Name: La fusion absolue et relative des données quantitatives PCR pour Quantifier STAT3 Splice Variant Transcriptions (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Découvrez une méthode de qPCR absolue et relative pour quantifier les variants d'épissage STAT3 dans les éosinophiles humains. Cette technique utilise des standards plasmidiques pour analyser précisément les proportions des quatre transcrits.

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Les auteurs tiennent à remercier les National Institutes of Health-NHLBI pour la subvention de projet Programme sur le rôle des éosinophiles dans Airway Inflammation et remodelage: P01HL088584 (PI: N. Jarjour), et l&#39;Université du Wisconsin Carbone Cancer Center et Département de médecine pour le financement intra-muros. Nous remercions Douglas Annis pour le clonage des quatre variantes de STAT3.

NOTE: éosinophiles du sang périphérique ont été reçues sans identifier l&#39;information en accord avec un protocole approuvé (# 2013-1570) par l&#39;Université de Wisconsin-Madison Centre des sciences de la santé Institutional Review Board. Signé le consentement éclairé du donneur a été obtenu pour l&#39;utilisation de chaque échantillon dans la recherche. 1. Création d&#39;Plasmides comme normes de modèle <ol><li> Créer des amorces pour un amplicon comprenant les deux sites d&#39;épissage STAT3, avec 5 &#39; des sites Kpnl et Nhel restriction (et des extensions 5&#39;) selon le Tableau 1a. REMARQUE: Les sites Kpnl et Nhel ont été choisies pour permettre à des inserts à ligaturer dans un vecteur pET-28a modifié avec résistance à la kanamycine 25,26 site Kpnl avait été ajouté dans le site de clonage multiple.. </li><li> En utilisant les éosinophiles fraîchement donnés, préparer des échantillons en double de 2,5 x 10 6 cellules / ml dans un milieu de culture cellulaire (Roswell Park Memorial &#39;Institut (RPMI) 1640). Incuber pendant 1 heure à 37 ° C sous 5% de CO2 et 10% d&#39; humidité. <ol><li> Préparer (c) un ADN complémentaire à partir d&#39; échantillons (au moins 1 x 10 6 cellules par préparation) selon les instructions du fabricant en utilisant l&#39;extraction de l&#39; ARN et des kits de synthèse d&#39; ADNc. </li></ol></li><li> À partir du modèle d&#39; ADNc préparé à l&#39; étape 1.2.1, amplifier STAT3 variants d&#39; épissage en utilisant une amplification PCR selon le tableau 2a. </li><li> Resolve amplicons dans 2% d&#39; agarose Tris-acétate-éthylènediaminetétraacétate (TAE) gel 27. bandes d&#39;accise du gel et purifient selon gel instructions du kit d&#39;excision. </li><li> Amplicons coupées et plasmide avec des enzymes de restriction appropriées (vue d&#39;ensemble de la restriction en référence 27), en utilisant des volumes, des temps d&#39;incubation et les températures recommandées par le fournisseur d&#39;enzyme; et purifier comme dans l&#39;étape 1.4. Ligaturer amplicons restreintes dans le plasmide dans des conditions de fournisseurs recommandés. </li><li> Préparer une suite négativerol (ADN plasmidique restreint sans insert mais avec ligase) et un contrôle positif (plasmide sans restriction avec résistance à la kanamycine). Effectuer des transformations plasmidiques standard de E. compétente coli DH5a 28 utilisant Les mélanges de ligature 27. </li><li> Incuber transformé E. coli dans 1 ml Luria-Broth (LB) (préparé selon les instructions 27) agitation pendant 1 heure à 37 ° C. transformants Spread sur des plaques LB contenant 50 pg / ml de kanamycine et incuber à 37 ° C pendant la nuit. </li><li> Choisissez plusieurs colonies à partir des α STAT3 et plaques STAT3 ß en utilisant des cure - dents stériles 27. Transfert chacun 2 ml LB. Cultivez cultures durant la nuit à 37 ° C dans un incubateur à agitation. </li><li> On purifie les plasmides à partir de cultures bactériennes en suivant les instructions fournies dans le kit de purification d&#39;ADN. plasmides Conserver à -20 ou -80 ° C. </li><li> plasmides de séquence de plusieurs colonies en préparant 20 réactions de séquençage ul. pipette 3un tampon de réaction de séquençage ul, 2 ul de mélange réactionnel de séquençage, de l&#39;eau ultrapure 12 ul, 1 ul de plasmide comme matrice et 2 pi amorce de séquençage. NOTE: Si vous utilisez vecteur pET-28a, utiliser une amorce de séquençage 5&#39;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG-3 &#39;. <ol><li> Évaluer électrophorétogrammes de plasmides codant pour chaque variante: Sα, Sβ, ΔSα et ΔSβ 25. </li></ol></li><li> Mesurer la concentration de l&#39;ADN plasmidique pur en ng / ul. Si la lecture de l&#39; absorbance à 260 nm en utilisant un spectrophotomètre, calculer la concentration d&#39;ADN en utilisant la loi de Beer-Lambert 29: <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq1.jpg" /> Où c = concentration, A = absorbance, ε (coefficient d&#39;extinction) = 0,02 (pg / ml) -1 cm -1 pour l&#39; ADN et L = longueur de trajet double brin de lumière (généralement 1 cm). </li><li> En utilisant les poids moléculaires de STAT3 variant d&#39; épissage d&#39; ADNc amplicons et le vecteur, calculer le nombre de copies par ml. NOTE: Le poids moléculaire par paire de bases (pb) est estimée à 650 Da. <img alt="équation 2" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq2.jpg" /></li></ol> 2. Analyse Primer Spécificité pour Absolute qPCR <ol><li> Préparer 1 à 10 série de dilutions de plasmides STAT3, avec 10 ~ 8 à 10 copies par 3 ul (20 ul) avec de l&#39; eau ultrapure. Concentration de la mesure de la plupart concentrées (~ 10 8 copies par ml, voir l&#39; étape 1.11). </li><li> Utilisez plasmides dilué pour préparer quatre mélanges &quot;non-cibles&quot; (ie., STAT3 ΔSβ contrôle négatif contenant des concentrations égales de STAT3 Sα, ΔSα, Sβ mais pas ΔSβ) à 10 6 copies par ml chacun. Préparer un mélange &quot;cible&quot; avec des concentrations égales de tous les quatre modèles chacun à 10 6 copies par ml. </li><li> Préparer la solution de paire d&#39;amorcess pour chaque variante d&#39;épissure (voir le tableau 1b et à la figure 1) en faisant ~ 60 ul d&#39;amorces , chacun à une concentration de 7 uM (concentration finale dans l&#39; échantillon sera de 560 nM). </li><li> Diluer l&#39; ADN polymérase / dsDNA liaison colorant mélange 7: 5 avec pur H 2 O. </li><li> Mettre en place l&#39; essai 1 dans une plaque à 96 puits par PCR comme indiqué dans le modèle (tableau 3). <ol><li> Ajouter 21 ul dilué l&#39; ADN polymérase / dsDNA liaison colorant mélange, puis 2 pi de mélange d&#39; amorces et 2 pi de modèle (selon le tableau 2b). Au lieu de modèle, ajoutez 2 pl filtrés H 2 O à la commande sans modèle (NTC) ainsi. Mettre en place des réactions en double afin d&#39; évaluer la répétabilité 30. </li></ol></li><li> plaque Seal qPCR avec couvercle adhésif et centrifuger pendant 5 min à 1200 g à 12 ° C. </li><li> Si vous utilisez des logiciels répertoriés sur les matériaux, mis en place l&#39; expérience comme décrit. <ol><li> Allumez la machine qPCR et insert étanche plaque qPCR. Cliquez sur Fichier &amp;# 62; Nouveau&gt; Suivant&gt; Sélectionnez &quot;Nouveau détecteur&quot;, choisissez reporter, désaltérante et fournir le nom. Mettre en place un &quot;nouveau détecteur&quot; pour chaque variante d&#39;épissage. </li><li> Sélectionnez Suivant et mettre en place des normes comme demandé sur la page de la plaque de l&#39;échantillon Set Up, assurant des quantités sont entrées dans la table et des détecteurs appropriés sont sélectionnés. Cliquez sur Terminer. </li><li> Mettre en place le cyclisme selon le tableau 2b. Faire en sorte que la fluorescence de la lecture (pour déterminer Ct) se produit au cours de l&#39;étape C à 72 ° de chaque cycle. Sélectionnez Exécuter. </li><li> Lorsque l&#39;exécution est terminée, cliquez sur le&gt; onglet parcelle Amplification onglet Résultats. Évaluer parcelle d&#39;amplification de sortie pour évaluer la qualité des données (chercher une parcelle exponentielle, comme dans la figure 2). NOTE: Assurez-parcelles d&#39;amplification sont essentiellement exponentielle et que le seuil de cycle peut être fixé à la partie exponentielle de la parcelle. Veiller à CTN ne sont pas amplifiées et d&#39;autres points standard démontrent une faible valeur Ct avec un haut ARn. </li><li> Pour export résultats au logiciel de feuille de calcul, cliquez sur Fichier&gt; Exporter&gt; Résultats. </li></ol></li></ol> 3. Évaluation absolue qPCR Assay Spécificité et répétabilité <ol><li> Répétabilité <ol><li> Utilisez les données de l&#39; étape 2.7.5 pour calculer l&#39; écart type de Ct (cycle seuil pour fluorescence) valeurs. <img alt="l&#39;équation 3" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq3.jpg" /> Où N = nombre d&#39;échantillons (2 si elle est faite en double exemplaire), <img alt="l&#39;équation 4" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq4.jpg" /> = Ct et de l&#39; échantillon <img alt="l&#39;équation 5" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq5.jpg" /> = Échantillon Ct signifie. Vérifiez que l&#39;écart type des valeurs Ct de doublons est ≤0.2. Vérifiez que les valeurs de Ct dans tous les puits , mais NTC sont plus petits que 38. </li><li> Si la répétabilité est mauvais paramètres optimize de cyclisme en augmentant ou en diminuant le temps de recuit. </li></ol></li><li> Plot copie du journal engourdieer (comme déterminé à l&#39; étape 1.12 et préparé à l&#39; étape 2.1) vs valeur Ct pour créer une courbe standard; donnant l&#39;équation suivante: <img alt="L&#39;équation 6" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq6.jpg" /> Où y est Ct, m est la pente, x est log (nombre de copies) et b est la valeur d&#39;interception. NOTE: La R 2 valeur de la régression linéaire sera ≥0.95 de bonnes données. </li><li> Calculer l&#39;efficacité d&#39;amplification en utilisant la courbe standard et l&#39;équation: <img alt="L&#39;équation 7" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq7.jpg" /> NOTE: Viser l&#39;efficience ≥75%. </li><li> Calculer la spécificité de qPCR test 1 en utilisant la formule de trop: <img alt="L&#39;équation 8" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq8.jpg" /> Où Δ Ct Trop = Ct cible - Ct non-cible, décrivant la différence dans le nombre de cycle seuil pour ampli spécifique et non spécifiquelification NOTE: Spécificité devrait dépasser quatre ordres de grandeur (ie, le facteur de spécificité ≥4.). <ol><li> Si la spécificité est faible, d&#39;optimiser en abaissant la concentration de l&#39;amorce. Mettre en place des essais (comme décrit dans les étapes 2,5-2,7) avec des concentrations d&#39;amorces finales allant de 100 à 500 nm. </li></ol></li></ol> 4. Exécution relative dosages qPCR <ol><li> Traiter les cellules avec Cytokines pour favoriser la transcription. <ol><li> Pour les éosinophiles fraîchement donnés, préparer des échantillons en double de 2,5 x 10 6 cellules / ml dans un milieu de culture cellulaire (RPMI 1640) et traiter avec 50 ng / ml d&#39; interleukine-3 (IL3) et / ou 50 ng / ml de facteur α de nécrose tumorale ( TNFa) pendant des périodes de 3, 6, 9 et 20 heures à 37 ° C sous 5% de CO2 et 10% d&#39; humidité. </li></ol></li><li> Préparer l&#39; ADNc à partir d&#39; échantillons d&#39;éosinophiles (au moins 1 x 10 6 cellules par préparation) selon les instructions du fabricant en utilisant les kits d&#39;extraction d&#39;ARN et synthèse d&#39;ADNc. </li&gt; <li> Préparer des dilutions en série de deux aliquotes échantillon d&#39;ADNc (contrôle ou échantillons au repos), avec une dilution allant de &quot;1&quot; à la dilution &quot;1 en 1024&quot;. <ol><li> Pour la dilution 1 à 4, la pipette 1 pi d&#39;ADNc et 3 pi d&#39;eau ultrapure. </li><li> Pour la dilution de 1 sur 16, pipette 1 pl de la 1 à 4 dilution et de l&#39; eau ultrapure 3 pi, etc. </li></ol></li><li> Mettre en place la PCR en plaque de 96 puits avec 25 ul de réactions que les étapes décrites 2.3-2.5 mais avec plusieurs concentrations d&#39; amorces pour STAT3 pan- et GUSB (voir modèle dans le tableau 4). </li><li> Ajouter &quot;nouveau détecteur&quot; pour GUSB et suivez les étapes 2,6-2,7, en utilisant les paramètres de cycle décrits dans le tableau 2c. </li><li> Générer des courbes standard (voir les étapes 3.2 et 3.3) pour déterminer les concentrations d&#39;amorces aboutissent à 95-100% d&#39;efficacité d&#39;amplification. </li><li> Mettre en place la plaque avec des échantillons préparés d&#39;ADNc (de l&#39;étape 4.2) et des concentrations d&#39;amorces optimisées(voir le tableau 2c pour les paramètres de cyclisme, les réactifs et le tableau 5 96 puits modèle de plaque). </li><li> Effectuer les étapes 2,6-2,7. Refaire le test au moins une fois et de vérifier la qualité des données. </li><li> Calculer la valeur Ct moyenne de l&#39; échantillon en double Cts pour les deux STAT3 et GUSB de gène de ménage. </li><li> Obtenir des valeurs Δ Ct pour chaque échantillon. <img alt="L&#39;équation 9" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq9.jpg" /></li><li> Désigner échantillon de repos (a généralement plus faible concentration de transcrit d&#39;intérêt) que l&#39; échantillon 0. Calculer Ct 31 pour chaque échantillon (ici désigné comme échantillon X) ΔΔ: <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq10.jpg" /></li><li> Calculer fois d&#39;augmentation pour chaque échantillon: <img alt="équation 11" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq11.jpg" /></li><li> Reproductibilité <ol><li> Calculer le coefficient de variation (CV) du nombre de copies pour pan- STAT3 et GUSB. <img alt="équation 12" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq12.jpg" /> Où N = nombre d&#39;échantillons, = calculé le nombre de copies de l&#39; échantillon et = moyenne de l&#39; échantillon. Vérifier que CV de chaque échantillon (plusieurs essais) est ≤10%. </li></ol></li></ol> 5. Analyse de Absolute qPCR données pour les échantillons inconnus <ol><li> Comparer les valeurs Ct obtenues en rapport qPCR (tel que décrit à l&#39; étape 4.9) pour GUSB de gène de ménage pour assurer les concentrations d&#39; ADNc de échantillons sont dans un ordre de grandeur. <ol><li> Diluer ADNc en conséquence (par exemple, si l&#39; échantillon 1 a une valeur Ct de ~ 17,5, et les valeurs de Ct d&#39; autres échantillons de sont ~ 21, l&#39; échantillon 1 est à peu près 2 (21-17.5) = 11 fois plus concentré Effectuez un 1: 1. Dilution avec eau ultrapure dans la même gamme sans diluer plus que nécessaire). NOTE: Considérablement différentes concentrations de départ seront biais de l&#39;analyse de régression linéaire (étape 4.12). </li></ol></li><li> Mettre en place absolue test qPCR d&#39;échantillons. Préparer dosage plaque de modèle de 2a pour Sα et Sβ selon le tableau 6; et préparer dosage 2b pour ΔSα et ΔSβ selon le tableau 7. Effectuer des essais comme décrit dans les étapes 2.6-2.7.3 (et le tableau 2b). Répéter les essais au moins une fois. </li><li> Vérifiez la qualité des données et l&#39;exportation comme décrit dans les étapes 2.7.4-2.7.5. </li><li> Mettre en place absolue qPCR plaque de 96 puits avec 25 ul de réactions en utilisant des amorces pan- STAT3 (les amorces dans le tableau 1c, modèle dans le tableau 8) à 400 uM et un mélange des quatre plasmides ou un plasmide unique à des concentrations totales inscrites. NOTE: L&#39;efficacité n&#39;a pas d&#39;importance pour qPCR absolue, mais l&#39;optimisation de l&#39;efficacité de ces amorces est important pour qPCR par rapport (étape 4). </li><li> plaque Seal qPCR avec couvercle adhésif et centrifuger pendant 5 min à 1200 g à 12 ° C. </li><li> Mettre en place &quot;nouveau détecteur&quot; pour pan- STAT3 comme dans les étapes 2.7.1-2.7.3. </li><li> Mettre en place le vélo pour pan- STAT3 selon le tableau 2c (mêmes conditions que par rapport qPCR). Faire en sorte que la fluorescence de la lecture (pour déterminer Ct) se produit au cours de l&#39;étape C à 72 ° de chaque cycle. Refaire le test au moins une fois pour assurer la reproductibilité. </li><li> Vérifiez la qualité des données et l&#39;exportation (voir les étapes 2.7.4-2.7.5). <ol><li> Si les parcelles d&#39;amplification ne sont pas exponentielle (voir la figure 2), diluer l&#39; ADNc de l&#39; échantillon (1:10) et répéter dosage comme décrit (étape 5.7). </li></ol></li><li> En utilisant l&#39;équation de la courbe standard (voir 3.2, Figure 3) et les valeurs Ct des échantillons, calculer le nombre de copies de chaque variant d&#39;épissage et de STAT3 pan- dans chaque échantillon. <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq13.jpg" /></li><li> Journal de la parcelle (qPCR valeurs du nombre de copies absolues obtenues pour pan- STAT3) vs log (qPCR valeurs du nombre de copies absolues cumulées pour STAT3 variants d&#39; épissage). NOTE: régression linéaire Idéal et la pente des valeurs seraient tous deux ~ 1. </li><li> Calculer la répétabilité (étape 3.1) et la reproductibilité (étape 4.13). </li></ol> 6. La fusion absolue et relative des données qPCR <ol><li> Multipliez la proportion de la variante avec le STAT3 pli-augmentation totale pour calculer un facteur d&#39;augmentation de chaque variant d&#39;épissage. </li><li> Calculer les écarts-types (voir l&#39;étape 3.1.1) des valeurs absolues et relatives pour tenir compte de la propagation de l&#39;erreur. Déterminer l&#39;erreur de mesure standard (SEM), comme indiqué: <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq14.jpg" /></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons développé ce protocole afin d&#39;évaluer les niveaux et les proportions de STAT3 variant d&#39;épissage transcrits dans les éosinophiles et les cellules de lymphome et d&#39;apprendre si la stimulation de cytokine a affecté les niveaux et les proportions. STAT3 est d&#39; un intérêt particulier en raison de sa fonctionnalité pléiotropique et incertaine, avec des rapports contradictoires quant à savoir si elle agit comme une oncoprotéine ou suppresseur de tumeur dans le cancer (examiné en référence 33). Les différences de STAT3 α et β variant d&#39;épissage fonction avaient été précédemment caractérisé 34,35, et notre protocole facilité une analyse knock-down / ré-expression qui suggère un besoin pour un rapport optimal entre S et ΔS transcriptions 19. quantification précise des variants d&#39;épissage distincts facilitera de nouvelles enquêtes de relation fonction de STAT3 hétérogène pour épissure composition variant. Le protocole intègre les données absolues et relatives qPCR, combinant la capacité de absoluté qPCR pour calculer des proportions variant d&#39;épissage, et par rapport qPCR pour mesurer les changements dans l&#39;expression globale de STAT3. Cette approche permet de distinguer des différences subtiles dans l&#39;ordre et en même temps la mesure des rapports d&#39;épissage sur deux sites d&#39;épissage alternatif plus de 50 nucléotides d&#39;intervalle. Déterminer les rapports des événements d&#39;épissage individuellement aurait pas donné la conclusion remarquable qu&#39;un biais co-épissage existait de telle sorte que les niveaux ΔSβ sont plus élevés que prévu si les utilisations des deux sites sont épissés au hasard 25. Critique, absolue qPCR en utilisant des courbes d&#39;étalonnage de plasmides permet une quantification (avec une efficacité sous-optimale) des variations d&#39;épissage qui donnent lieu à des séquences très similaires. Nous nous attendons à un épissage subtil dosage qPCR roman devrait prendre environ deux mois pour optimiser. Les étapes clés dans le développement de tests sont la création de plasmides de STAT3 utilisés pour générer des courbes standard pour qPCR absolue; expérimentalementla détermination des séquences d&#39;amorces optimales et paramètres de cycle pour assurer la spécificité et la reproductibilité; et l&#39;intégration des données relatives qPCR dérivée de la quantification pan-STAT3 expression relative à l&#39;expression de GAPDH. La corrélation du nombre de copies quantifiées par la quantification par rapport à STAT3 pan- cumulative (Sα + ΔSα + + Sβ ΔSβ) montre que le protocole donne des résultats fiables. Une mise en garde de la technique est le vaste processus de validation. Il est nécessaire d&#39;évaluer la variabilité intra-essai (répétabilité), la variabilité inter-essai (reproductibilité) et la spécificité. Le protocole décrit des façons d&#39;obtenir des sorties numériques pour ces paramètres. Nous avons estimé que l&#39; efficacité ≥75%, le facteur de spécificité ≥4, coefficient de variation (reproductibilité) ≤10% et Ct écart - type (répétabilité) ≤0.2 des seuils appropriés 30. Des mutations ou délétions dans la séquence d&#39;acides aminés 1-690 STAT3 ne seront pas découveRouge par ce protocole, même si elles peuvent influencer les rapports d&#39;épissage. Proportions de transcrits pourraient ne pas être proportionnelle à proteoform proportions 36. Puisque les échantillons ont des quantités différentes à partir d&#39;ADNc totale, qPCR absolue est adapté pour comparer le nombre de copies de variants d&#39;épissage dans un échantillon, mais pas pour la comparaison inter-échantillon à moins couplé avec le parent qPCR utilisant un gène de ménage établi. La méthode décrite est conforme aux directives MIQE qPCR pour la reproductibilité 30. peut-être besoin d&#39;être modifié pour obtenir des données reproductibles si un autre appareil est utilisé PCR paramètres de cycle et les concentrations d&#39;amorces. spécificité parfaite est impossible sans compromettre l&#39;efficacité de façon drastique, mais la cible a été amplifié plus efficacement par plus de quatre ordres de grandeur. ADN linéaire est plus facilement amplifié que circulaire. Si un autre plasmide ne fournit pas des courbes standards satisfaisants (R 2 &lt;; 0,95), considèrent linéariser le plasmide par restriction à un seul site avant quantification. Optimisation de qPCR est crucial pour obtenir des données de bonne qualité (Figure 1). La plupart des protocoles qPCR reposent sur deux étapes du vélo, et les machines sont optimisées en conséquence. chauffage non uniforme du bloc de chauffage peut être exacerbée en trois étapes à vélo, ce qui contribue à une mauvaise répétabilité. Les essais doivent être mis en place dans des conditions stériles avec des pointes de pipette et filtre l&#39;eau ultrapure, idéalement dans une hotte à flux laminaire dédié. Parce que les contaminants peuvent conduire à des résultats incohérents, des essais doivent être mis en place dans des conditions stériles avec des pointes de pipette et filtre l&#39;eau ultrapure, idéalement dans une hotte à flux laminaire dédié. Pour plus d&#39; informations sur l&#39; optimisation qPCR, reportez - vous à Bustin et al. 32 Quantifier STAT3 peut conduire à une plus grande perspicacité dans un certain nombre de contextes. STAT3 auto-régule sa propre expression 37, et le protocole décrit ci - dessus peut aiderd&#39;élucider si les rapports de variants d&#39;épissage de STAT3 contribuent à la régulation de cette boucle de rétroaction positive. Le protocole peut être utilisé pour étudier les changements dans les rapports de variants d&#39;épissage comme observé dans des cellules à des densités différentes 38 ou au cours du développement: il est connu que α / ratio β des STAT3 changements au niveau protéique au cours de l&#39; hématopoïèse 16. Sundin et al. découvert qu&#39;un polymorphisme nucléotidique simple épissage biaisée intronique de l&#39; exon 12 dans STAT3 d&#39;un patient avec le syndrome de Job 39. Il est concevable que l&#39;un des nombreux SNP présents dans les introns entre l&#39;exon 21 et 22, ou de l&#39;exon 22 et 23 peuvent contribuer à des rapports d&#39;épissage de ΔS / S et α / β, respectivement. Le test peut être utilisé pour quantifier la transcription STAT3 dans les cellules cancéreuses, où des mutations ou des changements dans la régulation de l&#39; épissage peuvent introduire un biais dans le processus d&#39;épissage 40. Des mutations dans les facteurs d&#39;épissage (comme SF3B1), comme observed dans les syndromes myélodysplasiques 41 peut également conduire à des changements qui peuvent être mesurés par ce protocole. Plus largement, cette approche détecte spécifiquement co-association dans l&#39;épissage, ce qui est impossible avec les classiques ARN-Seq, ni norme qPCR. Bien que le phénomène de l&#39;épissage mutuellement exclusifs exon démontre la coordination des décisions d&#39;épissage, le co-association d&#39;autres événements d&#39;épissage n&#39;a pas été bien documenté. Une autre méthode récemment décrite, dans laquelle l&#39; ARN-Seq a été modifié de manière à interroger ADNc pleine longueur, suggère des événements d&#39;épissage éloignés sont plus co-dépendants qu&#39;on ne le pensait 42. STAT3 contient un site d&#39;épissage donneur en tandem. Accepteur des sites d&#39;épissage tandem sont plus fréquentes 43 et les principes du protocole décrit pourraient servir de point de départ pour le développement de tests pour la détection de coïncidence de NAGNAG épissage et d&#39; autres événements d&#39;épissage à moins de 200 nucléotides. Autres potenapplications tiels comprennent la quantification de coïncidence d&#39;autres différences de séquences subtiles, comme indels ou doubles , triples polymorphismes / nucléotidiques 44.

Courte portée (tandem) d&#39;épissage alternatif, où les sites accepteurs ou donneurs de remplacement sont à proximité les uns des autres, est fréquente chez les mammifères, les invertébrés 1 2 et 3 plantes. On estime que 20% des gènes de mammifères contiennent des sites d&#39;épissage alternatif de 2-12 nucléotides en dehors 4. Beaucoup de ces sites sont 3 nucléotides à part et donnent lieu à l&#39;inclusion ou l&#39;exclusion d&#39;un seul codon. Il y a un débat sur la nature de la réglementation de l&#39; épissage sur ces sites 5,6 avec certains estimant que les différences épissage motifs sont si subtiles que la sélection est stochastique 7, tandis que d&#39; autres en déduisent une réglementation fondée sur la spécificité des tissus 8. Tandem sélection de site d&#39;épissage a été analysé semi-quantitativement par électrophorèse capillaire modifiée 7, et le gel à haute résolution électrophorèse 8. ARN-Seq (séquençage de l&#39;ARN) lit peut être utilisé pour quantifier les ratios d&#39;épissage à chaque épissuresite. De cette façon, les données de l&#39; ARN-Seq a donné un aperçu de la réglementation des sites d&#39;épissage tandem 9. Il a également permis la prédiction des rapports variants d&#39;épissage attendus sur la base nucléotidique motif 10. La plupart de l&#39;accent mis sur l&#39;épissage qui inclut ou exclut un seul codon a été mis sur les survenant plus fréquemment tandem accepteur sites d&#39;épissage, appelés NAGNAGs (où N = nucleotide quelconque). sites d&#39;épissage alternatifs Tandem donateurs incluant ou excluant un seul codon (GYNGYN motif de reconnaissance, où Y = pyrimidine) sont moins fréquentes que les accepteurs en tandem. Transducteur de signal et activateur de la transcription 3 (STAT3) est un gène clé subissant tandem donneur épissage alternatif 1,11. Les sites de tandem donneur d&#39;épissage rejoindre exons 21 et 22 et se traduisent par l&#39;inclusion ou l&#39; exclusion du codon pour Serine-701 (S ou ΔS respectivement) 1,11. en aval des sites alternatifs d&#39;accepteur (40 nucléotides espacées les unes des autres) de jonction des exons 22 et23a / b en raison de l&#39;inclusion soit des 55 résidus terminaux du domaine de transactivation (de α) ou un domaine de transactivation tronqué avec 7 résidus C-terminaux uniques (ß) 11. Par conséquent, quatre variants d&#39;épissage sont possibles. La protéine STAT3 est un facteur majeur de la transcription et l&#39; intégrateur de signal dans de nombreux types cellulaires 12 et lorsqu&#39;ils sont mutés son activation constitutive contribue à plusieurs phénotypes cancéreux (revue dans la référence 13). Syndrome de Job, un trouble de l&#39; immunodéficience caractérisée par des niveaux élevés d&#39;IgE, est également causée par des mutations dans STAT3 (revue en référence 14). Rôles distincts pour α STAT3 et protéines variantes β d&#39;épissage ont été décrites précédemment 15. Dans un premier temps , STAT3 β a été pensé pour agir d&#39;une manière négative dominante 16, antagoniser l&#39; activité transcriptionnelle de STAT3 de α, mais les travaux ultérieurs suggéré qu&#39;il a des gènes cibles indépendants 17 </sup&gt;. Malgré la subtilité du tandem épissage, il y a lieu de croire que l&#39;absence ou la présence de sérine-701 fonction (Ser701) des influences. Non seulement est Ser701 à proximité de Tyrosine-705 (le résidu phosphorylée dans l&#39; activation de STAT3 18), mais une étude récente suggère que les variants d&#39;épissage STAT3 S et ΔS sont tous deux nécessaires pour la viabilité du lymphome STAT3-addicted Diffuse Grand cellules B (DLBLCL) 19 cellules. La pertinence biologique reste à explorer. Étant donné que la composition de variant d&#39;épissage pourrait influer sur la fonction, nous nous sommes efforcés de découvrir si le rapport a été perturbée par la stimulation des cytokines dans les éosinophiles. Nous avons d&#39; abord tenté d&#39;explorer le lien entre les deux événements d&#39;épissage en utilisant une PCR spécifique pour α STAT3 et variants d&#39;épissage β, suivie d&#39; un clivage de produits avec une enzyme de restriction spécifique pour les variants d&#39;épissage S AFEI. Densitométrie des produits a indiqué l&#39;inclusion de Ser701 a été roughly dix fois plus fréquente que son omission (ΔS) dans les deux α STAT3 et β (données non présentées). Cependant, cette approche semi-quantitative n&#39;a pas été suffisamment reproductible, et ne pouvait être utilisé efficacement pour mesurer les quatre variants d&#39;épissage simultanément. Pour analyser les proportions de chacun des quatre variants d&#39;épissage, il était nécessaire d&#39;établir une PCR (qPCR) protocole quantitatif qui a donné serrés techniques (plusieurs essais d&#39;un échantillon donné) réplique. QPCR relative repose sur la comparaison d&#39;un gène d&#39;intérêt à un gène standard ou le ménage connu pour être exprimé à un niveau particulier 20 et est appropriée lorsque le gène d&#39;intérêt et le gène de ménage sont amplifiés avec une efficacité similaire. Un brin (ds) fluorescent (cyanine) , un colorant de double liaison à l&#39; ADN se lie aux amplicons PCR 21, et après un certain nombre de cycles, une amplification suffisante pour la fluorescence est produite pour être détectable. Plus le niveau initialde la transcription, plus le cycle seuil (Ct) valeur. Puisque la concentration de préparations d&#39; ADNc diffère, il faut comparer la concentration de la transcription avec la concentration d&#39;une transcription connue pour être exprimée à un niveau constant dans tous les échantillons, comme glucuronidase-β (GUSB) en éosinophiles 22. qPCR relative est impossible pour des séquences très similaires, comme le montre les variants d&#39;épissage résultant d&#39;un épissage en tandem. Les conditions strictes requises pour amplifier spécifiquement les variantes d&#39;épissage conduisent à une diminution du rendement. Au lieu de cela, la quantification absolue doit être utilisé 23. Cela implique la préparation d&#39; une courbe standard avec des concentrations connues de la transcription épissé d&#39;intérêt, et les conditions de PCR assurant optimiser la spécificité 24. Comme décrit, les données absolues et relatives qPCR pour un gène particulier peuvent être fusionnés pour informer la compréhension de l&#39;expression du gène dans un type cellulaire particulier,ce cas STAT3 dans les éosinophiles diversement stimulées 25. Ici, STAT3 variant d&#39;épissage de quantification est décrit dans l&#39;espoir que le procédé peut être adapté à des études ciblées en tandem d&#39;autres événements d&#39;épissage. L&#39;optimisation est un processus long, où plusieurs paires d&#39;amorces à diverses concentrations et de nombreuses itérations de paramètres de cycle ont été testés au cours de quelques mois. Les principales caractéristiques du protocole sont la validation de la spécificité primaire et quantification basée sur les courbes standard avec des concentrations connues des variants d&#39;épissage. qPCR relative en collaboration se sont révélées utiles pour notre application mais pas nécessaire.

<table><tbody><tr><td>MJ Research PTC-200 Thermocycleur</td><td>GMI</td><td>N/A</td><td>Utilisé pour le système PCR en</td></tr><tr><td>temps réel standard PCR 7500</td><td>Applied Biosystems</td><td>N/A</td><td>Machine qPCR</td></tr><tr><td>GS-6R</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>Centrifugeuse pour plaques à 96 puits</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 sprectrophotomètre</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8758</td><td>milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>PfuTurbo ADN polymérase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600410</td><td>ADN polymérase pour PCR standard</td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biosciences</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biosciences</td><td>R0131S</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Qiagen</td><td>330523</td><td>qPCR, ADN polymérase/dsMélange de colorants de liaison à l’ADN</td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Kit d’extraction d’ARN</td></tr><tr><td>SuperScript III Système de synthèse de premier brin</td><td>Invitrogen (ThermoFisher Scientific)</td><td>18080-044</td><td>Kit de synthèse d’ADNc</td></tr><tr><td>Amorces</td><td>Integrated DNA Technology</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 1.1</td><td>New England Biosciences</td><td>B7201S</td><td></td></tr><tr><td>GenePure LE Agarose</td><td>ISC BioExpress</td><td>E-3120-500</td><td>composant du gel TAE</td></tr><tr><td>Pipettors</td><td>Principaux fournisseurs de laboratoire (MLS)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette filtrante</td><td>Neptune</td><td>Scientific BT10XL, BT20, BT200</td><td></td></tr><tr><td>EU One Piece Thin Wall</td><td>Plate MidSci</td><td>ABI7501</td><td></td></tr><tr><td>ThermalSeal A Sealing Film</td><td>MidSci</td><td>TSA-100</td><td>96 well plate</td></tr><tr><td>seal pET-Elmer (variante de pET-28a)</td><td>Novagen ; modifié dans le laboratoire Mosher</td><td>N/A</td><td>Détails dans le PMID : 20947497</td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps Système de purification d’ADN</td><td>Promega</td><td>A1460</td><td>Purification de plasmides</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Kit de séquençage de cycle ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>4337455</td><td>Kit de séquençage</td></tr><tr><td>QIAEX II Kit d’extraction de gel</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td>Purification d’amplicons</td></tr><tr><td>DH5&alpha ; cellules compétentes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18265-017</td><td>disponible auprès de plusieurs fournisseurs, voir PMID : 2162051</td></tr><tr><td>kanamycin</td><td>Research Products International Corp.</td><td>K22000-5.0</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td>composant du tampon TAE</td></tr><tr><td>Acide acétique, glacial</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A38C-212</td><td>composant du tampon TAE</td></tr><tr><td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td><td>Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich)</td><td>E-5134</td><td>composant du tampon TAE</td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td>composant du bouillon Luria</td></tr><tr><td>Extrait de levure Bacto, technique</td><td>BD Biosciences</td><td>288620</td><td>composant du bouillon Luria</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S271-10</td><td>composant du bouillon Luria</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td>composant du bouillon Luria</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td>composant de Luria Plaque de bouillon</td></tr><tr><td>Lasergene SeqBuilder</td><td>DNASTAR</td><td></td><td>Figure 1 générée à l’aide du logiciel Lasergene SeqBuilder version 12.2.0 (DNASTAR)</td></tr></tbody></table>

la fusion absolue et relative des données quantitatives pcr pour quantifier stat3 splice variant transcriptions

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Le transducteur de signal humain et activateur de transcription 3 (STAT3) est l’un des nombreux gènes contenant un site d’épissage en tandem. D’autres sites d’épissage du donneur distants de 3 nucléotides entraînent l’inclusion (S) ou l’exclusion (ΔS) d’un seul résidu, la sérine 701. Plus en aval, l’épissage sur une paire de sites d’épissage accepteurs alternatifs aboutit à des transcrits codant soit pour les 55 résidus terminaux du domaine de transactivation (α), soit pour un domaine de transactivation tronqué avec 7 résidus uniques (β). Comme indiqué dans ce manuscrit, il a été possible de mesurer les proportions des quatre transcrits épissés de STAT3 (Sα, Sβ, ΔSα et ΔSβ) à l’aide de la qPCR absolue (réaction en chaîne par polymérase quantitative). Le protocole distingue et mesure donc les variantes d’épissage très similaires. La qPCR absolue utilise des plasmides de calibrage et la spécificité de la détection n’est donc pas compromise pour des raisons d’efficacité. Le protocole nécessite la validation de l’amorce et l’optimisation des paramètres de cyclage. Une combinaison de qPCR absolue et de qPCR relative dépendante de l’efficacité des transcrits STAT3 totaux a permis de décrire les fluctuations des niveaux des variants d’épissage STAT3 chez les éosinophiles traités avec des cytokines. Le protocole a également fourni la preuve d’une interdépendance de co-épissage entre les deux événements d’épissage STAT3. La stratégie basée sur une combinaison des deux techniques de qPCR devrait être facilement adaptable à l’étude du co-épissage à d’autres sites d’épissage en tandem.

De bonnes données qPCR de qualité vont générer une courbe d&#39;amplification sigmoïde (Figure 2a), ce qui signifie augmentation exponentielle dans les transcriptions au cours du cyclisme. La présence de trop de modèle peut se traduire par un fond de fluorescence élevée, ce qui signifie une base de référence inappropriée est établie dans les premiers cycles. Si les données ne fournissent pas une courbe exponentielle (Figure 2b), une optimisation plus poussée est nécessaire (décrite dans les étapes 3.1 et 3.4). Pour de plus amples informations sur la résolution des résultats de qPCR, reportez - vous à la référence 32. Les courbes d&#39; étalonnage obtenues pour les plasmides modèle d&#39;étalonnage indiquent l&#39;efficacité de l&#39; amplification (courbe pour STAT3 Sα représenté sur la figure 3). Efficacités entre 83 et 95% ont été observées dans les conditions décrites. L&#39;équation pour la spécificité (étape 3.4) suppose égale efficacité, ce qui est peu probable 25, de sorte que la spécificitéest susceptible d&#39;être plus grande que le facteur de spécificité indique. Afin d&#39;évaluer la congruence des niveaux STAT3, les valeurs absolues de chacune des quatre variants d&#39;épissage ont été mesurés, ainsi que le niveau de STAT3 totale, celle - ci en utilisant des amorces d&#39; amplification d&#39; une région commune aux quatre variantes d&#39;épissage (figure 4). Idéalement , la régression linéaire (indication de corrélation) et la pente (rapport de STAT3 pan- à des variants d&#39;épissage additionnées) devraient tous deux être proche de 1. Les données absolues qPCR sont présentées comme des graphiques circulaires pour montrer les proportions des quatre variants d&#39;épissage au fil du temps post-stimulation avec des cytokines (figure 5a). Éosinophiles repos (0 h) avaient la plus faible proportion de STAT3 Sα, bien que cette variante était toujours le plus abondant. Multipliant la fraction de STAT3 variants d&#39;épissage β (S ^6; + ΔSβ) par la fraction des variants d&#39;épissage STAT3 ΔS (+ ΔSα ΔSβ) a donné une valeur constante inférieure à la valeur expérimentale enregistrée pour ΔSβ. Si les événements d&#39;épissage étaient indépendants, on pourrait penser que la multiplication fraction de ΔS variantes par la fraction de variantes ß donnerait une valeur qui correspond à la valeur déterminée expérimentalement. Des niveaux plus élevés de ΔSβ que prévu des événements d&#39;épissage indépendants suggère un biais co-épissage existe. Fusion des données qPCR absolue et relative a démontré que les niveaux de tous les variants d&#39;épissage de STAT3 augmenté post-stimulation avec des cytokines IL3 et TNFa, avec des niveaux pic 6 h post-stimulation (Figure 5b - e). Pour trois des quatre variants d&#39;épissage, les niveaux de transcription étaient environ 3 fois plus élevé chez les éosinophiles traités IL3 + TNFa (6 h) par rapport à éosinophiles dans les médiasau même point de temps. Les niveaux STAT3 Sα étaient 3,5 fois plus élevé dans IL3 + TNFa éosinophiles traités par rapport à éosinophiles dans les médias à ce point de temps. La plus grande incertitude ( la plus grande erreur de mesure standard) a été observée dans ΔSβ (Figure 5e), qui comprend la plus petite fraction du total STAT3 dans tous les échantillons. Ce ne fut pas surprenant que les niveaux inférieurs sont associés à des valeurs Ct plus élevées. Exiger plus de cycles pour atteindre le cycle de seuil composé incertitude due à la variation du cycle à cycle dans l&#39;efficacité de l&#39;amplification. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54473/54473fig1.jpg" /> Figure 1: Représentation schématique des paires d&#39;amorces utilisées pour effectuer la qPCR des variants d&#39;épissage STAT3 et pan-STAT3 Les amorces utilisées pour amplifier spécifiquement chacune des variantes d&#39;épissage STAT3 (Sα, Sβ, et ΔSα ΔSβ respectivement) s.hown. Amorces Forward (STAT3 &quot;S&quot; et &quot;ΔS&quot;) couvrent la jonction entre les exons 21 et 22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54473/54473fig2.jpg" /> Figure 2:. Parcelles d&#39;amplification de données qPCR (a) des parcelles d&#39;amplification sigmoïde des moyens d&#39; amplification fiable. Ces données ont été obtenues à partir qPCR de deux dilutions en série de plasmide contenant STAT3 Sα, chaque paire de lignes de couleur représentant les niveaux de fluorescence des échantillons en double dilution au cours de 40 cycles (axe des x). L&#39;échantillon le plus concentré (gris-vert) a été suffisamment amplifié par cycle de 17 (avec colorant proportionnel à fluorescence, montré sur l&#39;axe des y dsDNA liaison) pour dépasser la valeur de fluorescence de seuil (BaseliNE présentée comme flèche verte). Sa valeur Ct serait 17. (b) des parcelles non-exponentielles suggèrent que le seuil d&#39; arrière-plan de fluorescence n&#39;a pas été correctement mis en place dans les premiers cycles. Cela pourrait être dû à la présence d&#39;un inhibiteur, ou un modèle hautement concentré ou amorces. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54473/54473fig3.jpg" /> Figure 3: Courbe standard de journal (nombre de copies de STAT3 Sα) vs Ct Il existe une relation linéaire entre le log du nombre de copies et le seuil du cycle de chaque variant d&#39;épissage STAT3 (Ct).. Création d&#39;une courbe standard à partir d&#39;ADN plasmidique imite l&#39;ADNc d&#39;échantillons et doncfournit une meilleure mesure qu&#39;une courbe créée à partir de amplicons PCR dilué. Les données présentées sont des valeurs Ct obtenues à partir de qPCR de deux dilutions successives de plasmide contenant STAT3 Sα. A partir de cette courbe, le nombre de copies présent dans chaque échantillon peut être interpolée, et l&#39;efficacité d&#39;amplification calculée (83,9%). Bien que intersections de y sont moins reproductibles que la pente, l&#39;interception suggère 42,2 cycles seraient nécessaires pour être certain pas d&#39; ADN cible est présente. Les barres d&#39;erreur indiquent SEM, n = 3. courbes comparables ont été construits pour STAT3 Sβ, ΔSα et ΔSβ (non représenté). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54473/54473fig4.jpg" /> Figure 4: Comparaison des pan- quantifiée <strong&gt; STAT3 vs variantes cumulatifs STAT3 d&#39;épissage. La régression des ajouté épissage STAT3 variantes vs STAT3 totale devrait avoir la pente (rapport de pan- à cumulative) et R valeur 2 (corrélation) proche de 1. Les valeurs de 17 échantillons (éosinophiles et DLBCL) compris. Les barres d&#39;erreur représentent la SEM de X à Y déterminations, n ≥ 2 pour chacun. Figure adapté de la référence 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/54473/54473fig5.jpg" /> Figure 5:. Les niveaux de variants d&#39;épissage STAT3 ont fluctué au cours du traitement de la cytokine (a) Les graphiques circulaires indiquant les pourcentages de chaque variante STAT3 d&#39;épissuredes éosinophiles pendant le traitement par l&#39;IL3 et TNFa. (B - e) Variation des variants d&#39;épissage de STAT3 dans les éosinophiles traitées avec différentes combinaisons de cytokines, mesurées en combinant les données relatives et absolues qPCR Sα (b), Sβ (c), ΔSα (d), et ΔSβ (e) niveaux STAT3. fluctué au fil du temps post-stimulation. Niveaux d&#39;abord augmenté, atteignant un sommet de 6 heures après la stimulation. La combinaison IL3 + TNFa a suscité une expression plus élevée de tous les variants d&#39;épissage quatre STAT3 que IL3 seul. SEM calculée pour chaque point de données comptables pour la propagation de l&#39; erreur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl1.jpg" /> Tableau 1:<html> Les amorces utilisées pour l&#39; amplification (a), absolu (b) et relatif (c) PCR quantitative. Amorces de clonage ont des séquences de restriction et 5&#39;-extensions pour une coupe efficace. Sites de restriction Kpnl et Nhel sont indiqués en gras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473tbl1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.</a> <img alt="Tableau 2" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl2.jpg" /> Tableau 2. Paramètres de cyclisme PCR ( à gauche) et des volumes de réactifs ( à droite) pour l&#39; amplification (a), relative (b), absolue (c) PCR quantitative. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473tbl2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.</a> <html> 3 / 54473tbl3.jpg &quot;/&gt; Tableau 3:. Modèle pour absolue qPCR test d&#39;étalonnage plasmidique Ce test est nécessaire pour évaluer la reproductibilité et l&#39; efficacité, ainsi que de générer des courbes standard à partir de laquelle interpoler des données. Les mélanges &quot;non-cibles&quot; donnera une estimation de la spécificité. L&#39; optimisation peut être nécessaire pour assurer la cohérence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473tbl3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.</a> <img alt="tableau 4" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl4.jpg" /> Tableau 4:. Modèle de qPCR relative (STAT3 pan- et d&#39; entretien ménager gène GUSB) d&#39;essai d&#39;étalonnage Contrairement qPCR absolue, le point de ce test est de déterminer les conditions dans lesquelles l&#39; efficacité d&#39;amplification est ~ 100%.tp_upload / 54473 / 54473tbl4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table. <img alt="tableau 5" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl5.jpg" /> Tableau 5:.. Modèle de rapport analyse de l&#39; échantillon qPCR pour mesurer pan- STAT3 et gène de ménage GUSB courbes standard sont répétées avec des échantillons pour assurer une efficacité comparable des essais <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473tbl5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.</a> <img alt="tableau 6" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl6.jpg" /> Tableau 6: Modèle d&#39;absolu dosage de l&#39; échantillon qPCR pour mesurer les variantes S courbes standard sont répétées avec des échantillons pour assurer eff comparable.<html> cacité des tests. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473tbl6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.</a> <img alt="tableau 7" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl7.jpg" /> Tableau 7:.. Modèle pour absolue dosage de l&#39; échantillon qPCR pour mesurer les variantes ΔS courbes standard sont répétées avec des échantillons pour assurer une efficacité comparable des essais <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473tbl7large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.</a> <img alt="tableau 8" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl8.jpg" /> Tableau 8: Modèle d&#39;absolu dosage de l&#39; échantillon qPCR pour mesurer STAT3 pan-.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.

Les événements d’épissage en tandem se produisent à des sites distants de moins de 12 nucléotides. Il est possible de quantifier les ratios de ces variantes d’épissage à l’aide d’une approche PCR quantitative absolue. Ce manuscrit décrit comment les variantes d’épissage du gène STAT3, dans lesquelles deux événements d’épissage entraînent l’inclusion/exclusion de la sérine-701 et l’extrémité C-terminale α/β, peuvent être quantifiées.

La fusion absolue et relative des données quantitatives PCR pour Quantifier STAT3 Splice Variant Transcriptions

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

L'objectif général de ce protocole est de quantifier les proportions et les niveaux absolus des transcrits des variants d'épissage de STAT3 dans les éosinophiles. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la régulation de l'épissage, telles que la co-association d'événements d'épissage distants et l'identification des conditions pouvant entraîner des différences dans les proportions d'épissage en tandem. Le principal avantage de cette technique réside dans l'utilisation de standards plasmidiques permettant l'obtention de données de qPCR absolues et relatives, ce qui nous permet de déterminer les proportions et les niveaux globaux de quatre transcrits de STAT3.Dans notre cas, nous souhaitons comprendre comment les quatre variants de STAT3 — S alpha, S beta, delta S alpha et delta S beta — changent lorsque les éosinophiles sont stimulés par des cytokines. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la composition de STAT3 dans les éosinophiles, elle peut également être appliquée à d'autres types cellulaires à partir desquels on peut obtenir de l'ADNc. Étant donné que les formes S et delta S diffèrent par seulement trois nucléotides, nous avons dû sacrifier l'efficacité afin d'obtenir une spécificité suffisante pour les standards de chaque variant.Dans ce protocole, l'ADNc préparé à partir d'éosinophiles humains est utilisé comme matrice pour amplifier les variants d'épissage de STAT3. Après avoir construit les plasmides comme décrit dans le protocole textuel, préparez des réactions de séquençage pour séquencer les plasmides provenant de plusieurs colonies. Chaque réaction de 20 microlitres doit contenir trois microlitres de tampon de réaction de séquençage, deux microlitres de mélange de réaction de séquençage, 12 microlitres d'eau ultrapure, un microlitre de plasmide et deux microlitres d'amorce de séquençage.Lorsque les résultats du séquençage sont disponibles, analyser les électrophorégrammes des plasmides codant pour chaque variante : S alpha, S beta, delta S alpha et delta S beta. Mesurer la concentration de l'ADN plasmidique purifié en nanogrammes par microlitre et calculer le nombre de copies par microlitre. Commencer cette procédure en préparant une série de dilutions au 1/10 des plasmides STAT3 à l'aide d'eau ultrapure.Avec environ 10⁸ à 10³ copies par microlitre. Mesurer la concentration de l'échantillon le plus concentré. Utiliser les plasmides dilués pour préparer quatre mélanges sans cible comme contrôles négatifs pour chaque variante d'épissage, à 10⁶ copies par microlitre pour chaque variante.Préparez un mélange cible avec des concentrations égales des quatre matrices, chacune à 10 puissance six copies par microlitre. Préparez des solutions de paires d'amorces pour chaque variante d'épissage avec 60 microlitres d'amorces, chacune à une concentration de sept micromolaire, pour une concentration finale de 560 nanomolaire dans l'échantillon. Diluez la polymérase ADN et le mélange de colorant de liaison à l'ADN double brin sept pour cinq avec de l'eau pure.Préparer le test dans une plaque PCR 96 puits en suivant ce modèle. Ajouter d'abord à chaque puits 21 microlitres du mélange de polymérase à ADN diluée et de colorant de liaison à l'ADN double brin. Puis ajouter deux microlitres de mélange d'amorces et deux microlitres de matrice.Dans chaque puits témoin sans matrice, ajouter deux microlitres d'eau filtrée au lieu de la matrice. Préparer les réactions en double afin d'évaluer la répétabilité. Sceller la plaque de qPCR avec un couvercle adhésif et centrifuger pendant cinq minutes à 1 200 g et à 12 degrés Celsius.Allumez la machine de qPCR et insérez la plaque de qPCR scellée. Si vous utilisez le système de PCR en temps réel ABI, configurez l'expérience comme indiqué. Cliquez sur Fichier, Nouveau, Suivant, sélectionnez un nouveau détecteur, puis indiquez un nom et choisissez un marqueur rapporteur et un éteigneur.Configurez un nouveau détecteur pour chaque variante d'épissage. Sélectionnez Suivant et configurez les étalons comme indiqué sur la page Configuration de la plaque d'échantillons, en veillant à entrer les quantités dans le tableau et à sélectionner les détecteurs appropriés. Cliquez sur Terminer.Configurer le programme de cyclage PCR approprié. Veiller à ce que la lecture de la fluorescence pour déterminer les valeurs de cycle seuil ait lieu pendant l'étape de 72 degrés Celsius de chaque cycle. Sélectionner Exécuter.Lorsque l'exécution est terminée, cliquez sur l'onglet Résultats, puis sur l'onglet Courbe d'amplification. Évaluez la courbe de sortie pour apprécier la qualité des données. Une courbe exponentielle indique une amplification fiable.Exporter les résultats vers un logiciel de feuille de calcul. L'analyse des données, telle que décrite dans le protocole textuel, est essentielle pour déterminer si le test nécessite une optimisation supplémentaire afin d'assurer sa reproductibilité. L'ADN complémentaire utilisé pour ce test est préparé à partir d'éosinophiles traités avec des cytokines afin de favoriser la transcription.Préparez des dilutions sérielles de deux aliquots d'ADNc avec une gamme de dilution allant de un à un sur 1 024. Mettez en place le dosage dans une plaque de 96 puits avec des réactions de 25 microlitres, comme illustré pour l'analyse de la spécificité des amorces, mais avec plusieurs concentrations d'amorces pour STAT3 pan et le gène de référence GUSB. Un modèle est présenté dans ce tableau.Insérez la plaque PCR scellée dans la machine de qPCR. Configurez l'expérience à l'aide du logiciel en ajoutant un nouveau détecteur pour GUSB et en utilisant le programme de cyclage PCR approprié. Ensuite, les résultats sont utilisés pour calculer la valeur du cycle seuil pour chaque échantillon, comme décrit dans le protocole textuel.Pour commencer cette procédure, comparez les valeurs de cycle seuil obtenues en qPCR relative pour le gène de référence GUSB et diluez l'ADNc en conséquence avec de l'eau ultrapure afin de garantir que toutes les concentrations se situent dans une plage d'un ordre de grandeur. Préparez les essais de qPCR absolue des échantillons dans des plaques de 96 puits. Suivez ce modèle pour S alpha et S beta et ce modèle pour delta S alpha et delta S beta.Réalisez les dosages comme indiqué précédemment et répétez-les au moins une fois. Ensuite, préparez une plaque de qPCR absolue en 96 puits avec des réactions de 25 microlitres en utilisant des amorces pan-STAT3 à 400 micromolaire et un mélange des quatre plasmides ou un plasmide unique selon ce modèle. Scellez la plaque de qPCR avec un couvercle adhésif et centrifugez pendant cinq minutes à 1 200 g et à 12 degrés Celsius.Insérez la plaque PCR scellée dans l'appareil de qPCR et configurez l'expérience comme indiqué précédemment, en ajoutant un nouveau détecteur pour le STAT3 pan. Configurez les mêmes paramètres de cyclage que pour la qPCR relative. Après avoir répété le dosage au moins une fois, analysez les résultats comme décrit dans le protocole textuel.De bonnes données de qPCR produiront un tracé d'amplification en forme de sigmoïde, indiquant une augmentation exponentielle des transcrits au cours des cycles. Ces données ont été obtenues par qPCR de deux dilutions sérielles d'un plasmide contenant STAT3 S alpha. Chaque paire de lignes colorées représente les niveaux de fluorescence d'échantillons dilués en double au cours de 40 cycles.Les courbes standards générées pour les plasmides calibrateurs du modèle indiqueront l'efficacité de l'amplification. Dans cette courbe pour STAT3 S alpha, l'efficacité d'amplification était de 83,9 %. Afin d'évaluer la congruence des niveaux de STAT3, les valeurs absolues de chacune des quatre variantes d'épissage ont été mesurées, ainsi que le niveau de STAT3 total. Idéalement, à la fois la régression linéaire et la pente devraient être proches de un.Les données absolues de qPCR sont présentées sous forme de diagrammes circulaires afin d'illustrer les proportions des quatre variants d'épissage de STAT3 au cours du traitement par les cytokines. La fusion des données absolues et relatives de qPCR a démontré que les niveaux de tous les variants d'épissage de STAT3 augmentaient après stimulation par les cytokines IL3 et TNF alpha, avec un pic atteint à six heures. L'analyse regroupée des données provenant de tous les points temporels a révélé un biais faible mais significatif en faveur de l'association concomitante des événements d'épissage bêta et delta S.Une fois optimisés, les tests fondés sur cette technique peuvent être réalisés en quatre heures si l'on respecte correctement les procédures. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de travailler dans des conditions stériles afin de prévenir toute contamination. Les choix d'épissage incluant ou excluant un codon représentent 20 % des variations d'épissage en phase.Notre protocole devrait pouvoir être facilement adapté à la quantification de telles variations. Après son développement, cette technique a permis à Mao Zhang de collaborer avec mon groupe et celui de Li-Shan Rue afin de réaliser des expériences de contrôle de réexpression après inhibition des variants de STAT3 dans des cellules de lymphome ABC. Ces expériences ont démontré qu'un mélange des variants S et delta S est nécessaire à la survie cellulaire en culture.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une PCR quantitative absolue et relative, ainsi que des conditions appropriées pour distinguer et quantifier des différences d'épissage subtiles.

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En utilisant l&#39;ARN-séquençage pour détecter de nouveaux variants d&#39;épissage associés à la résistance aux médicaments dans<em&gt; In vitro</em&gt; Modèles de cancer

Nous décrivons une méthode pour trier des cellules de mammifères uniques et quantifier l’expression d’un maximum de 96 gènes cibles d’intérêt dans chaque cellule. Cette méthode comprend l’utilisation de normes qPCR internes pour permettre l’estimation du nombre absolu de transcrits.

Unicellulaire profil d&#39;expression génique utilisant FACS et qPCR avec les normes internes

Un protocole in situ (ISH) de l’hybridation qui utilise courts oligonucléotides antisens pour détecter les modes épissage alternatif pré-ARNm dans les sections de cerveau de souris est décrite.

Analyse quantitative de l’épissage alternatif pré-ARNm dans les Sections de cerveau de souris à l’aide de RNA essai In Situ hybridation avec

Dans cet article, un protocole à haut débit pour une détermination rapide et fiable des niveaux d’expression des gènes dans des échantillons de C. elegans en vrac ou en vrac est décrit. Ce protocole n’exige pas l’isolement d’ARN et produit l’ADND directement à partir d’échantillons. Il peut être utilisé avec des plates-formes qPCR nanofluidiques multiplexées à haut débit.

Rt-PCR quantitatif à haut débit dans les échantillons de C. elegans en vrac et en vrac à l’aide de la technologie nanofluidique

Ce protocole présente un outil rapide et utile pour évaluer le rôle d’une protéine avec la fonction uncaracterized dans le règlement d’épissage alternatif après traitement chimiothérapeutique.

Utilisation de l’outil E1A Minigene pour étudier les changements d’épissage de l’ARNm

L’épissage alternatif (AS) et la polyadénylation alternative (APA) élargissent la diversité des isoformes de transcrits et de leurs produits. Ici, nous décrivons des protocoles bioinformatiques pour analyser les tests de séquençage d’ARN en vrac et de séquençage à 3' pour détecter et visualiser l’AS et l’APA variant selon les conditions expérimentales.

Identification d’un épissage alternatif et d’une polyadénylation dans les données de séquençage de l’ARN

Ce protocole décrit un test rapporteur minigène pour surveiller l’impact des mutations du site de l’épissure 5'sur l’épissage et développe un suppresseur U1 snRNA pour le sauvetage de l’inhibition de l’épissage induite par mutation. Les constructions de l’ARNN U1 rapporteur et suppresseur sont exprimées dans les cellules HeLa, et l’épissage est analysé par extension d’amorce ou RT-PCR.

Un test cellulaire basé sur un rapporteur pour surveiller l’efficacité de l’épissage

Ce protocole mesure quantitativement la stabilité et la demi-vie des ARN amplificateurs intergéniques et intragéniques dans les cellules souches embryonnaires de souris grâce au traitement à l’Actinomycine D, RT-qPCR et analyse de régression non linéaire. Des stratégies de normalisation spécifiques à la position sont intégrées pour modéliser avec précision la dynamique de désintégration de l’ARNe, de manière dépendante du contexte.

Évaluation quantitative optimisée de la stabilité de l’ARN d’amélioration dans les cellules souches embryonnaires de souris

Ce protocole fournit un pipeline de calcul rationalisé pour quantifier les transcrits d’amplificateurs naissants. En intégrant l’accessibilité de la chromatine, les caractéristiques de la chromatine et les données transcriptionnelles, il permet une détection précise et une analyse spécifique du brin de l’activité des amplificateurs dans des régions intragéniques complexes, tout en restant accessible aux chercheurs sans formation approfondie en bioinformatique.

Un pipeline informatique pour la quantification de l’ARN amplificateur intergénique/intragénique dans les cellules souches embryonnaires de souris

Découvrez une méthode de qPCR absolue et relative pour quantifier les variants d'épissage STAT3 dans les éosinophiles humains. Cette technique utilise des standards plasmidiques pour analyser précisément les proportions des quatre transcrits.

La fusion absolue et relative des données quantitatives PCR pour Quantifier STAT3 Splice Variant Transcriptions

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