dat het nuttig is om een ​​goede schatting van de golf-vectoren voorafgaand af van de exacte schatting patroon en dit kan worden gevonden door het afbeelden van een fluorescerende laag bead.

Aangezien de fase stap tussen verschoven patronen is , Dwz. De scheiding van frequentiecomponenten kan worden uitgevoerd door een Fourier-transformatie langs de "fase-as". De wereldwijde fase en de pony contrast kan dan worden bepaald met behulp van complexe lineaire regressie van verschillende componenten. De afzonderlijke componenten gescheiden worden dan gecombineerd met een gegeneraliseerde Wiener filter. Voor een gedetailleerde beschrijving van zowel de parameter extractie en de uitvoering van de algemene Wiener filter verwijzen we de lezer naar Gustafssonet al. ²³ waarbij hetzelfde algoritme wordt gebruikt.

Protocol

1. Het organiseren en uitlijnen Opwinding Path

1. De posities van de componenten op de optische tafel (zie figuur 1 voor een overzicht van de optische opstelling). Scheid de doelstelling, lenzen L3, L4, L5, en de SLM elk door de som van hun brandpuntsafstanden zodat het SLM oppervlak wordt doorgegeven op het brandvlak van het objectief.
2. Plaats multi-edge dichroïsche spiegel DM4 in het filter kubus torentje van de microscoop frame.
3. Steek de tweede dichroïsche spiegel DM3 in een 1 "vierkant kinetische spiegel te monteren, en plaats het een brandpuntsafstand uit de buurt van de condensor lens L5.
   Let op: Dit excitatie pad ontwerp neemt twee identieke dichroïsche spiegels DM3 en DM4 die zijn overgenomen uit dezelfde productie-batch aan uniforme optische eigenschappen. De dichroïsche spiegel (DM4) zodanig is geplaatst dat de s- en p- assen geschakeld vergeleken met de dichroïsche in de microscoop (DM3) hierdoor een annulerenpolarisatie ellipticiteit geïntroduceerd door de dubbele breking (figuur 1). Deze compensatie werkt net zo goed voor elke golflengte verlichting. Deze stap is essentieel voor hoge modulatie contrast.
4. Alvorens de lenzen in het excitatiepad nauwkeurig definiëren de optische as van het systeem.
   1. Verwijder het objectief (OB) van de toren en in plaats daarvan schroef in een uitlijning tool. Deze bestaat uit een 500 mm lange optisch systeem kooi met twee schijven aanpassing aan beide uiteinden.
   2. Gebruik de dichroïsche spiegel DM3 en tijdelijke afstemming spiegel geplaatst op de geschatte latere locatie van de SLM een gecollimeerde referentiebundel van Laser 1 sturen door het midden van de gaten in de twee alignment schijven. Richt de straal van Laser 1 tot tijdelijke spiegel zoals in figuur 1 met behulp van drie spiegels en dichroïsche spiegel DM2. De tijdelijke spiegel aan de SLM moet zo dicht bij loodrecht op de optische as daarvan.
      
   3. Verwijder de pasgereedschap zodra de grove optische as determined.Insert een iris in de laserstraal pad is geweest voordat het de microscopie lichaam binnenkomt en centreren op de balk. Bevestig een stuk van de witte kaart met een klein gat gecentreerd op de iris.Reinsert het objectief (OB).
      Opmerking: De bundel verlaat het doel zal nu zeer uiteenlopend zijn, maar er zal een zeer zwakke reflectie van het achteroppervlak van de lens die zichtbaar is op de witte kaart. Alle lenzen, zelfs als ze anti-reflectiecoating, zwak zal terug reflecties die kunnen worden gebruikt om coaxiale uitlijning hebben. Als de bundel precies loodrecht op de lens dan zal de reflectie weer terug door het centrum van de iris
   4. Maak iteratieve hoekige aanpassingen aan de twee spiegels (DM3 en afstemming spiegel aan de SLM positie) naar de achterkant reflectie op centrerende kaart met de binnenkomende bundel. Verwijder tijdelijk de objectieflens (OB) en markeer de laserspot op het plafond van een referentiepositie maken.
   5. Plaats een paar irissen ter hoogte van de referentiebundel langs de draadgaten van de tafel. De bundel parallel met het oppervlak van de optische tafel. De optische as wordt nu gedefinieerd.
5. Plaats de condensor lens (L5) ruwweg een brandpuntsafstand van het objectief. Monteer deze lens op een lineaire translatie decor te vertalen in de richting van de referentie-bundel.
6. Pas de condensorlens positie en hoek zodanig dat de bundel verlaat het doel gecollimeerd en raakt de referentievlek op het plafond. Controleer of de lens loodrecht op de bundel door opnieuw controleren van de achterbezinningsverlies de iris en witte kaart. Verwijder het objectief (OB) en plaats de tweede lens van het beeld relais telescoop (L4).
   NB: zorgen voor de juiste collimatie en non-doorbuiging van de team wordt vergemakkelijkt wanneer er een even aantal lenzen in de stralengang.
7. Pas de positie en de hoek van deze lens met een lineaire translatietafel collimatie te houden en te zorgen voor de referentiebundel raakt nog de gemarkeerde plaats op het plafond.
8. Vervang het objectief (OB) en plaats de eerste lens van de telescoop (L3). Pas de positie en de hoek van deze lens voor collimatie en niet-afbuiging waarborgen, zoals in vorige stappen.
9. Monteer de SLM chip op een cardanische mount die rotatie biedt zonder vertaling over het midden van de chip oppervlak.
   Opmerking: De specifieke plaats ontwerp hangt af van de gebruikte SLM. Als de SLM wordt zonder mount, moet worden bevestigd aan een aangepaste gefreesd aluminium plaat die vervolgens wordt bevestigd aan een cardanische lens mount.
10. Met de lenzen uitgelijnd, plaatst u de SLM in de plaats van de spiegel. Stel de positie van de SLM zodat de referentiebundel is gelegen in het midden van de SLM-chip, en stel de eengle zodat de bundel passeert door de twee relais lenzen (L3 en L4). Controleer of de referentie-bundel is nog steeds gericht op de gemarkeerde plaats.
11. Uitbreiden en collimeren de referentie-bundel met behulp van een Kepleriaanse beam expander.
    1. Monteer de twee lenzen (L1 en L2) in een kooi voor gemakkelijke aanpassing.
    2. Centre de kooi systeem op de referentie-bundel door het verwijderen van de lenzen en te vervangen door irissen.
    3. Plaats de twee lenzen en stel de axiale positie van L2 naar de geëxpandeerde bundel met een afschuifinterferometer collimeren. L2 moet men brandpuntsafstand van het oppervlak van de SLM worden.
    4. Controleer of de uitgebreide bundel is nog steeds gecollimeerd na de twee relais lenzen L3 en L4. Gebruik het scheren interferometer net na DM3 te controleren op collimatie.
12. Zodra de excitatie pad is afgestemd voor een enkele golflengte, het koppelen van de andere twee lasers in de laserstraal pad. Steer elke balk door middel van twee irissen gecentreerd op de excitatie pad metde bundel combineren dichroïsche spiegels (DM1 en DM2).

2. Aanpassing van de Polarisatie Rotator

1. Monteer de LCVR met de snelle as 45 ° met de invallende polarisatie.
2. Fine-tunen van polarisatie hoek van de bundel incident aan de LCVR met behulp van een achromatische halve golf plaat (HWP) door het invoegen van de HWP en de LCVR tussen gekruiste polarisatoren. Draai de HWP om de uitgezonden vermogen te minimaliseren.
   Opmerking: Om te werken als een variabele polarisatiedraaier, moet de snelle as van het vloeibaar kristal retarder (LCVR) nauwkeurig uitgelijnd op 45 ° met de invallende bundel vertikale polarisatie. De LCVR fysiek bevestigd aan 45 °, maar dit is slechts een grove uitlijning. De HWP wordt gebruikt voor een perfecte 45 ° uitlijning van de invallende polarisatie ten opzichte van de LCVR snelle as. De kwart golfplaat (QWP) zet de gekantelde elliptische polarisatie geïnduceerd door de LCVR terug naar lineaire polarisatie in een hoek gecontroleerd door de aangelegde spanning^24.
3. Steek de QWP na de LCVR en draai het naar zijn langzame as af te stemmen op de inkomende polarisatie door het minimaliseren van het uitgezonden vermogen tussen gekruiste polarisatoren.

3. Aanpassing van de Emissie Path

1. Grof de positie van de camera met behulp van een micrometerverdeling en doorgelaten licht.
   1. Focus op het dradenkruis met behulp van de microscoop oculairs en bevestig het objectief op deze positie.
   2. Ruwweg centreren de camera en zet de camera positie om het beeld van het vizier scherp te stellen door het observeren van het beeld op het scherm.
      Opmerking: Als een extern filter wiel wordt gebruikt, de filter kubus zal een emissie filter bevatten, dus de oculairs mag niet worden gebruikt bij lasers zijn ingeschakeld.
2. Fijn stel de camera positie met behulp van een fluorescerende kraal monster.
   1. Bereid een monolaag van fluorescerende kralen door het verspreiden van een druppel van 100 nm multicolor kralen op een dekglaasje # 1,5. Laat dry om de kralen om de dekglaasje adsorberen en vervolgens opnieuw onderdompelen in water.
   2. Plaats de kraal monster op het doel met immersie olie. Fijn aanpassen van de positie van de camera, zodat de fluorescerende kraal laag is scherpgesteld. Mis het objectief standpunt niet aanpassen nadat de focus is gevonden.
      Opmerking: Als de SLM moet in een vlak conjugaat aan het monstervlak, de positie van de SLM, relais lenzen en objectief worden bepaald. Om scherp te stellen, verplaatst het monster axiaal in plaats van de doelstelling van het gebruik van een piëzo z-podium.
3. Genereren van de juiste SIM binaire rooster patronen als bitmap-bestanden.
   1. Voor 2D / TIRF-SIM, het genereren van een reeks van 9 binaire raster beelden: 3 patroon oriëntaties met elk 3 gelijke afstand faseverschuivingen. Genereren deze numeriek (met MATLAB bijvoorbeeld) van een geroteerd 2D sinusoïde met een faseverschuiving toegepast, dan drempelvorming een binair beeld te produceren. Zie Aanvullende Code Files bijvoorbeeld code.
   2. voor alignment doeleinden, ook leiden raster patronen die zijn windowed door een kleine cirkelvormige opening voor elk van de 3 oriëntaties, zoals getoond in figuur 2. De vensters uitlijning roosters hoeven niet extern worden geactiveerd maar kan handmatig worden geschakeld door de gebruiker via de SLM's software.
      Opmerking: Zie referenties voor een bespreking van de optimale rotatiehoeken en een voorbeeld van roosterpatroon generatiecode ^16,20.
4. Upload de bitmap beelden naar de SLM met behulp van software van de fabrikant (bijvoorbeeld MetroCon).
   1. Laad de SLM besturingssoftware en klik op "Connect".
   2. In het tabblad "Repertoire", klikt u op "Load" aan het repertoire bestand te openen en controleer het nummer van Running Orders in het dossier. In het voorbeeld repertoire bestand gegeven zijn er vijf Running Orders.
   3. Klik op "Send to board" om het repertoire bestand naar de SLM te uploaden.
   4. Wacht tot de bitmap beelden te uploaden eennd voor het apparaat automatisch opnieuw op te starten.
      Opmerking: Een voorbeeld repertoire bestand, dat raspen bitmapafbeeldingen en een bestand definiëren van de order bevat, is opgenomen als een aanvullend Code File. De ".repz" bestand kan worden geopend met behulp van ZIP-bestand archiver software.
5. Toon een windowed uitlijning rooster op de SLM voor de eerste oriëntatie (bijvoorbeeld 0 °).
   1. In de SLM besturingssoftware, selecteer het tabblad "Status", voer het nummer van de Running Orde (in het geval van het voorbeeld bestand, dit is rijklare toestand "1").
   2. Klik op "Select" om de Running Order om de uitlijning rooster te veranderen.
      Opmerking: Dit zal een klein cirkelvormig gebied te verlichten in het monster vlak. Als de SLM oppervlak correct is geconjugeerd aan het monster vlak daarna zal de randen van deze regio sterk worden scherpgesteld. Het rooster patroon zal meerdere diffractie-ordes te produceren in het brandpunt van L3: de nulde orde reflectie van de reflecterende backplane van deSLM, de -1 en +1 orders overeenkomt met het rooster, en ook zwakkere hogere orden die ontstaan ​​door verstrooiing van interne componenten specifiek voor de SLM (bijv. Reflecties van de interne bedrading van de SLM pixels en onregelmatigheden pixel randen) . Alles behalve de -1 en +1 bestellingen moeten worden uitgefilterd.
6. Plaats een ruimtelijke masker (SM) gemonteerd in een x, y fase in de lichtbaan van het brandpunt van L3, en vertalen de positie ten opzichte van de optische as, zodat alleen de gewenste eerste opdrachten worden doorgegeven. Direct na het ruimtelijk filter, zal slechts twee cirkelvormige bundels zichtbaar.
   Opmerking: De ruimtelijke masker wordt gefabriceerd door ponsen 6 gaten in aluminiumfolie met behulp van een naald. De gaten groot genoeg zijn om de eerste orde bundels passen voor laser-golflengten. Een gedetailleerde analyse van de ruimtelijke masker wordt gegeven in referentie ^20.
7. Toont de volgende oriëntatie van de uitlijning rooster (60 °, rijklare 2) en opnieuwervoor te zorgen dat alleen de eerste bestellingen worden verhuurd door de ruimtelijke masker, het aanpassen van zijn positie, indien nodig.
8. Herhaal dit voor de uiteindelijke oriëntatie (120 °, rijklare 3).
9. Controleer het beeld van de fluorescerende kraal laag op de camera. Als de twee cirkelvormige bundels elkaar niet overlappen zoals weergegeven in figuur 2 daarna anders het monstervlak door iteratief aanpassen van de objectieflens en camerapositie.
10. Stel het doel positie om de twee bundels die het beeld zal brengen onscherp overlappen. De positie van de camera om het beeld terug in focus en fine-tunen van de doelstelling in het geval brengen twee cirkels zijn nog zichtbaar. Herhaal dit proces tot de twee bundels elkaar overlappen en één cirkelvormig gebied is scherpgesteld.
11. Zodra de positie van het monstervlak is ingesteld, houdt de objectiefpositie gefixeerd.
12. Afbeelding aan TIRF verlichting bevestigen een oplossing van fluorescente kleurstof, bijvoorbeeld bij een excitatiegolflengte 488 nm, gebruik een oplossing van 1081; M rhodamine 6G.
    1. Breng de kleurstof monster in focus. Als de twee bundels incident bij de juiste TIRF hoek dan zullen enkele moleculen zichtbaar zonder hoge achtergrond, en de randen van de cirkelvormige opening zal worden scherpgesteld. Zie figuur 2B-D voor voorbeelden van op elkaar afgestemd en uitgelijnd TIRF balken.
    2. Tonen elke oriëntatie van de windowed roosters op zijn beurt en ervoor te zorgen dat alle drie oriëntaties bieden TIRF verlichting en dat de twee stralen elkaar overlappen op het monster vlak. Fijnafstelling van de positie van de balken kan worden gemaakt door het aanpassen dichroïsche spiegel DM3.
       Noot: Hoewel verschillende golflengten zijn gericht op iets verschillende posities door axiale chromatische aberratie, is niet kritisch en kan worden gecorrigeerd door een constante z-offset naar monsterpositie vóór excitatie met de tweede golflengte.

4. Systeem Synchronisatie en kalibratie

1. Plaats de kraal monolaag svoldoende op de doelstelling en brengt in beeld.
2. Programmeer de SLM met behulp van de besturingssoftware voor elk van de 3 faseverschuiving beelden weer te geven, het eerste patroon richting (0 °).
   1. Met behulp van de SLM control software, schakelt naar Running Orde 4 van het voorbeeld repertoire.
   2. Configureren van de camera met behulp van de acquisitie software (bijvoorbeeld HCImage) om de productie twee signalen: een positieve en een negatieve TTL trigger-signaal tijdens de wereldwijde periode van blootstelling. In de camera software, onder "Advanced Camera Properties", stelt Output Trigger Kind 1 en 2 om "Exposure", en Output Trigger Polariteit 1 en 2 om "positieve" en "negatieve" respectievelijk.
   3. Verbind Output 1 en 2 van de camera naar de "trigger" en "Finish" ingangen van de SLM, respectievelijk, met behulp van coax-kabels. De SLM is nu gesynchroniseerd met de camera.
3. Het verwerven van een reeks van 3 beelden.
   1. In de "Sequence" venster, kies &# 34; Hard Disk Record ', zoals het scantype, en zet de telling frame 3.
   2. Klik op "Start" om 3 frames te verwerven. De SLM patroon verandert bij elke blootstelling. De fluorescerende kralen in het beeld zal verschijnen om aan en uit knipperen tussen elk van de 3 afbeeldingen. Het bedrag van de knipperende is een uitlezing van de modulatie contrast van de sinusvormige verlichting patroon.
4. Draai de polarisatie van de excitatielaser de LCVR met aangepaste software om azimutale polarisatie en derhalve de hoogste modulatie contrast voor het gegeven patroon oriëntatie bereiken.
   1. Laad de LCVR kalibratiesoftware.
   2. Voer 0 en 8 voor respectievelijk de minimale en maximale spanning.
   3. Klik op "Sweep LCVR Voltage" om de polarisatie te draaien.
      Opmerking: De retardantie LCVR is een functie van de temperatuur en kan dag tot dag drift zelfs met temperatuurregeling. In deze stap wordt een optimale azimutale polarisatie empirisch gevonden door Sweeping de aangelegde spanning tussen de minimale en maximale spanning die het effect van rotatie van polarisatie incident op het monster. De modulatie contrast wordt berekend voor elke spanning ²⁵ en de spanning die bereikt piekcontrast wordt gebruikt in de volgende stappen.
   4. Wacht tot de kalibratie is voltooid, en noteer de gemeten spanning.
5. Herhaal dit kalibratieproces voor de overige twee oriëntaties patroon (60 ° en 120 °) en elk van de golflengten.
6. Synchroniseer de belichting met de LCVR, lasers, emissie-filter wiel en piëzo z-fase ^26. Om dit te bereiken, gebruik dan een high speed data-acquisitie (DAQ) board als de master klok bron voor het systeem, en gebruik de SLM LED Enable uitgangssignaal naar de lasers te moduleren (zie figuur 3B).
   Opmerking: De specifieke implementatie is afhankelijk van de gebruikte componenten, maar het gebruik van een hoge snelheid DAQ kaart voor digitale trigger synchronisatie en regeling van de LCVR een analoge spanning via de software, aanbevolen. De controle-software die wordt gebruikt in dit protocol is op aanvraag beschikbaar.
7. Door de axiale chromatische aberratie voor elke golflengte, ook voor az offset naar monstertafel.
   1. Bepaal experimenteel de offset door te focussen op een multicolor parel monolaag monster bij de eerste golflengte (bijv. 488 nm) en vervolgens over te schakelen naar de tweede (bijv. 640 nm). De kralen zal nu worden niet scherp.
   2. Heroriëntatie van de kralen en meet de verandering in de Z-positie die nodig was. Deze offset kan dan telkens de excitatiegolflengte veranderd worden toegevoerd aan de piëzo z-fase.
8. Met de SLM besturingssoftware, schakelt de SLM rijklare volledige reeks 9 binaire raster beelden vereist voor TIRF-SIM. Dit is rijklaar 0 in het voorbeeld repertoire.
9. Met behulp van de camera control software, verwerven 9 afbeeldingen van de kraal monster. In de "Sequence" ruit van de camera software, selecteer "Hard Disk Record" als het type scan, en verander de telling frame 9.
10. Klik op "Start" om beelden te verwerven.
11. Sla de verkregen beelden als TIFF-bestanden door "TIFF" het selecteren van het type afbeelding in het venster "Save gebufferde Images", en klik op OK.

Reconstrueren van een super-resolutie uit het ruwe TIFF-afbeeldingen met behulp van commerciële of aangepaste software voor de verbetering van de resolutie ten opzichte van standaard TIRF valideren.
Opmerking: Voor onze microscoop gebruiken we aangepaste reconstructie code ontwikkeld, zowel in-house en door Dr. Lin Shao ^27.

Representative Results

Multicolor 100 nm diameter fluorescerende bolletjes werden in beeld gebracht aan de norm TIRF vergelijken met TIRF-SIM en kwantificeren van de haalbare verbetering van de laterale resolutie (Figuur 4A - B). Reconstructie van ruwe frames in super-resolutie werd uitgevoerd met standaard algoritmen zoals beschreven in de literatuur ^27,28. Men kan zien dat TIRF-SIM aanzienlijk hogere laterale resolutie is kennelijk opzichte TIRF. De puntspreidingsfunctie (PSF) van een microscoop goed benaderd door de afbeelding van een sub-diffractie gerangschikte fluorescerende kralen derhalve de PSF en de resolutie kan worden gekwantificeerd door het aanbrengen 2D Gaussische functies afzonderlijke kralen voor elke golflengte. De geschatte resolutie van de microscoop op basis van de gemiddelde waarde van de volledige breedte half maximum (FWHM) is 89 nm en 116 nm voor 488 en 640 nm TIRF-SIM respectievelijk (Figuur 4C). Dit komt overeen met een tweevoudige improkenheid in laterale resolutie beide golflengten ten opzichte van de theoretische diffractie beperkte case. Fluorescent gelabelde amyloïde fibrillen ook een uitstekende monsterhoeveelheid tonen verdubbeld resolutie (figuur 4D). Amyloïde fibrillen werden in vitro gevormd door incuberen van β-amyloïde gelabeld met 10% rhodamine derivaat kleurstoffen (488 nm excitatie) gedurende 1 week en vervolgens met beeldvorming TIRF-SIM. Zie referentie ¹² voor meer informatie.

Subcellulaire structuren met een hoog contrast, zoals emGFP gelabeld microtubuli (Figuur 5B, G) of LifeAct-GFP (Figuur 5D) zijn ideaal voor TIRF-SIM beeldvorming en leveren een hoog contrast super-resolutie beelden. TIRF SIM-beeldvorming met de opstelling die in dit protocol maakt waarneming van een subpopulatie van microtubuli in de nabijheid van het basale cel cortex en microtubuli polymerisatie en depolymerisatie kan be gezien in de tijd (Animated figuur 1). Niet alle monsters vatbaar voor beeldvorming met TIRF-SIM, met name lage contrast monsters zonder discrete structuren. Cellen die cytosolische GFP ontberen hoge resolutie gegevens behalve op de randen van het plasmamembraan (Figuur 5F, H en geanimeerde figuur 2) en zijn dus suboptimaal voor TIRF-SIM beeldvorming als de resulterende reconstructies in wezen TIRF beelden bedekt met artefacten. In deze monsters, kan de toename van contrast vaak toegeschreven aan de deconvolutie stap van de reconstructie-algoritme.

Hoge modulatie contrast is essentieel voor een succesvolle SIM beeldvorming. De Fourier-transformatie van het gereconstrueerde beeld maakt visualisatie van de SIM optische overdrachtsfunctie (OTF) (figuur 6A, bijvoegsel). Zonder het maximaliseren van de modulatie contrast voor elke oriëntatie door te zorgen voor azimutale polaireordening met een polarisatiedraaier, er zeer weinig modulatie van de hoge-resolutie-informatie in het monster leidt tot een lage signaal-ruisverhouding in de SIM doorlaatbanden. Reconstructie algoritmen die de standaard Wiener filter aanpak gewoon versterken het lawaai in de SIM doorlaatbanden en de opbrengst van een beeld, dat een standaard afbeelding TIRF bedekt met zeshoekige (of "honingraat") beltoon artefacten (Figuur 6A, rechter paneel) is in wezen. Een mogelijke versterking kan het gebruik van iteratieve ^29,30 of ^31,32 blinde reconstructiealgoritmes om deze artefacten afhankelijk van het type monster verminderen. Wij raden het gebruik van de ImageJ plugin SIMcheck om de kwaliteit van SIM-gegevens te controleren voor en na reconstructie ^33.

Figuur 1:. Lay-out van de Multicolor TIRF-SIM-instelling De TIRF-SIM microscope bestaat uit drie hoofdonderdelen, de balk productie-eenheid, het patroon projectie-eenheid, en de detectie-eenheid. In de bundel-eenheid worden drie verschillende lasers uitgelijnd op dezelfde stralengang via dichroïsche spiegels (DM1 en DM2) en geleid door vier optische elementen voor polarisatieregeling. Eerst werd een polarisator (P) zorgt voor de zuiverheid van de lineaire polarisatietoestand van elk van de laserbundels. De volgende drie optische elementen nodig zijn polarisatie roteren in een snelle, geautomatiseerde wijze zoals beschreven in de tekst. Daarna twee lenzen (L1 en L2) in een telescoop configuratie breiden de straal van het actieve vlak van de ruimtelijke lichtmodulator (SLM) aansluiten en in drie bundeltjes afgebogen door geprojecteerd binair buigingsrooster patroon van de SLM (voorbeelden getoond in tegels 1- 9). De polarisatietoestand van de verlichtende opzichte van de SLM patroon wordt weergegeven als een pijl. Een tweede telescoop (L3 en L4) de-vergroot het patroon en biedt toegang tot the Fourier vlak van de SLM patroon. In dit vlak een ruimtelijk masker (SM) wordt gebruikt voor het uitfilteren van de centrale component en andere ongewenste componenten diffractie van korrelig structuur van de SLM en de interne bedrading. Voordat de twee resterende balken zijn gericht op de achterkant brandvlak van de doelstelling (OB) via de condensor lens (L5), zijn twee dichroïsche spiegels (DM3 en DM4) opgenomen in de setup. DM4 fungeert als een conventionele dichroïsche spiegel in fluorescentie microscopie te scheiden verlichting van emissie licht. Echter, deze spiegel onvermijdelijk induceert ellipticiteit in de polarisatietoestand van het belichtingslicht kan worden gecompenseerd door DM3, een dichroïsche spiegel van idealiter dezelfde partij als DM4. De olie-immersie TIRF objectief heeft een groot genoeg NA twee-counter voortplantende golven op het dekglaasje die volledig tot uiting komen rechtstreeks te starten en aanleiding geven tot een gestructureerd verdwijnende veld in het dekglaasje te geven. Het monster wordt aangebracht op een xyz translatietrap. Opsporing is performed door dezelfde objectieve en DM4 in de transmissie, plus een extra filtering van bandpass emissie filters, gemonteerd in een computer gestuurde filter wiel (EFW). Tot slot wordt het beeld geprojecteerd op een sCMOS camera door de interne microscoop buis lens (L6). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2:. Aanpassing van overlappende Balken (A) Een SLM raspen patroon windowed met een cirkelvormig diafragma is nuttig voor uitlijning. Als twee niet-overlappende bundels zichtbaar op de camera (links), dan is de positie van het monstervlak moet verplaatsen door iteratief aanpassen van de axiale positie van de objektieflens en de camera op een cirkelvormige lichtvlek (rechts) werd verkregen. De balken moeten elkaar overlappen in order de sinusvormige excitatie patroon vereist voor TIRF-SIM produceren. Indien de balken niet volledig overlappen vermindert het gezichtsveld waarover het interferentiepatroon wordt gevormd. (B en C) De exacte hoek van inval van de bundels is belangrijk voor TIRF-SIM. Als de hoek onjuist is, wordt één van de bundels niet op de gewenste hoek voor TIRF en dit is goed zichtbaar afbeelden van een fluorescerende kleurstofoplossing. Een bundel een invalshoek groter dan de kritische hoek die het cirkelvormige spot levert, en de andere niet, hetgeen leidt tot de lange streep links van de afbeelding (B). (D) de hoek van spiegel DM3 aanpassen verzekert beide bundels invallen onder dezelfde hoek, en dit kan worden bevestigd met onscherp doel: indien correct gericht, XZ projectie van een z stapel een fluorescente kleurstof monster moet tonen twee symmetrisch kruisende balken met verwaarloosbare achtergrond bij derichten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3:. Synchronisatie afhankelijkheden van de verschillende systeemcomponenten (A) Voor een snelle SIM overname, synchronisatie van het systeem onderdelen met behulp van een hardware-gebaseerde oplossing is essentieel. (B) Een data-acquisitie board (DAQ) worden gebruikt als een master trekker. Een TTL signaal van de DAQ kaart is bevestigd aan de sCMOS External Input verzonden en gebruikt om de juiste belichting te activeren. De camera Global uitgang Exposure triggers dan is de SLM op een rooster patroon weer te geven, en de SLM LED inschakelen uitgang wordt gebruikt om digitaal moduleren van de laser excitatie zodanig dat de laser alleen uitzendt als de SLM pixels zijn in de "aan" staat. Nadat de belichting is complete, wordt de camera Global uitgang blootstelling gebruikt om het SLM patroon vooruit naar de volgende rooster fase of hoek. Het DAQ kaart voert ook een analoge spanning naar de LCVR controller de lineaire polarisatietoestand van de belichtingsbundel regelen. Deze spanning wordt ingeschakeld na de overname van de 3-fase beelden voor elke hoek van het patroon. Na de overname van 9 beelden voor een enkele golflengte, de DAQ kaart stuurt een signaal naar de emissie-filter wiel controller, en schakelt over naar de volgende golflengte. De DAQ kaart geldt ook a-z offset aan het monster door het uitvoeren van een analoge spanning naar de z-fase piezo controller. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: TIRF-SIM beeldvorming van Test Monsters van 100 nm Multicolor Kralen en Fluorescent Labelled amyloïdefibrillen. (A en B) Vergelijking van standaard TIRF opzichte TIRF SIM-reconstructies van 488 nm en 640 nm excitatie. (C) Histogram van de volledige breedte half maximum (FWHM) van Gauss past op de TIRF-SIM kralen waarin wordt aangegeven welke resolutie verbetering. (D) versus TIRF TIRF-SIM van β-amyloïde fibrillen gelabeld met 10% rhodamine derivaat kleurstof (488 nm excitatie). Schaal bars = 1 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5:. Live cell TIRF SIM-Imaging Vergelijking van conventionele en TIRF TIRF SIM-afbeeldingen (A, B) microtubuli (emGFP-tubuline) in een HEK293-cel, (C, D (E, F) cytosolische GFP in HEK293 cel. Afbeeldingen in B en F zijn enkele tijdstippen uit de films. Boxed gebieden worden weergegeven uitvergroot in (G, H). Schaal bars = 3 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6:. Invloed van polarisatierotator op Gereconstrueerde Bead afbeeldingen (A) zonder het gebruik van een polarisatierotator zoals een LCVR de signaal-ruisverhouding in de SIM doorlaatbanden is laag waardoor kenmerkende hexagonale artefacten in het gereconstrueerde SIM afbeeldingen (rechts), (B) in 2D-SIM, de gestructureerde verlichtingspatronen direct zichtbaar in de Fouriertransformatie van de onbewerkte beelden (links excitatie ruimtelijke frequentie gemarkeerd) deze binnen de straal van de emissie OTF drager vallen echter in TIRF-SIM, zij buiten de OTF steun en daarom niet zichtbaar (rechts). In dit geval moet het patroon modulatie contrast worden beoordeeld aan de hand van een schaars kraal monolaag, zoals beschreven in het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7:. Ruimtelijke lichtmodulator Gebaseerd Patroon Generation Hiermee Implementatie van andere beeldvormende technieken zoals multifocale SIM (A) In MSIM, een rooster van vierkante pointsdisplayed op de SLM (inzet) levert een rooster van diffractie beperkte haarden in het beeldvlak. Een dunne laag van lage concentratie rhodamine 6G is afgebeeld op Visua Lize de brandpunten. Het patroon is vertaald over het monster (B) en de verkregen ruwe beeld z-stack wordt gereconstrueerd om een beeld te genereren met een verminderde out-of-focus licht (C). Schaal bars = 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Animated Figuur 1:. Time Series Movie van EmGFP-tubuline in een HEK293 Cell Rapid polymerisatie en depolymerisatie van emGFP gelabelde microtubules kan worden waargenomen met behulp van TIRF-SIM. Beelden die met behulp van 50 msec belichtingstijd per ruwe frame (450 msec per SIM kader) met een tussenafstand van 0,5 sec. Belichtingstijd gebruikt werd beperkt door de helderheid van de fluorofoor, niet door de snelheid van de camera of SLM. 3988movie1.mov "target =" _ blank "> Klik hier om deze video te bekijken.

Geanimeerde Figuur 2:. Time Series Movie van cytosolische GFP in een HEK293 celmonsters met laag contrast als deze niet ideaal monsters voor TIRF SIM-imaging. Retrograde membraan stroom kan worden gezien in de TIRF beelden maar TIRF-SIM heeft geen bijkomende informatie verschaffen afgezien van de celranden. TIRF-SIM-beelden werden verkregen met behulp van 50 msec belichtingstijd per ruwe frame (450 msec per SIM kader) met een tussenafstand van 5 sec. Klik hier om deze video te bekijken.

Aanvullende Code File: Voorbeeld SLM repertoire file (48449_300us_1-bit_Balanced.seq3).d / 53988 / 48449_300us_1-bit_Balanced.seq3 "> Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code Bestand:. Voorbeeld SLM repertoire file (period9_001.bmp) Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code Bestand:. Voorbeeld SLM repertoire file (period9_002.bmp) Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code Bestand:. Voorbeeld SLM repertoire file (period9_003.bmp) Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code File: Voorbeeld SLM repertoire-bestand (period9_004.bmp). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code Bestand:. Voorbeeld SLM repertoire file (period9_005.bmp) Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code Bestand:. Voorbeeld SLM repertoire file (period9_006.bmp) Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code Bestand:. Voorbeeld SLM repertoire file (period9_007.bmp) Klik hier om dit bestand te downloaden.

Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code Bestand:. Voorbeeld SLM repertoire file (period9_009.bmp) Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code Bestand:. Voorbeeld SLM repertoire file (period9_mask_1.bmp) Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code Bestand:. Voorbeeld SLM repertoire file (period9_mask_2.bmp) Klik hier om dit bestand te downloaden. >

Aanvullende Code Bestand:. Voorbeeld SLM repertoire file (period9_mask_3.bmp) Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code Bestand:. Voorbeeld SLM repertoire file (TIRF-SIM_example.rep) Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code Bestand:. Voorbeeld raspen generatie code (1 of 2) (generate_gratings.m) Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code File: Voorbeeld raspen generatie code (2 van 2) (circular_mask.m).= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53988/circular_mask.m"> Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code Bestand:. Voorbeeld code modulatie contrast (calculate_contrast.m) te berekenen Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Custom-built TIRF-SIM-systemen, zoals de setup die in dit protocol zijn in staat multicolor super-resolutie imaging met hoge snelheid in vergelijking met in de handel verkrijgbare microscopen. De inherente voordelen van SIM als een super-resolutie techniek is dat de temporele resolutie niet wordt beperkt door de fotofysica van de fluorofoor, vergeleken met andere methoden zoals moleculen lokalisatie microscopie (SMLM) of bijzondere scanmethodes zoals gestimuleerde emissie uitputting microscopie ( STED). In tegenstelling tot deze andere technieken, is SIM-kaart niet nodig photoswitchable of onuitputtelijk fluoroforen zo multicolor beeldvorming is eenvoudig. Niet TIRF-SIM systemen, zoals optische snijden SIM en multifocale SIM kan bereiken doorgaans resolutie verbeteringen van 1,7 keer of minder in een feitelijke de factor 2 verbeterd hier vermeld, en commerciële systemen zijn vaak langzamer en minder flexibel dan het systeem in dit protocol.

"> De twee belangrijkste problemen bij de uitvoering van deze techniek zijn enerzijds de noodzaak van nauwkeurige positionering van de zes SIM bundels in de TIR zone achterkant apertuur doel, dat een bewerkelijk en vergt tijd in beslag optische uitlijning procedure. Ten tweede, hoge patroon contrast produceren bij het ​​monster, polarisatie draaiing van essentieel belang is. voor lage NA 2D-SIM-systemen, kan polarisatierotatie worden vermeden door zorgvuldige keuze van de lineaire polarisatie oriëntatie, maar wordt dit onmogelijk voor TIRF-SIM ^25. voor high-speed multicolor beeldvorming, electro- optische polarisatieregeling noodzakelijk is en dit verhoogt de complexiteit en kosten van het systeem.

Beperkingen van de techniek

TIRF-SIM, als conventionele TIRF, is natuurlijk beperkt tot waarneming van biologische structuren en processen bij het basale celmembraan die kunnen worden verlicht door het 150-200 nm penetratiediepte van het verdwijnende veld. TerwijlSIM wordt vaak aangehaald als minder photodamaging cellen dan zowel STED of SMLM gaat laterale resolutie verdubbeling toch het vereiste aantal fotonen met tenminste 4 maal ⁵ in vergelijking met conventionele TIRF microscopie. Voor de beeldvorming bij hoge frame rates met een korte blootstelling keer, deze foton toename vereist het gebruik van een verhoogde verlichting intensiteiten. Hoewel elke fluorofoor kan worden gebruikt voor SIM beeldvorming van bewegende monsters vast of langzaam, hoge helderheid fluorescente proteïnen of volgende generatie synthetische kleurstoffen met verbeterde fotostabiliteit worden aanbevolen voor live cell imaging.

Hoewel deze implementatie kan afbeelden van een enkele kleur op SIM framesnelheden dan 20 Hz is, wordt meerkleurige beeldvorming in de gepresenteerde systeem beperkt door de schakeltijd van de gemotoriseerde emissie filterwiel. Vanwege de grote omvang van de sCMOS camera chip, zou het gebruik van een multiband emissiefilter en het splitsen optica mogelijk zijn en mogelijk gelijktijdig imaging met meerdere golflengtes zonder snelheid boete. Een andere mogelijkheid is de verschillende excitatie lasers afwisselen en gebruik een multiband notch filter om het excitatielicht verwerpen. Het gebruik van een binaire ferroelektrische SLM in deze uitvoering is niet optimaal. De diffractie-efficiëntie van een dergelijke SLM is zeer laag, dus de meeste van het invallende licht is in de nulde orde reflectie die wordt weggefilterd door de ruimtelijke masker. Voor toepassingen die een zeer hoge frame rates, wordt de beeldvorming snelheid dus beperkt door het uitgangsvermogen van de laser diodes. De SLM wordt ook een aantal ellipticiteit in de polarisatie voor golflengten weg van de 550 nm golflengte ontwerp waarbij de pixels niet als ideale halve golf platen te bedienen. Hoewel dit naar zou worden gecompenseerd door een additionele LCVR, kan de ideale oplossing het gebruik van een digitale microspiegel inrichting (DMD) als patroongenerator zijn.

eventuele wijzigingen

De setup preseHier nted is flexibel en eenvoudig worden aangepast dan commerciële instrumenten zodat andere beeldvormingsmodaliteiten zoals 3D-SIM, snelle 2D-SIM, multifocale SIM (MSIM) en niet-lineaire SIM (NL-SIM) kan worden uitgevoerd ^21,34,35.

2D-SIM kan goed geschikt voor het afbeelden van relatief vlak, snel bewegende structuren zoals perifere endoplasmatisch reticulum zijn. De perifere ER dieper ligt dan binnen de cel kan worden verlicht met een TIRF verdwijnende veld maar vanwege de vlakke structuur kan worden afgebeeld met behulp van standaard 2D-SIM met verwaarloosbare out-of-focus achtergrond. Bovendien kan het gebruik van verbeterde optische sectie reconstructiealgoritmes onderdrukken out-of-focus licht breiden het gebruik van 2D-SIM optisch dikke monsters, wanneer zij axiale resolutie verdubbeling is niet vereist ^21.

In MSIM wordt het monster verlicht door een dun rooster excitatie foci ^36. Deze modaliteit kan worden uitgevoerd door eenvoudige verwijdering van de ruimtelijke masker (SM) En vervangen door een polarisator. De SLM heeft nu als een amplitude modulator. De binaire SIM roosters op het SLM kan worden vervangen door een 2D rooster vlekken, de grootte van de gekozen gelijk aan de omvang van een diffractie beperkte focus in het beeldvlak te plaatsen. In figuur 7A wordt een rooster van 4 x 4 pixelvierkanten op het SLM (inzet) die, wanneer demagnified op het monster genereert diffractie beperkte foci van 150 x 150 nm, gezien de fysieke SLM pixelgrootte van 13,62 urn. De excitatie foci vervolgens kan worden door het verschuiven van de rooster patroon op de SLM en dit wordt meerdere malen herhaald om het gehele gezichtsveld te verlichten. Beelden werden per vertaalde patroonpositie en de stapel nabewerkt tot een gereconstrueerd beeld met een betere resolutie van maximaal wijken voor een factor en verminderde out-of-focus licht ten opzichte van het het equivalent groothoek tot30. Deze modaliteit kan nuttig zijn voor het afbeelden van dikke, dichte monsters waarvoor standaard SIM ongeschikt, bijvoorbeeld lage contrast structuren zoals gekleurd rode bloedcellen (figuur 7C), hoewel de acquisitietijd is toegenomen als gevolg van het grote aantal ruwe frames benodigde gezichtsveld (hier N = 168).

Tenslotte kan de opstelling worden aangepast om ofwel hoge NA lineaire TIRF-SIM of gepatroneerde activering niet-lineaire SIM (PA NL-SIM) inschakelen, zoals onlangs door Li et al., Door gebruik van een ultrahoge 1,7 NA doelstelling of aanvulling van een 405 nm laser fotoactivatie en zorgvuldige optimalisering van de SLM raster patronen ^35.

toekomstige toepassingen

SIM is nog steeds een zich snel ontwikkelende techniek en vele toepassingen in de life sciences zullen worden ingeschakeld in de toekomst. De snelheid, resolutie en contrast verbeteringen van de techniek en de mogelijkheid om met behulp van standaard fluoroforen mean dat Bio-imaging, SIM ingesteld op conventionele vele microscoopsystemen, zoals confocale en breedveld platforms vervangen. Commerciële SIM-systemen zijn reeds beschikbaar vandaag de dag met een uitstekende technische specificaties, maar ze zijn buiten het financiële bereik van vele onderzoekslaboratoria, en, heel belangrijk, ze zijn niet flexibel worden aangepast en ontwikkeld om de meest recente ontwikkelingen in het onderzoek op het terrein uit te voeren. Ze missen ook de essentiële mogelijkheid om 'worden aangepast voor het experiment bij de hand', vaak een kritisch knelpunt in cutting edge life science onderzoek. Het hier beschreven systeem zal bijzonder geschikt zijn om dynamische processen te bestuderen nabij het ​​celoppervlak, in vitro gereconstitueerde dubbellaag systemen voor oppervlaktechemie bestuderen in de materialen en natuurkunde, bijv. 2D materialen, en vele andere toepassingen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
488 nm laser	Toptica	iBeam SMART	with digital modulation
561 nm laser	Coherent	OBIS LS	with digital modulation
640 nm laser	Cobolt	MLD	with digital modulation
Long-pass dichroic mirrors	Thorlabs		for combining excitation beams
Quad band dichroic mirror	Chroma	ZT405/488/561/640rpc	3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube
Quad band dichroic mirror	Chroma	ZT405/488/561/640rpc	From same batch as above, 25 x 25 mm
1" square kinematic mount	Edmund Optics	58-860
Glan-Taylor calcite polarizers	Thorlabs	GT5-A	For alignment of LCVR
Glan-Taylor mount	Thorlabs	SM05PM5
Achromatic half wave plate	Thorlabs	AHWP05M-600	400-800 nm
Rotation cage mount	Thorlabs	CRM1/M	For HWP
Liquid Crystal Variable Retarder	Meadowlark Optics	SWIFT	Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm.
LCVR controller	Meadowlark Optics	D3060HV	Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders
Achromatic quarter wave plate	Meadowlark Optics	AQM-100-0545
Rotation cage mount	Thorlabs	CRM1P/M	For QWP
10 mm achromatic doublet	Thorlabs	AC080-010-A-ML	For beam expander
200 mm achromatic doublet	Thorlabs	AC254-200-A-ML	For beam expander
Cage XY Translators	Thorlabs	CXY1
Ferroelectric spatial light modulator	Forth Dimension Displays	M0787-00249	SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1,280 x 1,024 pixels, with driver board
SLM mounting frame	Forth Dimension Displays	M0787-10014	Fixed to custom built aluminium mount
Ø50.8 mm Gimbal Mirror Mount	Thorlabs	GM200/M	For SLM mounting
Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform	Thorlabs	XYR1/M	For SLM mounting
Rail carrier	Newport	M-PRC-3	For SLM mounting
Precision Optical Rail	Newport	PRL-6	For SLM mounting
300 mm achromatic doublet lens	Qioptiq	G322 273 322	f = 300 mm, 31.5 mm diameter
140 mm achromatic doublet lens	Qioptiq	G322 239 322	f = 140 mm, 31.5 mm diameter
Precision XY Translation Mounts	Thorlabs	LM2XY
Lens Mounting Adapters	Thorlabs	SM2AD32	For mounting 31.5 mm lenses in 2" mounts
Translation stages	Comar	12XT65	Dovetail, side drive
XY Translator with Differential Drives	Thorlabs	ST1XY-D/M	for spatial filter
Rotation cage mount	Thorlabs	CRM1/M	for spatial filter
300 mm achromatic doublet	Thorlabs	AC508-300-A-ML	Excitation tube lens
Automated XY stage with Z-piezo top plate	ASI	PZ-2150-XYFT-PZ-IX71	with MS-2000 controller
Inverted microscope frame	Olympus	IX-71
Objective lens	Olympus	UAPON100XOTIRF	100X/1.49NA
High speed filter wheel	Prior Scientific	HF110A	with Prior ProScan III controller
Bandpass emission filters	Semrock	FF01-525/30, FF01-676/29
sCMOS camera	Hamamatsu	ORCA Flash v4.0
Stage top incubator	OKO Lab	H301-K-FRAME	For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers
Stainless steel optical posts	Thorlabs	TR series	for mounting optical components
Post holders	Thorlabs	PH series	for mounting optical components
Kinematic mirror mounts	Thorlabs	KM100	for mounting 1" mirrors
Shearing interferometer	Thorlabs	SI100
100 nm fluorescent microspheres	Life Technologies	T-7279	Tetraspeck
Rhodamine 6G	Sigma Aldrich	83697-250MG
8 well glass bottom dishes	ibidi	80827	with #1.5 coverglass
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass	Thermo Fisher Scientific	155409	with #1.5 coverglass
0.01 mm microscope reticle slide	EMS	68039-22
CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher Scientific	C10613