La fusion absolue et relative des données quantitatives PCR pour Quantifier STAT3 Splice Variant Transcriptions

L'objectif général de ce protocole est de quantifier les proportions et les niveaux absolus des transcrits des variants d'épissage de STAT3 dans les éosinophiles. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la régulation de l'épissage, telles que la co-association d'événements d'épissage distants et l'identification des conditions pouvant entraîner des différences dans les proportions d'épissage en tandem. Le principal avantage de cette technique réside dans l'utilisation de standards plasmidiques permettant l'obtention de données de qPCR absolues et relatives, ce qui nous permet de déterminer les proportions et les niveaux globaux de quatre transcrits de STAT3.

Dans notre cas, nous souhaitons comprendre comment les quatre variants de STAT3 — S alpha, S beta, delta S alpha et delta S beta — changent lorsque les éosinophiles sont stimulés par des cytokines. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la composition de STAT3 dans les éosinophiles, elle peut également être appliquée à d'autres types cellulaires à partir desquels on peut obtenir de l'ADNc. Étant donné que les formes S et delta S diffèrent par seulement trois nucléotides, nous avons dû sacrifier l'efficacité afin d'obtenir une spécificité suffisante pour les standards de chaque variant.

Dans ce protocole, l'ADNc préparé à partir d'éosinophiles humains est utilisé comme matrice pour amplifier les variants d'épissage de STAT3. Après avoir construit les plasmides comme décrit dans le protocole textuel, préparez des réactions de séquençage pour séquencer les plasmides provenant de plusieurs colonies. Chaque réaction de 20 microlitres doit contenir trois microlitres de tampon de réaction de séquençage, deux microlitres de mélange de réaction de séquençage, 12 microlitres d'eau ultrapure, un microlitre de plasmide et deux microlitres d'amorce de séquençage.

Lorsque les résultats du séquençage sont disponibles, analyser les électrophorégrammes des plasmides codant pour chaque variante : S alpha, S beta, delta S alpha et delta S beta. Mesurer la concentration de l'ADN plasmidique purifié en nanogrammes par microlitre et calculer le nombre de copies par microlitre. Commencer cette procédure en préparant une série de dilutions au 1/10 des plasmides STAT3 à l'aide d'eau ultrapure.

Avec environ 10⁸ à 10³ copies par microlitre. Mesurer la concentration de l'échantillon le plus concentré. Utiliser les plasmides dilués pour préparer quatre mélanges sans cible comme contrôles négatifs pour chaque variante d'épissage, à 10⁶ copies par microlitre pour chaque variante.

Préparez un mélange cible avec des concentrations égales des quatre matrices, chacune à 10 puissance six copies par microlitre. Préparez des solutions de paires d'amorces pour chaque variante d'épissage avec 60 microlitres d'amorces, chacune à une concentration de sept micromolaire, pour une concentration finale de 560 nanomolaire dans l'échantillon. Diluez la polymérase ADN et le mélange de colorant de liaison à l'ADN double brin sept pour cinq avec de l'eau pure.

Préparer le test dans une plaque PCR 96 puits en suivant ce modèle. Ajouter d'abord à chaque puits 21 microlitres du mélange de polymérase à ADN diluée et de colorant de liaison à l'ADN double brin. Puis ajouter deux microlitres de mélange d'amorces et deux microlitres de matrice.

Dans chaque puits témoin sans matrice, ajouter deux microlitres d'eau filtrée au lieu de la matrice. Préparer les réactions en double afin d'évaluer la répétabilité. Sceller la plaque de qPCR avec un couvercle adhésif et centrifuger pendant cinq minutes à 1 200 g et à 12 degrés Celsius.

Allumez la machine de qPCR et insérez la plaque de qPCR scellée. Si vous utilisez le système de PCR en temps réel ABI, configurez l'expérience comme indiqué. Cliquez sur Fichier, Nouveau, Suivant, sélectionnez un nouveau détecteur, puis indiquez un nom et choisissez un marqueur rapporteur et un éteigneur.

Configurez un nouveau détecteur pour chaque variante d'épissage. Sélectionnez Suivant et configurez les étalons comme indiqué sur la page Configuration de la plaque d'échantillons, en veillant à entrer les quantités dans le tableau et à sélectionner les détecteurs appropriés. Cliquez sur Terminer.

Configurer le programme de cyclage PCR approprié. Veiller à ce que la lecture de la fluorescence pour déterminer les valeurs de cycle seuil ait lieu pendant l'étape de 72 degrés Celsius de chaque cycle. Sélectionner Exécuter.

Lorsque l'exécution est terminée, cliquez sur l'onglet Résultats, puis sur l'onglet Courbe d'amplification. Évaluez la courbe de sortie pour apprécier la qualité des données. Une courbe exponentielle indique une amplification fiable.

Exporter les résultats vers un logiciel de feuille de calcul. L'analyse des données, telle que décrite dans le protocole textuel, est essentielle pour déterminer si le test nécessite une optimisation supplémentaire afin d'assurer sa reproductibilité. L'ADN complémentaire utilisé pour ce test est préparé à partir d'éosinophiles traités avec des cytokines afin de favoriser la transcription.

Préparez des dilutions sérielles de deux aliquots d'ADNc avec une gamme de dilution allant de un à un sur 1 024. Mettez en place le dosage dans une plaque de 96 puits avec des réactions de 25 microlitres, comme illustré pour l'analyse de la spécificité des amorces, mais avec plusieurs concentrations d'amorces pour STAT3 pan et le gène de référence GUSB. Un modèle est présenté dans ce tableau.

Insérez la plaque PCR scellée dans la machine de qPCR. Configurez l'expérience à l'aide du logiciel en ajoutant un nouveau détecteur pour GUSB et en utilisant le programme de cyclage PCR approprié. Ensuite, les résultats sont utilisés pour calculer la valeur du cycle seuil pour chaque échantillon, comme décrit dans le protocole textuel.

Pour commencer cette procédure, comparez les valeurs de cycle seuil obtenues en qPCR relative pour le gène de référence GUSB et diluez l'ADNc en conséquence avec de l'eau ultrapure afin de garantir que toutes les concentrations se situent dans une plage d'un ordre de grandeur. Préparez les essais de qPCR absolue des échantillons dans des plaques de 96 puits. Suivez ce modèle pour S alpha et S beta et ce modèle pour delta S alpha et delta S beta.

Réalisez les dosages comme indiqué précédemment et répétez-les au moins une fois. Ensuite, préparez une plaque de qPCR absolue en 96 puits avec des réactions de 25 microlitres en utilisant des amorces pan-STAT3 à 400 micromolaire et un mélange des quatre plasmides ou un plasmide unique selon ce modèle. Scellez la plaque de qPCR avec un couvercle adhésif et centrifugez pendant cinq minutes à 1 200 g et à 12 degrés Celsius.

Insérez la plaque PCR scellée dans l'appareil de qPCR et configurez l'expérience comme indiqué précédemment, en ajoutant un nouveau détecteur pour le STAT3 pan. Configurez les mêmes paramètres de cyclage que pour la qPCR relative. Après avoir répété le dosage au moins une fois, analysez les résultats comme décrit dans le protocole textuel.

De bonnes données de qPCR produiront un tracé d'amplification en forme de sigmoïde, indiquant une augmentation exponentielle des transcrits au cours des cycles. Ces données ont été obtenues par qPCR de deux dilutions sérielles d'un plasmide contenant STAT3 S alpha. Chaque paire de lignes colorées représente les niveaux de fluorescence d'échantillons dilués en double au cours de 40 cycles.

Les courbes standards générées pour les plasmides calibrateurs du modèle indiqueront l'efficacité de l'amplification. Dans cette courbe pour STAT3 S alpha, l'efficacité d'amplification était de 83,9 %. Afin d'évaluer la congruence des niveaux de STAT3, les valeurs absolues de chacune des quatre variantes d'épissage ont été mesurées, ainsi que le niveau de STAT3 total. Idéalement, à la fois la régression linéaire et la pente devraient être proches de un.

Les données absolues de qPCR sont présentées sous forme de diagrammes circulaires afin d'illustrer les proportions des quatre variants d'épissage de STAT3 au cours du traitement par les cytokines. La fusion des données absolues et relatives de qPCR a démontré que les niveaux de tous les variants d'épissage de STAT3 augmentaient après stimulation par les cytokines IL3 et TNF alpha, avec un pic atteint à six heures. L'analyse regroupée des données provenant de tous les points temporels a révélé un biais faible mais significatif en faveur de l'association concomitante des événements d'épissage bêta et delta S.

Une fois optimisés, les tests fondés sur cette technique peuvent être réalisés en quatre heures si l'on respecte correctement les procédures. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de travailler dans des conditions stériles afin de prévenir toute contamination. Les choix d'épissage incluant ou excluant un codon représentent 20 % des variations d'épissage en phase.

Notre protocole devrait pouvoir être facilement adapté à la quantification de telles variations. Après son développement, cette technique a permis à Mao Zhang de collaborer avec mon groupe et celui de Li-Shan Rue afin de réaliser des expériences de contrôle de réexpression après inhibition des variants de STAT3 dans des cellules de lymphome ABC. Ces expériences ont démontré qu'un mélange des variants S et delta S est nécessaire à la survie cellulaire en culture.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une PCR quantitative absolue et relative, ainsi que des conditions appropriées pour distinguer et quantifier des différences d'épissage subtiles.