Introduction
Um die notwendigen Nährstoffe für das Überleben, bösartige Tumore benötigen Zugriff auf das Blut des Patienten Strom zu erhalten. Um diesen Zugang zu erhalten, lassen Sie Tumorzellen chemische Signale, die das Wachstum neuer Blutgefäße in den Tumor stimulieren, so dass die normalen physiologischen Prozess Hijacking bekannt als Angiogenese 2. Es ist auch durch die Blutgefäße durch Angiogenese erzeugt , daß Metastase (dh die Ausbreitung von Krebs auf andere Organe) auftreten. Da der Prozess der Angiogenese mit dem Fortschreiten von einer solchen Vielzahl von Krebsarten so wichtig ist, ist es ein attraktives Ziel in der Krebstherapie Forschung 3.
Ein Verfahren verwendet die Angiogenese zu quantifizieren ist die endothelialen Vorläuferzellen die Fähigkeit zur Messung der Röhren zu bilden, wenn sie auf einer extrazellulären Matrix platziert. Da die Bildung dieser Rohre ist ein kritischer Schritt in der frühen Angiogenese, Testen Umgebungsbedingungen (beispielsweise Vorhandensein oder Fehlen eines gegebenen compound), die stimulieren oder hemmen, Schlauchbildung bietet einen Einblick in spezifische Schritte, die zur Hemmung der Angiogenese ausgerichtet werden können. Die Endothelzellen-Rohr-Assay ist eine der am häufigsten verwendeten 4 in - vitro - Methoden , die die Fähigkeit der Zellen misst Rohre zu bilden. Es ist ein einfacher Test, erfordert relativ wenige Komponenten und eine kurze Kulturdauer 5. Vielleicht am wichtigsten ist jedoch, dass die aus dieser Art von Test gewonnenen Daten quantifizierbar ist.
Ein Beispiel für die Verwendung des Rohrbildungstest beinhaltet die Entwicklung von Rohren aus vaskulären Endothelzellen Vergleich auf der extrazellulären Matrix gegen Wachstumsfaktor reduziert gewachsen (GFR) extrazellulären Matrix. Die extrazelluläre Matrix ist eine Basalmembran-ähnlichen Material isoliert aus Sarkom Zellen und ihre Hauptkomponenten sind Laminin, Typ-IV-Kollagen, Wachstumsfaktoren und Proteoglykane. Einige Verbindungen haben unterschiedliche Auswirkungen auf die Fähigkeit der Zelle Röhren zu bilden, wenn ineine Umgebung mit reduzierter Wachstumsfaktoren und reduziert Heparansulfatproteoglykane (HSPGs). HSPGs sind ein Bestandteil der extrazellulären Matrix, die in der extrazellulären Matrix GFR signifikant reduziert wird. wenn die Hypothese ist, als ein Beispiel, dass die Angiogenese-Inhibitoren, wie SB225002, die blockiert den CXCR2-Rezeptor, eine wesentlich schwächere Fähigkeit der Schlauchbildung zu unterbrechen, wenn HSPGs reichlich vorhanden sind, dann wird ein Vergleich zwischen Rohrbildungsaktivität in der extrazellulären Matrix und GFR extrazelluläre Matrix wichtig, um die Möglichkeit der Angiogenese-Hemmung über die Steuerung von HSPGs zu erkunden.
Andere Assays , die häufig verwendet werden , um die Wirkungen von Verbindungen auf die Angiogenese zu bestimmen , sind in vivo - Methoden. Bemerkenswerte Beispiele hierfür sind die Hühner - Chorioallantoismembran (CAM) -Assay 6 Hühnereiern verwendet und die in vivo Matrigel Plug Angiogenese - Assay unter Verwendung von 7 Mäusen. Während in vivo - Verfahren messen die Angiogenese in three Abmessungen und sind repräsentativ für den menschlichen Körper im Vergleich zu der in vitro - Assay tube formation, leiden sie den Fehler deutlich mehr Zeit erfordert und wesentlich schwieriger durchzuführen. Sowohl der CAM - Assay und die extrazelluläre Plug - Test dauert mindestens eine Woche 8 zu tun, während im Vergleich dazu kann das Rohr Bildungstest in einem einzigen Tag durchgeführt werden und es nicht Tierversuchen erfordern.
Es ist wichtig, dass die Endothelzellen in diesem Bericht sind menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC) verwendet zu beachten. Diese Zellen spielen eine Schlüsselrolle in der vaskulären sprießen und das Wachstum von Blutgefäßen, und sind ausreichend analogen Zellen in Tumoren an Endothelzellen verwendet werden , um zu bewerten anti-angiogene Aktivität in in vitro und in vivo Experimenten 9. Andere Zellen, wie primäre mikrovaskuläre Endothelzellen können auch verwendet werden.
Es ist auch wichtig zu beachten, dass neben niedriger mitEbenen HSPGs hat die GFR extrazelluläre Matrix auch Ebenen vieler Komponenten reduziert, wenn in den normalen extrazellulären Matrix verglichen. Dies umfasst, ist aber nicht beschränkt auf: EGF, IGF-1, PDGF und TGF-beta. Diese Durchführung von Experimenten, die Bedeutung dieser Verbindungen in Bezug auf die Angiogenese zu studieren kann sich mit der extrazellulären Matrix GFR interessiert.
Protocol
1. Zellkultur
- Seed 3x10 5 HUVEC - Zellen in 10 ml vollständigem Wachstumsmedium 10 in einem 75 cm - Kolben.
- Inkubiere Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 bis 70-80% Konfluenz.
2. Tubulibildung Assay
- Auftauen entweder den Wachstumsfaktor reduziert (GFR) extrazelluläre Matrix oder normale extrazelluläre Matrix über Nacht auf Eis bei 4 ° C.
Anmerkung: Aus Gründen der Kürze halber "extrazelluläre Matrix" wird im folgenden verwendet werden, um sowohl GFR und normale extrazelluläre Matrix zu referenzieren. Das Verfahren zu ihrer Herstellung ist identisch. - Halten Sie 96-Well-Kulturplatten auf Eis, und fügen Sie 50 ul gekühltes extrazellulären Matrix pro Vertiefung vorgekühlte Tipps. Bereiten dreifach von 5 Vertiefungen nur die normale extrazelluläre Matrix enthält. Bereiten andere dreifach von 5 Vertiefungen nur GFR extrazellulären Matrix enthält.
- Inkubiere die Platte mit 96 Vertiefungen bei 37 ° C für 30 min.
- Waschen Sie die HUVECseinmal mit Phosphat-gepufferter Lösung ohne Calcium und Magnesium (PBS) und 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA. Inkubieren Sie die Schale bei 37 ° C für 1-5 min, um die Zellen in jeder Minute überprüft, bis die meisten Zellen abrunden. Vertreiben Sie die Zellen, indem der Kolben einmal tippen.
- 5 ml Basalmedium (dh endothelialen Zellwachstumsmedium , ohne etwas (zB Nahrungsergänzungsmittel) hinzugefügt) mit 1% fötalem Rinderserum (FBS). Sammeln Sie die Zellen in dem Kolben durch Pipettieren und Transfer in ein 15-ml-Tube. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 xg für 5 min und den Überstand verwerfen.
- Re-suspend mit 2 ml Basismedium, zählen die Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers, und stellen Sie die Zellkonzentration auf 2-3 x 10 5 Zellen / ml.
- Herstellung von 100 & mgr; l der folgenden Konzentrationen von 10x CXCR2 Inhibitor SB225002 in Basalmedium: 11 uM, 5,6 uM, 1,1 uM, 0,56 uM und 0 & mgr; M (Kontrolle).
- Pipettieren von 300 ul der HUVEC Suspension in jede 5 microcentrifuge Rohre. In 33 ul der Inhibitorkonzentrationen (11 & mgr; M, 5,6 uM, 1,1 uM, 0,56 uM und 0 & mgr; M) in ein Rohr jeweils die HUVECs und Wirbel enthält.
- Pipettieren von 50 & mgr; l von jeder der Zellsuspensionen (1-1,5 x 10 & sup4 ; Zellen) in die einzelnen Vertiefungen der extrazellulären Matrix. Schild Jede Suspension in dreifacher Ausfertigung und Inkubation für 4-16 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Nach 4-16 h, nehmen 4 Bilder der Rohre pro Vertiefung mit einem inversen Mikroskop - Kamera 11 gebildet (Originalvergrößerung x 100).
3. Tubulus Disruption Assay
- Bereiten Sie die extrazelluläre Matrix und die Platten nach den gleichen Spezifikationen wie das Rohr Formation Assay (Schritte 2.1 bis 2.3).
- Vorbereitung HUVEC Suspension wie in den Schritten 2.4- 2.4.2 des Schlauchbildung Assay und Aliquot in eine 96-Well-Platte für die extrazelluläre Matrix bei 50 & mgr; l pro Vertiefung enthält.
Hinweis: Platte genug Brunnen so dass es 3 Vertiefungen pro medikamentöse Behandlung. - Wachsen Zellen an extrazelluläre Matrix für 4 h bei 37 ° C, 5% CO 2. Nehmen Sie Bilder vor dem Beginn der medikamentösen Behandlung.
- Bereiten Sie 2x Konzentrationen des CXCR2-Inhibitor SB225002, wie in Schritt 2.5 des Rohrbildungstest beschrieben, und 50 ul jeder Konzentration pro Vertiefung der 96-Well-Platte, die HUVECs enthält. Platte mit jeder Konzentration in dreifacher Ausfertigung.
- Inkubiere die Platte für eine weitere 2-12 h bei 37 ° C, 5% CO 2. Nehmen 4 Bilder der Rohre in jeder gebildeten auch ein umgekehrtes Mikroskop - Kamera (Originalvergrößerung × 100) 11 verwendet wird .
4. quantifizierende Angaben
- Auswerten durch Messung in den Bildern erfasst die Gesamtrohrlänge von Röhren in vier zufällige mikroskopische Felder Tubusbildung die Mikroskop-Kamera-Software.
- Öffnen Sie das Bild in der Mikroskop-Kamera-Software, und klicken Sie auf "Anmerkungen und Messungen9 ;. Unter der "Länge" Abschnitt, wählen Sie die "einfache Linie" Werkzeug. Klicken Sie auf das Bild, dann ziehen Sie eine Linie entlang der Länge des Rohres, dann rechts klicken.
Hinweis: Die Software wird automatisch die Länge der Linie in Pixel zu berechnen und die Daten in eine Datei geschrieben. - Wiederholen Sie den Vorgang für alle U-Bahnlinien in dem Bild, das durch die "einfache Linie" Werkzeug auswählen. Klicken Sie auf das Bild, dann ziehen Sie eine Linie entlang der Länge des Rohres, dann rechts klicken.
Hinweis: Die Software wird die Länge jeder Zeile aufzuzeichnen und die Daten auf dem Bildschirm anzuzeigen. - jedes Rohr in das Bild nach der Messung klicken Sie auf "Exportieren", entschied sich dann 'Länge in eine Tabelle'.
Anmerkung: Die Länge Daten werden in ein Tabellenkalkulations exportiert werden. - Fügen Sie alle die Rohrlängen aus der Tabelle die Gesamtrohrlänge zu erhalten. Berechnen und die durchschnittliche Länge der Rohre aufzunehmen.
Hinweis: Vier Replikate werden empfohlen mit Mittelwert und Standardabweichung bestimmt.
5. Wiederherstellen von Zellen aus der extrazellulären Matrix Kultur
- Kultur und führen Sie eine Rohrbildungstest in einem größeren Maßstab als 96-Well-Platte wird nicht ausreichen, Zellzahl ergeben (siehe Abschnitt 2). Für 12 - Well - Platten, verwenden Sie 500 ul extrazellulären Matrix und 500 ul der HUVEC Zellsuspension (1,5x10 5 Zellen).
- Inkubieren Sie die Zellen für 4-16 h, um Rohre zu bilden. Dann absaugen Zellkulturmedium. Spülen Sie die Zellen mit 1 ml kaltem 1x PBS ohne Calcium und Magnesium.
- 1 ml eiskaltem PBS-2,5 mM EDTA-Puffer auf die Kultur und halten auf Eis für 10 min.
- Vertreiben Sie die Zellen und extrazelluläre Matrix-Gemisch aus der Schale einer 1000 ul Pipettenspitze mit Spitze abgeschnitten, und dann übertragen auf eine kalte 15-ml-Röhrchen, waschen Sie die gut mit 4 ml eiskaltem PBS-2,5 mM EDTA und in das Rohr stecken .
- Setzen Sie die Röhrchen auf Eis für 1-4 Stunden und wird das Röhrchen einige Male, bis die gesamte extrazelluläreMatrix gelöst ist.
- Zentrifuge für 10 min bei 1.620 × g bei 0 ° C
- Re-suspend der Zellpellets mit 1 ml kaltem PBS zu einem 1.ml Röhrchen auf Eis.
- bei 3000 × g bei 0 ° C, darüber zu verfügen, dann der Überstand für 5 min erneut zentrifugiert.
- Lagern Sie die Zellen in -80 ° C.
Representative Results
Erhebliche, gesunde Bildung endothelialer Gefäße leicht zu gehemmten Schlauchbildung in den Mikroskopiebildern gegenübergestellt werden. Gesunde tube formation erscheint als organisierte Bahn der Kapillar-ähnlichen Strukturen (Abbildung 1). Im Vergleich dazu zeigt sich gehemmt tube formation als Streu Zellen (Abbildung 2). Rohrbildungstest Daten werden durch die Messung der Gesamtrohrlänge von Kapillarröhrchen (Tabelle 1) quantifiziert. Neben Gesamtrohrlänge die durchschnittliche Rohrlänge, Gesamtzahl der Röhren oder Gesamtzahl der Verzweigungspunkte gemessen werden. Strukturierte Röhrenbildung wird eine größere Netto-Rohrlänge als Streu gehemmt Schlauchwachstum. In 3 ermöglicht eine Dosiswirkungskurve Berechnung der IC 50 unter den Versuchsbedingungen von HUVECs auf GFR extrazellulären Matrix und einem CXCR2 Inhibitor SB225002.
Abbildung 1. Endothelial t ube Bildung auf der extrazellulären Matrix und Wachstumsfaktor-reduziert (GFR) extrazellulären Matrix. Zwei Bilder zeigen erfolgreiche tube formation auf der extrazellulären Matrix (A) und GFR extrazellulären Matrix (B). Die miteinander verbundenen Netzwerk von Rohren zeigt deutlich, daß das Wachstum von Rohren in dieser HUVECs gesund ist. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Die Hemmung der Schlauchbildung auf extra- und Wachstumsfaktor reduziert (GFR) extrazellulären Matrix durch einen CXCR2 - Inhibitor SB225002 (5,6 uM). Zwei Bilder zeigen RöhreFormation, die von einem CXCR2 Inhibitor SB225002 (5,6 uM) auf der extrazellulären Matrix (A) und GFR extrazellulären Matrix (B) gehemmt wurde. Die isolierten Klumpen von HUVEC-Zellen in diesem Bild zeigen, ersichtlich, dass die Zellen waren nicht in der Lage, die Rohre zu bilden, notwendig, miteinander zu verbinden. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Dosis - Wirkungskurve auf Wachstumsfaktor-reduziert (GFR) extrazellulären Matrix. Die X-Achse zeigt die Rohrlänge und die Y-Achse zeigt die Konzentration eines Inhibitors CXCR2. Die Dosis-Wirkungs-Kurve zeigt, dass die HUVEC Reaktion auf den CXCR2-Inhibitors auf GFR extrazellulären Matrix ist dosisabhängig. Der IC 50 ( die Hälfte der maximalen Inhibitory Konzentration) wurde unter Verwendung von Software - 13 berechnet und kann mit einer Dosis - Wirkungs - Kurve für die extrazelluläre Matrix, beispielsweise verglichen werden. IC 50 ist die Konzentration des Inhibitors, die die Antwort auf 50% abnimmt. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung.
| Growth Factor Ermäßigt (GFR) der extrazellulären Matrix und Inhibitor (4 Replikaten) | Gesamtrohrlänge Durchschnitt (Pixel) (1 Pixel = 0,34 & mgr; m) | Standardabweichung | P - Wert |
| GFR extrazelluläre Matrix Kontrolle | 2447 | 168,174 | |
| GFR extrazelluläre Matrix + 0,56 uM SB225002 | 1.422,5 | 185.4218 | 0.000395 |
| GFR extrazelluläre Matrix + 1,1 uM SB225002 | 1004 | 126.1784 | 2,14 x 10 -5 |
| GFR extrazelluläre Matrix + 5,6 uM SB225002 | 519,25 | 129.6368 | 4,19 x 10 -6 |
| GFR extrazelluläre Matrix + 11 & mgr; M SB225002 | 393,75 | 212.6857 | 1,21 x 10 -5 |
Aufgewachsen auf GFR extrazellulären Matrix mit variierenden Konzentrationen an CXCR2 - Inhibitor Tabelle 1 Quantifizieren Gesamtrohrlängen auf Wachstumsfaktor reduziert (GFR) extrazelluläre Matrix unter variierenden Bedingungen. Ein Teil einer Tabelle unter Verwendung von Gesamtlängen Rohr in Proben aufgezeichnet. Die Daten zeigen, daß der Inhibitor CXCR2 tut Röhrenbildung hemmen. Eingeschlossen sind damit verbundenen Werte wie Durchschnitt von vier Wiederholungen, Standardabweichung, und P - Wert. gemessen in Pixel zu zeigendie Daten, die exportiert werden. IC 50 kann mit Hilfe statistischer Software 13 berechnet werden. (1 Pixel = 0,34 & mgr; m)
Discussion
Bei dieser Assay-Durchführung ist es wesentlich, die extrazelluläre Matrix auf Eis zu halten oder bei 4 ° C zu jeder Zeit, wenn nicht anders angegeben. Wenn der extrazellulären Matrix erlaubt über 4 ° C zu erwärmen, wird es zu polymerisieren, und der Test wird ruiniert. Es ist auch wichtig , dass irgendetwas zu gewährleisten , die in Kontakt kommt (beispielsweise Pipettenspitzen, die Platte) mit der extrazellulären Matrix ist für die oben erwähnte Grund vorgekühlten. Die Anzahl der in jeder Vertiefung ausgesäten Zellen ist kritisch, zu wenige Zellen die erwartete Bahn in der Kontrollprobe nicht geben, zu viele Zellen werden große Zellcluster oder eine Monoschicht bilden, und der Test nicht gültig. Ein weiterer wichtiger Faktor für den Erfolg dieses Assays ist die Zellpassage Nummer der HUVECs. Die Passage-Nummer sollte immer niedriger sein als zehn, sonst robuste Schlauchbildung kann nicht auftreten. Darüber hinaus sollte man sicherstellen, dass das Zellkulturmedium verwendet wird, nicht abgelaufen ist, oder die Zellen nicht lebensfähig sein. Alternathungsweise kann man das Medium und seine Komponenten Aliquotierung und sie bei -20 ° C lagern für einen bestimmten Zeitraum nach dem Ablaufdatum zu erhalten. Natürlich ist es noch bevorzugt, das Medium zu dem Ablaufdatum vor dem Gebrauch
Wie alle Verfahren, gibt es einige Nachteile, die endothelial Küvettenrohr Bildungstest durch. Ein großes Problem ist, dass, da es verschiedene Arten von Endothelzellen und Trägermatrizen, die Ergebnisse des Assays variieren stark in Abhängigkeit von der Art der Zelle und Matrix verwendet wird. Die Endothelzellen verwendet (HUVECs, HAECs oder HMVECs) sind primäre Zellen, sie sind teuer in der Variabilität erhalten und haben im Vergleich zu immortalisierten Zellen. Die primären Zellen haben begrenzte Passagen für den Einsatz, und eignen sich daher nicht für langfristige Angiogenese Experimente 14. Für die zuverlässige Daten, sollte man immer die gleichen Typen für den Test verwenden. Wie auch bei anderen in - vitro - Assays sollten die Ergebnisse eines Rohrbildungstest sein conbestätigt in vivo, da die Ergebnisse von den gesteuerten und künstlichen Bedingungen von zweidimensionalen Gewebekultur nicht immer in der komplexen Biosystem eines lebenden Organismus reflektiert werden kann. Es ist auch wichtig, im Auge zu behalten, dass diese Art von Test kann nur verwendet werden, Endothelzellen Röhrenbildung zu demonstrieren, und sollte nicht verwendet werden andere, nicht-endothelialen, Rohr bildenden Zellen zu testen.
Dieser Test ist eine ziemlich einfache und schnelle Methode angiogenen Potenzial einer Verbindung zu quantifizieren. Es bildet auch eine Plattform für weitere Experimente, wie allein, spielt es keine Informationen über die spezifischen Mechanismus ergeben, durch die die Verbindung tatsächlich das Gefäß Umformprozess beeinflusst. Allerdings ist die Verwendung von verschiedenen extrazelluläre Matrix ein Beispiel dafür, wie man weiter einen Rahmen für die Forschungsfragen schaffen, die nicht häufig verwendet wird. Es gibt Ansätze, um die spezifischen biochemischen Mechanismen der Verbindung mit spezifischen Inhibitoren zu untersuchen, die Komponenten Zieldie Angiogenese Weg. Ein weiterer Ansatz kann sein , um RNA aus den Endothelzellen extrahieren und RT-PCR (Real Time PCR) 12 Änderungen der Genexpression zu analysieren , die das Wachstumsverhalten in dem Test beobachtet verursachen. Zukünftige Anwendungen dieses Verfahrens umfassen HUVECs transfiziert zu schaffen knock-down-Assays für bestimmte Schritte des Angiogenese-Weg. Es gibt Potenzial, diesen Ansatz anzuwenden, um die Lymphangiogenese Weg zu studieren. Durch Veränderung der extrazellulären Matrixkomponenten, die Wechselwirkung der Matrix und zellulären Prozess der Angiogenese bei Krebs unterstützen kann weiter erläutert. Die Extraktion von RNA und Proteine aus Endothelzellen unter diesen besonderen Bedingungen stellen zusätzliche quantifizierbare Daten entsprechenden Daten an die Abbildung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 ) | Fisher | NC9525043 | HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin. Aliquot the medium and its components and store them at -20 °C, warm in 37 °C before use. |
| MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10 ml; LDEV-Free | Fisher | CB-40230 | Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in -20 °C, warm in 4 °C before use. |
| MATRIGEL MATRIX 10ML; 10 ml; LDEV-Free | Fisher | CB-40234 | extracellular matrix, keep in -20 °C, warm in 4 °C before use. |
| SB225002 | Fisher | 559405 | CXCR2 inhibitor, keep in -20 °C, warm in room temperature before use. |
| Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ScienCell Research Laboratories | 8000 | culture it according reference 10. |
| Trypsin 0.05%-EDTA phenol red | Invitrogen | 25300-054 | keep in 4 °C, warm in 37 °C before use. |
| Nikon ECLIPSE Ti | Nikon | Inverted Research Microscope. | |
| NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit | Nikon | Inverted Research Microscope software | |
| Graph-pad Prism 5 | GraphPad Software, Inc. | scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50. |
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