Introduction
Røntgenkrystallografi har vært, og vil fortsette å være, en ekstremt kraftig teknikk for å forstå innholdet av ligand-reseptor interaksjoner. Ved å visualisere disse vekselvirkninger i atom detalj, er det ikke bare mulig å avsløre de molekylære mekanismene som regulerer mange biologiske prosesser, men det er også mulig direkte å endre kontakt grensesnitt for terapeutisk effekt. Sammen med teknikker som overflate-plasmonresonans og isotermisk titrering kalorimetri (for å nevne et par), kan slike modifikasjoner så analyseres biophysically for å vurdere den direkte innvirkning på bindingsaffinitet, interaksjon kinetikk, og termodynamikk. Til slutt, ved å utføre funksjonelle forsøk på relevante celletyper, et detaljert bilde av molekyl og funksjonelle virkningen av endringer i reseptor-ligand interaksjoner kan merkes, og gir meget spesifikk mekanistisk informasjon. Samlet er disse typene av metoder gi en atom oppløsning bildet slik at det avskrekke melse av hvordan biologiske systemer fungerer, med tilhørende konsekvenser for diagnostiske og terapeutiske fremskritt.
Vårt laboratorium benytter rutinemessig disse teknikkene for å studere reseptorer som medierer human T-celle-immunitet mot patogener og kreft, i autoimmunitet, og under transplantasjon. Her fokuserer vi på det menneskelige CD8 + T-celle respons til kreft, formidlet av en interaksjon mellom T-celle reseptor (TCR) og human leukocytt antigen (HLA) -restricted tumor-avledede peptider (phla). Dette er viktig fordi, selv om CD8 + T-celler er i stand til å målrette kreftceller, har vi og andre tidligere vist at anti-cancer TCR suboptimalt binder seg til deres kognate phla 1, 2. Således har mange laboratorier forsøkt å endre enten den TCR 3, 4, 5 eller peptidet ligand 6,class = "xref"> 7, 8 for å øke immunogenisiteten, og for å bedre mål-kreftceller. Men disse metodene er ikke alltid effektive og kan ha alvorlige bivirkninger, inkludert off-target toksisitet 4, 9, 10. Videre forskning utforske de molekylære mekanismene som styrer T-celle anerkjennelse av kreft antigener vil være avgjørende for å overvinne disse manglene.
I denne studien har vi fokusert på svarene mot autologe melanomceller av CD8 + T-celler som er spesifikke for et fragment av differensiering melanocyte antigen glykoprotein 100 (gp100), gp100 280-288, presentert av HLA-A * 0201 (den vanligste -expressed menneskelig phla klasse I). Dette antigenet har vært mye studert mål for immunterapi melanom og har blitt utviklet som en såkalt "heteroclitic" peptid hvor en valin erstatter alaninanker posisjon 9 til å forbedre phla stabilitet 11. Denne tilnærmingen ble anvendt for å forsterke induksjon av melanom-reaktive CTL in vitro og har blitt brukt i kliniske studier 12. Imidlertid kan modifikasjoner av peptid-rester har uforutsigbare effekter på T-celle-spesifisitet, demonstreres ved den dårlige effektiviteten av de fleste heterolitic peptider i klinikken 6, 13. Faktisk, en annen heteroclitic form av gp100 280-288, hvor peptid rest Glu3 ble byttet ut med Ala, opphevet anerkjennelse av en polyklonal populasjon av gp100 280-288-spesifikke T-celler 14, 15. Vi har tidligere vist at selv små forandringer i peptid anker rester kan vesentlig endre T-celle-gjenkjennelse på uforutsigbare måter 6, 16. Dermed studien fokusert på building et mer detaljert bilde av hvordan CD8 + T-celler gjenkjenner GP100 og hvordan modifikasjoner av samspillet mellom TCR og phla kan påvirke denne funksjonen.
Her, genererte vi meget rene, løselige former av to TCR spesifikke for gp100 280-288 presentert av HLA-A * 0201 (A2-YLE), så vel som de naturlige og endrede former av phla. Disse reagenser ble anvendt for å danne proteinkrystaller for å løse det ternære atomstrukturen til en human TCR i kompleks med heteroclitic form av A2-YLE, samt to av de mutante pHLAs i unligated form. Vi brukte deretter et peptid skanning tilnærming for å demonstrere virkningen av peptid erstatninger på TCR ved å utføre in-depth biofysiske eksperimenter. Til slutt, genererte vi en genetisk modifisert CD8 + T-cellelinje, omprogrammeres for å uttrykke en av A2-YLE-spesifikke TCR, for å utføre funksjonelle eksperimenter for å teste den biologiske virkningen av de forskjellige peptid modifikasjoner. Disse data viser at selv modisifikasjoner mot peptid rester som er utenfor TCR bindende motiv kan ha uforutsigbare ringvirkninger på tilstøtende peptid rester som oppheve TCR bindende og T-celle anerkjennelse. Våre funn representerer den første eksempel på de strukturelle mekanismer som ligger under T-celle-gjenkjennelse av denne viktig terapeutisk mål for melanom.
Protocol
1. Protein Expression
- Gjøre genkonstruksjoner for generering av løselige TCR og pHLAs, som beskrevet i detalj tidligere 17, 18. Utforme hver konstruere med en 5 'BamH1 og en 3' EcoR1 restriksjonssete for innføring i pGMT7 vektoren.
- Å transformere E. coli Rosetta (DE3) pLysS med en pGMT7-avledet plasmid vektor som inneholder sekvensen som koder for proteinet av interesse ved å inkubere 1 mL av 50-200 ng / ul plasmid med 5 pl av E. coli i 5 min ved 4 ° C , 2 min ved 42 ° C og 5 minutter ved 4 ° C, og plate ut over natten ved 37 ° C på en LB-agarplate supplert med 50 mg / l karbenicillin.
- Plukke individuelle kolonier og vokser ved 37 ° C og 220 rpm i 30 ml TYP medium (16 g / l trypton, 16 g / l gjærekstrakt og 5 g / l HK 2 O 4) supplert med 100 pM karbenicillin inntil suspensjonen når en optisk density (OD 600) på mellom 0,4 og 0,6.
- Indusere proteinproduksjon i en 5 ml alikvot ved å innføre 0,5 mM isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) i 3 timer. Hold 20 pl av suspensjonen med og uten induksjon av natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) analyse og flekker på gelen.
- Legg startkulturer til 1 liter TYP supplert med 100 pM carbenicillin og dyrke celler som beskrevet ovenfor i trinn 1.3 til suspensjonen har nådd en OD 600 mellom 0,4 og 0,6.
- Indusere proteinekspresjon i 3 timer med 0,5 mM IPTG. Sentrifuger cellene i 20 min ved 3000 x g og hell av supernatanten forsiktig.
- Oppløs pelleten i 40 ml lyseringsbuffer (10 mM Tris, pH 8,1, 10 mM magnesiumklorid, MgCl2, 150 mM NaCl, og 10% glycerol), sonicate på is i 30 min ved 60% effekt ved anvendelse av en 2 s intervall , og inkuber ved værelsetemperatur (RT) i 30 minutter med 0,1 g / l DNase.
- Behandle suspensjon som inneholder proteinene i form av inklusjonslegemer (IB) med 100 ml av vaskebuffer (0,5% Triton X-100, 50 mM Tris, pH 8,1; 100 mM NaCl; og 10 mM EDTA).
- Sentrifuger prøven i 20 minutter ved 4 ° C og 8000 x g og hell av supernatanten forsiktig. Re-suspendere pelleten i 100 ml av re-suspensjon buffer (50 mM Tris, pH 8,1; 100 mM NaCl; og 10 mM EDTA, pH 8,1), sentrifuger som før ved 8000 xg, og hell av supernatanten forsiktig.
- Til slutt oppløse pelleten i 10 ml guanidin buffer (6 M guanidin, 50 mM Tris, pH 8,1, 2 mM EDTA, pH 8,1, og 100 mM NaCl) og måle proteinkonsentrasjon ved 280 nm ved anvendelse av et spektrofotometer.
2. phla og TCR Refolding
- For phla refolder, bland 30 mg av HLA-A2 (eller HLA-A2 med en biotin-tag) IBS, 30 mg β2m IBS, og 4 mg av peptidet i 30 min ved 37 ° C i et vannbad i et sluttvolum av 6 ml av guanidin-buffer supplert med 10 mM ditiotreitol(DTT).
- Initiere protein folding på nytt ved fortynning av den foregående blandingen i 1 liter av en på forhånd avkjølt HLA Foldings-buffer (50 mM Tris, pH 8,1; 400 mM L-arginin, 2 mM EDTA, pH 8,1; 6 mM cysteamin, og 4 mM cystamin).
- La HLA refolde omrøring ved 4 ° C i 3 timer og deretter overføre den til en 12,4 kDa MWCO (molekylvekt cut-off) dialyserør og dialyser to ganger i 24 timer mot 20 l 10 mM Tris, pH 8,1.
- For TCR refolder, bland 30 mg TCR α kjede IBS og 30 mg TCR β kjede IBer i 30 minutter ved 37 ° C i et vannbad i 6 ml guanidin-buffer supplert med 10 mM DTT.
- Initiere protein folding på nytt ved fortynning av denaturert TCR blandingen i 1 liter av en på forhånd avkjølt TCR Foldings-buffer (50 mM Tris, pH 8,1, 2,5 M urea, 2 mM EDTA, pH 8,1; 6 mM cysteamin, og 4 mM cystamin) for tre h.
- Overfør Foldings inn i en 12,4 kDa MWCO-dialyseslange og dialyser to ganger i 24 timer mot 20 l 10 mM Tris, pH 8,1.
- Filter både phla eller TCR refåringer ved bruk av en 0,45-m membranfilter for rensetrinnene.
3. Rensing av Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC)
- Laster den filtrerte Foldings preparat (enten phla eller TCR) på en 7,9 ml, 50 um anionbytterharpiks-kolonne pre-ekvilibrert med 20 ml 10 mM Tris, pH 8,1 på en fleksibel og intuitiv kromatografi system.
- Eluere proteinet ved 5 ml / min med en saltgradient (0-500 mM NaCl i 10 mM Tris, pH 8,1, over 8 kolonnevolumer) og samles 1-ml fraksjoner.
- Analyser av fraksjonene som korresponderer til proteinet av interesse ved hjelp av SDS-PAGE, basseng fraksjonene inneholdende proteinet av interesse sammen, og konsentrere dem ned til 500 ul med 10-kDa MWCO 20 eller 10 kDa MWCO 4 ved sentrifugering i 20 minutter ved 4000 xg , forkaster gjennomstrømning.
- Laste de konsentrerte proteinpreparater i en 2 ml injeksjonssløyfe på en 24 ml størrelseseksklusjons-kromatografi-kolonne pre-ekvilibrert med appeni relevante elueringsbuffer: fosfat-bufret saltvann (PBS), HBS (10 mM HEPES, pH 7,4; 150 mM NaCl; 3,4 mM EDTA, og 0.005% overflateaktivt middel), eller krystall-buffer (10 mM Tris, pH 8,1, og 10 mM NaCl ).
- Eluere proteinene ved en strømningshastighet på 0,5 ml / min i løpet av ett kolonnevolum; samle 1 ml fraksjoner som inneholder proteinet av interesse bekreftet ved SDS-PAGE.
MERK: Disse metodene ble brukt til å generere løselige PMEL17 TCR og GP100 TCR, samt alle de pHLAs brukt i denne studien: HLA-A * 0201 med YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- 7A), eller YLEPGPVAA (A2-YLE-8A).
4. overflate-plasmonresonans (SPR) Analyse
- Utføre likevekt bindende analyse eller termodynamisk analyse ved anvendelse av en molekylær interaksjon analysesystem utstyrt med en CM5 sensorbrikke 19.
- Aktiver CM5 chip ved fgende en 1: 1 blanding av 100 mM N-hydroksysuccinimid (NHS) og 400 mM 1-etyl-3- (3-dimetylpropyl) -carboiimide (EDC) i 10 minutter ved en strømningshastighet på 10 uL / min og ved 25 ° C.
- Last omtrent 5000 responsheter (RU) av streptavidin (110 ul av 200 ug / ml i 10 mM acetat, pH 4,5) ved kovalent å knytte til chip overflate i alle fire strømningsceller og bruke 100 ul av 1 M etanolamin-hydroklorid for å deaktivere eventuelle gjenværende reaktive grupper.
- Par ca 500-600 RU av phla, på ~ 1 mikrometer i kommersielle buffer (gitt av produsenten), til CM5 sensor chip ved lav strømningshastighet på 10 mL / min for å sikre jevn fordeling på chip overflaten.
- Mett chip overflaten med en mM biotin i kommersielle buffer (gitt av produsenten) for 60 s.
- Injiser ti serielle fortynninger av oppløselig TCR enn de aktuelle strømnings-celler ved en høy strømningshastighet på 30 mL / min ved 25 ° C.
- Beregn likevektsbindende konstant(K D (E)) verdier ved hjelp av en ikke-lineær kurve (y = (P1x) / (P2 + x)) 20.
MERK: y = respons enheter, x = analytiker konsentrasjon, P1 = r max, P2 = K D. - Utfør kinetikk analyse forutsatt en 1: 1 Langmuir bindende og passe dataene ved hjelp av en global-fit algoritme i programvarepakken to.
- Utfør termodynamikk eksperimenter ved å gjenta denne metoden ved følgende temperaturer: 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C, og 30 ° C 19.
- Bruk K D-verdiene bestemmes av SPR ved forskjellige temperaturer for å beregne ΔG ° ved hjelp av standard termodynamisk ligning (ΔG ° = -RTlnK D) 19.
MERK: R = gasskonstanten, T = temperatur i K, ln = naturlig log. - Beregn de termodynamiske parametere i henhold til Gibbs-Helmholtz-ligningen (ΔG ° = AH - TΔS °) 19. Plott bindende frie energier, ΔG ° (ΔG ° = -RTlnK D), mot temperatur (K) ved hjelp av en ikke-lineær regresjon for å passe de tre-parameter ligning (y = AH + ΔCp * (x-298) -x * ΔS- x * ΔCp * ln (x / 298)) 19.
MERK: y = temperatur i K, x = ΔG °.
5. Isoterm Titrering kalorimetri (ITC)
- Utfør ITC eksperimenter med en isoterm titrering kalorimeteret. Injiser 30 uM phla inn i kalorimeteret cellen og belastning 210 uM oppløselig TCR inn i sprøyten. Bruke følgende bufferbetingelser: 20 mM HEPES (pH 7,4) inneholdende 150 mM NaCl.
- Utføre 20 TCR injeksjoner, hver av et 2 mL volum. Beregn AH og K D ved hjelp av analyseprogrammer.
6. Krystallisering, Diffraksjon datainnsamling, og Model Refinement
- Utfør krystallisering forsøk med en krystallisering robot.
- Grow krystaller av vapeller diffusjon ved 18 ° C med en sittende slipp i en 96-brønns plate med et reservoar inneholdende 60 ul av krystallisering buffer (moderluten) 21.
- Konsentrer det oppløselige phla til omtrent 10 mg / ml (0,2 mM) i krystall-buffer ved spinning ved 3000 x g i en 10-kDa molekylvekt cut-off sentrifugal konsentratoren.
- For ko-komplekse strukturer, bland TCR og phla ved et 1: 1 molart forhold for å oppnå en proteinoppløsning ved ca. 10 mg / ml (0,1 mM).
- Tilsett 200 nL av phla alene, eller 1: 1 molarforhold blanding av TCR og phla, til 200 nL av hvert reservoar oppløsning fra krystalliseringen skjermen ved hjelp av en krystallisering robot og skåring til krystallene under et mikroskop etter 24 timer, 48 timer, 72 t, og deretter en gang i uken.
- Harvests enkrystaller av manuelt montere dem i kryo-buer under et mikroskop og cryo-kjøle dem ved å senke og lagre dem i flytende nitrogen (100 K).
MERK: Legge krystaller tar litt pracTice, og bestemmer hvilke krystaller er god nok for datainnsamling kommer med erfaring. Som en tommelfingerregel, jo større og mer regelmessig krystall, jo bedre. - Samle inn data i en strøm av nitrogengass ved 100 K.
MERK: Denne informasjonen ble kjøpt på Diamond Light Source (DLS) nasjonal synkrotron vitenskap anlegget i Storbritannia. - Analysere dataene ved å estimere refleksjons intensiteter med xia2 bruke både MOSFLM 22 og XDS pakker 23, og deretter skalere data med SCALA eller formålsløs 24 og CCP4 pakke 25.
- Løs strukturer med molekylær erstatning ved hjelp PHASER 26.
- Juster modell med Kvakk 27 og avgrense modell med REFMAC5 28.
- Forbered grafiske fremstillinger med PYMOL 29.
- Beregn kontaktene ved å bruke "kontakt"program i CCP4 pakken. Bruk en 4 en cut-off for van der Waals kontakter og en 3.4 en cut-off for hydrogenbindinger og salt broer.
- Beregn overflate komplementaritet ved hjelp av "SC" -programmet i CCP4 pakken.
- Beregn krysningsvinkel av TCR-phla kompleks, som beskrevet 30.
MERK: For denne studien ble refleksjonsdata og endelige modellen koordinater deponert hos PDB database (PMEL17 TCR-A2-YLE-9V PDB: 5EU6, A2-YLE PDB: 5EU3, A2-YLE-3A PDB: 5EU4, og A2 -YLE-5A PDB: 5EU5).
Representative Results
Ved hjelp av metodene beskrevet ovenfor, genererte vi løselig TCR (tabell 1) og phla molekyler til å gjennomføre dyptpløyende molekylære analyser av gp100 280-288 anerkjennelse av CD8 + T-celler. En modifisert E. coli-ekspresjonssystem ble anvendt for å danne uoppløselig IBer for hver enkelt kjede av både TCR (a og p kjeder) og pHLAs (α kjede og β2m). Denne fremgangsmåte har fordelen av å være relativt billige og enkle å sette opp og genererer store utbytter av proteiner (100-500 mg / l kultur). Også, de uoppløselige proteiner er meget stabil når den lagres ved -80 ° C. Vi så brukt en veletablert folding på nytt og rensing teknikk for å generere funksjonelle homogene, oppløselige proteiner. Denne fremgangsmåten er nyttig for å generere proteiner for biofysiske, strukturelle, og cellulære forsøk, så vel som reagenser som kan brukes for diagnose eller terapi.
(tabell 2). Denne analyse demonstrerte som restene i peptidet var viktigst for TCR-binding. Høy oppløsning analyser av bindingsaffinitetene ved hjelp av denne teknikken er svært nyttig for å bestemme biologiske mekanismer som styrer protein-protein interaksjoner, såvel som for å analysere bindingsaffiniteten av terapeutiske molekyler.
Vi deretter krystallisert en melanom-spesifikt oppløselig TCR (PMEL17 TCR) i kompleks med en modifisert tumor-avledet phla (A2-YLE-9V) for å undersøke bindingen modus på atom-oppløsning (figur 1 og 2 og tabell 3). Disse forsøk gir direkte visualisering av bindingsflaten mellom to molekyler, providing nøkkelinformasjon om de underliggende prinsippene for interaksjon. Vi utførte ytterligere en termodynamisk analyse av samspillet med både SPR og ITC, avslører den energiske bidrag som gjorde det mulig å binde (figur 3). Disse analysene ble ytterligere understøttet av et høyoppløselig beskrivelse av kontakten fotavtrykket mellom de to proteiner (figur 4 og tabell 4).
Vi løste strukturer unligated phla molekyler, presentere muterte former av peptid, avsløre at en molekylær bryter kan forklare hvorfor visse mutasjoner avskaffet TCR binding (figur 5).
Samlet er disse teknikkene gitt nye opplysninger som viser mekanismen som forklarer hvordan T-celler gjenkjenner et melanom-avledet antigen som er et viktig mål for anti-kreftbehandling. Forstand, disse teknikkenekan brukes til å undersøke praktisk talt en hvilken som helst reseptor-ligand-interaksjon, avdekke nye biologiske mekanismer som kan være målrettet for nye terapeutiske fremskritt.
Figur 1: Tetthet Plot analyse. Den venstre kolonnen viser utelate kart der modellen ble raffinert i fravær av peptid. Forskjellen tetthet er profilert på 3,0 sigma, er positive konturer vises i grønt, og negative konturer er røde. Den høyre kolonnen viser den observerte kart på 1,0 sigma (vist som en grå maske rundt pinne representasjoner av proteinkjedene) etter påfølgende avgrensning ved hjelp av automatiske non-krystallografiske symmetri begrensninger anvendes av REFMAC5. (A) Modellen for PMEL17 TCR-A2-YLE-9V med TCR CDR3 sløyfene farget blå (α kjede) og orange (β kjede) og peptidet i grønt. (B) Modellen for A2-YLE medpeptid farget mørk grønn. (C) Modellen for A2-YLE-3A med peptidet farget oransje (for A2-YLE-3A, det var 2 molekyler i asymmetriske enhet, men disse var nesten identiske i form av utelate og tetthets kart, så bare kopiere en er vist her). (D) Modellen for A2-YLE-5A med peptidet farget rosa. Gjengitt med tillatelse fra referanse 31. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Oversikt over PMEL17 TCR i Complex med A2-YLE-9V. (A) Cartoon representasjon av PMEL17 TCR-A2-YLE-9V kompleks. TCR er farget svart; TCR CDR sløyfer vises (rød, CDR1α, mørk grønn, CDR2α, blå, CDR3α, gul, CDR1β, aqua, CDR2 ^6 ;; orange, CDR3β); og HLA-A * 0201 er vist i grått. Den YLE-9V peptid er representert av grønne pinner. (B) Overflate og stokk representasjoner av rester av PMEL17 TCR CDR sløyfer (fargekodet som i A) at kontakt med A2-YLE overflate (A2, grå, YLE-9V, grønne pinner). Den svarte diagonal linje angir krysningsvinkel av TCR i forhold til lengdeaksen av YLEPGPVTV peptid (46,15 ° C). (C) Kontakt fotavtrykk av PMEL17 TCR på A2-YLE-9V overflate (A2, grå); lilla og grønn (overflate og pinner) viser HLA-A * 0201 og YLE rester henholdsvis kontaktet av gp100 TCR. Cut-off på 3,4 Å for hydrogenbindinger og 4 A for van der Waals kontakter. Gjengitt med tillatelse fra Reference 31. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Termodynamisk analyse av PMEL17 TCR-A2-YLE Interaksjon. (A) PMEL17 TCR likevekts-bindende responser til A2-YLE på 5, 12, 18, 25, og 37 ° C over, ni til ti TCR seriefortynninger. SPR rå og montert data (forutsatt 1: 1 Langmuir spesifikk binding) er vist i den innfelte av hver kurve, og ble anvendt for å beregne K i og k av verdier ved anvendelse av en global fit-algoritmen (BIAevaluation 3,1). Tabellen viser likevekts-bindende (K D (E)) og kinetiske bindende konstanter (K D (K) = K off / k on) ved hver temperatur. Den likevektsbindingskonstant (K D, um) ble verdiene beregnet ved hjelp av en ikke-lineær tilpasning (y = (P1x) / (P2 + x)). (B) Den termodynamiske parametre ble beregnet i henhold til Gibbs-Helmholtz-ligningen (ΔG ° = AH ° - TΔS °). Bindings gratis energi, ΔG ° (ΔG ° = -RTlnK D), ble plottet mot temperatur (K) ved hjelp av en ikke-lineær regresjon for å passe de tre-parameter ligning (y = AH ° + ΔCp ° * (x-298) -x * D s ° -x * ΔCp ° * ln (x / 298)). Entalpi (AH °) og entropi (TΔS °) ved 298 K (25 ° C) er vist i kcal / mol og ble beregnet ved ikke-lineær regresjon av temperatur (K) plottet mot den frie energi (ΔG °). (C) Isoterm kalori titrering (ITC) målinger for PMEL17 TCR-A2-YLE interaksjon. Entalpi (AH °) og entropi (TΔS °) ved 298 K (25 ° C) er vist i kcal / mol. Gjengitt med tillatelse fra referanse 31. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Konformasjonell Sammenligning av YLE, YLE-3A og A2-YLE-5A Peptider som presenteres av HLA-A * 0201. (A) YLE (mørk grønn pinner) og YLE-3A (oransje pinner) peptid innretting av superimposition av HLA-A * 0201 α1 helix (grå tegneserie). Boxed rester indikerer mutasjon av Glu3 inn en alanine. De innfellinger viser hvordan Glu3Ala substitusjon fører til et skifte i posisjon (svart pil) av nabo rest Pro4 i A2-YLE-3A struktur i forhold til A2-YLE struktur. (B) YLE (mørk grønn pinner) og YLE-5A (rosa pinner) peptid innretting av superimposition av HLA-A * 0201 α1 helix (grå tegneserie). Eske rester indikerer mutasjon av glycin 5 inn i et alanin. Gjengitt med tillatelse fra referanse
| TCR | CDR1α | CDR2α | CDR3α | CDR1β | CDR1β | CDR1β |
| PMEL17 | DSAIYN | IQSSQRE | CAVLSSGGSNYKLTFG | SGHTA | FQGTGA | CASSFIGGTDTQYFG |
| gp100 | TSINN | IRSNERE | CATDGDTPLVFG | LNHDA | SQIVND | CASSIGGPYEQYFG |
| KALYS | LLKGGEQ | CGTETNTGNQFYFG | SGHDY | FNNNVP | CASSLGRYNEQFFG | |
| 296 | DSASNY | IRSNVGE | CAASTSGGTSYGKLTFG | MNHEY | SMNVEV | CASSLGSSYEQYFG |
Tabell 1: Justering av TCR CDR3 Regions of PMEL17, gp100, MPD og 296 GP100 spesifikke TCR. Gjengitt med tillatelse fra referanse 31.
| peptidsekvensen | Peptide | PMEL17 TCR TRAV21 TRBV7-3 Affinity K D | gp100 TCR TRAV17 TRBV19 AffiNITY K D | ||||
| YLEPGPVTA | YLE | 7.6 ± 2 mikrometer | 26,5 ± 2,3 mikrometer | ||||
| YLEPGPVT V | YLE-9V | 6.3 ± 1.2 mikrometer | 21,9 ± 2,4 mikrometer | ||||
| En LEPGPVTA | YLE-1A | 15,9 ± 4,1 mikrometer | 60,6 ± 5,4 mikrometer | ||||
| YL En PGPVTA | YLE-3A | Ingen binding | Ingen binding | ||||
| YLE En GPVTA | YLE-4A | 19,7 ± 1,3 mikrometer | 144,1 ± 7,8 mikrometer | ||||
| YLEP En PVTA | YLE-5A | > 1 mm | > 1mM | ||||
| YLEPG En VTA | YLE-6A | 11.4 ± 2,7 mikrometer | 954.9 ± 97,8 mikrometer | YLEPGP A TA | YLE-7A | 31.1 ± 4 mikrometer | 102,0 ± 9,2 mikrometer |
| YLEPGPV A A | YLE-8A | 38,1 ± 7,4 mikrometer | 121.0 ± 7,5 mikrometer |
Tabell 2: Affinity Analysis (K D) PMEL17 TCR og gp100 TCR til gp100 280-288 peptid varianter. Gjengitt med tillatelse fra referanse 31.
| parametere | PMEL17 TCR-A2-YLE-9V | A2-YLE | A2-YLE-3A | A2-YLE-5A |
| PDB kode </ Strong> | 5EU6 | 5EU3 | 5EU4 | 5EU5 |
| datasett statistikk | ||||
| Space Group | P1 | P1 21 1 | P1 | P1 21 1 |
| Enhet celleparametre (a) | a = 45,52, b = 54,41, c = 112,12, a = 85,0 ° b = 81,6 °, g = 72,6 ° | a = 52,81, b = 80,37, c = 56,06, b = 112,8 ° | a = 56,08, b = 57,63, c = 79,93, a = 90,0 ° b = 89,8 °, g = 63,8 ° | a = 56,33, b = 79,64, c = 57,74, b = 116,2 ° |
| strålekilde | DIAMOND I03 | DIAMOND I03 | DIAMOND I02 | DIAMOND I02 |
| Bølgelengde (Å) | 0,9763 | 0,9999 | 0,9763 | 0,9763 |
| målerød oppløsning range (A) | 51,87 til 2,02 | 45,25 til 1,97 | 43,39 til 2,12 | 43,42 til 1,54 |
| Ytre Oppløsning Shell (Å) | 02.07 til 02.02 | 2,02 til 1,97 | 02.18 til 02.12 | 1,58 til 154 |
| refleksjon observert | 128 191 (8955) | 99 442 (7056) | 99 386 (7463) | 244 577 (17 745) |
| unike refleksjoner | 64 983 (4785) | 30 103 (2249) | 49 667 (3636) | 67 308 (4962) |
| Fullstendighet (%) | 97,7 (96,7) | 98,5 (99,3) | 97,4 (96,7) | 99,6 (99,9) |
| mangfold | 2,0 (1,9) | 3,3 (3,1) | 2,0 (2,1) | 3,6 (3,6) |
| I / Sigma (I) | 5,5 (1,9) | 7,2 (1,9) | 6,7 (2-0,3) | 13 (2,3) |
| Rpim (%) | 5.7 (39.8) | 8.8 (44.7) | 8.7 (41.6) | 4,5 (35,4) |
| R merge (%) | 7.8 (39.6) | 9.8 (50.2) | 8.7 (41.6) | 5,0 (53,2) |
| avgrensning statistikk | ||||
| Oppløsning (Å) | 2.02 | 1.97 | 2.12 | 1,54 |
| Ingen refleksjoner brukes | 61688 | 28557 | 47153 | 63875 |
| Ingen refleksjon i Rfree sett | 3294 | 1526 | 2514 | 3406 |
| R riks (ingen cut-off) (%) | 18.1 | 19,7 | 17.2 | 17,0 |
| R gratis | 22.2 | 25.5 | 21.1 | 20.1 |
| Root mean square avvik fra ideell geometri | ||||
| Bond lengder (A) | 0,018 (0,019) * | 0,019 (0,019) * | 0,021 (0,019) * | 0,018 (0,019) * |
| Bond vinkler (°) | 1,964 (1,939) * | 1,961 (1,926) * | 2,067 (1,927) * | 1,914 (1,936) * |
| Samlet koordinere feil (A) | 0,122 | 0,153 | 0,147 | 0,055 |
| Ramachandran Statistikk | ||||
| mest Favoured | 791 (96%) | 371 (98%) | 749 (99%) | 384 (98%) |
| Tillatt | 32 (4%) | 6 (2%) | 10 (1%) | 5 (1%) |
| uteliggere | 2 (0%) | 3 (1%) | 1 (0%) | 2 (0%) |
Tabell 3: Data Reduction og Refinement statistikk (molekyl erstatning). Gjengitt med tillatelse fra referanse 31. Verdier i parentes er for den høyeste oppløsningen skallet.
| HLA / peptid rest | TCR rest | Nei vdw (≤4Å) | Nei H-bindinger (≤3.4Å) |
| Gly62 | αGly98 | 3 | |
| αSer99 | 1 | ||
| Arg65 | αSer99 | 2 | |
| Arg65 O | αAsn100 Nδ2 | 2 | 1 |
| Arg65 NH1 | βAsp58 Oδ2 | 1 | |
| βSer59 | 8 | ||
| Lys66 | αGly98 | 1 | |
| αSer99 | 4 | ||
| αAsn100 | 4 | ||
| Ala69 | αAsn100 | 2 | |
| βAla56 | 2 | ||
| Gln72 Nε2 | βGln51 O | 3 | 1 |
| βGly54 | 7 | ||
| βAla55 | 1 | ||
| Thr73 | βGln51 | 1 | |
| Val76 | βGln51 | 3 | |
| βGly52 | 2 | ||
| Lys146 | βPhe97 | 3 | |
| βIle98 | 3 | ||
| Ala150 | βIle98 | 1 | |
| βAsp102 | 3 | ||
| Val152 | βIle98 | 1 | |
| Glu154 | αTyr32 | 1 | |
| Gln155 N | αTyr32 OH | 4 | 1 |
| Gln155 Oε1 | βThr101 N | 10 | 1 | αGly97 O | 1 | 1 |
| αGly98 | 1 | ||
| αSer96 | 1 | ||
| Glu3 | αTyr101 | 1 | |
| Pro4 | αSer96 | 1 | |
| αSer99 | 1 | ||
| αAsn100 | 4 | ||
| Pro4 O | αTyr101 N | 14 | 1 |
| Gly5 | αTyr101 | 3 | |
| βGly100 | 2 | ||
| Val7 | βIle98 | 7 | |
| βGly99 | 2 | ||
| βGly100 | 2 | ||
| Thr8 | βThr31 | 5 | |
| βGln51 | 1 | ||
| βPhe97 | 1 | ||
| Thr8 N | βIle98 O | 6 | 1 |
Tabell 4: PMEL17 TCR-A2-YLE-9V Kontakt tabellen. Gjengitt med tillatelse fra referanse 31.
Discussion
Protokollene er skissert her gir et rammeverk for den molekylære og celle disseksjon av T-celle responser i sammenheng med menneskelig sykdom. Selv om kreft var hovedfokus i denne studien har vi brukt svært lignende metoder for å undersøke T-celle responser på virus 32, 33, 34, 35, 36, 37 og under autoimmunitet 38, 39, 40. Videre har vi brukt disse teknikkene i videre forstand til å forstå de molekylære prinsipper som styrer T-celle antigen anerkjennelse 2, 19, 41, 42. Faktisk, den uforutsigbare natur modifikasjoner peptid rester, selv deutenfor av TCR kontakt rester, har konsekvenser T-celle anerkjennelse viktige implikasjoner for utforming av heteroclitic peptider. Disse funnene direkte har bidratt til utviklingen av nye T-celle-terapi, inkludert peptid-vaksiner 6, 43 og kunstige høy affinitet TCR 3, 4, 5, 20, 44, såvel som forbedret diagnostikk 45, 46, 47.
Kritiske trinnene i protokollen
Generering av en høyren, funksjonelt protein er viktig for alle metodene beskrevet i dette dokumentet.
Modifikasjoner og feilsøking
Vanskeligheter med å generere svært ren protein ofte knyttet til uttrykk for høyt-Ren, uoppløselig IBer fra E. coli-ekspresjonssystemet. Vanligvis endrer uttrykket protokollen (f.eks induserende på ulike optiske tettheter, ved hjelp av ulike E. coli-stammer, eller ved hjelp av ulike medier formasjoner) løser disse problemene.
Begrensninger av teknikken
Disse teknikker gjør bruk av oppløselige proteinmolekyler (TCR og phla) som normalt blir uttrykt på celleoverflaten. Derfor er det viktig å sikre at strukturelle / biofysiske funn er i overensstemmelse med cellulære tilnærminger for å bekrefte biologisk betydning.
Betydningen av teknikken med hensyn på eksisterende / alternative metoder
Gjennom bruk av røntgenkrystallografi og biofysikk bekreftet gjennom funksjonsanalyse, har vi og andre har vist at TCR spesifikke for kreft epitoper er generelt preget av lave bindingsaffiniteter 48. Denne lave TCR affinitet kan bidra til å forklare hvorfor T-celler are ikke naturlig effektiv på å fjerne kreft. Høy oppløsning atomstruktur av komplekser mellom anti-kreft TCR og beslektede tumorantigener begynner å avdekke den molekylære basis for denne svake affinitet. Videre disse studiene er nyttig for å bestemme hvilke mekanismer som ligger bak de terapeutiske intervensjoner utformet for å overvinne dette problemet, såing fremtidige forbedringer 16. I denne studien undersøkte vi den første strukturen i en naturlig forekommende αβTCR i kompleks med en gp100 HLA-A * 0201-begrenset melanom epitop. Strukturen, kombinert med en grundig biofysiske undersøkelse, viste den samlede binding modus av samspillet. Vi har også oppdaget en uventet molekyl bryter, som skjedde i en mutert form av peptidet, som avskaffet TCR binding (vurdert ved hjelp av overflate-plasmonresonans) og CD8 + T-cellegjenkjenning (funksjonell eksperimenter). Det var bare mulig å demonstrere denne nye mekanismen av HLA-antigen presentatiom bruk av høyoppløselige metoder beskrevet.
Fremtidige applikasjoner eller retninger etter å mestre denne teknikken
Samlet våre resultater demonstrere makt røntgenkrystallografi og biofysiske metoder kombinert med robuste funksjonsanalyser. Ved hjelp av disse metodene, er det mulig å dissekere ut presise molekylære mekanismene som regulerer T-celle-gjenkjenning av antigen. Faktisk er det også mulig å bruke denne tilnærmingen for å løse strukturen av unligated TCR, som viser hvordan konformasjonsendringer kan spille en rolle under antigen diskriminering 49, 50, 51. En bedre forståelse av den svært komplekse og dynamiske natur som underbygger TCR-phla interaksjoner har også åpenbare implikasjoner for terapi design. Å være i stand til direkte å "se" molekylene som blir målrettet terapeutisk, samt den virkning at modifikasjoner har på antigen recognition, vil helt klart forbedre utviklingen av disse medisinene fremover. I denne studien viser vi at selv endringer i et enkelt peptid rest som ikke er tungt engasjert av en TCR kan uforutsigbart overføre strukturelle endringer i andre rester i den HLA-bundet peptid, som i sin tur endrer dramatisk T-celle-gjenkjennelse. En mer fullstendig forståelse av de molekylære mekanismene som benyttes i løpet av T-celle-gjenkjenning av antigen vil være svært fordelaktig ved utforming av fremtidige terapier for et vidt spekter av humane sykdommer.
Acknowledgments
BM er støttet av en Cancer Research UK PhD student. AG er støttet av en Life Science Research Network Wales PhD student. VB er støttet av en Cancer Research Wales PhD student. DKC er et Wellcome Trust Forskning Karriereutvikling Fellow (WT095767). AKS er et Wellcome Trust etterforsker. GHM er finansiert av en felles Life Science Research Network Wales og Tenovus Cancer Care PhD Studentship. Vi takker de ansatte på Diamond Light Source for å skaffe utstyr og støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S.O.C. media | Invitrogen | ||
| Orbi-Safe New Orbit incubator | Sanyo | ||
| carbenicillin | Sigma | ||
| IPTG | Fisher | ||
| Quick Coomassie Stain SafeStain | Generon | ||
| Legend RT centrifuge | Sorvall | ||
| Tris | Fisher | ||
| magnesium chloride | Arcos | ||
| NaCl | Fisher | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | ||
| Sonopuls HD 2070 | Bandelin | ||
| DNAse | Fisher | ||
| Triton | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Fisher | ||
| guanidine | Fisher | ||
| NanoDrop ND1000 | Thermo | ||
| Peptides | Peptide Protein Research | ||
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | ||
| L-arginine | SAFC | ||
| cysteamine | Fisher | ||
| cystamine | Fisher | ||
| dialysis tubing | Sigma-Aldrich | ||
| urea | Sigma-Aldrich | ||
| Metricel 0.45 μm membrane filter | Pall | ||
| POROS 10/100 HQ | Applied biosystems | ||
| ÄKTA pure FPLC system | GE Healthcare Life Sciences | ||
| 10 kDa MWCO Vivaspin 20 | Sartorius | ||
| 10 kDa MWCO Vivaspin 4 | Sartorius | ||
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Phosphate Buffer Saline | Oxoid | ||
| BIAcore buffer HBS | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Biotinylation kit | Avidity | ||
| BIAcore T200 | GE Healthcare Life Sciences | ||
| CM5 chip coupling kit | GE Healthcare Life Sciences | ||
| streptavidin | Sigma-Aldrich | ||
| Microcal VP-ITC | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | ||
| Gryphon crystallisation robot | Art Robbins Instruments | ||
| Intelli-plate | Art Robbins Instruments | ||
| Crystallisation screens and reagents | Molecular Dimensions | ||
| 75 cm2 flask | Greiner Bio-One | ||
| 0.22 μm filters | Miller-GP, Millipore | ||
| Ultra-Clear ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | ||
| Optima L-100 XP with SW28 rotor | Beckman Coulter | ||
| CD8 microbeads | Miltenyi Biotec | ||
| anti-CD3/CD28 Dynabeads | Invitrogen | ||
| anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec | ||
| CK medium, PHA | Alere Ltd | ||
| anti-TCRVβ mAb | BD | ||
| dasatinib | Axon | ||
| MIP-1β and TNFα ELISA | R&D Systems | ||
| 51Cr | PerkinElmer | ||
| 1450 Microbeta counter | PerkinElmer |
References
- Aleksic, M., Liddy, N., et al. Different affinity windows for virus and cancer-specific T-cell receptors: implications for therapeutic strategies. European journal of immunology. 42 (12), 3174-3179 (2012).
- Cole, D. K., Pumphrey, N. J., et al. Human TCR-binding affinity is governed by MHC class restriction. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 178 (9), 5727-5734 (2007).
- Cole, D. K., Sami, M., et al. Increased Peptide Contacts Govern High Affinity Binding of a Modified TCR Whilst Maintaining a Native pMHC Docking Mode. Frontiers in immunology. 4 (JUN), 168 (2013).
- Raman, M. C. C., Rizkallah, P. J., et al. Direct molecular mimicry enables off-target cardiovascular toxicity by an enhanced affinity TCR designed for cancer immunotherapy. Scientific reports. 6, 18851 (2016).
- Liddy, N., Bossi, G., et al. Monoclonal TCR-redirected tumor cell killing. Nature medicine. 18 (6), 980-987 (2012).
- Cole, D. K., Edwards, E. S. J., et al. Modification of MHC anchor residues generates heteroclitic peptides that alter TCR binding and T cell recognition. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 185 (4), 2600-2610 (2010).
- Parkhurst, M. R., Salgaller, M. L., et al. Improved induction of melanoma-reactive CTL with peptides from the melanoma antigen gp100 modified at HLA-A*0201-binding residues. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 157 (6), 2539-2548 (1996).
- Salgaller, M. L., Marincola, F. M., Cormier, J. N., Rosenberg, S. A. Immunization against epitopes in the human melanoma antigen gp100 following patient immunization with synthetic peptides. Cancer research. 56 (20), 4749-4757 (1996).
- Cameron, B. J., Gerry, A. B., et al. Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells. Science translational medicine. 5 (197), 197ra103 (2013).
- Linette, G. P., Stadtmauer, E. A., et al. Cardiovascular toxicity and titin cross-reactivity of affinity-enhanced T cells in myeloma and melanoma. Blood. 122 (6), 863-871 (2013).
- Miles, K. M., Miles, J. J., Madura, F., Sewell, A. K., Cole, D. K. Real time detection of peptide-MHC dissociation reveals that improvement of primary MHC-binding residues can have a minimal, or no, effect on stability. Molecular immunology. 48 (4), 728-732 (2011).
- Lesterhuis, W. J., Schreibelt, G., et al. Wild-type and modified gp100 peptide-pulsed dendritic cell vaccination of advanced melanoma patients can lead to long-term clinical responses independent of the peptide used. Cancer immunology, immunotherapy CII. 60 (2), 249-260 (2011).
- Speiser, D. E., Baumgaertner, P., et al. Unmodified self antigen triggers human CD8 T cells with stronger tumor reactivity than altered antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (10), 3849-3854 (2008).
- Schaft, N., Willemsen, R. A., et al. Peptide fine specificity of anti-glycoprotein 100 CTL is preserved following transfer of engineered TCR alpha beta genes into primary human T lymphocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 170 (4), 2186-2194 (2003).
- Schaft, N., Coccoris, M., et al. An Altered gp100 Peptide Ligand with Decreased Binding by TCR and CD8α Dissects T Cell Cytotoxicity from Production of Cytokines and Activation of NFAT. Frontiers in immunology. 4 (SEP), 270 (2013).
- Madura, F., Rizkallah, P. J., et al. Structural basis for ineffective T-cell responses to MHC anchor residue-improved "heteroclitic" peptides. European journal of immunology. 45 (2), 584-591 (2015).
- Boulter, J. M., Glick, M., et al. Stable, soluble T-cell receptor molecules for crystallization and therapeutics. Protein engineering. 16 (9), 707-711 (2003).
- Garboczi, D. N., Utz, U., et al. Assembly, specific binding, and crystallization of a human TCR-alphabeta with an antigenic Tax peptide from human T lymphotropic virus type 1 and the class I MHC molecule HLA-A2. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 157 (12), 5403-5410 (1996).
- Madura, F., Rizkallah, P. J., et al. T-cell receptor specificity maintained by altered thermodynamics. Journal of Biological Chemistry. 288 (26), 18766-18775 (2013).
- Cole, D. K., Rizkallah, P. J., et al. Computational design and crystal structure of an enhanced affinity mutant human CD8 alphaalpha coreceptor. Proteins: Structure, Function and Genetics. 67 (1), 65-74 (2007).
- Benvenuti, M., Mangani, S. Crystallization of soluble proteins in vapor diffusion for x-ray crystallography. Nature protocols. 2 (7), 1633-1651 (2007).
- Leslie, A. G. W., Powell, H. R., et al. Automation of the collection and processing of X-ray diffraction data - a generic approach. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (11), 1924-1928 (2002).
- Kabsch, W.
- Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).
- Bailey, S. N. Collaborative Computational Project, N. 4. The CCP4 suite: Programs for protein crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (5), 760-763 (1994).
- McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J.
- Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 60 (12 I), 2126-2132 (2004).
- Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 53 (3), 240-255 (1997).
- DeLano, W. L. The PyMOL Molecular Graphics System. Schrödinger LLC. 1, Available from: http://www.pymol.org (2000).
- Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How Tcrs Bind Mhcs, Peptides, and Coreceptors. Annual Review of Immunology. 24 (1), 419-466 (2006).
- Bianchi, V., Bulek, A., et al. A Molecular Switch Abrogates Glycoprotein 100 (gp100) T-cell Receptor (TCR) Targeting of a Human Melanoma Antigen. Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8951-8959 (2016).
- Matthews, P. C., Koyanagi, M., et al. Differential clade-specific HLA-B*3501 association with HIV-1 disease outcome is linked to immunogenicity of a single Gag epitope. Journal of virology. 86 (23), 12643-12654 (2012).
- Gostick, E., Cole, D. K., et al. Functional and biophysical characterization of an HLA-A* 6801-restricted HIV-specific T cell receptor. European Journal of Immunology. 37 (2), 479-486 (2007).
- Miles, J. J., Bulek, A. M., et al. Genetic and structural basis for selection of a ubiquitous T cell receptor deployed in Epstein-Barr virus infection. PLoS Pathogens. 6 (11), e1001198 (2010).
- Holland, C. J., Rizkallah, P. J., et al. Minimal conformational plasticity enables TCR cross-reactivity to different MHC class II heterodimers. Scientific reports. 2, 629 (2012).
- Kløverpris, H. N., Cole, D. K., et al. A molecular switch in immunodominant HIV-1-specific CD8 T-cell epitopes shapes differential HLA-restricted escape. Retrovirology. 12, 20 (2015).
- Motozono, C., Kuse, N., et al. Molecular Basis of a Dominant T Cell Response to an HIV Reverse Transcriptase 8-mer Epitope Presented by the Protective Allele HLA-B*51:01. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 192 (7), 3428-3434 (2014).
- Motozono, C., Pearson, J. A., et al. Distortion of the major histocompatibility complex class i binding groove to accommodate an insulin-derived 10-mer peptide. Journal of Biological Chemistry. 290 (31), 18924-18933 (2015).
- Cole, D. K., Bulek, A. M., et al. Hotspot autoimmune T cell receptor binding underlies pathogen and insulin peptide cross-reactivity. The Journal of clinical investigation. , (2016).
- Bulek, A. M., Cole, D. K., et al. Structural basis for the killing of human beta cells by CD8(+) T cells in type 1 diabetes. Nature immunology. 13 (3), 283-289 (2012).
- Ekeruche-Makinde, J., Clement, M., et al. T-cell receptor-optimized peptide skewing of the T-cell repertoire can enhance antigen targeting. Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37269-37281 (2012).
- Cole, D. K., Miles, K. M., et al. T-cell Receptor (TCR)-peptide specificity overrides affinity-enhancing TCR-major histocompatibility complex interactions. Journal of Biological Chemistry. 289 (2), 628-638 (2014).
- Cole, D. K., Gallagher, K., et al. Modification of the carboxy-terminal flanking region of a universal influenza epitope alters CD4+ T-cell repertoire selection. Nature communications. 3, 665 (2012).
- Varela-Rohena, A., Molloy, P. E., et al. Control of HIV-1 immune escape by CD8 T cells expressing enhanced T-cell receptor. Nature medicine. 14 (12), 1390-1395 (2008).
- Holland, C. J., Dolton, G., et al. Enhanced Detection of Antigen-Specific CD4+ T Cells Using Altered Peptide Flanking Residue Peptide-MHC Class II Multimers. The Journal of Immunology. 195 (12), 5827-5836 (2015).
- Wooldridge, L., Clement, M., et al. MHC class I molecules with Superenhanced CD8 binding properties bypass the requirement for cognate TCR recognition and nonspecifically activate CTLs. Journal of immunology (Baltimore, Md: 1950). 184 (7), 3357-3366 (2010).
- Laugel, B., Den Berg, H. A. V. an, et al. Different T cell receptor affinity thresholds and CD8 coreceptor dependence govern cytotoxic T lymphocyte activation and tetramer binding properties. Journal of Biological Chemistry. 282 (33), 23799-23810 (2007).
- Bridgeman, J. S., Sewell, A. K., Miles, J. J., Price, D. A., Cole, D. K. Structural and biophysical determinants of αβ T-cell antigen recognition. Immunology. 135 (1), 9-18 (2012).
- Willcox, B. E., Gao, G. F., et al. TCR binding to peptide-MHC stabilizes a flexible recognition interface. Immunity. 10 (3), 357-365 (1999).
- Borbulevych, O. Y., Piepenbrink, K. H., Baker, B. M. Conformational melding permits a conserved binding geometry in TCR recognition of foreign and self molecular mimics. Journal of immunology (Baltimore, Md: 1950). 186 (5), 2950-2958 (2011).
- Armstrong, K. M., Piepenbrink, K. H., Baker, B. M. Conformational changes and flexibility in T-cell receptor recognition of peptide-MHC complexes. The Biochemical journal. 415 (2), 183-196 (2008).
