Introduction
البلعمة هي وظيفة الخلايا الرئيسية التي تبدأ مع الاعتراف وربط المواد على السطح المستقبلات، مما يؤدي بعد ذلك إلى استيعاب وتدهور المواد بلعها. في حين حقيقيات النوى وحيدة الخلية مثل discoideum Dictyostelium العفن والاميبات استخدام البلعمة لتتغذى على البكتيريا، وقد تطورت الكائنات العليا مع خلايا المهنية. الضامة أو الخلايا الجذعية هي خط الدفاع الأول ضد الجراثيم في مختلف الأنسجة والأعضاء، وضرورية لتنشيط الجهاز المناعي التكيفي من خلال تقديم المستضد وخلوى إنتاج 1-4. في ظل ظروف معينة البلعمة يمكن أن يقوم بها الخلايا البلعمية غير المهنية، على سبيل المثال، البطانية والخلايا الظهارية. هذه العملية مهمة للحفاظ على التوازن خلال تطوير وفي مرحلة البلوغ لدوران الأنسجة الطبيعية والتجديد. البالعات أخيرا، متخصصة مثل خلايا سيرتولي في الخصية أو شبكية العينالخلايا الظهارية الصباغ للغاية البالعات قوية 5.
تشكيل يبلوع حيث يحدث تدهور الكائنات الدقيقة أو الحطام الخلوي يبدأ مع تجميع مستقبلات البلعمية على سطح الخلية البلعمية. الأحداث يشير إلى المصب التالية تجميع مستقبلات طهائية مثل مستقبلات التيسير (FCR) أو تكمل مستقبلات (CRS) اتسمت بشكل جيد. ومع ذلك، هناك أيضا العديد من مستقبلات غير طهائية بما في ذلك مستقبلات تول مثل (TLRs)، يكتينس، مستقبلات المانوز ومستقبلات زبال. هذه المستقبلات تعترف المحددات على سطح الجسيمات مثل المانوز أو فوكوسي المخلفات، فسفاتيديل، وعديدات سكر شحمية 1،6-9.
ويشمل الممرض أو الحطام الخلية الاعتراف ملزم لوتجميع عدة أنواع من مستقبلات البلعمية، التي تؤدي بدورها إلى المكثف وعابرة إعادة الأكتين. بالتوازي إيماس البؤري، من المقصوره داخل الخلايانهاية الخبر تساهم في الافراج عن التوتر الغشاء والمهم بالنسبة البلعمة فعالة من الجزيئات الكبيرة. تم تشريح الأحداث يشير مما يؤدي إلى الأكتين البلمرة وغشاء تشوه في النماذج التجريبية التي ادت الى مستقبلات أكلة واحدة. خلال البلعمة بوساطة FCR، هناك مكثفة بلمرة الأكتين التي ينظمها GTPases صغيرة (راك، Cdc42). بين المؤثرات الخاصة المصب، والبروتين متلازمة ويسكوت الدريخ (WASP) يؤدي إلى تفعيل للذات أكتين البروتين 2/3 مجمع (Arp2 / 3) أن nucleates خيوط الأكتين 1،2،4،10. الإنتاج المحلي لل، 5 bisphosphate (PI (4،5) ف 2) فوسفتيدلينوستول-4 هو أمر حاسم لبلمرة الأكتين الأولية أن يدفع تشكيل pseudopod. مطلوب تحولها إلى PI (3،4،5) ف 3 لتمديد pseudopod وإغلاق يبلوع 11. وتساهم عدة مسارات لاختفاء PI (4،5) ف 2. أولا مفرزة من فوسفتيدلينوستول الفوسفات الكيناإس إي إس (PIPKIs) من PI الاعتقالات يبلوع (4،5) ف 2 التوليف. ثانيا، يمكن فسفرته والتي يستهلكها الصف الأول PI3K تحركات (PI3K) وتحويلها في PI (3،4،5) ف 3 12. كما تم ضمنية دور للفوسفاتاز وفوسفوليباز في PI (4،5) ف 2 التحلل وإزالة F-أكتين خلال البلعمة في خلايا الثدييات وفي Dictyostelium 13،14. وδ فسفوليباز C (PLC) hydrolyzes PI (4،5) ف 2 في مادة ال diacylglycerol وإينوزيتول 1،4،5- تريس الفوسفات. كما تم تورط PI (4،5) ف 2 و PI (3،4،5) ف 3 الفوسفاتيز OCRL (متلازمة عينية مخية كلوية من لوي) في تشكيل يبلوع. تشكيل المحلية الدقيق للF-الأكتين والتحلل لها وينظم بإحكام في المكان والزمان، ونحن قد أظهرت أن التوظيف من المقصورات داخل الخلايا المهم لتقديم محليا الفوسفاتيز OCRL، مما يسهم في التحلل الأكتين المحلي في قاعدة الكأس أكلة تبقى آلية والجزيئي اللاعبين المطلوب للإغلاق يبلوع وانفصال الغشاء محددة بشكل واضح بسبب الصعوبات في تصور ورصد موقع إغلاق يبلوع. حتى وقت قريب، وقد لوحظ البلعمة على خلايا ثابتة أو الحية التي استيعاب جزيئات على وجهه الظهرية أو على الجانبين، مما يجعل من التصور في الوقت المناسب من موقع يبلوع إغلاق الصعب. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن طرق تحديد يسبب انكماش الأغشية والتحيز النتائج على تمديد أقدام كاذبة والإغلاق. على النقيض من ذلك، وفحص أن أنشأنا ووصف هنا يسمح لنا تصور تمديد pseudopod وخطوة إغلاق البلعمة في الخلايا الحية 13، على أساس إجمالي المجهر التأمل الداخلي (TIRFM) 16. تستخدم هذه التقنية البصرية موجة زائل لإثارة fluorophores في منطقة رقيقة في واجهة بين شفافية حتىغطاء (ساترة) وسائل (مستنبت الخلية). سمك عمق الإثارة حوالي 100 نانومتر من سطح صلب، مما يسمح التصور من الأحداث الجزيئية قريبة من غشاء البلازما. TIRFM يسمح ارتفاع نسبة إشارة إلى الخلفية، ويحد من مضان خارج نطاق التركيز جمعها والسمية الخلوية بسبب الإضاءة من الخلايا. الاستفادة من TIRFM، قمنا بتطوير "يبلوع إغلاق فحص" التي يتم تنشيط coverslips مع بولي يسين ثم المغلفة مع خلايا الدم الحمراء opsonized مفتش (مفتش-SRBCs). ثم يسمح الضامة معربا عن البروتينات عابر الموسومة fluorescently التي تهم تبتلع مفتش-SRBCs. في حين أن الخلايا فصل الجزيئات المستهدفة التي هي ملزمة لسطح الزجاج غير تساهمي، نصائح من pseudopods يمكن ملاحظتها وتسجيلها في وضع TIRF. يتم الجمع بين الاستحواذ TIRF مع الاستحواذ في وضع epifluorescence، بعد تحويل ميكرون المرحلة 3 أعلاه، والذي يسمح فيماualization من قاعدة الكأس البلعمة. إضافة العقاقير الدوائية مثل تلك التي تحول دون الأكتين أو dynamin أثناء عملية ممكنة أيضا لزيادة تشريح عملية على المستوى الجزيئي. بروتوكول صفها بالتفصيل هنا هو لالفئران خط خلية بلعم RAW264.7 والجسيمات opsonized، ولكن عمليا، ويمكن أن تتكيف مع أي خلية أكلة أخرى ومع أهداف أخرى مثل الخرز. وهذه الطريقة تسمح توصيف أفضل للتنظيم في الزمان والمكان من اللاعبين الجزيئية تشارك في تمديد pseudopod وإغلاق يبلوع خلال مختلف العمليات أكلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: البلازميد تستخدم Lifeact-mCherry هو هدية كريمة من الدكتور غيوم مونتاينا، معهد كوري في باريس، ولدت بعد 17.
1. خلايا وترنسفكأيشن
ملاحظة: تزرع الضامة RAW264.7 إلى confluency الفرعية في المتوسط كاملة (RPMI (روزويل معهد الحديقة التذكارية) 1640 المتوسطة، و 10 ملي HEPES، 1 ملم البيروفات الصوديوم، 50 ميكرومتر β-المركابتويثانول، 2 مم L-الجلوتامين و 10٪ FCS ( مصل العجل الجنين)) في لوحة 100 ملم. و transfected أنها مع البلازميدات ترميز البروتينات الموسومة التي fluorescently Electroporation لل. بشكل روتيني حوالي 5-6 س و transfected 10 6 خلايا مع 20 ميكروغرام أو 10 ميكروغرام البلازميد لكل ترنسفكأيشن أو شارك في ترنسفكأيشن على التوالي. لاحظ أن وسائل أخرى للترنسفكأيشن على أساس Electroporation للأو lipofection يمكن استخدام أساليب بديلة.
- تتخلص من الخلايا مع رافع الخلية و resuspend لهم في 10 مل من مستنبت بواسطة pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات.
- أجهزة الطرد المركزيتعليق خلية 300 x ج، 5 دقائق على RT في الدوار زاوية يتأرجح.
- سخن 10 مل من المتوسط كاملة تستكمل مع 10 ميكروغرام / مل الجنتاميسين عند 37 درجة مئوية.
- بعد الطرد المركزي، ونبذ طاف و resuspend بيليه في 3 مل من "غسل عازلة أ" من عدة Electroporation لل.
- الطرد المركزي تعليق خلية 300 x ج، 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الدوار زاوية يتأرجح.
- في هذه الأثناء تحضير مزيج الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة: 120 ميكرولتر 2X B الاحتياطي، 20 ميكروغرام البلازميد ترميز الحمض النووي للبروتين من الفائدة، برنامج البداية السريعة 240 ميكرولتر H 2 O.
- بعد الطرد المركزي، ونبذ طاف بأسره.
- resuspend الكرية خلية في مزيج الحمض النووي ونقل إلى cuvettes Electroporation لل4 مم.
- في احتضان RT لمدة 3 دقائق.
- Electroporate في 250 V، 900 μF.
- على الفور resuspend الخلايا في مرحلة ما قبل تحسنت (37 ° C) المتوسطة كاملة تستكمل مع الجنتاميسين ولوحة للم في صحن 100 ملم.
- احتضان خلايا transfected بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
- في صباح اليوم التالي، تحل محل المتوسطة كاملة مع 10 مل من مصل خالية المجهر المتوسطة (RPMI 1640 دون الفينول الأحمر، 10 ملي HEPES، 1 ملم البيروفات الصوديوم، 50 ميكرومتر β-المركابتويثانول، 2 مم L-الجلوتامين).
2. طهاية من خلايا الدم الحمراء
ملاحظة: كما نموذجا للهدف الجسيمات لالضامة، وتستخدم خلايا الخراف الدم الحمراء (SRBCs). عادة، يتم استخدام حوالي 7 × 10 6 SRBCs في 35 مم طبق أسفل الزجاج.
- غسل SRBCs مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X (الفوسفات مخزنة المالحة) /0.1٪ BSA (البقري ألبومين المصل) وأجهزة الطرد المركزي (600 x ج، 4 دقيقة).
- بعد الطرد المركزي، ونبذ طاف و resuspend SRBCs في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X / 0.1٪ BSA وأجهزة الطرد المركزي (600 x ج، 4 دقيقة).
- بعد الطرد المركزي، ونبذ طاف و resuspend SRBCs في برنامج تلفزيوني 1X / 0.1٪ BSA مع أرنب مفتش مكافحة SRBCsفي شبه التصاق التركيز. استخدام 500 ميكرولتر من محلول يحتوي على الأجسام المضادة / 5 ميكرولتر من SRBCs.
ملاحظة: إن تركيز-التصاق فرعية من الأجسام المضادة يتوافق مع أدنى تركيز التي لم لحث على تراص الكشف عن تشكيل شبكة. بشكل عام، وتركيز-التصاق الفرعية هو 8.2 ميكروغرام / مل.- تحديد تركيز مفتش مكافحة SRBCs اللازمة ليستطهي وSRBCs من خلال اختبار التراص. مخفف تسلسليا مكافحة SRBCs (السهم عند 13.1 ملغ / مل) مفتش بين 1/50 - 1/25600 في صفيحة. إضافة 2 × 10 6 SRBCs في كل بئر. احتضان لوحة في الظلام في RT لعدة ساعة.
- في احتضان RT لمدة 30 دقيقة مع دوران بطيء.
- بعد سنتين يغسل في برنامج تلفزيوني 1X / 0.1٪ BSA كما هو موضح أعلاه، resuspend وSRBCs opsonized مفتش (مفتش-SRBCs) في درجة حرارة ما قبل المصل خالية المجهر المتوسطة (2 مل / طبق).
طلاء 3. بولي يسين من Coverslips
- في هذه الأثناء، وعلاج 35 ملم الزجاج أطباق أسفل مع 2 مل من 0.01٪ بولي-L-ليسين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الأطباق مرتين مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
4. التثبيت غير التساهمية SRBCs على أطباق أسفل الزجاج
- صب 2 مل من SRBCs تعليق في 35 مم الزجاج طبق أسفل.
- أجهزة الطرد المركزي مع الدوار يتأرجح في 500 x ج خلال 2 دقيقة على أطباق أسفل الزجاج 35 مم.
- إزالة طاف ويغسل مرة واحدة مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X / 10٪ BSA.
- احتضان الجسيمات لمدة 30 دقيقة مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X / 10٪ BSA لكل طبق.
- غسل الأطباق ثلاث مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
- استبدال 1X برنامج تلفزيوني مع 2 مل من قبل تحسنت (37 ° C) مصل خالية المجهر المتوسطة.
5. البلعمة تصور من قبل TIRFM
- مجهر
ملاحظة: تم تنفيذ TIRFM باستخدام مجهر مجهزة هدف النفط الغمر (N 100X، NA1.49)، وغرفة التدفئة مع CO 2، واثنين من الغناءلو كاميرات كشف الفوتون EMCCD (الإلكترون ضرب المسؤول جهاز جانب) إلى جانب وجود عدسة 1.5X.- قبل يوم من جلسة المجهر TIRF، تشغيل غرفة التدفئة في 37 درجة مئوية للسماح للتدفئة متجانسة للمرحلة المجهر.
- تحديد زاوية حرجة
ملاحظة: يستخدم برنامج ImageJ اللون التعريف لمعالجة تيارات صورة TIRF.- وضع 35 ملم الزجاج طبق السفلي يحتوي على SRBC opsonized مع المصل خالية المتوسطة المجهر تحت المجهر.
- تتخلص من الخلايا و resuspend منهم في المتوسط قبل إضافتها (100-500 ميكرولتر) في صحن.
- استخدام "لايف اقتناء" برنامج لمراقبة المجهر وتنفيذ الإثارة مع 491 نانومتر و / أو ليزر 561 نانومتر لتحديد الخلايا معربا عن البروتينات الموسومة fluorescently.
- تحديد الخلايا التي تعبر عن البروتينات الموسومة fluorescently.
- وضعه في وسط الميدان والحصول على 500 ايمالأعمار في الطول الموجي الإثارة واحد، مع زوايا مختلفة تبدأ من 0º حتى 5º، بزيادة قدرها 0.01º (الشكل 2A). يتم تغيير زوايا تلقائيا من قبل النظام المجهر.
- تحديد الزاوية الحرجة والسماح للضوء الحادث أن تنعكس تماما على الزجاج / واجهة المتوسطة وتوليد موجة زائل. باستخدام برنامج ImageJ اللون التعريف، افتح تسلسل الصور من خلال النقر على "ملف"، "فتح" وحدد الملف.
- تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI)، مع أداة مستطيلة، في الخلية مع مضان موحد (الشكل 2B الأصفر 1).
- مؤامرة "لمحة محور Z" يعني كثافة مضان تقاس في العائد على الاستثمار مع وظيفة من الزوايا على محور س بالضغط على "صورة" علامة التبويب "الأكوام" في القائمة المنسدلة و "أرض الملف Z-محور" أسفل (الشكل 2B أحمر 2).
ملاحظة: الزاوية الحرجة هي الزاوية التي أدت إلى أماهمضان ximum قبل انخفاض حاد في مضان. - استخدام أي قيمة زاوية على محور س متفوقة على الزاوية الحرجة خلال الدورة المجهري للحصول على إشارة TIRF كمثال 2.00 (الشكل 2C).
- الاستحواذ
- استخدام برامج لايف شراء، إعداد معلمات من الاستحواذ مع وحدة "بروتوكول محرر" (الشكل 3A).
- إنشاء بروتوكول مع "حلقة" التي تضم "قنوات متعدد" الاستحواذ للحصول على إشارة الفلورسنت من البروتينات ذات الاهتمام في المنطقة TIRF. أدخل زاوية TIRF (على سبيل المثال 2.00)، ووقت التعرض (على سبيل المثال 50 ميللي ثانية) وكثافة الليزر (على سبيل المثال 50٪) (الشكل 3B 1).
- إدخال "Z خطوة" من ميكرون الهدف 3 أعلاه المنطقة TIRF للحصول على اكتساب إشارة في epifluorescence مع أداة "قنوات متعدد". أدخل زاوية أدناه رانه الزاوية الحرجة (كمثال 1.00)، وهي المرة من المعرض (50 ميللي ثانية) وكثافة الليزر (50٪) (الشكل 3B و 2 و 3).
- المقبل إضافة "ض خطوة" من ميكرون الهدف 3 أدناه، للعودة في المنطقة TIRF (الشكل 3B 4). إضافة "لقطة" من الخلية في الضوء الساطع LED (ديود باعث للضوء) (الشكل 3B 5).
- العثور على خلية في المصالح مع معدل معتدل للتعبير البروتين الموسومة fluorescently الذي يبدأ البلعمة من SRBC من خلال توسيع غشاء البلازما حول الجسيمات.
- وضعه في وسط الميدان.
- بدء تدفق اقتناء 500 - 1000 الإطارات. في علامة التبويب "حلقة العد"، أدخل "750 لقطة" (الشكل 3B 1).
ملاحظة: يستخدم برنامج ImageJ اللون التعريف لمعالجة تيارات صورة TIRF. - فتح الصور تسلسل في صورة J البرنامج عن طريق النقر"ملف"، "فتح" واختيار الملف.
- فصل القنوات عن طريق النقر على علامة التبويب "صورة"، "Hyperstacks" القائمة المنسدلة وعلى "المكدس لhyperstack" وظيفة. إكمال إطار ظهر: الترتيب: xyctz. قناة (ج): عدد من القنوات (على سبيل المثال: "2" إذا كان لديك اثنين fluorochromes)؛ شرائح (ض): عدد من شرائح في محور ض (على سبيل المثال: "1" إذا كان هناك أي تحرك في محور Z-)؛ إطارات (ر): عدد من الصور مقسمة في عدد من القنوات. عرض الوضع: درجات الرمادي.
ملاحظة: يتم إنشاؤها اثنين من متواليات صورة منفصلة، المقابلة لاثنين من قنوات مختلفة.
- استخدام برامج لايف شراء، إعداد معلمات من الاستحواذ مع وحدة "بروتوكول محرر" (الشكل 3A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمثل نظام تجريبي وصفها في هذه المخطوطة تخطيطي في الشكل 1. توضع الضامة Transfected RAW264.7 معربا عن البروتينات ذات الاهتمام تنصهر علامة فلوري في اتصال مع الأغنام opsonized مفتش خلايا الدم الحمراء (SRBCs) التي كانت ثابتة غير تساهمي على ساترة. يمكن الضامة فصل في SRBC من ساترة لتبتلع ذلك. المجهر TIRF تستخدم يسمح اكتساب يصاحب ذلك من الإشارات من منطقة TIRF الموافق نصائح من pseudopods وإشارات في وضع epifluorescence بعد تحول Z 3 ميكرون أعلاه.
ومن الضروري لتحديد الزاوية الحرجة لمجموع مضان انعكاس داخلي كما هو موضح في الشكل 2. وهذا يضمن إشارة TIRF نظيفة من منطقة 100 نانومتر تحت غشاء البلازما الشكل 3 يمثل تطوير acquisitiعلى المعلمات من خلال وحدة تسمى "محرر البروتوكول" المدرجة في البرنامج لايف شراء. هذا النموذج يسمح للمستخدمين إنشاء وإدارة سير العمل قبل أن يتم إرسالها إلى المجهر، التي سيتم تنفيذ هذه العملية. في نهاية عملية الاستحواذ، المستخدم يجمع تيار TIFF.
ويبين الشكل 4، والخلية الحية فيلم TIRFM الممثلين "يبلوع إغلاق فحص" في الضامة RAW264.7 transfected مع البلازميد (على سبيل المثال، Lifeact-mCherry، هدية عينية من الدكتور غيوم مونتاينا، معهد كوري في باريس، ولدت بعد 17) متابعة البلمرة أكتين. سمح الضامة عابر البلازميد معربا عن بابتلاع مفتش-SRBCs منضمة إلى ساترة. كما تم الرئيسي يعارضها نصائح من pseudopods إلى ساترة الزجاج حول SRBC واحد، والكشف عن عصابة F-أكتين في المنطقة TIRF (لوحة العليا) التي تضيق تدريجيا حتى إغلاقه. في موازاة ذلك، ضبابية F-الأكتينإشارة الكشف عنها بواسطة epifluorescence بعد تحويل المرحلة 3 ميكرون فوق (اللوحة السفلية) تتوافق مع التحلل في قاعدة الكأس البلعمة. بعد 3 دقائق من الاستحواذ، كان SRBC المنضوية تماما، كما أكد مع الضوء المرسل (لوحة على اليمين).
لذلك، وهذه الطريقة يمكن استخدامها للتمييز بشكل صحيح الأحداث الجزيئية التي تحدث في أقاصي pseudopods والأحداث الجزيئية التي تحدث في قاعدة الكأس البلعمة.
الشكل 1. التمثيل التخطيطي ل"يبلوع إغلاق الفحص" تحليلها من قبل TIRFM. يتم تنفيذ فحص إغلاق يبلوع باستخدام الضامة معربا عن عابر واحد أو اثنين الموسومة fluorescently البروتين. وتودع الضامة على SRBCs opsonized مفتش الثابتة غير تساهمي على الص بولي يسينتيد coverslips. يتم تسجيل الصور في وضع TIRF للكشف عن موقع إغلاق يبلوع وفي وضع epifluorescence للكشف عن قاعدة من الكأس البلعمة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحديد زاوية حرجة للTIRFM. (أ) عن طريق "اقتناء لايف"، يتم وضع الخلايا معربا عن البروتينات الموسومة fluorescently في وسط الميدان (منطقة 1 باللون الأحمر). مع خيار TIRF ستاك، تم الحصول على الصور في الطول الموجي الإثارة واحد، مع زوايا مختلفة تبدأ من 0 درجة تصل إلى 5 درجة مئوية، بزيادة قدرها 0.01 درجة (المنطقة 2 باللون الأحمر). (ب) يتم فتح سلسلة من الصور باستخدام يماغيج برنامج لون التعريف وكثافة مضان يعني من عيتم رسم egion من الفائدة (ROI) مع وظيفة من الزوايا على محور س باستخدام "الأكوام" و "بلوتز محور الشخصية" (منطقة 1 باللون الأحمر). (ج) موقف س من ذروة مضان على مؤامرة يناظر الزاوية الحرجة: 1.98 ° (الخط المنقط الأسود). يمكن استخدام أي قيمة بعد هذه الزاوية. وكمثال على ذلك، يمكن اختيار 2.00 درجة (خط أحمر). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. عملية سير العمل باستخدام لايف شراء وحدة: "محرر البروتوكول". (أ) في إطار "محرر البروتوكول"، يتم إنشاء قماش سير العمل. (ب) ويضم هذا البروتوكول "حلقة" من الإجراءات التي المجهر ويكرر عدة مرات قررتمن قبل المستخدم. وكمثال على ذلك: 750 (1). وشملت واحدة حلقة: "قنوات متعدد" الاستحواذ مع الإثارة ليزر من البروتينات الفلورية من الاهتمام في وضع TIRF. كمثال: ليزر 491 نانومتر كثافة 50٪ زاوية -TIRF 2.00 (2)؛ "Z الخطوة" الهدف 3 ميكرون (3)؛ "قنوات متعدد" الاستحواذ في وضع epifluorescence (4)؛ "Z الخطوة" الهدف إلى المنطقة TIRF (5) و "لقطة" في ضوء المنقولة (6). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
والمتراكمة الشكل 4. F-الأكتين باعتباره نقطة في موقع يبلوع إغلاق. يبلوع إغلاق فحص أجري باستخدام الضامة RAW264.7 معربا عن عابر البلازميد Lifeact-mCherry (هدية عينية من الدكتور غيوم موntagnac، معهد كوري في باريس، ولدت بعد 17). وقد حصلت على إشارة البلازميد في TIRF منطقة (أعلى) وفي وضع epifluorescence (القاع). ويشير السهم الأحمر تراكم الأكتين في المنطقة TIRF. ويرد تنتقل صورة الخفيفة في 3 دقائق، مما يشير إلى SRBC المنضوية. شريط النطاق، 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيلم 1: المتراكمة F-الأكتين في نصائح من Pseudopods وفي الموقع من يبلوع الإغلاق، بينما برأت ذلك من قاعدة من تم تنفيذها باستخدام الضامة RAW264.7 معربا عن عابر البلازميد فحص إغلاق أكلة كأس يبلوع. تم إجراء التصوير البلازميد في TIRF منطقة (أعلى) وفي وضع epifluorescence (القاع) باستخدام TIRFM البديللاي كل 50 مللي ثانية خلال 3 دقائق عند 37 درجة مئوية. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cuvettes 4 mm | Cell project | EP104 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | Room temperature |
| Electrobuffer kit | Cell project | EB110 | |
| 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Gene X-cell pulser | Biorad | 165-2661 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | |
| iMIC | TILL Photonics | Oil-immersion objective (N 100X, NA1.49), heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens | |
| Poly-L-Lysine Solution 0.1% | Sigma | P8920-100ml | Dilution at 0.01% in water |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10 x 500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nat Rev Immunol. 14, 166-180 (2014).
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S.
- Underhill, D. M., Ozinsky, A.
- Canton, J., Neculai, D., Grinstein, S. Scavenger receptors in homeostasis and immunity. Nat Rev Immunol. 13, 621-634 (2013).
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262, 193-215 (2014).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J Cell Biol. 169, 139-149 (2005).
- Schlam, D., et al. Phosphoinositide 3-kinase enables phagocytosis of large particles by terminating actin assembly through Rac/Cdc42 GTPase-activating proteins. Nat Commun. 6, 8623 (2015).
- Marion, S., et al. The NF-kappaB Signaling Protein Bcl10 Regulates Actin Dynamics by Controlling AP1 and OCRL-Bearing Vesicles. Dev Cell. 23, 954-967 (2012).
- Loovers, H. M., et al. Regulation of phagocytosis in Dictyostelium by the inositol 5-phosphatase OCRL homolog Dd5P4. Traffic. 8, 618-628 (2007).
- Deschamps, C., Echard, A., Niedergang, F. Phagocytosis and cytokinesis: do cells use common tools to cut and to eat? Highlights on common themes and differences. Traffic. 14, 355-364 (2013).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Chapter 12, Unit 12.29: Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Curr Protoc Cytom. , (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Marie-Anais, F., Mazzolini, J., Herit, F., Niedergang, F. Dynamin-actin cross-talk contributes to phagosome formation and closure. Traffic. 17 (5), 487-499 (2016).
