La fusion absolue et relative des données quantitatives PCR pour Quantifier STAT3 Splice Variant Transcriptions

L’objectif global de ce protocole est de quantifier les proportions et les niveaux absolus de transcrits de la variante d’épissage STAT3 chez les éosinophiles. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la régulation de l’épissage, telles que la co-association d’événements d’épissage distal et l’identification des conditions qui peuvent entraîner une différence entre les proportions d’épissage en tandem. Le principal avantage de cette technique réside dans les normes plasmidiques qui permettent d’acquérir des données de qPCR absolues et relatives, ce qui nous permet de déterminer les proportions et les niveaux globaux de quatre transcrits STAT3.

Dans notre cas, nous souhaitons savoir comment les quatre variants de STAT3 S alpha, S beta, delta S alpha et delta S bêta changent lorsque les éosinophiles sont stimulés par des cytokines. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la composition de l’éosinophile STAT3, elle peut également être appliquée à d’autres types de cellules pour lesquelles l’ADNc peut être obtenu. Étant donné que S et delta S ne varient que dans trois nucléotides, nous avons dû sacrifier l’efficacité pour obtenir la spécificité de l’une ou l’autre des normes pour chaque variante.

Dans ce protocole, l’ADNc préparé à partir d’éosinophiles humains est utilisé comme modèle pour amplifier les variants d’épissage STAT3. Après avoir créé les plasmides comme décrit dans le protocole textuel, préparez des réactions de séquençage pour le séquençage des plasmides de plusieurs colonies. Chaque réaction de 20 microlitres doit contenir trois microlitres de tampon de réaction de séquençage, deux microlitres de mélange de réaction de séquençage, 12 microlitres d’eau ultrapure, un microlitre de plasmide et deux microlitres d’amorce de séquençage.

Lorsque les résultats du séquençage sont disponibles, évaluer les électrophorétogrammes des plasmides codant pour chaque variant ; S alpha, S bêta, delta S alpha et delta S bêta. Mesurez la concentration d’ADN plasmidique pur en nanogrammes par microlitre et calculez le nombre de copies par microlitre. Commencez cette procédure en préparant une série de dilution sur 10 des plasmides STAT3 à l’aide d’eau ultrapure.

Avec environ 10 à la huitième à 10 à la troisième copies par microlitre. Mesurez la concentration de l’échantillon le plus concentré. Utilisez les plasmides dilués pour préparer quatre mélanges non cibles comme témoins négatifs pour chaque variante d’épissage à raison de 10 à six copies par microlitre pour chaque variante.

Préparez un mélange cible avec des concentrations égales des quatre modèles, chacun à 10 ou six exemplaires par microlitre. Préparez des solutions de paires d’amorces pour chaque variante d’épissage avec 60 microlitres d’amorces, chacune à une concentration de sept micromolaires, pour une concentration finale de 560 nanomolaires dans l’échantillon. Diluez l’ADN polymérase, mélange de colorant de liaison à l’ADN double brin, sept à cinq avec de l’eau pure.

Configurez le test dans une plaque PCR de 96 puits en suivant ce modèle. Ajoutez d’abord dans chaque puits 21 microlitres d’ADN polymérase diluée, mélange de colorant de liaison à l’ADN double brin. Ajoutez ensuite deux microlitres de mélange d’apprêt et deux microlitres de gabarit.

À chaque puits de contrôle sans gabarit, ajoutez deux microlitres d’eau filtrée au lieu du gabarit. Configurez les réactions en double pour évaluer la répétabilité. Scellez la plaque qPCR à l’aide d’un couvercle adhésif et centrifugez pendant cinq minutes à 1 200 g à 12 degrés Celsius.

Allumez la machine qPCR et insérez la plaque qPCR scellée. Si vous utilisez le système de PCR en temps réel ABI, configurez l’expérience comme indiqué. Cliquez sur Fichier, Nouveau, Suivant, sélectionnez Nouveau détecteur, puis donnez un nom et choisissez un Rapporteur et un Extincteur.

Configurez un nouveau détecteur pour chaque variante d’épissure. Sélectionnez Suivant et configurez les étalons comme indiqué sur la page Configurer la plaque d’échantillonnage, en vous assurant que les quantités sont entrées dans le tableau et que les détecteurs appropriés sont sélectionnés. Cliquez sur Terminer.

Mettez en place le programme de cyclisme PCR approprié. Assurez-vous que la lecture de fluorescence pour déterminer les valeurs seuils du cycle se produit pendant l’étape de 72 degrés Celsius de chaque cycle. Sélectionnez Exécuter.

Une fois l’exécution terminée, cliquez sur l’onglet Résultats : onglet Graphique d’amplification. Évaluez le graphique Amplification de sortie pour évaluer la qualité des données. Un graphique exponentiel indique une amplification fiable.

Exportez les résultats vers un tableur. L’analyse des données telle que décrite dans le protocole textuel est essentielle pour savoir si le test nécessite une optimisation supplémentaire dans un souci de reproductibilité. L’ADNc pour ce test est préparé à partir d’éosinophiles traités avec des cytokines pour favoriser la transcription.

Préparer des dilutions en série de deux aliquotes d’ADNc d’échantillon avec une plage de dilution de un à un sur 1,024. Mettre en place le test dans une plaque de 96 puits avec des réactions de 25 microlitres, comme démontré pour l’analyse de la spécificité de l’amorce, mais avec plusieurs concentrations d’amorces pour le pan STAT3 et un gène de ménage GUSB. Un modèle est présenté dans ce tableau.

Insérez la plaque PCR scellée dans la machine qPCR. Configurez l’expérience à l’aide du logiciel, en ajoutant un nouveau détecteur pour GUSB et en utilisant le programme de cyclage PCR approprié. Ensuite, les résultats sont utilisés pour calculer la valeur de cycle seuil pour chaque échantillon, comme décrit dans le protocole de texte.

Pour commencer cette procédure, comparez les valeurs de cycle seuil obtenues en qPCR relative pour le gène d’entretien GUSB et diluez l’ADNc en conséquence avec de l’eau ultrapure pour vous assurer que toutes les concentrations sont dans un ordre de grandeur précis. Mettre en place les tests qPCR absolus des échantillons dans des plaques de 96 puits. Suivez ce modèle pour S alpha et S bêta et ce modèle pour delta S alpha et delta S bêta.

Effectuez les tests comme indiqué précédemment et répétez les tests au moins une fois. Ensuite, installez une plaque de qPCR absolue à 96 puits avec des réactions de 25 microlitres à l’aide d’amorces pan STAT3 à 400 micromolaires et d’un mélange des quatre plasmides ou d’un seul plasmide suivant ce modèle. Scellez la plaque qPCR à l’aide d’un couvercle adhésif et centrifugez pendant cinq minutes à 1 200 g à 12 degrés Celsius.

Insérez la plaque PCR scellée dans la machine qPCR et configurez l’expérience comme indiqué précédemment, en ajoutant un nouveau détecteur pour le pan STAT3. Configurez les mêmes paramètres de cyclage que pour la qPCR relative. Après avoir répété le test, analysez au moins une fois les résultats comme décrit dans le protocole de texte.

Des données qPCR de bonne qualité généreront un graphique d’amplication sigmoïdale signifiant une augmentation exponentielle des transcrits au cours du cycle. Ces données ont été obtenues à partir de la qPCR de deux dilutions en série de plasmide contenant STAT3 S alpha. Chaque paire de lignes colorées représente les niveaux de fluorescence d’échantillons dilués en double au cours de 40 cycles.

Les courbes standard générées pour les plasmides de l’étalonneur de matrice indiqueront l’efficacité de l’amplification. Dans cette courbe pour STAT3 S alpha, l’efficacité d’amplification était de 83,9 %Afin d’évaluer la congruence des niveaux de STAT3, les valeurs absolues de chacune des quatre variantes d’épissage ont été mesurées, ainsi que le niveau de STAT3 total. Idéalement, la régression linéaire et la pente doivent être proches de un.

Les données absolues de qPCR sont présentées sous forme de diagrammes circulaires pour montrer leurs proportions des quatre variantes d’épissage STAT3 au cours du traitement par cytokines. La fusion des données absolues et relatives de qPCR a démontré que les niveaux de tous les variants d’épissage STAT3 augmentaient après la stimulation avec les cytokines IL3 et TNF alpha, avec des niveaux culminant à six heures. La mise en commun des données de tous les points temporels a révélé un biais faible mais significatif pour la coassociation des événements d’épissage bêta et delta S.

Une fois optimisés, les tests basés sur cette technique peuvent être effectués en quatre heures s’ils sont effectués correctement. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de travailler dans des conditions stériles pour éviter la contamination. Les décisions d’épissage qui incluent ou excluent un codon représentent 20 % de la variation d’épissage dans le cadre.

Notre protocole devrait être facilement adaptable à la quantification de ces variations. Après son développement, cette technique a permis à Mao Zhang de travailler avec mon groupe dans le groupe de Li-Shan Rue pour contrôler des expériences de réexpression knockdown de variants STAT3 dans des cellules de lymphome ABC. Ces expériences ont démontré qu’un mélange de variants S et delta S est nécessaire à la survie cellulaire en culture.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une qPCR absolue et relative et des conditions appropriées pour distinguer et quantifier les différences subtiles d’épissage.