Summary
Humana pluripotenta stamceller (hPSCs) har den inneboende förmågan att differentiera och själv organisera sig i olika vävnadsmönster; men detta kräver presentation av rumsliga miljö gradienter. Vi presenterar stencil micropatterning som en enkel och robust metod för att generera biokemiska och mekaniska gradienter för styrning hPSC differentieringsmönster.
Introduction
Humana pluripotenta stamceller (hPSCs), inklusive embryonala stamceller (hESCs) och inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), allmänt utnyttjas i regenerativ medicin samt experimentell modellering av normal och sjuk organogenesen på grund av deras differentiering potential till cellinjer av alla tre germinallager 1,2. Differentieringen öden hPSCs är mycket känsliga för lokala miljöfaktorer som kan modulera autokrina eller parakrina signalerar en liksom mechanotransduction processer förmedlade genom fysiska signaler 3-5. Cell micropatterning omfattar en uppsättning tekniker som har utvecklats för att spatialt organisera geometri och placering av en cellpopulation som ett sätt att styra den lokala cellulära mikro, såsom cell-cell-interaktioner 6 och cell-matrix interaktioner 3. I samband med hPSCs har cell micropatterning använts för att få betydande insikt i hur nisch-beroendeENT autokrin signalering modulerar hESC pluripotens-differentiering beslut 7 och organisation i början av embryonala differentieringsmönster 6. 2D och 3D micropatterned hPSCs har använts för att reglera kolonistorleken av flercelliga mönster, vilket i sin tur påverkade differentierings besluten i de tre groddblad 8,9. Vi har använt flercelliga hPSC micropatterns att modulera omfattningen av cell-cell och cell-matris-interaktioner inom en hPSC koloni för att sondera hur grin-E-cadherin överhörning kan ge upphov till cell öde heterogenitet 10. Demonstrationerna från ovanstående rapporter öppna nya vägar mot tillämpningen av flercelliga micropatterns av hPSCs som experimentella modeller för läkemedelstoxicitet screening för utvecklings sjukdomar 11, för att studera effekten av tillväxtfaktorer och hormoner under vävnad eller organutveckling, och att riva upp bildandet av vävnadsmönster.
En myriad av cell micropatterning tekniker har utvecklats som granskats av FALCONNET et. al. 12, men bara en handfull, såsom mikro-kontakt utskrift 7,8,13, mikro kultur 14,15, photopatterning 6 och microstencils 16 har framgångsrikt genomförts med hPSCs. Utmaningen med micropatterning hPSCs ligger i deras sårbarhet och en stringent krav på specifika extracellulära matriser (ECM) och tillväxtbetingelser för cellbindning och överlevnad. För 2D hPSC mönster, är mikrokontakttryckning en av de vanligaste metoderna för att generera hPSC micropatterns på vävnadsodlings och glassubstrat 13. Metoden kan användas för att mönstra gemensamma ECM används i hPSC kultur, inklusive laminin och basalmembranmatriserna, såsom Matrigel. Det kräver dock vanligen en tvåstegs beläggningsprocessen med hjälp av Poly-D-lysin, och kräver särskilda inerta atmosfäriska och fuktighet för att göra stabila ECM micropatterns för hPSCs att fästa på 6,13. Den främsta hänsyn till varje micropatterning metod är att ordningen ytmodifieringen kan generera hPSC självhäftande ECM mönster på önskad geometrisk upplösning och samtidigt minimera ospecifik cellbindning till de omgivande områdena.
Här rapporterar vi användning av stencil micropatterning som en enkel metod för att generera hPSC micropatterns utan ytterligare yta modifieringssteg före genereringen av bindemedels ECM mönster för hPSCs att fästa på. Cell stencil består av ett tunt membran, t ex polydimetylsiloxan (PDMS) ark, med mikron till millimeterstorlek genomgående hål förseglade på en cellodlingssubstrat för att fysiskt innehålla ECM beläggningar och därefter seedade hPSCs. Som stencil mönstring fungerar genom att fysiskt hålla tillbaka den plats där hPSC kan komma åt och fästa direkt på det underliggande ECM belagda substratet, är denna metod är kompatibel med olika substrat som kan stödja hPSC kulturer. De enda requirement är att valet av stencilen material kan bilda en reversibel tätning med substratet. Dessa substrat innefattar konventionella vävnadskulturpolystyren (TCPS) 17, ligand konjugerade substraten 18, såväl som elastomera substrat med avstämbar styvhet (t ex., PDMS) 19. Denna metod tillåter också beläggning av olika ECM, såsom vitronektin (eller VTN protein), laminin och basalmembran matriser (t.ex. Matrigel och Geltrax) för att möjliggöra ordentlig fastsättning och differentiering av hPSCs. Därför kan vi överföra optimerade ECM-substrat konfigurationer för en viss hPSC linje att stencil micropatterning för optimal cellmatris vidhäftning, överlevnad och differentiering. Nyligen har en liknande metod även rapporterats att rikta lever differentiering av micropatterning hESCs användning av poly (metylmetakrylat) (PMMA) mikro stencil arrayer 16.
Cell schabloner kan tillverkas av olika material, inklusive uppfylldaals 20,21, poly (p-xylylen) polymerer 22,23, PMMA 16 och vanligast, PDMS 24-28. Kisel och poly (p-xylylen) polymerer stenciler kräver direkt etsning av de genomgående hålen med specialutrustning 20-23, vilket begränsar deras tillgänglighet till biologiska användare. PDMS stenciler kan framställas genom olika metoder beroende på funktionen storlek som krävs, som vanligtvis sträcker sig från 3 pm till 2000 pm 11,26-29. Om små funktioner önskas, kan tunna stenciling ark framställas genom formpressning PDMS pre-polymer på en mikrofabricerad kisel mall innehållande reliefer av de micropatterns 28. För funktioner> 1000 fim, ger en CO 2 laserskärare en enkel och billig metod för att direkt skära mönster på en i förväg gjuten PDMS arket under stencil tillverkning. Återvinning av PDMS stenciler gör dem också kostnadseffektivt att genomföra en serie experiment med tillräcklig konsistens.
10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Detta protokoll beskriver framställningen av PDMS stencil med 1000 pm mönster av laserskärning och micropatterning av hESC linjen H9 använda PDMS schablonen.
1. Design och tillverkning av PDMS Stencil för Micropatterning
- Utforma stenciling ark med genomgående hål av önskad geometri och storlek (t.ex. 1000 pm cirklar) och schablonen packning med hjälp av datorstödd design mjukvara 10.
- Laser klippa stenciling bladet och packningen på 120-150 um och 2 mm tjock polydimetylsiloxan (PDMS) ark respektive med hjälp av en CO2-laser-skärare 10.
- Binda PDMS packningen med PDMS stencil ark med hjälp av flytande ohärdade PDMS och grädda i 60 ° C under 3-4 timmar för att erhålla PDMS stencilen för micropatterning.
- Sterilisera PDMS stencilen genom autoklavering vid 120 ° C under 30 minuter och torkning i en ugn före användning.
2. hESCs Huvudunderhåll
- Kultur de hESC linjer i en matare fritt upprätthållande medium på 1 × hESC kvalificerade basalmembranmatris belagda cellodlingsplattor vid 37 ° C och 5% CO2.
- Passage hESCs när de är ca 70% konfluenta efter 3 min inkubation vid 37 ° C med dispas behandling och mekaniskt dissociera de hESC kolonier i 100-200 | j, m klumpar. Plate hESCs klumpar vid en densitet av 30-50 klumpar per 9,6 cm 2 av tillväxtområde på basalmembranmatrisen belagda vävnadsodlings polystyren vid 1: 6 delningsförhållande.
3. Stencil Micropatterning av mänskliga embryonala stamceller
- Förberedelser före cell mönstring
- Täta en PDMS stencil på en 60 mm petriskål genom att man avskaffar 700 pl 70% analytisk kvalitet etanol i ultrarent vatten i petriskål och placera schablonen på toppen.
- Placera petriskål inuti biosäkerhet skåp över natten för att låta than etanol torr.
- Kontrollera ingen bubbla existerar under schablonen för att säkerställa att schablonen bildar en god tätning med petriskål. Detta förhindrar läckage av ECM beläggningslösning. Försegla petriskål och lagra under sterila betingelser tills den är färdig för cellsådd.
- Förbered alikvoter av hESC kvalificerade basalmembranet matris enligt Certificate of Analysis. Se till att varje portion ger 1 × hESC kvalificerade basalmembranet matrislösningen vid utspädning i 25 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium: Nutrient Blandning F-12 (DMEM / F12) enligt tillverkarens produktblad.
- Förbered ECM beläggningslösning genom att tillsätta en portion av hESC kvalificerade basalmembranet matris i 16,7 ml DMEM / F12 för att göra 1,5 × hESC kvalificerade basalmembranmatrislösningen. Håll alla ECM beläggningslösningen på is för att förhindra gelning.
- Komplettera hESC underhållsmedium med 10 pM ROCK-inhibitor (Y27632).
- Behandla petriskål med 100 WO två plasma för 90 sek. För att säkerställa sterilitet, bara öppna petriskål locket inuti plasmakammaren före plasmabehandling, och snabbt täcka tillbaka petriskålen efter avslutad behandling. Detta underlättar ytvätning och förhindrar luftbubbelbildning i micropattern genomgående hålen under tillsatsen av ECM beläggningslösning.
- Tillsätt 450 pl 1,5 × hESC kvalificerade basalmembranet matris lösning för att täcka hela schablonen. Försegla petriskål med självförseglingsbara filmen, såsom Parafilm för att förhindra lösningen från att torka ut, och inkubera under 5 timmar vid 37 ° C före användning.
- Seeding hESCs har laddats in i stencilerat substratet
- Undersök hESC kolonier i 6-brunnar för att identifiera de differentierade cellområden som visar förlust av typisk hESC morfologi (t.ex. förlust av rundade, tätt Packed epitelial morfologi, hög kärna / cytoplasma förhållande med framträdande nukleolerna). Ta bort differentierade regioner med hjälp av en vakuumsug.
- Tvätta två gånger med 2 ml DMEM / F12 per brunn.
- Tillsätt 1 ml matsmältningsenzymer, såsom Accutase, per brunn av 6-brunnar och inkubera vid 37 ° C under 8 min. Knacka försiktigt plattan att lösgöra alla kolonier från underlaget.
- Skölj varje brunn med minst 4 ml av DMEM / F12 per 1 ml av matsmältningsenzymer och samla cellsuspension i 15 ml koniska rör.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 200 x g under 3 min vid rumstemperatur.
- Aspirera för att avlägsna supernatanten och tillsätt 400 | il av hESC underhållsmedium kompletterat med ROCK-inhibitor (Rocki) för att återsuspendera cellerna. Pipett cellsuspensionen upp och ner 3 gånger försiktigt bryta klumpar i enstaka celler.
- Blanda enda cellsuspensionen väl och späd 10 pl cellprover i 190 pl DMEM / F12 (1:20 utspädning). Använd en hemocytometer för att bestämma celldensitet på aktie cellsuspensionen.
- Beräkna den erforderliga cellsåddtäthet för en given stencil.
OBS: Till exempel, har vi experimentellt bestämd cellsåddtäthet för att erhålla en sammanflytande monoskikt av enskilda celler är cirka 4444 celler / mm 2. Således kommer en stencil med en yta på 450 mm 2 och sådd volym av 400 ^ kräver en cellsuspension för att vara vid en densitet av 2 miljoner celler / 400 | il. - Späd stamcellsuspension till önskad såddtäthet (se steg 3.3.8 OBS) med hESC odlingsmedium kompletterat med Rocki.
- Lägga till en utsedd volym av cellsuspension innehållande det erforderliga antalet celler i varje stencil och lämna petriskålens ostörd i huven under 5 minuter vid rumstemperatur för att tillåta cellerna att sedimentera.
- Överför petriskål i inkubatorn och inkubera under 1 timme för att tillåta cellvidhäftning. Noga med att hålla petriskålen nivå underöverföra processen så att celler förblir som ett monoskikt i schablonen.
- Stencil borttagning och passivering av omönstrad substrat
- Undersök petriskål under ett mikroskop för att kontrollera om cellerna är ordentligt monterad på det underliggande substratet.
- Aspirera bort cellsuspensionen från schablonen.
- Tillsätt 2 ml / skål av 0,5% cellodling kompatibel icke-jonisk surfaktant i DMEM / F12 till området kring schablonen.
- Använd ett par autoklaveras pincett för att försiktigt dra av schablonen. Snurra nonjonisk tensidlösning runt som schablonen skalas av för att förhindra cellerna från att torka ut. observerar visuellt de micropatterned-celler i petriskål.
- Inkubera micropatterned-celler i 0,5% icke-joniskt ytaktivt medel-DMEM / F12-lösning under 10 min vid 37 ° C.
- Aspirera bort den icke-joniskt ytaktivt medel-DMEM / F12-lösning. Tvätta 3 gånger med 2 ml / skål av DMEM / F12.
- Tillsätt 2 ml / skål av hESCunderhållsmedium kompletterat med Rocki och inkubera vid 37 ° C över natten.
- Efter inkubation över natten, aspirera hESC underhållsmedium kompletterat med Rocki, tvätta en gång med DMEM / F12 och inducera mesoendoderm differentiering genom tillsats av 2 ml / skål av differentiering medium kompletterat med 100 ng / ml Aktivin, 25 ng / ml BMP4 och 10 ng / ml FGF2 .
- Utvärdera micropatterns använder faskontrast avbildning och beräkna den genomsnittliga Brachyury (T) intensitetsprofiler för varje mönster som beskrivits tidigare åtta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta dokument beskriver vi framställningen av en cell stencil genom att använda en laserskärare för att generera 1000 fim funktioner. Schablonen var sammansatt av 2 delar: ett tunt stenciling ark (omkring 100-200 | j, m tjock) innehållande micropattern genomgående hål, och en PDMS packning för att innehålla den ECM beläggningslösningen eller cellsuspension. Här, var 127 | j, m och 2 mm tjocka kommersiellt tillgängliga PDMS ark används som stenciling arket och packningen respektive. Andra metoder för framställning av PDMS ark av kontrollerbar tjocklek, såsom spinnbeläggning, kan också användas för att tillverka delarna. De två komponenterna har bundits samman med hjälp av flytande ohärdat PDMS prepolymer-tvärbindningsblandningen såsom ett lim eller plasmabindning och bakades vid 60 ° C under 3-4 h (Fig. 1).
Materialet för stenciling arket valdes baserat på valet av cellodlings substrate. Vid användning av konventionell vävnads (TCPS) som odlingssubstrat, kan PDMS schabloner användas eftersom efterlevnaden av PDMS stenciling bladet kommer att bilda en god tätning med den stela TCPS (E ~ 3 GPa) (Fig. 2A). I experimentella konstruktioner där man önskar undersöka rumslig heterogenitet stamcells öde på mjukare cellodlings-underlag, såsom elastomera PDMS substrat med en avstämbar styvhet intervallet 5 kPa till 2 MPa 30, kan styvare stenciling material användas. Som ett exempel visade vi användningen av en polyetylentereftalat (PET) stencil (E ~ 2 GPa) för att generera 1 mm Micropatterned hPSC kolonier på mjukare PDMS substrat som har en styvhet på ~ 5 kPa (Fig. 2B). PET stencil tillverkades genom limning en PDMS packningen på en stenciling ark framställt av kommersiellt tillgängliga PET-filmer (Fig. 2B, inlägg). Vi noterar att den erforderliga cellvidhäftning tidpunkt under micropatterningprocessen var längre (~ 3 tim) på mjukare PDMS substrat av styvhet ~ 5 kPa jämfört med konventionella TCPS substrat.
Vi utnyttjade stencil Micropatterned hESC kolonier för att visa att rumslig heterogenitet i cellvidhäftnings förmedlade mekaniska krafter kunde mönster tidigt mesoendoderm differentiering. Vi har tidigare visat att H9 hESCs på kolonin periferin upplevde högre grin sammanväxningar än celler vid kolonin inre, vilket resulterade i sin företrädesrätt differentiering till Brachyury (T) -positiva mesoendoderm celler vid induktion med Aktivin, BMP4 och FGF2 31 (Fig. 3A ). När cellerna mönstrad i olika geometrier (cirkel, fyrkant, rektangel och halvcirkelformad båge) vid en konstant koloni område, geometrisk anisotropi i hörnen av kvadrater, rektanglar och konvexa krökningar ledde till en lokal koncentration av integrinmedierad dragkrafter och resulterade i ökad mesoendoderm differentiering 32,33. I själva verket, genom att kartlägga T uttryck intensiteten vid olika orter inom en enda koloni, fann vi att omfattningen av mesoendoderm induktion var högre i skarpa hörn av kvadratiska och rektangulära kolonier (Fig. 3B) och konvexa krökningar av en halvcirkelformad båge (Fig . 3C), vilket motsvarade rapporterade höga integrinmedierad spänningsområden i en anisotrop geometri 32,33. Därför kan micropatterning användas för att modulera den rumsliga fördelningen av cellvidhäftningsmedierade mekaniska krafter inom en intakt hPSC koloni som ett medel för att styra den efterföljande differentieringsprocessen.
Figur 1. Framställning av PDMS stencil för micropatterning. (A) Schematisk representerar de kritiska stegen i stencil tillverkning. En 127 pm tjock PDMS ark var laSer-klipp för att producera designade mönster, och ytterligare 2 mm tjockt PDMS arket laserskurna för att producera packningen. Dessa två komponenter sammanbundna med ohärdade PDMS att montera schablonen. (B) bilder som visar montering av komponenter för att bilda en PDMS stencil med 1 mm runda genomgående hål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Micropatterned hESC kolonier (1000 | j, m cirklar) på olika odlingssubstrat. Mikroskopiska bilder av hESC micropattern koloni omedelbart efter avlägsnandet av (A) PDMS stenciler (infälld) som används för att generera hESC micropatterns på styva substrat, t ex, TCPS av styvhet ~ 2 GPa, och (B) PET stenciler (infälld) Används för att generera micropatterns på mjukare underlag, t.ex. PDMS av stelhet ~ 5 kPa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Effekt av hESC micropatterns av olika geometriska former på deras mesoendoderm differentiering 8. (A) hESC micropatterns av olika geometriska former men samma koloni område genererades med hjälp av PDMS stenciler. Fas bilder (övre panelen) och intensitet kartor över T uttryck (nedre panelen) efter 24 timmar av mesoendoderm differentieringen. (B) Genomsnittlig T intensitetsprofiler (längs vita streckade linjer i (A)) i isometriska cirkulära kolonier eller anisometric kvadratiska och rektangulära kolonier . Alla kolonier hade samma område ex cept den 50% cirkel, som hade halv av kolonin området. (C) Genomsnittlig T intensitetsprofiler från den konkava eller konvexa kanter in i kolonin interiör i en halvcirkulär båge, såsom indikeras av vita streckade linjer i (A). Varje intensitetsprofil i (BC) är ett genomsnitt av 16 intensitetsprofiler erhållna från 4 kolonier. Bilderna åter tryckt med tillstånd från Toh et. al., 8. Skalstreck = 200 nm och RFU är relativ fluorescens enhet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Schematisk bild av arbetsflödet för att micropattern hESC kolonier och inducera differentiering. Viktiga steg för framgångsrika generationen av hESC micropatterns är markerade med grå rutor..com / filer / ftp_upload / 54.097 / 54097fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tillverkning av micropatterning stenciler
Stencil micropatterning ger en idealisk metod för att generera hPSC micropatterns för att undersöka nisch-medierad differentiering mönstring. Den viktigaste fördelen med stencil mönstring över andra micropatterning tekniker, såsom mikrokontakttryckning och photopatterning, är att den inte kräver ytmodifiering och kan genomföras på konventionella TCPS substrat. Därför kan optimerade odlingsmedier och ECM beläggningar för olika hPSC linjer lätt överföras till stencil micropatterning.
Det finns ett antal viktiga steg under tillverkningen av cellen stencil som bidrar till uppkomsten av goda micropatterns. Trohet återge de utformade geometrier i hPSC micropatterns beror på kvaliteten och enhetligheten genomgående hål tillverkning i stenciling bladet. För studier med flercelliga micropatterns av> 1000 um, de genomgående hålen kan tillverkas direkt genom laserskärning på en i förväg gjuten PDMS arket. Upplösningen på laserskärning är beroende av fläckstorleken för laserstrålen och precisionen hos den mekaniska skede styra banan för laserstrålen. För konventionella CO 2 laserskärare, fann vi att det kan producera runda eller böjda funktioner med god trohet men inte geometrier med skarpa hörn (t ex., Fyrkant). I applikationer där små eller skarpa drag är önskvärda, de genomgående hålen i stenciling arket kan tillverkas genom gjutning av PDMS på en mikrofabricerad kisel mall innehållande reliefer av de micropatterns 28. Utmaningen av formningsmetoden är att producera mikro-storlek genomgående hål i tunna PDMS ark utan rest PDMS över kisel mall reliefer. Flera strategier har utvecklats för att lösa detta problem som beskrivs av Li et. al. 28
Under somtering av stenciling arket och packning för att producera cell stencilen, bör man se till att den stenciling arket är plan och fri från damm under bindningsprocessen för att förhindra läckage från schablonen. Buckling av stenciling arket under bindningsprocessen kan äventyra tätningen av stencilen till odlingssubstrat, vilket orsakar ECM och cell-lösningar för att läcka ut från micropattern genomgående hålen. Schablonen bör steriliseras genom autoklavering (120 ° C, 30 min) och torkas noggrant i en ugn för att säkerställa att den kan bilda en god tätning med odlingssubstratet.
En annan viktig faktor är valet av stenciling arkmaterialet. PDMS stencil är idealisk för micropatterning hPSCs på styva struktursubstrat, såsom TCPS med en styvhet på ~ 2 GPa. Men om man vill micropattern hPSCs på mjukare underlag, till exempel på PDMS substrat som vanligen används för att ställa cellsubstrat styvhet 34, huruvida en PDMSstenciling blad kommer att göra det svårt att dra av schablonen efter cellsådd processen, därför att förstöra hPSC micropatterns. I detta fall måste materialet val för stenciling ark av schablonen väljas så att den kan bilda en tätning med odlingssubstratet men kan skalas av med lätthet.
Genererings hPSC micropatterns
Protokollet för micropatterning H9 hESCs på TCPS substrat med hjälp av en PDMS stencil presenteras här har optimerats för att uppnå en sammanhängande koloni med god cellviabilitet och mönstring trohet. Det är väsentligt att de hPSCs bildar lämpliga cell-cell- och cell-matris interaktioner inom den rumsliga inneslutning av en speciell geometri som definieras av de micropatterns så att en kan undersöka hur geometriberoende faktorer påverkar differentierings öden. Vi har identifierat några viktiga steg för att framgångsrikt generera hPSC micropatterns (Fig. 4)och de diskuteras enligt följande.
Först betyder kvaliteten på hPSC kultur. Det är viktigt att skörda hPSC kolonier på 70-80% sammanflödet, med majoriteten av kolonier som visar odifferentierad hPSC morfologi samtidigt ta bort de differentierade områden. Översammanflytande hPSC kulturer brukar orsaka spontan differentiering och om de differentierade områden som inte tas bort före cellsådd, kommer de differentierade cellerna störa normal differentiering mönster bildas.
För det andra, vid skörd hPSC kolonier till enkelcellsuspension, undvika överbehandling med matsmältningsenzymer är kritisk, eftersom detta ofta leder till celldöd efter inkubation över natten, även om cellerna kan fästa initialt. Vi fann att 8 minuter av enzymatisk behandling är optimal för H9 hESC linje odlas i vårt labb, även om vi rekommenderar att cell lossnar behandlingstiden bör optimeras separat för olika cellinjer.
Slutligen finns det ett behov att passivera substratet som omger hPSC micropatterns med icke-cell-adhesiva molekyler i syfte att begränsa prolifererande eller differentierande celler till inom micropattern. Detta är viktigt för att upprätthålla trohet av hPSC micropattern, och i sin tur att den biokemiska och mekaniska miljö lutning för differentieringsmönster utvecklas. Cellodlings kompatibla icke-joniska ytaktiva medel, såsom Pluronic F-127 kan användas som ett passiveringsmedel. När passive med tensider, bör behandlingen tid och koncentration optimeras på grund av ytaktivt s cytotoxicitet vid lång exponering. Som vi diskuterade ovan, ger den presenterade protokollet en detaljerad riktlinje att micropattern hPSCs med hjälp av en PDMS stencil, men optimering av detta protokoll, särskilt för ovanstående kritiska steg, uppmuntras till SUccessfully generera hPSC micropatterns.
En begränsning med stencil micropatterning är att det är mer passande för att generera större micropatterns varierande från 100-1,500 im. För att generera mycket små utrymmen för enskild cell mönstring, tillverkning av stenciling ark med <50 ^ m genomgående hål är mycket utmanande som tidigare nämnts. Därför förväntar vi oss att användningen av stencil micropatterned hPSCs är väl lämpad att undersöka flercelliga vävnads mönster bildas under olika utvecklingsprocesser (t.ex. neuroepithelium fällbara eller endoderm mönstring).
Genom att använda micropatterning att geometriskt begränsa en hPSC befolkning, kan vi konstatera cell adhesion medierad mekaniska 10 och parakrina signalerings gradienter 6 för att styra och förstå den rumsliga organisationen av de resulterande differentierings öden. Dessa micropatterned hPSC modeller med spatialt organiserad differentiation kan i sin tur översätts till sjukdomar eller teratogen screenings modeller 11 för medfödda missbildningar humana specifik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NUS startbidrag (R-397-000-192-133) och ETPL Gap Fund (R-397-000-198-592). GS är en NUS forskaren. Författarna vill tacka Dr Jiangwa Xing för hennes teknisk support på cell micropatterning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Used to form reservoir for stencil |
| 120-150 μm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Used to form stencil |
| 60 mm Petri dish | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substrate for micropatterning |
| Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzyme to break H9 cells into single cells |
| Activin | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| Plasma system | Femto Science, Korea | CUTE-MP | For plasma oxidation of stencil |
| Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging |
| DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basal medium for H9 cells |
| FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Growth factor for H9 differentiation |
| H9 cell line | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Human embryonic stem cells |
| hESC-qualified basement membrane matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | For capturing bright-field images |
| Laser cutter | Epilog Helix 24 Laser System | Used to generate through holes in PDMS sheet | |
| mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Maintainence medium for H9 cells |
| PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Used for sticking the PDMS stencil and reservior |
| ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Maintains H9 cells as single cells |
| STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiation medium for H9 cells |
| Polyethylene terephthalate film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Used to form stencil |
| Cell culture compatible non-ionic surfactant | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates |
References
- Graf, T., Stadtfeld, M. Heterogeneity of embryonic and adult stem cells. Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).
- Joddar, B., Ito, Y. Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures. J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages. Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).
- Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).
- Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials. 50 (0), 87-97 (2015).
- Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration. Sci Rep. 5, 10038 (2015).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. 3-D microwell culture of human embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).
- Yao, R., et al. Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation. Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).
- Mei, Y., et al. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).
- Melkoumian, Z., et al. Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).
- Carter, S. B. Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation. Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).
- Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).
- Wright, D., et al. Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).
- Jinno, S., et al. Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures. J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).
- Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
- Park, J., et al. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).
- Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil. Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).
- Li, W., et al. NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution. Sci Rep. 4, 4784 (2014).
- Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates. J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PLoS One. 7 (12), 51499 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).
- Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).
- Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4201-4213 (2010).
- Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation. J Biol Eng. 7 (1), 7 (2013).
