Introduction
단거리 대체 셉터 또는 도너 사이트는 서로 가까운 위치에 (탠덤) 스 플라이 싱은, 포유류 1 무척추이 식물 3에서 일반적이다. 포유 동물 유전자의 20 % 대체 스플 라이스 부위 떨어져 2-12 뉴클레오타이드 4를 포함하는 것으로 추정된다. 이러한 사이트의 대부분은 3 개의 뉴클레오티드 떨어져 단일 코돈의 포함 또는 제외 될. 다른 사람들이 조직 특이성 (8)에 따라 규정을 유추하면서 접합 모티브 차이가 선택 확률 7 너무 미묘하다 몇 가지 논쟁과이 사이트 5,6에 접합 규제의 성격에 대한 논쟁이있다.
탠덤 접합 부위의 선택은 변형 된 모세관 전기 영동 (7) 및 고해상도 겔 전기 영동 (8)를 이용하여 반 정량적으로 분석되었다. RNA-SEQ (RNA 서열)은 각 접합부에서 접합 비율을 정량하는 데 사용될 수 읽기대지. 이러한 방식으로, RNA-SEQ 데이터 탠덤 접합 부위 (9)의 조절에 대한 통찰력을 제공했다. 또한 염기 모티브 (10)에 따라 예상 스플 라이스 변형 비율의 예측을 사용할 수있다. 포함 또는 하나의 코돈 (N은 어떤 뉴클레오티드를 =) NAGNAGs로 알려진 더 일반적으로 발생하는 탠덤 수용체 스플 라이스 사이트에있다 제외 접합에 대한 강조의 대부분.
(Y는 피리 미딘을 = GYNGYN 인식 모티브를) 포함 또는 하나의 코돈을 제외한 직렬 기증자 대체 스플 라이스 사이트는 탠덤 수용체보다 일반적이다. 신호 변환기 및 전사 3 (STAT3)의 활성화는 탠덤 기증자 대체 접합 1,11을받은 핵심 유전자이다. 탠덤 접합 공여체 부위는 엑손 (21, 22)를 결합하고 세린 701 (S 또는 각각 ΔS) 1,11 대한 코돈을 포함 또는 제외 될. (40 뉴클레오티드 서로 떨어져) 다운 스트림 대안 수용체 사이트에 가입 엑손 (22)전이 활성화 도메인 (α) 7 고유의 C 말단 잔기 (β) (11)와 절단 된 전이 활성화 도메인의 55 단자 잔류 하나의 포함에 23A / B의 결과입니다. 따라서, 네 개의 접합부의 변형이 가능하다.
STAT3 단백질은 다양한 세포 유형 12 전사 인자 및 주요 신호 통합과 돌연변이 때 그 구성 적 활성화 (참고 13에서 검토) 여러 가지 암의 표현형에 기여한다. 욥의 증후군, IgE의 높은 수준의 특징으로하는 면역 결핍 질환이 또한 STAT3의 돌연변이에 의해 발생합니다 (참고 14에서 검토). STAT3의 α와 β 스플 라이스 변형 단백질에 대한 고유 한 역할이 이전 된 15 설명했다. 처음에, STAT3 β는 STAT3의 α의 전사 활성을 길항, 지배적 인 음성 방식 (16)에 작용하는 것으로 생각하지만, 이후의 작업은 독립적 인 표적 유전자 (17)가 제안되었다 18 인산화 잔류 물)에 근접하지만, 최근의 연구는 STAT3 S와 ΔS 스플 라이스 변종 STAT3 중독 확산 대형 B 세포 림프종 (DLBLCL)의 생존을 위해 모두 필요하다고 제안 세포 19. 생물학적 관련성 탐구 일이다. 스플 라이스 변이체 조성물은 기능에 영향을 미칠 수 있다는 것을 감안하면 비가 호산구 사이토킨 자극에 의해 교란 된 주는지 노력.
우리는 처음에 S 스플 라이스 변종, AfeI에 대한 특정 제한 효소와 제품의 절단 다음 STAT3의 α와 β 스플 라이스 변종에 대한 PCR의 특정을 사용하여 두 개의 접합 이벤트 사이의 연결을 탐구하려고 시도했습니다. Ser701이 연구되었다의 제품 농도계는 포함을 표시씼어 열 배 더 많이 STAT3의 α와 β 모두의 누락 (ΔS)보다 (데이터가 표시되지 않음). 그러나,이 반 정량적 인 접근을 충분히 재현되지 않고, 네 개의 접합부를 동시에 측정하는 변형을 유효하게 이용할 수 없었다. 네 스플 라이스 변이체의 각각의 비율을 분석하기 위해 꽉 기술 (주어진 샘플 여러 분석)을 수득 정량적 PCR (qPCR에) 프로토콜을 설정할 필요가 있었다 복제.
상대 qPCR에 특정 레벨 (20)에서 발현되는 것으로 공지 된 표준 또는 하우스 키핑 유전자를 관심있는 유전자의 비교에 의존 관심과 하우스 키핑 유전자의 유전자 유사한 효율로 증폭하는 경우에 적합하다. 이중 가닥 (DS) DNA 결합 형광 (시아닌) 염료는 PCR의 증폭 (21)에 결합하고,주기의 특정 숫자 후, 충분한 증폭 검출로 형광을 위해 발생했습니다. 높은 초기 레벨사체의 하부 역치 사이클 (CT) 값. cDNA의 제제의 농도가 상이하기 때문에, 하나의 호산구 22-β 글루 쿠 (GUSB) 등 모든 샘플에서 일정한 수준으로 발현되는 것으로 공지 된 전 사체의 농도 사체의 농도를 비교할 필요가있다.
상대 qPCR에 탠덤 접합으로 인한 스플 라이스 변종에서 볼 수 있듯이, 매우 유사한 시퀀스 가능하지 않습니다. 구체적 스플 라이스 변이체를 증폭하기 위해 필요한 엄격한 조건이 효율 저하를 초래한다. 대신, 절대 정량 (23)를 사용해야합니다. 이는 관심의 접합 사체의 알려진 농도의 표준 곡선을 준비하는 것을 수반하고, 보장 PCR 조건은 24 특이성을 최적화한다. 설명한 바와 같이, 특정 유전자에 대한 절대 및 상대 qPCR의 데이터에 특정 세포 유형으로 유전자의 발현에 대한 이해를 알리기 위해 병합 될 수있다다양하게 자극 호산구 (25)이 경우 STAT3.
여기서, STAT3 스플 라이스 변이체 정량화 방법은 다른 탠덤 접합 이벤트 대상 연구에 적용 할 수 있다는 기대를 설명한다. 최적화는 다양한 농도와 자전거 매개 변수의 다수의 반복에서 여러 프라이머 쌍은 몇 달에 걸쳐 시험 하였다 긴 과정이었다. 프로토콜의 주요 기능은 스플 라이스 변종의 알려진 농도의 표준 곡선에 따라 프라이머 특이성 검증 및 정량화 있습니다. 함께 상대 qPCR에 우리의 응용 프로그램에 도움이 입증하지만 필요가 없습니다.
Protocol
참고 : 말초 혈액 호산구가 건강 과학 임상 시험 심사위원회에 대한 위스콘신 - 매디슨 센터의 대학의 프로토콜 승인 (# 2,013에서 1,570 사이)에 있던 정보를 식별하지 않고 받았다. 도너 서명 된 동의서 연구에서 각 샘플의 사용을 얻었다.
1. 템플릿을 기준으로 플라스미드 만들기
- 표 1A에 따라 5'- KpnI로 절단하고 된 NheI 제한 부위 (및 5'-확장)으로, 모두 STAT3 스플 라이스 사이트를 걸치는의 증폭을위한 프라이머를 만듭니다.
참고 : KpnI로 절단하고 된 NheI 사이트는 삽입을 사용하도록 선택 하였다는 카나마이신 저항을 25, 26으로 수정 된 애완 동물 28A 벡터에 결찰 할 KpnI로 절단 사이트는 여러 복제 사이트에 추가되었다.. - 세포 배양 배지에서 2.5 × 106 세포 / ml의 중복 샘플을 준비 갓 기부 호산구 사용 (로스웰 파크 Memoria리터 연구소 (RPMI) 1640 배지). 5 % CO 2 및 10 % 습도하에 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션.
- RNA의 추출 및 cDNA 합성 키트를 사용하여 제조 업체의 지침에 따라 (준비 당 적어도 1 × 10 6 세포) 시료에서 보완 (C) DNA를 준비합니다.
- 템플릿 cDNA를 단계 1.2.1에서 제조에서 STAT3 스플 라이스가 표 2A에 따라 증폭 PCR을 사용하여 변형 증폭.
- 2 % 아가 로스 트리스 - 아세테이트 - 에틸렌 (TAE) 젤 (27)에서 증폭를 해결합니다. 겔로부터 소비세 밴드 및 겔 절단 키트 설명서에 따라 정제.
- 볼륨, 배양 시간 및 온도를 사용하여 적절한 제한 효소 (참조 (27)의 제한의 개요)와 컷 증폭 및 플라스미드 효소 제공자에 의해 권장, 단계 1.4에서와 같이 정화. 공급자 권장 조건에서 플라스미드에 제한 증폭을 결찰.
- 음 계속 준비ROL (리가 삽입하지 않고 있지만으로 제한 플라스미드 DNA)과 양성 대조군 (카나마이신 저항 제한 플라스미드). 관할 E.의 표준 플라스미드 변환을 수행 대장균 DH5α 28 사용 결찰 혼합물 27.
- 형질 전환 된 E.을 품어 1ml를 루리아 - 브로 쓰 (LB) 배지에서 대장균을 37 ° C에서 1 시간 동안 진탕 (27 지시 된 바와 같이 제조). 50 / ㎖ 카나마이신 μg의와 하룻밤 37 ° C에서 품어 포함하는 LB 플레이트에 확산 형질 전환.
- 멸균 이쑤시개 (27)를 사용하여 STAT3의 α와 STAT3의 β 판에서 여러 식민지를 선택합니다. 2 ml의 (LB)에 각각 이동 진탕 배양기에서 37 ° C에서 하룻밤 문화를 성장.
- 하는 DNA 정제 키트에 제공된 지침에 따라 세균성 문화 플라스미드를 정제. -20 또는 -80 ° C에서 보관 플라스미드.
- 20 μl의 염기 서열 반응을 준비하여 여러 식민지에서 시퀀스 플라스미드. 피펫 (3)시퀀싱 μL 반응 완충액, 2 ㎕의 서열 분석 반응 혼합물 12 μL을 초순수 템플릿 2 μl를 시퀀싱 프라이머 1 ㎕의 플라스미드.
참고 : 애완 동물-28A 벡터를 사용하는 경우, '시퀀싱 프라이머 5'-TAA TAC GAC TCA CTA 태그 GGG-3을 사용합니다.- Sα, Sβ, ΔSα 및 ΔSβ 25 : 각 변형을 인코딩하는 플라스미드의 electrophoretograms을 평가합니다.
- NG / μL에서 순수한 플라스미드 DNA의 측정 농도. 분광 광도계를 사용하여 260 nm에서 흡광도를 판독하는 경우, 비어 - 람 베르트 법칙 (29)를 이용하여 DNA 농도를 구한다
여기서 c = 농도, A = 흡광도, ε (흡광 계수) = 0.02 (μg의 / ㎖) -1 cm -1 빛의 이중 가닥 DNA와 L = 경로 길이 (보통 1cm)합니다. - STAT3 스플 라이스 변형의 cDNA 오전의 분자량을 사용하여plicons 상기 벡터는 당 μL 카피 수를 계산한다.
참고 : 염기쌍 당 분자량 (BP)은 650 다로 추정된다.
2. 절대 qPCR에 대한 프라이머 특이성 분석
- 초순수를 사용 μL 당 ~ 8월 10일에서 3월 10일까지 사본 (20 μL)와 STAT3 플라스미드의 10 희석 시리즈 1을 준비합니다. 가장 집중의 측정 농도 (μL 당 10 ~ 8 사본, 단계 1.11 참조).
- 4 개의 "비 대상"믹스를 준비하기 위해 희석 플라스미드를 사용 (예., STAT3 Sα, ΔSα, Sβ 있지만 ΔSβ의 동일한 농도를 포함하는 STAT3 ΔSβ 음성 대조군) 각 μL 당 10 6 사본에. μL 당 10 6 사본에 네 개의 템플릿 각각의 동일한 농도와 "대상"믹스를 준비합니다.
- 프라이머 쌍 솔루션을 준비각 스플 라이스 변종들 (560 nM의 것입니다 샘플의 최종 농도) 7 μM 농도에서 ~하여 프라이머 각각 60 μl를 (표 1B와 그림 1 참조).
- 순수한 H 2 O로 5 : DNA 폴리머 라제 / dsDNA 염료 결합 믹스 7 희석
- 템플릿 (표 3)에 도시 한 바와 같이 96 웰 PCR 플레이트에 분석 한 설정.
- DNA 중합 효소 / 염료 혼합 dsDNA가 결합 희석 21 μl를 추가 한 다음 프라이머 믹스 2 μL 및 템플릿의 2 μL (표에 따라 2B). 대신 템플릿의 잘 아니 템플릿 컨트롤 (NTC)에 H 2 O 필터 2 μl를 추가합니다. 중복의 설정 반응은 반복 (30)을 평가합니다.
- 접착제 커버와 12 ° C에서 1,200 XG에 5 분 동안 원심 분리기와 인감 qPCR에 접시입니다.
- 설명에 따라 자료에 나와있는 소프트웨어를 사용하는 경우, 실험을 설정합니다.
- qPCR에 기계와 인서트를 켜고은 qPCR에 판을 밀봉. 파일을 클릭 &# 62; 새> 다음>, "새 감지기"를 선택 리포터를 선택, 소광와 이름을 제공합니다. 각 스플 라이스 변형에 대한 "새로운 감지기"를 설정합니다.
- 수량을 확보, 다음을 선택하고 설정 샘플 플레이트 페이지에 메시지로 기준을 설정 테이블에 입력하고 적절한 탐지기가 선택됩니다. 마침을 클릭합니다.
- 표 2B에 따라 순환 설정합니다. (CT를 결정하는) 읽기가 형광을 확인 각 사이클의 72 °의 C 단계에서 발생합니다. 실행을 선택합니다.
- 실행이 완료되면 결과 탭> 증폭 플롯 탭을 클릭합니다. (그림 2에서와 같이 지수 플롯을 찾습니다) 데이터 품질을 평가하기 위해 출력 증폭 플롯을 평가합니다.
주 : 확인 증폭 플롯 주로 지수 및 순환 액이 플롯의 지수 부분으로 설정 될 수있다. 확인 NTCS 증폭되지 않고 다른 표준 포인트 높은 ΔRn와 낮은 코네티컷 값을 보여줍니다. - 특급하려면오트는 파일> 내보내기> 결과를 클릭, 스프레드 시트 소프트웨어에 발생합니다.
3. 절대 qPCR에 분석 특이성 및 반복성 평가
- 반복
- 코네티컷의 표준 편차 값 (형광에 대한 임계 사이클)를 계산하는 단계 2.7.5에서 데이터를 사용합니다.
여기서 N = 샘플 수 (2 중복 할 경우)
= 샘플의 코네티컷과 
= 코네티컷 의미 샘플. 중복 코네티컷 값의 표준 편차 ≤0.2 있는지 확인합니다. NTC 우물하지만 모두 코네티컷 값이 38보다 작은 있는지 확인합니다. - 반복 중 하나를 증가 또는 감소 어닐링 시간을 기준으로 가난한 최적화 사이클링 매개 변수 인 경우.
- 코네티컷의 표준 편차 값 (형광에 대한 임계 사이클)를 계산하는 단계 2.7.5에서 데이터를 사용합니다.
- 플롯 로그 복사 마비어 (로 단계 1.12에서 결정 단계 2.1에서 준비) 코네티컷 값 대 표준 곡선을 생성하는 단계; 다음 식을 얻었다 :
Y는 코네티컷이고, m은 기울기이고, X는 로그 (카피 수)이고, B는 절편 값이다.
참고 : 선형 회귀의 R 2 값은 좋은 데이터 ≥0.95 될 것입니다. - 표준 곡선 및의 방정식을 사용하여 증폭 효율을 계산한다 :
참고 : 효율성 ≥75 %를 목표로. - 너무의 공식을 사용하여 qPCR에 분석 1 특이성을 계산한다 :
여기서 Δ = 코네티컷 너무 코네티컷 표적 - 특이 및 비 - 특이 A 대한 임계 사이클 넘버에서의 차이를 설명 코네티컷 비 대상lification
참고 : 특이성은 크기의 네 주문을 초과한다 (즉, 특이 요인을 ≥4.).- 특이성이 불량 인 경우, 프라이머 농도를 낮춤으로써 최적화. 100 nm의에서 500 nm의에 이르기까지 최종 프라이머 농도 (단계 2.5-2.7에 설명 된대로) 분석을 설정합니다.
= 샘플의 코네티컷과 
= 코네티컷 의미 샘플. 중복 코네티컷 값의 표준 편차 ≤0.2 있는지 확인합니다. NTC 우물하지만 모두 코네티컷 값이 38보다 작은 있는지 확인합니다. 
4. 상대 qPCR에 분석 실험을 수행
- 전사를 촉진하는 사이토 카인과 세포 치료.
- 갓 기부 호산구를 들어, 세포 배양 배지에서 2.5 × 106 세포 / ㎖ (RPMI 1640 배지) 중복 샘플을 준비하고 (50 NG / ㎖ 인터루킨 -3 (IL3) 및 / 또는 50 NG / ㎖ 종양 괴사 인자 α로 처리 5 % CO 2 및 10 % 습도 하에서 37 ℃에서 3, 6, 9 및 20 시간의 기간에 대한 TNFα).
- RNA의 추출 및 cDNA 합성 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 호산구 샘플 (준비 당 적어도 1 × 10 6 세포)에서의 cDNA를 준비합니다. "1 1024"희석 "1"에서 희석 범위, 두 개의 샘플의 cDNA 씩 (제어 또는 휴식 샘플)의 연속 희석을 준비합니다.
- 1 희석 4, 1 μL 피펫 cDNA의 3 μL 초순수하십시오.
- 1 16 희석를 들어, 하나의 피펫 1 μl를 4 희석 3 μL의 초순수 등의
- 한 단계 2.3-2.5로하지만, 췌장염 STAT3 및 GUSB (표 4의 서식 참조)에 대한 몇 가지 프라이머 농도 25 ㎕의 반응을 96 웰 플레이트에 PCR을 설정합니다.
- GUSB은 "새로운 감지기"를 추가하고 표 2c에 설명 된 자전거 매개 변수를 사용하여, 단계 2.6-2.7을 따르십시오.
- 표준 곡선을 프라이머 농도가 95-100% 증폭 효율 결과를 결정하는 (단계 3.2 및 3.3 참조)를 생성합니다.
- (단계 4.2)에서 제조 된 cDNA 샘플 및 최적화 된 프라이머 농도 설정 판(자전거 매개 변수, 시약 및 표 5 96 웰 플레이트 템플릿 표 (c) 참조).
- 단계 2.6-2.7를 수행합니다. 반복 분석은 적어도 한 번 및 데이터 품질을 확인하십시오.
- STAT3 및 하우스 키핑 유전자 GUSB 모두 중복 샘플 CTS의 평균 코네티컷 값을 계산합니다.
- 각 샘플에 대해 Δ 코네티컷 값을 얻습니다.
- 샘플로 (일반적으로 관심의 성적의 가장 낮은 농도) 휴식 샘플을 지정 0으로 계산 ΔΔ (여기 샘플 X로 지정) 각 샘플에 대한 코네티컷 (31) :
- 각 샘플에 대한 접이식 증가를 계산한다 :
- 재현성
- 췌장염 ST에 대한 카피 수의 변화 (CV)의 계수를 계산AT3 및 GUSB.
N은 = 샘플의 수는 = 샘플의 계산 사본 번호 = 샘플은 어디를 의미한다. 각 샘플 (여러 분석)의 CV를 확인하는 것은 ≤10 %이다.
- 췌장염 ST에 대한 카피 수의 변화 (CV)의 계수를 계산AT3 및 GUSB.
5. 알 수없는 샘플에 대한 절대 qPCR에 데이터 분석
- 샘플 '의 cDNA 농도는 진도의 한 순서 내에 확인하기 위해 하우스 키핑 유전자 GUSB에 대한 (단계 4.9에 설명 된대로) 상대 qPCR에 얻을 코네티컷 값을 비교합니다.
- 이에 따라 (cDNA를 희석 예를 들어, 샘플 1은의 코네티컷 값 ~ 17.5, 및 기타 샘플 '코네티컷 값이있는 경우, 샘플 1은 대략 2 (21-17.5) = 11 배 농축 ~ 21이다 1 수행합니다. 1 희석 필요 이상으로 희석하지 않고 동일한 범위 초순수).
주 : 매우 다른 출발 농도 바이어스 선형 회귀 분석 (4.1 단계 것2).
- 이에 따라 (cDNA를 희석 예를 들어, 샘플 1은의 코네티컷 값 ~ 17.5, 및 기타 샘플 '코네티컷 값이있는 경우, 샘플 1은 대략 2 (21-17.5) = 11 배 농축 ~ 21이다 1 수행합니다. 1 희석 필요 이상으로 희석하지 않고 동일한 범위 초순수).
- 샘플의 절대 qPCR에 분석을 설정합니다. 표 6에 따라 Sα 및 Sβ에 대한 분석 2A 템플릿 판을 준비; 와. 표 7에 따라 ΔSα 및 ΔSβ에 대한 분석도 2b를 준비 단계에 설명 된대로 분석을 수행 2.6-2.7.3 (표 2B). 한 번 이상 분석을 반복합니다.
- 단계 2.7.4-2.7.5에 설명 된대로 데이터 품질 및 수출을 확인합니다.
- 췌장염 STAT3 프라이머 (표 1c에 프라이머, 표 8에서 템플릿) 400 μM에서 모두 네 개의 플라스미드의 혼합 또는 나열된 총 농도에서 하나의 플라스미드를 사용하여 25 ㎕의 반응을 절대 qPCR에 96 웰 플레이트를 설정합니다.
참고 : 효율성은 절대 qPCR에 대한 중요하지만, 이러한 프라이머의 효율성을 최적화하는 것은 상대 qPCR에 (4 단계) 중요하지 않습니다. - 접착제 커버와 12 ° C에서 1,200 XG에 5 분 동안 원심 분리기와 인감 qPCR에 접시입니다.
- 팬은 "새로운 검출기를"설정- 단계 2.7.1-2.7.3에서와 STAT3.
- 표 2C에 따라 (상대 qPCR에 동일 조건) STAT3를 췌장염에 대한 순환 설정합니다. (CT를 결정하는) 읽기가 형광을 확인 각 사이클의 72 °의 C 단계에서 발생합니다. 반복 분석은 적어도 한번의 재현성을 보장한다.
- (2.7.4-2.7.5 단계 참조) 데이터 품질 및 수출을 확인합니다.
- 증폭 플롯 (도 2 참조) 지수가 아닌 경우, 샘플의 cDNA (1:10) 희석한다 (단계 5.7)에 기재된 바와 같이 분석을 반복한다.
- 표준 곡선의 식을 이용하여 각각의 스플 라이스 변이체의 각 샘플 췌장염 STAT3의 카피 수를 계산하고, 시료의 코네티컷 값 (도 3 3.2 참조).
- 플롯 로그 STA에 대한 로그 (누적 절대 qPCR에 복사 숫자 값 대 (췌장염 STAT3 얻어 절대 qPCR에 복사 숫자 값)T3 스플 라이스)의 변종.
참고 : 최적 선형 회귀 및 기울기 값은 모두 1 ~ 할 것이다. - 반복성 (단계 3.1) 및 재현성 (단계 4.13)를 계산합니다.
6. 병합 절대 및 상대 qPCR에 데이터
- 각 스플 라이스 변종의 접이식 증가를 계산하는 총 STAT3의 접이식 증가 변형의 비율을 곱하십시오.
- 표준 편차를 계산 오차의 전파를 고려하기 위해 절대 및 상대 값 (단계 3.1.1 참조). 그림과 같이 측정의 표준 오차 (SEM)을 결정합니다 :
Representative Results
좋은 품질의 qPCR에 데이터 순환의 과정을 통해 성적 증명서의 기하 급수적 인 증가를 의미하는 S 자형 증폭 줄거리 (그림 2a)을 생성합니다. 너무 템플릿의 존재는 부적절한 기준이 처음 몇 사이클 확립 의미 높은 형광 백그라운드에서 발생할 수있다. 데이터가 지수 곡선 (도 2b)을 제공하지 않는 경우, 상기 최적화 (단계 3.1 및 3.4에서 설명하는) 것이 필요하다. 문제 해결 qPCR의 결과에 대한 자세한 내용은 32를 참조를 참조하십시오. 템플릿 교정기 플라스미드에 대해 생성 된 표준 곡선은 증폭 (STAT3 Sα에 대한 곡선 그림 3)의 효율을 나타냅니다. 83 ~ 95 %의 효율이 기재된 조건 하에서 관찰 하였다. 특이성 (단계 3.4)에 대한 방정식은 동일한 가능성 25 효율 때문에 특이성 가정특이 인자 알보다 클 가능성이 높다.
STAT3 수준의 일치 성을 평가하기 위해, 네 스플 라이스 변이체의 각각의 절대 값이 전체 STAT3, 네 스플 라이스 변이체에 공통 영역을 증폭 후자 사용한 프라이머 (도 4)의 정도뿐만 아니라 측정 하였다. 이상적으로 선형 회귀 분석 (상관 관계 표시) 및 경사 (합산 스플 라이스 변종에 췌장염 STAT3의 비율)은 모두 1에 가까워 야합니다.
절대 qPCR의 데이터는 파이 차트는 시간이 지남에 따라 사이토 카인 (그림 5a)와 후 자극을 네 스플 라이스 변종의 비율을 표시하는 형식으로 표시하고 있습니다. 이러한 변형이 항상 가장 풍부한 있었지만 휴식 호산구 (0 시간)는 STAT3 Sα의 가장 작은 비율을 가졌다. STAT3 β 스플 라이스 변이체의 분획 (S ^ 승산6; STAT3 ΔS 스플 라이스 변종의 비율에 의해 + ΔSβ) (ΔSα + ΔSβ)는 지속적으로 ΔSβ에 대한 실험적으로 기록 된 값보다 낮은 값을했다. 스 플라이 싱 이벤트 독립적 인 경우에, 하나는 ΔS의 분율을 곱한 것이 실험적으로 결정된 값과 일치하는 값을 줄 것이다 β 변형의 비율로 변형하는 것이 기대된다. 독립 접합 이벤트에서 예상보다 ΔSβ의 높은 수준은 공동 접합 바이어스가 존재 제안합니다.
절대 및 상대 qPCR에 데이터를 병합하면 모든 STAT3 스플 라이스 변종의 수준이 수준이 6 시간 포스트 자극을 정점으로, 사이토 카인 IL3 및 TNFα와 후 자극을 증가 시연 (그림 5B - 전자). 네 스플 라이스 변이체의 세 가지의 경우, 전사 레벨은 미디어 호산구 비교 IL3 + TNFα 처리 호산구 (6 시간)의 약 3 배 높았다동일한 시점. Sα STAT3 수준은이 시점에서 미디어 호산구 비교 IL3 + TNFα 처리 호산구 3.5 배 높았다. 가장 큰 불확실성 (측정의 가장 큰 표준 오차)는 모든 시료에서 총 STAT3의 작은 부분을 포함 ΔSβ (그림 5E)에 보였다. 낮은 수준이 높은 코네티컷 값과 연관된 이것은 놀라운 일이 아니었다. 이상의 사이클을 요구하는 것은 임계주기 때문에 증폭 효율 사이클마다 변동 불확실성 화합물 도달한다.
그림 1. STAT3 스플 라이스 변이체 및 팬 STAT3 구체적 STAT3 스플 라이스 변이체 (각각 Sα, Sβ, ΔSα 및 ΔSβ) 각각을 증폭하기 위하여 사용 된 프라이머는 (S)의 qPCR을 수행하는 데 사용되는 프라이머 쌍의 회로도hown. 앞으로 프라이머 (STAT3 "S"와 "ΔS")는 엑손 (21) 및 (22) 사이의 접합에 걸쳐 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. qPCR의 데이터를 증폭 플롯 (a)는 S 자형 증폭 플롯 안정적인 증폭을 의미한다. 이들 데이터는 40 사이클 (x 축)에 걸쳐 중복 희석 시료의 형광 레벨을 나타내는 컬러 라인의 각각의 쌍, STAT3 Sα를 함유하는 플라스미드의 두 연속 희석 qPCR에로부터 수득 하였다. (녹 회색) 곳 샘플 충분히 (형광 임계 값을 초과하는 baseli (Y 축에 도시 비례 형광 염료, dsDNA가 결합하여)주기 (17)에 의해 증폭) 녹색 화살표로 표시 북동. 코네티컷 그 값은 17 (b) 비 - 지수 플롯 백그라운드 형광 액이 제대로 처음 몇주기 설정되지 않았 음을 제시 할 것이다. 이는 억제제, 또는 고도로 농축 된 템플릿이나 프라이머의 존재 일 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 로그의 표준 곡선 코네티컷 대 (STAT3 Sα의 카피 수) 각 STAT3 스플 라이스 변종의 복제 수 및 임계 값주기 (CT)의 로그 사이의 선형 관계가 있습니다.. 샘플의 cDNA를 따라서 플라스미드 DNA로부터 표준 곡선을 모방 만들기희석 PCR의 증폭에서 만든 곡선보다 더 나은 측정을 제공합니다. 제시된 데이터는 STAT3 Sα를 포함하는 플라스미드의 두 연속 희석의 qPCR에 얻은 코네티컷 값입니다. 이 곡선으로부터, 각 샘플의 카피 수에 존재하는 보간 될 수 있고, 증폭 효율 (83.9 %)을 계산 하였다. Y- 인터셉트 슬로프보다 재현성 있지만 절편은 42.2 사이클에는 타겟 DNA가없는 특정 될 필요하다 나왔다. 오차 막대는 SEM을 표시, N = 3 Comparable를 곡선 STAT3 Sβ, ΔSα 및 ΔSβ (도시하지 않음)을 위해 건설되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 정량 췌장염의 비교
도 5 :. STAT3 스플 라이스 변이체는 사이토 카인 수준 처리 과정 동안 변동 (a) 각 STAT3 스플 라이스 변이체의 비율을 나타내는 파이 차트IL3 및 TNFα 치료 중 호산구있다. (B - E)의 상대 및 절대 qPCR의 데이터를 조합하여 측정 한 사이토 카인의 다양한 조합으로 처리 호산구 STAT3 스플 라이스 변이체의 변화 STAT3 Sα (b) Sβ (c) ΔSα (d) 및 ΔSβ (E) 레벨. 시간 후 자극을 통해 변동. 레벨은 초기 6 시간 후 자극을 정점으로 증가. IL3 + TNFα 조합은 혼자 IL3보다 네 STAT3 스플 라이스 변종의 높은 발현을 유도. SEM 오류의 전파를 차지 각 데이터 포인트에 대해 계산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1 번 테이블: 증폭 (a), 절대 (b) 및 상대 (c) 정량적 PCR에 사용되는 프라이머. 복제 프라이머는 제한 시퀀스 및 효율적인 절단 5'-확장이 있습니다. KpnI로 절단하고 된 NheI 제한 부위는 굵은 글씨로 표시됩니다. 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 2. PCR 사이클 매개 변수 (왼쪽)과 증폭 용 시약 볼륨 (오른쪽) (A), 상대의 (b), 절대 (다) 정량 PCR. 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3 / 54473tbl3.jpg "/>
표 3. 절대 qPCR의 플라스미드 교정 용 템플릿 분석이 분석은 재현성 및 효율뿐만 아니라, 데이터를 보간으로부터 표준 곡선을 생성을 평가하는 것이 필요하다. 은 "비 대상"믹스 특이성의 추정치를 제공합니다. 최적화가 일관성을 달성 할 필요가있다. 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 4 :. 상대 qPCR에 (팬 - STAT3 및 하우스 키핑 유전자 GUSB) 교정 분석을위한 템플릿 절대 qPCR에 달리,이 분석의 포인트는 증폭 효율이 ~ 100 %가되는 조건을 결정하는 것입니다.tp_upload / 54473 / 54473tbl4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 5 :.. 췌장염 STAT3 및 하우스 키핑 유전자 GUSB을 측정하는 상대 qPCR에 샘플 분석을위한 템플릿 표준 곡선은 분석의 비교 효율을 보장하기 위해 샘플과 함께 반복 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도표 6 : S의 변형을 측정하는 절대 qPCR에 샘플 분석을위한 템플릿 표준 곡선 비교 EFF을 보장하기 위해 샘플과 함께 반복된다. 분석법의 iciency. 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도표 7 :.. ΔS 변형을 측정하는 절대 qPCR에 샘플 분석을위한 템플릿 표준 곡선은 분석의 비교 효율을 보장하기 위해 샘플과 함께 반복 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도표 8 : 췌장염 STAT3를 측정하는 절대 qPCR에 샘플 분석을위한 템플릿입니다.large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
우리는 호산구 및 림프종 세포의 수준과 STAT3 스플 라이스 변형 성적의 비율을 평가하고 사이토 카인의 자극 수준과 비율에 영향을 여부를 배우기 위해이 프로토콜을 개발했다. STAT3는 암의 암 단백 또는 종양 억제 역할을하는지 여부에 대한 보고서를 충돌로 때문에다면 발현과 불확실한 기능이 특히 관심이다 (참조 33에서 검토). STAT3의 α와 β 스플 라이스 변형 기능의 차이는 이전에 (34, 35)을 특징으로했다, 우리의 프로토콜은 S의 최적 비율에 대한 필요성을 제안 노크 다운 / 다시 발현 분석을 용이하게하고 ΔS 19 성적 증명서.
독특한 스플 라이스 변종의 정확한 정량이 변형 구성을 스플 라이스 이기종 STAT3 기능을 관련의 추가 조사를 촉진 할 것이다. 프로토콜은 AB의 능력과 함께, 절대 및 상대 qPCR의 데이터를 통합하여용질 qPCR의 스플 라이스 변이체의 비율을 계산하고, 상대적인 qPCR의 전체 STAT3 발현의 변화를 측정. 이 방법은 한 50 개 이상의 뉴클레오티드 떨어져 두 개의 다른 스플 라이스 사이트에서 스 플라이 싱 비율을 순차적으로 미묘한 차이를 구별 동시에 측정 할 수 있습니다. 개별적으로 접합 이벤트의 비율을 결정하는 것은 공동 접합 바이어스 ΔSβ 레벨이 두 사이트의 사용은 임의로 25를 접합하는 경우 예상되는 이상이되도록 존재하는 놀라운 발견을 수득 않았을 것이다.
비판적 플라스미드 검량선을 사용하여 절대 qPCR에 매우 유사한 서열 될 스플 라이스 변이 (차선 효율) 정량 할 수있다. 우리는 새로운 미묘한 스 플라이 싱 qPCR에 분석을 최적화하기 위해 크게 2 개월이 걸릴해야합니다 기대하고 있습니다. 시험 개발의 주요 단계는 절대 qPCR에 대한 표준 곡선을 생성하는데 사용 된 플라스미드 STAT3의 생성이다; 실험적으로특이성 및 재현성을 보장하기 위해 최적의 프라이머 서열 및 사이클 파라미터를 결정하는 단계; 상대 qPCR의 데이터의 통합은 GAPDH 발현에 팬 STAT3 발현 상대적인 정량으로부터 산출했다. 누적 정량화 대 STAT3를 췌장염에 의해 정량화 카피 수의 상관 관계 (Sα + ΔSα + Sβ + ΔSβ) 프로토콜은 신뢰할 수있는 결과를 보여줍니다.
기술의주의해야 할 점은 광범위한 검증 과정이다. 내 분석 변동성 (반복성), interassay 변동 (재현성)와 특이도를 평가할 필요가있다. 프로토콜은 이러한 매개 변수에 대한 숫자 출력을 얻을 수있는 방법을 설명합니다. 우리는 효율성을 특이 요인 ≥4, 변화 (재현성)의 계수 ≤10 %와 코네티컷 표준 편차 (반복) ≤0.2 적합한 임계 값 (30) ≥75 %로 간주. STAT3 시퀀스 아미노산 1-690의 돌연변이 또는 삭제는 discove 수 없습니다이들이 접합 비율에 영향을 미칠 수 있지만,이 프로토콜에 의해 레드. 성적 비율은 비율 36 proteoform에 비례하지 않을 수 있습니다.
샘플 전체의 cDNA의 시작 양을 다른했기 때문에, 절대 qPCR에가 설립 하우스 키핑 유전자를 사용하여 상대 qPCR에 결합하지 않는 한 간 샘플 비교 샘플 내에서 스플 라이스 변종의 사본 번호를 비교하지만 적합합니다. 이 방법은 재현성 30 MIQE qPCR에 가이드 라인을 준수 설명했다. PCR 사이클링 변수와 프라이머 농도는 다른 장치를 사용하는 경우 재현 데이터를 얻기 위해 수정 될 필요가있다. 완전한 특이성이 크게 저하하지 않고 효율이 불가능하지만, 타겟 크기 순서의 4보다 큰보다 효율적 증폭 하였다.
선형 DNA는 쉽게 원형보다 증폭된다. 다른 플라스미드 만족 표준 곡선을 제공하지 않는 경우 (R 2 <; ) 0.95은 정량화하기 전에 단일 사이트 제한에 의해 플라스미드를 선형화 고려합니다. qPCR에 최적화 좋은 품질의 데이터를 (그림 1)을 얻기 위해 매우 중요하다. 대부분 qPCR의 프로토콜은 두 단계의 순환에 의존하고, 따라서 시스템이 최적화된다. 가열 블록의 불균일 한 가열이 불량 재현성에 기여 세 단계 사이클링에서 악화 될 수있다. 분석은 이상적으로 전용 층류 후드, 필터 피펫 팁 및 초순수와 멸균 조건에서 설정해야합니다. 오염 물질이 일치하지 않는 결과가 발생할 수 있기 때문에, 분석은 이상적으로 전용 층류 후드, 필터 피펫 팁 및 초순수와 멸균 조건에서 설정해야합니다. qPCR에 최적화에 대한 자세한 내용은, 풍만한 등을 참조하십시오. (32)
STAT3를 정량화하는 것은 상황의 숫자에 큰 통찰력으로 이어질 수 있습니다. STAT3의 자신의 식 (37)을 자동-조절, 위에서 설명한 프로토콜은 도움이 될 수 있습니다STAT3 스플 라이스 변종의 비율이 긍정적 인 피드백 루프를 조절에 기여 여부를 규명한다. 프로토콜은 상이한 밀도 38 또는 개발의 과정을 통해 세포에서 관찰 된 바와 같이 스플 라이스 변이체 비율의 변화를 연구하는 데 이용 될 수있다 : 그것은 알려져있다 조혈 16 동안 단백질 수준에서 STAT3 α / β의 비율이 변화한다. Sundin 등. 발견 작업 증후군 39 환자의 STAT3의 엑손 (12)의 인트론 단일 염기 다형성 바이어스 플라이 싱. 또한 엑손 21, 22, 또는 22, 23 엑손 사이의 인트론에 존재하는 다수의 SNP 중 하나는 각각 ΔS / S 비율의 접합 및 α / β에 기여할 수 있다는 것을 생각할 수있다. 분석은 스 플라이 싱 규제의 돌연변이 또는 변경이 스 플라이 싱 과정 (40)에 바이어스를 도입 할 수 암 세포에서 STAT3의 성적을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 스 플라이 싱 인자의 돌연변이 (SF3B1 등) observ로골수이 형성 증후군 (41)의 에드 또한이 프로토콜에 의해 측정 될 수있다 변경 될 수 있습니다.
더 광범위하게,이 방법은 특히 종래 RNA-SEQ 않으며 qPCR에 표준으로 가능하지 접합에 동시 연결을 검출한다. 상호 배타적 인 엑손 접합의 현상이 스 플라이 싱 의사 결정의 조정을 설명하는 동안, 다른 접합 이벤트의 공동 협회는 잘 연구되지 않았습니다. 전장 cDNA를 심문하도록 RNA-SEQ가 수정 된 최근에 기재된 다른 방법은, 먼 접합 이벤트 이상의 공동 의존 이전 42 생각보다 암시한다.
STAT3는 기증자 탠덤 스플 라이스 사이트를 포함합니다. 수락 탠덤 접합 부위 (43)는 더욱 빈번하고 설명 프로토콜의 원리 NAGNAG 접합 200 뉴클레오티드 내의 다른 접합 이벤트의 일치 검출을위한 검정의 개발을위한 시작점이 될 수있다. 기타 poten은 최초 응용 프로그램은 삽입과 삭제 또는 더블 / 트리플 염기 다형성 (44)와 같은 다른 미묘한 서열 차이의 우연의 정량화를 포함한다.
Acknowledgments
P01HL088584 : 저자는기도 염증과 리모델링에 호산구의 역할에 프로그램 프로젝트 그랜트 건강-NHLBI의 국립 연구소를 인정하고 싶습니다 (PI : N. Jarjour), 위스콘신 카르 보네 암 센터와 의학 교실 대학 교내 자금. 우리는 네 STAT3 변형 복제에 대한 더글러스 Annis가 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MJ Research PTC-200 Thermal Cycler | GMI | N/A | Used for standard PCR |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | N/A | qPCR machine |
| GS-6R | Beckman Coulter | N/A | centrifuge for 96-well plates |
| Nanodrop 2000 sprectrophotometer | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| RPMI-1640 medium | Sigma Aldrich | R8758 | cell culture medium |
| PfuTurbo DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600410 | DNA polymerase for standard PCR |
| KpnI | New England Biosciences | R0142S | |
| NheI | New England Biosciences | R0131S | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Qiagen | 330523 | qPCR, DNA polymerase/dsDNA-binding dye mix |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74204 | RNA extraction kit |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen (ThermoFisher Scientific) | 18080-044 | cDNA synthesis kit |
| Primers | Integrated DNA Technology | N/A | |
| NEBuffer 1.1 | New England Biosciences | B7201S | |
| GenePure LE Agarose | ISC BioExpress | E-3120-500 | component of TAE gel |
| Pipettors | Major lab suppliers (MLS) | N/A | |
| Filter pipette tips | Neptune Scientific | BT10XL, BT20, BT200 | |
| EU One Piece Thin Wall Plate | MidSci | ABI7501 | |
| ThermalSeal A Sealing Film | MidSci | TSA-100 | 96 well plate seal |
| pET-Elmer (variant of pET-28a) | Novagen; modified in Mosher lab | N/A | Details in PMID: 20947497 |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Sequencing kit |
| QIAEX II Gel Extraction kit | Qiagen | 20021 | Amplicon purification |
| DH5α competent cells | ThermoFisher Scientific | 18265-017 | available from several providers, see PMID: 2162051 |
| kanamycin | Research Products International Corp. | K22000-5.0 | |
| Tris base | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | component of TAE buffer |
| Acetic acid, glacial | ThermoFisher Scientific | A38C-212 | component of TAE buffer |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich) | E-5134 | component of TAE buffer |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | component of Luria Broth |
| Bacto Yeast extract, technical | BD Biosciences | 288620 | component of Luria Broth |
| Sodium chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | component of Luria Broth |
| Sodium hydroxide | ThermoFisher Scientific | SS255-1 | component of Luria Broth |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | component of Luria Broth plate |
| Lasergene SeqBuilder | DNASTAR | Figure 1 generated using Lasergene SeqBuilder software version 12.2.0 (DNASTAR) |
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