Introduction
hayatta kalmak için besin gerekli elde etmek için, habis tümörler hastanın kan akışına erişim gerektirir. Bu erişim elde etmek için, tümör hücreleri böylece anjiyogenez 2 olarak bilinen normal fizyolojik süreç kaçırma, tümörün yeni kan damarlarının büyümesini teşvik kimyasal sinyalleri bırakın. Bu metastazı (yani, diğer organlara kanser yayılması) oluşabilir anjiyogenez ile oluşturulan kan damarları aracılığıyla da. Anjiyogenez süreci, kanser gibi çeşitli ilerlemesi için çok önemli olduğu için, anti-kanser terapisi araştırmaları 3 çekici bir hedeftir.
anjiyojenezi ölçmek için kullanılan bir yöntem, hücre dışı bir matris üzerine yerleştirildiğinde tüpler oluşturmak üzere endotelyal progenitör hücre yeteneğini ölçmektir. Bu tüplerin oluşumu çevre koşullarına (belirli bir co örneğin, varlığı ya da eksikliği test anjiyogenez kritik bir erken adımdır, çünkümpound) teşvik veya inhibe edebilir tüp oluşumu anjiogenezisi inhibe hedeflenebilir belirli adımlar içgörü sağlar. Endotel hücre tüp oluşumu tahlil tüpleri oluşturmak üzere hücrelerin yeteneğini ölçen en yaygın olarak kullanılan 4, in vitro yöntemlerden biridir. Nispeten az sayıda bileşen ve kısa bir kültür dönemi 5 gerektiren basit bir tahlilidir. Belki de en önemlisi, tahlil bu tür elde edilen veriler ölçülebilir olmasıdır.
tüp formasyonu deneyi kullanımı için bir örnek, indirgenmiş gelişme faktörü (GFR) hücre dışı matrisin genel hücre dışı matrisin üzerinde büyümüş vasküler endotel hücrelerinden tüplerin gelişmesini karşılaştırılmaktadır. laminin, tip IV kolajen, büyüme faktörleri ve proteoglikanlar hücre dışı matris sarkoma hücreleri ve ana bileşenlerinin izole edilen bir bazal membran-benzeri malzeme olduğu bulunmaktadır. Bazı bileşikler, tüpler oluşturmak için hücre yeteneği üzerinde farklı etkileriAzaltılmış büyüme faktörleri ve düşük heparan sülfat proteoglikan (HSPGs) ile bir ortam. HSPGs anlamlı GFR hücre dışı matris içinde azalır hücre dışı matrisin bir bileşenidir. Bir örnek olarak, hipotez bu HSPGs bol tüp oluşumunu durdurmak için önemli ölçüde daha zayıf yeteneğine sahip blok CXCR2 reseptörü SB225002 gibi anjiyojenez inhibitörleri, daha sonra hücre dışı matris ve GFR, hücre dışı matris içinde tüp oluşumu aktivitesi arasında bir karşılaştırma bu ise, HSPGs kontrolü yoluyla anjiyogenez inhibisyonu olasılığını keşfetmek önemlidir.
Genel olarak angiogenesis üzerinde bileşiklerin etkisini belirlemek için kullanılan diğer deneyler, in vivo yöntemlerde bulunmaktadır. Bu kayda değer örnekleri tavuk yumurtası kullanılarak civciv koriyoallantoik membran (CAM) deneyi 6, ve in vivo Matrigel fareler kullanılarak anjiyogenez tahlil 7 takın. In vivo yöntemler t anjiyogenez ölçmek ikenHREE boyutları ve in vitro olarak tüp formasyonu deneyi ile karşılaştırıldığında, insan vücudunun fazla temsilcisi, önemli ölçüde daha fazla zaman gerektiren kusur acı ve önemli ölçüde daha fazlasını gerçekleştirmek zordur. CAM tahlil ve hücre dışı fiş tahlil Hem karşılaştırıldığında, tüp oluşumu tahlil tek bir gün içinde yapılabilir iken, yapmak için en az bir hafta 8 almak ve hayvan kullanımını gerektirmez.
Raporda kullanılan endotelyal hücreleri, insan göbek damarı endotelial hücreleri (HUVEC) olduğuna dikkat etmek önemlidir. Bu hücreler, vasküler filiz ve kan damarlarının büyümesi önemli bir rol oynar, ve yeterince in vitro ve in vivo deneylerde 9 anti-anjiyojenez etkinliğini değerlendirmek için kullanılan kanserlerinde endotel hücrelerine benzer şekilde yapılır. primer mikrovasküler endotel hücreleri gibi diğer hücreler de kullanılabilir.
Alt taşımasının yanısıra dikkat etmek de önemlidirNormal hücre dışı matris ile karşılaştırıldığında HSPGs düzeyleri de GFR hücre dışı matris bir çok bileşenlerinin seviyelerinin azalttı. Dahil, ancak bunlarla sınırlı değildir: EGF, IGF-1, PDGF ve TGF-beta. anjiyogenez ile ilgili bu bileşiklerin önemini okuyan performans deneyleri GFH hücre dışı matriks kullanarak ilginizi çekebilir.
Protocol
1. Hücre Kültürü
- Tohum 3x10 75 cm bir şişe içinde, tam büyüme ortamında 10 10 ml 5 HUVEC hücreleri.
- 70-80% konfluansa CO2,% 5 37 ° C'de inkübe hücreleri.
2. borucuk oluşumu Deneyi
- 4 ° C 'de bir gece boyunca buz üzerinde büyüme faktörü azaltılmış (GFR) hücre dışı matrisi veya normal hücre dışı matrisi ya da çözülme.
Not: 'ekstraselüler matriks' kısalık uğruna bundan sonra GFR ve normal hücre dışı matriks hem başvurmak için kullanılır. bunları hazırlamak için proses ile aynıdır. - Buz üzerinde 96 oyuklu kültür plakaları tutmak ve de önceden soğutulmuş ipuçlarını kullanılarak göz başına soğutulmuş hücre dışı matrisin 50 ul ekle. Yalnızca normal hücre dışı matriks içeren 5 kuyu üç kopya hazırlayın. Sadece GFR hücre dışı matriks içeren 5 kuyu başka üç nüsha hazırlayınız.
- 30 dakika boyunca 37 ° C'de 96 oyuklu plaka inkübe edin.
- HUVECler yıkayınbir kez fosfat tamponlu kalsiyum ve magnezyum (PBS) olmadan çözelti ve 1 ml% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. En Hücreler kadar yuvarlak kadar hücreleri her dakika kontrol 1-5 dakika süreyle 37 ° C'de çanak inkübe edin. bir kez balon dokunarak hücreleri çıkarmak.
- 5 ml bazal ortamı ekleme% 1 Fötal Sığır Serumu (FBS) ile (herhangi bir şey, yani endotelyal hücre büyüme ortamı (örneğin, ek) ilave edildi). pipetleme şişede hücreleri toplamak ve 15 ml'lik bir tüpe transfer. 5 dakika boyunca 200 xg'de hücreleri Santrifüj ve supernatant atın.
- 2 ml bazal ortam ile yeniden askıya hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve 2-3 x 10 5 hücre / ml hücre yoğunluğu ayarlanır.
- bazal ortamda CXCR2 önleyicisi SB225002 aşağıdaki 10x konsantrasyonlarda 100 ul hazırlanması: 11 uM, 5.6 uM, 1.1 uM, 0.56 uM ve 0 uM (kontrol).
- Her 5 MICR içine HUVEC süspansiyon 300 ul pipetocentrifuge borular. inhibitör konsantrasyonu 33 ul ekle (11 uM, 5.6 uM, 1.1 uM, 0.56 uM ve 0 uM), bir tüp içine HUVECler ve vorteks içeren.
- Pipet hücre dışı matrisin ayrı ayrı gözlere hücre süspansiyonları (1-1.5 x 10 4 hücreleri) her birinin 50 ul. Üç kez, her süspansiyon plaka ve 37 ° C'de,% 5 CO2 seviyesinde 4-16 saat süreyle inkübe edin.
- 4-16 saat sonra, iyi bir ters mikroskop kamera 11 (orijinal büyütme x 100) ile başına oluşan tüplerin 4 fotoğraf çekmek.
3. tübül bozulması Testi
- Tüp Oluşumu Testi (2.3 2.1 adımları) ile aynı özelliklere göre hücre dışı matriks ve tabak hazırlayın.
- 'Deki gibi 2.4- tüp formasyonu deneyi ve kısım 2.4.2 hücre dışı matris içeren bir 96-çukurlu plaka içinde göz başına 50 ul olmak HUVEC süspansiyonu hazırlanır.
Not: Yeterince kuyu s PlakalıBu o ilaç tedavisine başına 3 kuyu vardır. - 37 ° C'de 4 saat hücre dışı matris üzerinde hücreler büyümek,% 5 CO2. İlaç tedavisine başlanmadan önce görüntüleri çekin.
- Tüp formasyonu deneyi Aşama 2.5 de tarif edildiği gibi CXCR2 önleyicisi SB225002 2x konsantrasyonları hazırlamak ve HUVECler içeren 96 çukurlu bir levhanın her çukuruna Her konsantrasyondan 50 ul ekle. üç nüsha halinde her konsantrasyon Plate.
- 37 ° C'de bir 2-12 saat boyunca inkübasyona bırakılır,% 5 CO2. Iyi 11 (100 × orijinal büyütme) ters bir mikroskop kamera kullanarak her birinde oluşan tüplerin 4 fotoğraf çekmek.
4. ükler Verileri
- mikroskop kamera yazılımı kullanarak dört rastgele mikroskobik alanlarda boruların toplam boru uzunluğu ölçülerek görüntülerde yakalanan tüp oluşumunu değerlendirin.
- mikroskop kamera yazılımı görüntüyü açın ve 'Annotations ve Ölçümleri tıklayın9 ;. 'Uzunluk' bölümü altında, 'basit çizgi' aracını seçin. daha sonra sağ tıklayın, tüpün uzunluğu boyunca bir çizgi çizin, resmin üzerine tıklayın.
Not: Yazılım otomatik piksel hattının uzunluğunu hesaplamak ve bir dosyaya veri koyacağız. - 'Basit çizgi' aracını seçerek görüntüdeki tüm boru hatları için aynı işlemi tekrarlayın. daha sonra sağ tıklayın, tüpün uzunluğu boyunca bir çizgi çizin, resmin üzerine tıklayın.
Not: Yazılımın her satırın uzunluğunu kaydetmek ve ekranda verileri görüntüler. - Resimde her tüp ölçüldükten sonra, daha sonra, 'Export' tık 'e-tabloya Uzunluğu' seçti.
Not: uzunluk verileri bir elektronik tablo ihraç edilecek. - Toplam tüp uzunluğunu almak için e-tablodan boru uzunlukları tüm ekleyin. Hesaplayın ve tüplerin ortalama uzunluğu kaydedin.
Not: Dört çoğaltır ortalama ve belirlenen standart sapma ile tavsiye edilir.
Ekstrasellüler Matriks Kültür 5. kurtarma hücreler
- Kültür ve bir tüp formasyonu deneyi gerçekleştirmek yeterli hücre sayısını vermez, 96 gözlü bir levha olarak daha büyük bir ölçekte (bakınız bölüm 2). 12 gözlü levhalar için, hücre dışı matrisin 500 ul ve HUVEC hücre süspansiyonu 500 ul (1.5x10 5 hücreleri) kullanın.
- tüpler oluşturmak üzere 4-16 saat boyunca inkübe hücreleri. Daha sonra, hücre kültür ortamı aspire. kalsiyum ve magnezyum içermeyen soğuk 1 x PBS, 1 ml hücre durulayın.
- Kültür üzerine soğuk PBS-2.5 mM EDTA tampon 1 ml ilave edilir ve 10 dakika boyunca buz üzerinde tutulur.
- yıkama, ucu kesilmiş bir 1000 ul pipet kullanarak çanak hücreleri ve hücre dışı matris karışımı yerinden çıkarır ve daha sonra soğuk bir 15 ml tüp transferi de 4 ml buz gibi soğuk PBS-2.5 mM EDTA ve tüp içine yerleştirilmiş .
- 1-4 saat boyunca buz üzerinde tüpler koyun ve hücre dışı her kadar tüpü birkaç kez ters çevirinMatris çözündürülür.
- 0 ° C'de 1.620 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj
- Buz üzerinde bir 1.ml tüpüne 1 ml soğuk PBS ile hücre pelletleri yeniden askıya.
- Yine 0 ° C'de 3,000 x g'de 5 dakika boyunca, daha sonra üstte kalan sıvı kısmın bertaraf santrifüjlenir.
- -80 ° C hücreleri saklayın.
Representative Results
Önemli, sağlıklı endotel tüp oluşumu kolayca mikroskopi görüntüleri inhibe tüp oluşumuna tezat olabilir. Sağlıklı tüp oluşumu kılcal geçiş benzeri yapılar (Şekil 1) bir organize ağ gibi görünür. Buna karşılık, inhibe tüp oluşumu dağınık hücreleri (Şekil 2) olarak tezahür eder. Tüp formasyonu deneyi verileri kılcal tüpler (Tablo 1) toplam tüp uzunluğunu ölçerek belirlenir. Toplam boru uzunluğunun dışında, branş noktası ortalama boru uzunluğu, tüplerin sayısı veya toplam sayısı ölçülebilir. Yapılandırılmış tüp oluşumu dağınık inhibe tüp büyüme daha fazla net tüp uzunluğunu verir. Şekil 3'te, bir doz yanıt eğrisi GFR hücre dışı matrisin bir CXCR2 inhibitörü SB225002 ilgili HUVEC'lerin deney koşulları altında IC50 hesaplanmasını mümkün kılar.
Ekstrasellüler matriks ve büyüme faktörü-azaltılmış (GFH) ekstraselüler matriks Şekil 1. Endotelyal t ube oluşumu. İki görüntü ekstrasellüler matriks (A) ve GFR ekstrasellüler matriks (B) başarılı tüp oluşumunu göstermektedir. tüpler ağından açık borular büyümesi bu HUVEC sağlıklı olduğunu göstermektedir. Ölçek çubuğu = 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Faktörün indirgenmiş (GDH) CXCR2 önleyicisi SB225002 (5.6 uM) ile hücre dışı matris hücre dışı büyüme. Tüp oluşumu Şekil 2. önlemesi, iki resim tüpü göstermektedirhücre-dışı matrisi (A) ve GFR hücre dışı matrisin (B) üzerindeki bir CXCR2 önleyicisi SB225002 (5.6 uM) ile inhibe edilmiştir oluşumu. Bu görüntü gösterisinde görülen HUVEC hücrelerinin izole kümeleri hücreleri birbirine bağlamak için gerekli tüpler oluşturmak mümkün değildi. Ölçek çubuğu = 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Büyüme faktörü indirgenmiş (GFR) hücre dışı matrisin Şekil 3. Doz-yanıt eğrisi. X-ekseni boru uzunluğunu ve Y-ekseni bir CXCR2 inhibitörü konsantrasyonunu göstermektedir. Doz-yanıt eğrisi GFR hücre dışı matris üzerinde CXCR2 inhibitörüne HUVEC yanıtı doza bağlı olduğunu göstermektedir. IC50 (yarı-maksimum engelleyiciY konsantrasyon), örneğin, yazılım 13 ile ve hücre dışı matris için bir doz-yanıt eğrisi ile mukayese edilebilir hesaplanmıştır. IC50% 50 yanıt azaltır inhibitör konsantrasyonudur. Hata çubukları, standart sapmayı temsil ederler.
| Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFH) ekstraselüler matriks ve inhibitör (4 adet çoğaltır) | Toplam Tüp Uzunluğu Ortalama (piksel) (1 piksel = 0.34 um) | Standart sapma | P Değeri |
| GFR hücre dışı matris kontrolü | 2447 | 168,174 | |
| GFR hücre dışı matris + 0.56 uM SB225002 | 1422,5 | 185.4218 | 0.000395 |
| GFR hücre dışı matris + 1.1 uM SB225002 | 1004 | 126.1784 | 2.14 x 10 -5 |
| GFR hücre dışı matris + 5.6 uM SB225002 | 519,25 | 129.6368 | 4.19 x 10 -6 |
| GFR hücre dışı matris + 11 uM SB225002 | 393,75 | 212.6857 | 1.21 x 10 -5 |
Tablo 1. değişen koşullar altında büyüme faktörü indirgenmiş (GFR) hücre dışı matrisin toplam boru boyları nicel. CXCR2 bir inhibitörü değişken konsantrasyonlarda GFR hücre dışı matris üzerinde yetiştirilen örneklerde kaydedilen toplam boru boyları kullanılarak bir tablonun bir bölümü. Veri CXCR2 önleyicisi tüp oluşumunu inhibe etmediğine de işaret etmektedir. Böyle dört suretin, standart sapmanın ortalama ve P değeri olarak ilişkili değerler bulunuyor. göstermek için piksel cinsinden ölçülürihraç edilmektedir verileri. IC 50 istatistiksel yazılım 13 kullanılarak hesaplanabilir. (1 piksel = 0.34 um)
Discussion
Bu tahlilin gerçekleştirilmesi, aksi belirtilmediği sürece, her zaman buz ya da 4 ° C'de bir hücre dışı matris tutmak esastır. hücre dışı matris 4 ° C'nin üzerinde ısınmaya bırakıldı, bu polimerize olur, ve deney harap. Bu temas edecek bir şey temin etmek de önemlidir (ör pipet uçları, plaka) hücre dışı matris ile önceden soğutulmuş bahsedilen nedenle içindir. Her bir oyuk tohumlandı hücre sayısı önemlidir, çok az sayıda hücre, kontrol örneğinde beklenen ağ-vermeyecektir Çok fazla sayıda hücre, büyük hücre kümeleri ya bir tek tabaka oluşturacak ve deney geçerli olmayacaktır. Bu deneyde başarısında bir başka önemli faktör, HUVEC hücre kanalı sayısıdır. geçit numarası her zaman aksi takdirde sağlam tüp oluşumu oluşabilir, on daha düşük olmalıdır. Buna ek olarak, tek bir kullanılan hücre kültürü ortamı süresi henüz sağlamalıdır veya hücreler canlı değildir. Alternatively, bir orta ve bileşenlerini kısım ve son kullanma tarihi sonra belli bir süre için muhafaza -20 ° C 'de saklayabilir. Tabii ki, son kullanma tarihine kadar orta kullanmak için hala tercih edilir
Tüm prosedürler gibi, endotelyal hücre tüp formasyonu deneyi yürütmek için bazı dezavantajları da vardır. Önemli bir sorun, endotel hücreleri ve destek matrisi farklı olduğundan, Analizin sonuçları hücre ve matris türü kullanıldığı bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir olmasıdır. kullanılan endotel hücreleri (HUVECler, HAECs ya HMVECs) da ölümsüzleştirilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında değişkenlik alma ve için pahalı, primer hücrelerdir. Birincil hücreler, kullanım için sınırlı bir geçitler vardır ve bu nedenle, uzun dönemli anjiyojenez deneyler 14 için uygun değildir. güvenilir veri, bir zaman tayini için aynı tip kullanmalıdır. In vitro deneyler, diğer gibi bir tüp formasyonu deneyi sonuçları con olmalıdıriki boyutlu doku kültürü kontrollü ve yapay koşullarda elde edilen sonuçlar her zaman yaşayan bir organizma karmaşık biyosistemde yansıyan olmayabilir çünkü, in vivo güçlendi. Tüp oluşturan hücreler Bu tür testlerde, sadece endotel hücre tüp oluşumunu göstermek için kullanılabilir akılda tutmak önemlidir ve diğer non-endotelyal test etmek için kullanılmamalıdır.
Bu tahlil, bir bileşiğin anjiyojenik potansiyelini ölçmek için oldukça basit ve hızlı bir yöntemdir. Ayrıca, tek başına olarak, bileşim henüz kabı oluşturan işlemi etkiler belirli bir mekanizma ile ilgili bilgiler elde etmez, daha başka deneyler için bir platform oluşturur. Ancak, çeşitli hücre dışı matris kullanımı ayrıca yaygın kullanılmaz araştırma sorularına yönelik bir çerçeve oluşturmak için nasıl bir örnektir. bileşenlerini hedef spesifik inhibitörleri de dahil olmak üzere bileşiğin spesifik biyo-kimyasal mekanizmaları incelemek için yaklaşımlar vardıranjiyogenez yolu. Bir başka yaklaşım ise endotel hücrelerinden RNA çıkarmak ve deneyde gözlemlenen büyüme çalışmasına yol açabilir gen ekspresyonu değişiklikleri analiz etmek için RT-PCR (Real Time PCR) 12 kullanmak olabilir. Bu yöntemin gelecekte uygulamaları anjiyogenez yolun belirli adımlar için knock-down deneyleri oluşturmak için HUVECler transfekte içerir. lenfanjiogenetik yolunu incelemek için bu yaklaşımı uygulamak için potansiyel var. hücre-dışı matris bileşenlerini değiştirerek, matris ve kanserde anjiyogenez destek veren selüler işlemin etkileşimi ortaya çıkarılabilir olabilir. Bu özel şartlar altında endotel hücrelerinden RNA ekstraksiyonu ve proteinler, ek ölçülebilir veriler veri görüntüleme karşılık gelen sağlar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 ) | Fisher | NC9525043 | HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin. Aliquot the medium and its components and store them at -20 °C, warm in 37 °C before use. |
| MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10 ml; LDEV-Free | Fisher | CB-40230 | Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in -20 °C, warm in 4 °C before use. |
| MATRIGEL MATRIX 10ML; 10 ml; LDEV-Free | Fisher | CB-40234 | extracellular matrix, keep in -20 °C, warm in 4 °C before use. |
| SB225002 | Fisher | 559405 | CXCR2 inhibitor, keep in -20 °C, warm in room temperature before use. |
| Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ScienCell Research Laboratories | 8000 | culture it according reference 10. |
| Trypsin 0.05%-EDTA phenol red | Invitrogen | 25300-054 | keep in 4 °C, warm in 37 °C before use. |
| Nikon ECLIPSE Ti | Nikon | Inverted Research Microscope. | |
| NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit | Nikon | Inverted Research Microscope software | |
| Graph-pad Prism 5 | GraphPad Software, Inc. | scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50. |
References
- Sharma, B., Nawandar, D. M., Nannuru, K. C., Varney, M. L., Singh, R. K. Targeting CXCR2 enhances chemotherapeutic response, inhibits mammary tumor growth, angiogenesis, and lung metastasis. Mol Cancer Ther. 12 (5), 799-808 (2013).
- Birbrair, A., et al. Type-2 pericytes participate in normal and tumoral angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol. 307 (1), 25-38 (2014).
- Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
- Speyer, C. L., Hachem, A. H., Assi, A. A., Johnson, J. S., DeVries, J. A., Gorski, D. H. Metabotropic glutamate receptor-1 as a novel target for the antiangiogenic treatment of breast cancer. PLoS One. 9 (3), 88830 (2014).
- Gu, X., et al. Human Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease siRNA Inhibits the Angiogenesis Induced by X-Ray Irradiation in Lung Cancer Cells. International Journal of Medical Sciences. 10 (7), 870-882 (2013).
- Manjunathan, R., Ragunathan, M. Chicken chorioallantoic membrane as a reliable model to evaluate osteosarcoma-an experimental approach using SaOS2 cell line. Biol Proced Online. 17, 10 (2015).
- Nidhyanandan, S., Boreddy, T. S., Chandrasekhar, K. B., Reddy, N. D., Kulkarni, N. M., Narayanan, S. Phosphodiesterase inhibitor, pentoxifylline enhances anticancer activity of histone deacetylase inhibitor, MS-275 in human breast cancer in vitro and in vivo. Eur J Pharmacol. 764, 508-519 (2015).
- Li, Y., et al. Copper improves the anti-angiogenic activity of disulfiram through the EGFR/src/VEGF pathway in gliomas. Cancer Lett. Aug. , (2015).
- Park, H. J., Zhang, Y., Georgescu, S. P., Johnson, K. L., Kong, D., Galper, J. B. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Rev. 2 (2), 93-102 (2006).
- Clonetics Endothelial Cell System Technical Information & Instructions. , Lonza Walkersville, Inc. Available from: http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf (2015).
- The Essence of Cutting-edge Microscopy Research. , Nikon Corporation. Available from: http://www.nikoninstruments.com/images/stories/PDFs/Eclipse_Ti_Brochure.pdf (2008).
- de Wit, C., Fautz, C., Xu, Y. Real-time quantitative PCR for retrovirus-like particle quantification in CHO cell culture. Biologicals. 28 (3), 137-148 (2000).
- 50% of what? How exactly are IC50 and EC50 defined. , Graphpad Software. Available from: http://www.graphpad.com/support/faqid/1356/ (2015).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells for derived from umbililcal veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
