Abstract
Trofoblasten stamceller (TSC) opstår som følge af den første celle skæbne afgørelse i mammal udvikling. De kan dyrkes in vitro, bevarer evnen til at forny sig selv og til at differentiere til alle undertyper af trofoblasten afstamning, svarende til in vivo stamcellepopulation giver anledning til føtale del af placenta. Derfor TSC tilbyde en unik model til at studere placenta udvikling og embryonale versus ekstra embryonal celle skæbne beslutning in vitro. Fra blastocyst-stadiet og fremefter, en særskilt epigenetisk barriere, der består af DNA methylering og histon modifikationer stramt adskiller begge slægter. Her beskriver vi en protokol til fuldt ud at overvinde denne slægt barriere ved forbigående overekspression af trofoblast vigtige regulatorer Tfap2c, GATA3, Eomes og ETS2 i murine embryonale fibroblaster. De inducerede trofoblast stamceller er i stand til at forny sig selv og er næsten identiske med blastocyst afledte trophoblast stamceller in form af morfologi, markør genekspression og methylering mønster. Funktionel in vitro og in vivo assays bekræfter, at disse celler er i stand til at differentiere langs trofoblasten afstamning generere polyploid trofoblast kæmpeceller og chimerizing placenta når det injiceres i blastocyster. Induktionen af trofoblast stamceller fra somatisk væv åbner nye muligheder for at studere genetiske og epigenetiske egenskaber ved denne ekstra-embryonale afstamning og giver mulighed for at generere trophoblast stamcellelinjer uden at ødelægge den respektive embryo.
Introduction
For nylig er en undersøgelse, der sammenligner flere tilgange af muse embryonale stamceller til trofoblasten stamceller konvertering viste, at i alle undersøgte systemer, afstamning konvertering forblev ufuldstændig. I stedet for inducerede trofoblast stamceller (iTSCs) såkaldte trophoblast stamcelle-lignende celler er blevet genereret bevarer en hukommelse af cellen skæbne oprindelse 1. Her har vi fulgt en anden tilgang af ITSC generation. Svarende til den direkte induktion af pluripotente stamceller fra murine embryonale fibroblaster (MEF'er) 2, er iTSCs blevet direkte konverteret fra differentierede somatiske væv. Først identificerede vi 12 ansøgerlande faktorer inducerer TSC skæbne når overudtrykt i MEF. Senere har de faktorer Tfap2c, GATA3, Eomes og ETS2 blevet identificeret til at være nødvendige og tilstrækkelige for ITSC induktion 3. Samtidig anden gruppe uafhængigt fundet Tfap2c, GATA3 og Eomes at være tilstrækkelig til at omdanne MEF'er til iTSCs. I såundersøgelse, er den nødvendige tid til transgen ekspression betydeligt længere sammenlignet med vores undersøgelse, hvilket indikerer forskellige konvertering kinetik, når ETS2 er fraværende fra transdifferentiering cocktail 4.
Konventionel føtalt bovint serum (FBS) indeholdende kultur af inducerede og blastocyst afledt trofoblast stamceller er afhængig af tilstedeværelsen af faktorer, der udskilles af vækst-inaktiverede MEF'er 5,6. Under ITSC induktion, er disse faktorer, som MEF'er, som mangler fuld kombination af transgener og ikke undergår transdifferentiering. Men når de enkelte ITSC kolonier er sub-dyrkes, de kræver medier, som er blevet klargjort af vækst-inaktiverede MEF. Derfra kan iTSCs dyrkes og behandles som blastocyst afledt TSC overensstemmelse med standard protokoller. Notatet i modsætning til Tanaka et al. 5, vi rutinemæssigt kultur TSC og iTSCs uden gelatinering cellekultur retter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus eksperimenter blev udført i overensstemmelse med den tyske lov af dyrebeskyttelse og efter aftale med godkendelse af de lokale institutionelle dyr pleje udvalg (Landesamt fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen [godkendelse ID-nummer: AZ 84-02.04.2013 .A428]).
1. Medier Forberedelse
- Forbered 293T medium: Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM), 10% (vol / vol) FBS, L-glutamin (2 mM), natriumpyruvat (1 mM), penicillin / streptomycin (1x).
- Forbered MEF medium: DMEM, 10% (vol / vol) FBS, L-glutamin (2 mM), 1x ikke-essentielle aminosyrer, penicillin / streptomycin (1x).
- Forbered TS-medium (w / o FGF4 / heparin): Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, 20% (vol / vol) FBS (stamceller cellekulturkvalitet), penicillin / streptomycin (1x), L-glutamin (2 mM ), natriumpyruvat (1 mM), 2-mercaptoethanol (0,1 mM).
- Forbered TS-medium med FGF4 / heparin (TS + F4H): RPMI 1640, 20% (vol / vol) FBS (stamcellekultur kvalitet), penicillin / streptomycin (1x), L-glutamin (2 mM), natriumpyruvat (1 mM), 2-mercaptoethanol (0,1 mM), 25 ng / ml FGF4, 1 ug / ml heparin.
Bemærk: FGF4 og heparin tilsættes direkte til mediet umiddelbart før brug. - Forbered TS-CM med FGF4 / heparin (TS-CM + F4H): 70% MEF-condition TS medium + 30% frisk fremstillet TS medium + 25 ng / ml FGF4, 1 pg / ml heparin.
Bemærk: FGF4 og heparin tilsættes direkte til mediet umiddelbart før brug. - Forbered Transfektion medium: Advanced DMEM, 2% (vol / vol) FBS (stamceller cellekulturkvalitet), L-glutamin (2 mM), penicillin / streptomycin (1x).
- Forbered Virus-produktionsmedium: Advanced DMEM, 5% (vol / vol) FBS (stamceller cellekulturkvalitet), L-glutamin (2 mM), penicillin / streptomycin (1x).
2. Murine Embryonale fibroblast Derivation
- Set timede parringer hjælp wt 129S2SV hunner og homozygot mandlige R26 :: rtTA mus (stamme navn; B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor TM1 (rtTA* M2) Jae / J 7). På E13,5 sacrifice mus ved cervical dislokation og isolere primære murine embryoniske fibroblaster (MEF'er) ifølge standardprotokoller 8. Derefter plade celler fra et foster på en 150 mm skål i MEF medier.
- Når primære MEF kulturer flyder sammen på 150 mm skåle, vask cellerne to gange med 10 ml PBS, og der tilsættes 4 ml 0,05% trypsin / EDTA-opløsning. Inkuber retter i 3 - 4 minutter i inkubatoren ved 37 ° C.
- Efter inkubation kontrollere, om celler løsrevet fra fadet ved hjælp af et omvendt mikroskop (ved hjælp af en 10X objektiv). Der tilsættes 5 ml MEF medium at stoppe trypsinisering og indsamle cellesuspension i en 50 ml konisk rør.
- Pool cellesuspension fra flere retter og samle ind i en 50 ml konisk rør. Centrifuger cellesuspensionen i 3 min ved 200 xg og 10 ° C.
- Supernatanten kasseres og resuspender cellepelleten i FBS indeholdende 10% (v / v) dimethylsulfoxid. Frys MEF'er i portioner til videre brug.
Bemærk: Alternativt kan du bruge vilde type primære MEF; imidlertid nødvendigt en yderligere lentiviral vektor der udtrykker rtTA skal transduceres sammen med de andre lentivirusvektorer (fx under anvendelse af FUdeltaGW-rtTA plasmid beskrevet af Maherali et al. 9). - Udarbejdelse af MEF-conditioned TS medium
Bemærk: Før konvertering eksperimenter, har MEF-condition (CM) TS medier til at være forberedt, som er nødvendig for subkultur af individuelle ITSC linjer (beskrevet i afsnit 6).- Plade 1 x 10 7 mitotisk inaktiverede MEF'er pr 150 mm skål i MEF medium på ønskede antal retter. Inaktivere MEF'er efter γ-bestråling med en dosis på 9 Gy.
Bemærk: Udbyttet pr 150 mm skål er ca. 60 ml CM. - Dagen efter plating, aspireres og kassere MEF medium og tilsæt 20 ml frisklavede TS medium (uden FGF4 / heparin) på hver skål af mitotisk inaktiverede MEF'er og placere retter tilbage i inkubatoren ved 37 ° C.
- efter inkuberingTS medium i tre dage på mitotisk inaktiverede MEF'er, indsamle medium i 50 ml koniske rør. Filtermedium gennem et 0,2 um filter og fortsætte med 2.6.4. Erstat CM med 20 ml frisk TS medium til fremstilling af en yderligere batch af CM.
Bemærk: mitotisk inaktiverede MEF'er kan anvendes til CM fremstilling op til tre gange. - Alikvot 35 ml filtreret CM i 50 ml koniske rør og opbevares ved -20 ° C indtil brug. Efter optøning tilsættes 15 ml frisk fremstillet TS medium for at opnå 70% TS-CM og opbevares ved 4 ° C i op til en måned.
- Plade 1 x 10 7 mitotisk inaktiverede MEF'er pr 150 mm skål i MEF medium på ønskede antal retter. Inaktivere MEF'er efter γ-bestråling med en dosis på 9 Gy.
3. lentivirusvektor Produktion i 293T-celler
Bemærk: Alle trin udføres i laboratoriet plads licens til biosikkerhed niveau 2.
- Før konvertering eksperimenter, forberede lentivirusvektorer for doxycyclin (dox) afhængige overekspression af Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2 og mCherry. For hver lentivirus, cotransfektion 293T-celler under anvendelse afrespektive lentivirale transfer vektor sammen med en emballage plasmid og en VSV-G udtrykker kuvert plasmid (for plasmid information henvises til Materials tabel).
Bemærk: nyttige oplysninger om virus produktion henvises til Gavrilescu et al 10.. Selv om det beskriver retrovirus produktion, generelle kommentarer til kvaliteten af 293T celler og plasmid-DNA er sande for lentivirus produktion så godt.
ADVARSEL: Passende sikkerhedsforanstaltninger der skal træffes, når man arbejder med lentivirale vektorer og arbejdet skal udføres i en biosikkerhedsniveau 2 facilitet. - Coat fem 100 mm-skåle med poly-L-lysin (100 ug / ml) opløsning ved at dække skålene med 5 ml opløsning og ryst forsigtigt for at fordele belægningsopløsningen. Placer retterne tilbage i inkubatoren ved 37 ° C i 30 minutter. Efter 30 min aspirat coatingopløsning og skyl retter en gang med PBS.
- Plade 7 x 10 6 293T celler pr skål i 10 ml 293T-celle medier, sWirl retter for at fordele celler og placere retter tilbage i inkubatoren ved 37 ° C.
- Den næste morgen, udskift vækstmedium med 5 ml transfektionsmedium. Tilsæt 6 pi af en 1.000 x bestand af chloroquin-opløsning (25 mm) og anbringe retter tilbage i inkubatoren ved 37 ° C.
- Mellemtiden forbereder transfektion blandingen:
- For hver lentiviral vector forberede to 5 ml reaktionsrør, mærket A og B.
- Tilsættes 600 pi 2x HEPES-bufret saltvand (HBS) til rør A.
- I rør B mix 61.5 pi CaCl2-opløsning (2 M), med 18,5 ug lentivector DNA og 9,25 ug psPAX2 og 9,25 ug pMD2.G. Juster lydstyrken til 600 pi med sterilt kultur klasse H 2 O.
- Tilføj løsning fra rør B dråbevis til rør A mens vortexing. Inkuber transfektion blandingen i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Tilføj transfektionsblandingen meget omhyggeligt dråbevis til de fremstillede 293T-celler på 100 mm skål. ENfter 5 til 6 timer fjernes medium og erstattes med 10 ml virus-produktionsmedium. Placer retter tilbage i inkubatoren ved 37 ° C.
Bemærk: Vær forsigtig, når du fjerner og udskifter medium siden 293T-celler nemt løsnes fra fadet. Medium ændring 5-6 timer efter transfektion er afgørende, da længere tids udsættelse for chloroquin er toksisk for cellerne. - Den følgende morgen, forsigtigt fjerne og kassere medium og erstatte med 7 ml virus-produktion medium.
- Den følgende morgen høste det første parti af virusholdige medium. Aspirer medium og samles i en 15 ml konisk rør. Igen tilsættes der 7 ml virus-produktionsmedium på cellerne. Store virus medium i køleskabet, indtil det andet parti høstes den følgende dag.
- Den næste morgen aspirere det andet parti virus medium tilføje det til de 15 ml konisk rør indeholdende det første parti. 293T-celler kan nu bortkastes. Filter virusholdige medium gennem et 0,45 um surfactant-fri celluloseacetat -membrane filter. Alikvot filtreret, virusholdige medium og opbevares ved -80 ° C til yderligere anvendelse.
Bemærk: Virusproduktion kan også udføres i 6-brønds plader. Skaler ned mængder og celletal i overensstemmelse hermed.
4. fibroblast Transduktion med 4 Faktorer og mCherry Kontrol Vector
Bemærk: Alle trin udføres i en biosikkerhedsniveau 2 facilitet.
- For en skematisk fremstilling af den eksperimentelle omrids henvise til figur 1. Tø en aliquot af primære rtTA-MEF'er og pladen 3,33 x 10 5 celler pr brønd i en 6-brønds skål i et samlet volumen på 2 ml MEF medier. Forbered mindst 3 brønde og mærke dem med 4 faktorer (4F), mCherry og kontrol.
Bemærkning: Alternativt kan vildtype MEF'er anvendes, når en rtTA udtrykkende lentiviral vektor tilsættes til lentivector cocktail under trin 4.2. - Den følgende dag efter celler fuldt tilbagebetalt fra cryoprebevarelse, erstatte MEF medier i de tre 6-brønde med 0,6 ml (4F), 0,9 ml (mCherry) og 1 ml (kontrol) af Transduction medier, hhv. Optø en portion af PLV-tetO-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, -Ets og -mCherry virus ved stuetemperatur, og tilsættes 100 pi af hver virus-holdige supernatant (Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2) i 4F godt.
Bemærk: I tilfælde af vildtype MEF'er, reducere mængden af preplated medier med 100 pi og derudover tilsættes 100 pi FUdeltaGW-rtTA virus, der indeholder supernatant til 4F mix. - Tilsæt 100 pi mCherry virusholdige medier til brønden mærket med mCherry. Tilføj polybren til en slutkoncentration på 8 ug / ml i hver brønd. Skålen tilbage i inkubatoren ved 37 ° C og inkuberes MEF'er O / N med virus-indeholdende supernatant.
Bemærk: I tilfælde af vildtype MEF'er, reducere mængden af preplated medier med 100 pi og derudover tilsættes 100 pi FUdeltaGW-rtTA virus-indeholdende supernatant. - Den næste morgen, forsigtigt fjernevirusholdige medier og vaskes tre gange med 2 ml PBS. Endelig tilsættes 2 ml TS medier (uden FGF4 / heparin).
Bemærk: Transducerede MEF'er kan enten anvendes direkte til ITSC induktion eksperimenter eller fryses til senere brug.
5. fibroblast til ITSC konvertering
Bemærk: Alle trin udføres i laboratoriet plads licens til biosikkerhed niveau 2.
- Vask transducerede MEF'er to gange med 2 ml PBS, og efter tilsætning af 0,5 ml trypsin / EDTA-opløsning inkubere dem i inkubatoren i 3 - 4 minutter. Kontroller under et omvendt mikroskop for korrekt frigørelse af cellerne.
- Inaktivere trypsin ved at tilsætte 1 ml TS medium. Overfør cellesuspensionen til en 15 ml konisk rør og centrifugeres i 3 minutter ved 200 x g. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 2 ml TS medium. Brug utransducerede kontrolprøve at tælle cellerne.
- Plade 4F-MEF'er, mCherry-MEF'er og utransducerede kontrol MEF'er hver ved en densitet på 2 x 10 5celler pr 100 mm celledyrkningsskål i 10 ml TS medium indeholdende 2 pg / ml DOX (TS medium + FGF4 / heparin + dox).
- Alternativt udføre transdifferentiering på mindre retter. Plate 3,6 x 10 3 celler pr cm 2 på den ønskede fad størrelse, skala volumen i overensstemmelse hermed.
- Den næste dag, under anvendelse af et epifluorescensmikroskop (ved anvendelse af et 10X objektiv og et filter egnet til rød fluorescens excitation) overvåge ekspression af mCherry protein for at estimere transduktionseffektivitet.
Bemærk: Transduktion effektivitet bør være tæt på 100%. Hvis øget celledød fremgår efter transgen induktion betyder det, at virus titer var for høj. Transduktion bør gentages med reduceret mængde virus-holdigt medium. - Fra nu af forandring medier på alle retter hver anden dag indtil dag 10 efter plating. Derefter foder celler med TS medium uden dox (TS medium + FGF4 / heparin).
- Under anvendelse af et omvendt mikroskop monitor forudseende af 'transdifferentiated områder «(se figur 2B og C) på 4F skål for op til 3 uger. Sådanne kolonier bør ikke være synlig på de to kontrolgrupper retter (mCherry-MEF'er og utransducerede MEF'er).
6. Isolering af Individuelle ITSC Lines
Bemærk: trin 6.3 en vævskultur hætte ikke er påkrævet. Det anbefales at udslette ned inverteret mikroskop med 70% ethanol for at minimere risikoen for bakteriel forurening. Individuelle ITSC kolonier kan isoleres mellem dag 21 og 28 dage transdifferentiering.
- Tilsæt 40 pi 0,05% trypsin / EDTA-opløsning i 12 brønde af en 96 U-bund brønd skål og placere skålen på is.
- Før koloni isolation, aspireres medium på 4F-MEF transdifferentiering skål. Vask cellerne en gang med 10 ml PBS. Igen, tilsættes 10 ml PBS og sted fad under et omvendt mikroskop.
- Anvendelse af en 100-pi pipette sat til 40 pi lift individuelle kolonier ved circling dem med pipettespidsen og opsugning af flydende koloni. Overfør celler fra en koloni hver i en brønd af den fremstillede 96-brønds skål. Efter plukning 12 kolonier placere 96-brønds skål i inkubatoren ved 37 ° C i 5 min.
- Dissociere celler ved pipettering op og ned adskillige gange, og overførsel cellesuspension i en brønd i en 24-brønds skål med forberedte 500 pi TS-CM-medium (30% frisk TS-medium + 70% CM + FGF4 / heparin).
- Den følgende dag erstatte mediet med frisk TS-CM-medium for at fjerne døde celler. Skift medium hver anden dag.
- Monitor for fremkomsten af epitelial kolonier med lyse grænser (se figur 2). Når kolonier synes, kultur indtil 70% sammenflydende eller i op til en uge, og gradvist udvide på større retter. Fra nu af kultur celler som bona fide TSC, ifølge standard protokoller i serum indeholder medier eller i serum-fri, definerede medier 3,5,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På skålen hvor transgen ekspression af 4F aktiveres, celler hurtigt ændre morfologi (sammenlign figur 2A og B). Omkring dag 14 - 21 forskellige transdifferentiated områder emerge (to eksempler er givet i figur 2B og C). Disse primære kolonier mangler typiske TSC morfologi; men når de er sub-dyrkes, karakteristisk epithelmorfologi med stramme kanter og lyse grænser meget minder om bona fide TSC dukker (figur 2D). 4F-iTSCs pletten positive for trofoblast transkriptionsfaktorer CDX2 og Tfap2c (figur 2E). Disse ITSC linjer kan nu anvendes til efterfølgende in vitro eller in vivo analyser, dvs. in vitro differentieringsfaktorer assays eller placentale chimerization eksperimenter.
Figur 1. Tidslinje for MEF til ITSC konvertering. Grafisk fremstilling af transdifferentiering af MEF'er i iTSCs. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Repræsentative Ændringer i morfologi Under MEF til ITSC konvertering.
(A) mikrofotografi af rtTA-MEF'er. (B) mikrofotografi af transdifferentiated 4F-MEF'er. Eksempel på et transdifferentiated område, fremhævet med rødt. (C) Eksempel 2 i en transdifferentiated koloni på dag 21 af transdifferentiering efter ti dage dox induktion i 4F-MEF'er. Egnet til sub-dyrkning fremhævet med rødt. (D) mikrofotografi af 4F-iTSCs efter sub-dyrkning. Alle skala søjler indikerer 100 um. Billederne var taken på et omvendt mikroskop ved anvendelse af et 10X objektiv og fasekontrast. (E) Immunfluorescensfarvning mod transskription faktorer CDX2 og Tfap2c i 4F-iTSCs. Kerner farves med Hoechst. Scale søjler indikerer 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den 4 faktor (Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2) baseret transdifferentiering protokol præsenteres her giver en pålidelig metode til at generere trofast konverterede iTSCs fra muse embryonale fibroblaster. Endvidere er fremgangsmåden også anvendes til postnatale hale fibroblaster, men med et fald i effektivitet sammenlignet med embryonale fibroblaster 3. Generelt kvaliteten af primære fibroblaster er bør tages en kritisk faktor transdifferentiering udfald og omsorg til at bruge tidlige passage-celler (passage 02:58).
Styrken ved denne protokol er anvendelsen af doxycyclin-inducerbare vektorer, der muliggør tidsmæssige styring transgenekspression. Dette muliggør generering af stabile ITSC linjer, der aktiverer endogene transkriptionsfaktor netværk, vedligeholdelse TSC skæbne uafhængig af transgen ekspression. Dette er i modsætning til tidligere offentliggjorte protokoller, der beskriver induktionen af TSC skæbne af embryonale stamceller, en fremgangsmåde that til dato kun giver ufuldstændigt omprogrammerede trofoblasten stamceller celle-lignende celler 1.
Men en kendt begrænsning af protokollen beskrevet her er det variabelt antal af nye transdifferentiated kolonier, hvilket gør det vanskeligt at forudsige transdifferentiering effektivitet. Disse begrænsninger skyldes flere højt variable faktorer, som er afgørende for transdifferentiering resultatet: transduktion effektivitet af de enkelte lentivirusvektorer, mængden af spredning af udgangs cellepopulationen, og mængden af celledød under transdifferentiering. Under visse omstændigheder transdifferentiated ITSC kolonier undlader at dukke op. I dette tilfælde skal testes medier og reagenser for deres evne til at understøtte ægte TSC kultur, før deres anvendelse i ITSC generation. Derudover kan transduktion med 4F titreres, da for høje mængder af transgen ekspression fører til celledød. Generelt sub-dyrkning af individuelle ITSC lines kræver en vis praksis. I tilfælde af at problemer med subkultur af iTSCs forekomme (dvs.., Sub-dyrkede celler mislykkes at opretholde selvfornyelse og i stedet spontant differentierer), enkelt isolerede kolonier kan alternativt udpladet på skåle med 50% celledensitet på vækst inaktiveret feeder celler til at understøtte væksten og fastgørelse af celler. De ITSC linjer kan derefter gradvist vænnet fra foderautomater under efterfølgende passage. Notatet vi ikke lykkes direkte konvertere MEF i iTSCs bruger definerede TX medium forhold, da TX medium kun understøtter etableret ITSC / TSC linjer.
Hidtil er den protokol for ITSC induktion fra fibroblaster kun fastlagt for murine celler. Derfor vil det nu være af stor interesse for at tilpasse denne protokol til andre arter og muliggøre afledning af ITSC linjer fra humane eller andre modelsystemer. Desuden vil en analyse af de præcise mekanismer fibroblast til ITSC konvertering tilbyde nye indsigter i naturenaf den somatiske versus ekstra-embryonale afstamning barriere og hjælp til forståelse principper for celleskæbne bestemmelse under normal og patologisk udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20 °C |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
| human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80 °C |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
| ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
| Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
References
- Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Kubaczka, C., et al. Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts. Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).
- Benchetrit, H., et al. Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells. Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282 (5396), 2072-2075 (1998).
- Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin. Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).
- Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell. 121 (3), 465-477 (2005).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. (10), e550 (2007).
- Kubaczka, C., et al. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions. Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).
