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Imagerie en direct pour l'étude microtubules Instabilité dynamique dans les cancers du sein taxane-résistantes

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DOI :

10.3791/55027

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20 février 2017

 ,  , 
1Department of Medical Genetics, Signal Transduction Research Group, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta

Dans cet article

Résumé

Dans cet article, nous rapportons un protocole décrivant une méthode in vivo pour mesurer l’instabilité dynamique des microtubules dans les cellules cancéreuses du sein résistantes au docétaxel (MCF-7TXT). Dans cette méthode, un système d’imagerie par microscopie à déconvolution est utilisé pour détecter l’expression de la GFP-tubuline dans les cellules cibles.

Résumé

Les taxanes tels que le docétaxel appartiennent à un groupe d’agents ciblant les microtubules (MTA) qui sont couramment utilisés pour traiter le cancer. Cependant, la résistance aux taxanes dans les cellules cancéreuses réduit considérablement l’efficacité de l’utilisation à long terme des médicaments. Les preuves accumulées suggèrent que les mécanismes sous-jacents à la résistance aux taxanes comprennent à la fois des mécanismes généraux, tels que le développement de la multirésistance aux médicaments due à la surexpression des protéines d’efflux de médicaments, et des mécanismes spécifiques aux taxanes, tels que ceux qui impliquent la dynamique des microtubules.

Parce que les taxanes ciblent les microtubules cellulaires, la mesure de l’instabilité dynamique des microtubules est une étape importante pour déterminer les mécanismes de résistance des taxanes et donne un aperçu de la façon de surmonter cette résistance. Dans l’expérience, une méthode in vivo a été utilisée pour mesurer l’instabilité dynamique des microtubules. La α-tubuline marquée à la GFP a été exprimée et incorporée dans les microtubules des cellules MCF-7, ce qui a permis d’enregistrer la dynamique des microtubules par laps de temps à l’aide d’une caméra sensible. Les résultats ont montré que, contrairement aux cellulesparentales MCF-7 CC non résistantes, la dynamique des microtubules des cellulesMCF-7 TXT résistantes au docétaxel est insensible au traitement au docétaxel, ce qui provoque la résistance à l’arrêt mitotique induit par le docétaxel et à l’apoptose. Cet article décrit cette méthode in vivo de mesure de l’instabilité dynamique des microtubules.

Introduction

La principale cause de mortalité par cancer du sein est par métastase 1, 2. Taxanes, tels que le docétaxel et le paclitaxel, sont actuellement utilisés comme schémas de première intention dans le traitement du cancer du sein métastatique , 2, 3, 4, 5, 6. Ils font partie d'un groupe d'agents de microtubules-ciblage (ATM) qui perturbent la dynamique des microtubules. Cependant, l' un des plus grands défis à l' utilisation de taxanes dans le traitement curatif est le développement de la résistance de taxane dans les cellules cancéreuses, ce qui conduit à la maladie récidive 7. Représente la résistance aux médicaments pour plus de 90% de tous les décès chez les patients atteints d' un cancer du sein métastatique 7.

Les microtubules sont formés par la polymérisation des hétérodimères a et ß-tubulineclass = "xref"> 8, 9. La régulation précise de la dynamique des microtubules est important pour de nombreuses fonctions cellulaires, y compris la polarisation cellulaire, de la progression du cycle cellulaire, le transport intracellulaire et la signalisation cellulaire. Dysrégulation des microtubules et leur dynamique va perturber la fonction cellulaire et provoquer la mort cellulaire 10, 11. Selon la façon dont ils provoquent cette dysrégulation, les médicaments MTA peuvent être classés comme des microtubules agents stabilisants ( par exemple, taxanes) ou agents microtubules destabalizing (ie, vinca - alcaloïdes ou colchicine site des agents de liaison) 20. En dépit de leurs effets opposés sur la masse des microtubules, à une dose suffisante, les deux classes peuvent tuer les cellules cancéreuses grâce à leurs effets sur la dynamique des microtubules 21.

Les taxanes fonctionnent principalement par la stabilisation de la broche microtubules 12, conduisant àdésalignement chromosomique. L'activation perpétuelle ultérieure du point de contrôle de l'assemblage de broche (SAC) arrête la cellule en mitose. Prolongée mitotique arrestation provoque alors l' apoptose 13, 14. Taxane interagit avec les microtubules par le biais du site de liaison du taxane sur la β-tubuline 8, 15, qui est présent seulement dans la tubuline 16 assemblé.

Plusieurs mécanismes de résistance aux taxanes ont été proposées 9, 17. Ces mécanismes comprennent à la fois la multirésistance générale due à la surexpression de protéines et spécifiques de taxane de la résistance 5, 9, 18, 19 médicaments efflux. Par exemple, les cellules cancéreuses résistantes à un taxane peut avoir modifié l'expression et la fonction de certaines β-tubulin isotypes 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. En utilisant une méthode in vivo pour mesurer microtubules instabilité dynamique, on montre que, par rapport aux parents cellules MCF-7 non résistantes, CC 17, la dynamique des microtubules des cellules MCF-7 TXT docétaxel résistantes sont insensibles à un traitement par le docétaxel.

Pour mieux comprendre la fonction de MTAs et le mécanisme exact de taxane-résistance dans les cellules cancéreuses, il est essentiel de mesurer la dynamique des microtubules. Nous rapportons ici une méthode in vivo de le faire. En utilisant l' imagerie en direct en combinaison avec l'expression de la tubuline GFP-marqués dans les cellules, nous pouvons mesurer la dynamique des microtubules de MCF-7 TXT et MCF-7 cellules CC avec et wiThoout traitement par le docétaxel. Les résultats peuvent nous aider à concevoir des médicaments plus efficaces qui peuvent surmonter la résistance de taxane.

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Protocole

1. Préparation des cellules pour l'imagerie en direct

  1. La culture cellulaire et l' ensemencement
    1. Utiliser des cellules MCF-7 du cancer du sein sélectionnées pour la résistance au docétaxel (MCF-7 TXT) et leur lignée cellulaire parentale non résistante (MCF-7 CC). Le processus de sélection et la caractérisation détaillée de ces lignées cellulaires sélectionnées ont été décrites précédemment 24.
    2. Cultiver les cellules dans des boîtes de culture de 10 cm à 37 ° C dans un milieu composé de 90% de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) et 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et supplémenté avec des acides aminés non essentiels. Maintenir le support dans une atmosphère de CO2 à 5%. Maintenir les cellules MCF-7 TXT à 5 nM docétaxel.
    3. cellules de semences sur des lamelles pour l'imagerie en direct. 24 mm stériliser des lamelles en verre de poly-L-lysine en les rinçant à 70% d'alcool, puis en les exposant aux rayons ultraviolets pendant une nuit. Placez les lamelles dans un 6 puits plaque de culture de 35 mm. PLace une lamelle dans chaque puits.
    4. Retirez le support de la boîte de culture de 10 cm et laver les cellules avec du PBS. Ajouter 0,5 ml de trypsine-EDTA à l'antenne pour détacher les cellules du plat. Ajouter 5 ml de milieu de culture à l'antenne pour neutraliser la trypsine après le détachement des cellules.
    5. Compter les cellules avec un hémocytomètre pour déterminer le nombre de cellules par unité de volume.
    6. Ajouter environ 10 5 cellules dans chaque puits en fonction du nombre de cellules par unité de volume. Après avoir secoué doucement, mettez la plaque arrière dans l'incubateur pour permettre aux cellules de se fixer aux lamelles.
  2. Expression de la GFP-tagged α-tubuline
    1. Pour doser la dynamique des microtubules, transduire les cellules avec GFP-étiqueté α-tubuline avec le contrôle de la transduction de la GFP commerciale (par exemple, BacMam) selon le protocole du fabricant.
    2. La culture des cellules dans le puits pendant 36 h dans un incubateur à 37 ° C de la culture cellulaire afin de permettre comadhérence complète et 60% de confluence.
    3. Calculer le volume approprié de GFP-étiqueté α-tubuline pour ajouter à chaque puits, en fonction de l'équation suivante:
      figure-protocol-1
      Le nombre de cellules est le nombre total estimé de cellules dans le puits au moment de l'étiquetage et de la PPC souhaitée est le nombre de particules par cellule.
      REMARQUE: Ensemencement des cellules MCF-7 devrait avoir doublé le nombre de cellules de 10 5 à 2 x 10 5 avec un CCP désiré de 20, le volume requis pour chaque lamelle couvre -objet est donc de 40 ul. Pour différentes cellules, le volume calculé sur la base de la formule ci-dessus peut ne pas être le meilleur. Le volume exact doit être ajustée en fonction du niveau d'expression réelle de la GFP-tubuline.
    4. Mélanger l'a-tubuline plusieurs fois GFP étiqueté par inversion pour assurer une solution homogène. Ne pas vortex.
      NOTE: Pour le contrôle, le Null (contrôle) réactif est dépourvu de toute génétique des mammifèreséléments et peuvent être utilisés pour aider à déterminer les effets de baculovirus médiée potentiels et la fluorescence de fond. Un contrôle de la transduction de la GFP non ciblée peut également être utilisé, ce qui allume la cellule entière.
    5. Remplacez le milieu de culture avec du milieu frais. Ajouter 2 ml de nouveau milieu, et 40 pi de GFP-étiqueté α-tubuline dans chaque puits.
    6. Secouer doucement la plaque pour permettre un mélange complet de la GFP étiquetées α-tubuline avec le milieu de culture. Retourner la plaque dans l'incubateur de culture et mettre à incuber pendant 24 h pour permettre l'expression de la GFP-tubuline.
  3. Traiter les cellules avec le docétaxel
    NOTE: Cette expérience est de tester l'effet du docétaxel sur microtubules instabilité dynamique. Ainsi, on traite les cellules avec la concentration souhaitée du docétaxel.
    1. Préparer un milieu composé de 90% de DMEM et 10% de FBS et supplémenté avec des acides aminés non essentiels. Utilisez DMEM sans rouge de phénol, car le rouge de phénol peut interférer avec le fluorescence de GFP-tubuline. Ajouter la concentration souhaitée de docétaxel (allant de 10 nM à 10 uM). La solution mère de docétaxel est de 10 mM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO).
    2. Préchauffer le milieu contenant du docétaxel à 37 ° C dans l'incubateur de culture tissulaire.
    3. Remplacer le milieu de culture normal avec le milieu contenant docétaxel et laisser incuber pendant 30 minutes dans l'incubateur de culture tissulaire. Il devrait y avoir au moins 3 lamelles par puits pour chaque concentration de docetaxel.

2. Imagerie Live Examiner microtubules Instabilité dynamique

  1. Mise en place du système
    1. Réaliser des expériences dans une chambre maintenue à 37 ° C et 5% de CO 2. Acquérir des images de fluorescence par intervalle de temps avec un système microscopique équipé d'un 60X, 1,42 huile NA lentille d'objectif sur un microscope à fluorescence inversé et avec une caméra CCD.
    2. Mettre en place les cellules pour l'imagerie en direct. à la fois le porte-échantillon pré-chaud etle milieu à 37 ° C. Choisissez une lamelle à examiner. Monter la lamelle d'intérêt sur un porte-échantillon et incuber avec 1 ml du milieu contenant du docétaxel préparé à l'étape 1.3.1.
  2. Imagerie en temps réel d'instabilité dynamique des microtubules
    1. Identifier les cellules qui seront utilisées pour l'imagerie. Ils doivent être à plat, ont une intensité de fluorescence élevée exprimé GFP-tubuline, et ont des structures de microtubules claires.
    2. Choisissez une cellule dans le groupe des cellules identifiées à partir de l'étape 2.2.1 d'examiner d'abord. Focus sur la zone périphérique de la cellule identifiée. Mettre en place le programme pour le temps d'exposition et la fréquence d'acquisition d'image. Comme le temps d'exposition est généralement de 0,5 s, les images seront acquises tous les deux s.
    3. Permettre à un 20 minutes supplémentaires pour les étapes de 1,33 à 2.2.3. Ainsi, exactement 50 minutes après l'addition du docetaxel, tel que décrit à l'étape 1.3.3, commencer l'imagerie (ce qui est de la normalisation).
    4. Notez le microtubules dynamics pendant 2 min, en prenant toutes les 2 s une photo. Au total, l'acquisition de 60 images pour la cellule identifiée.
    5. Déplacer vers la cellule suivante identifiée et répétez les étapes 2.2.2 à 2.2.4. Répétez la procédure jusqu'à 5 cellules ont été imagées. Il est impératif de le faire avant le temps atteint 70 min après l'addition du docetaxel, tel que décrit à l'étape 1.3.3.
    6. Pour chaque condition de traitement, répétez les étapes 2.2.1 à 2.2.5 pour 3 lamelles différentes. Au total, l'image 15 cellules, ce qui est assez de données pour mesurer l'instabilité dynamique des microtubules.

3. Traitement de l'image et de l'analyse des données

  1. Déconvolution d'images
    1. Déconvoluer les images acquises pour obtenir une haute qualité. Ouvrir le programme de déconvolution équipé du système de microscope.
    2. Cliquez sur "Process" et sélectionnez "Deconvolve." Faites glisser le fichier d'image à la fenêtre "d'entrée" et cliquez sur "Do." Le fichier image sera déconvoluée, etfichier déconvoluée sera enregistrée comme un nouveau fichier automatiquement.
  2. Génération de vidéos
    1. Cliquez sur le fichier d'image déconvoluée à ouvrir avec le logiciel équipé.
    2. Cliquez sur "Fichier" et sélectionner "Enregistrer sous film." Sélectionnez le format "film" comme "AV" et le "style d'animation" comme "Forward". Réglez la "qualité de compression" à "100%" et le "Frame rate" à "5 / seconde."
    3. Cochez la case "Animer à travers le temps" et cliquez sur "Faites-le." La vidéo sera générée.
  3. Mesure de microtubules shortening et taux de croissance
    1. Identifier les microtubules qui seront utilisés pour la mesure. Pour chaque cellule, seulement quelques microtubules pourront avoir leur raccourcissement ou la croissance suivie de manière claire et complète.
    2. Examinez chaque image de la vidéo pour identifier l'image qui montre la longueur de départ de l'microtubules unnd cadre avec le microtubules le plus étendu ou raccourci. Mesurer la variation de longueur entre les deux microtubules et le temps écoulé entre les deux cadres.
    3. Calculer le taux de croissance ou le raccourcissement en divisant le changement de longueur dans le temps (l'unité est um / s). Pour chaque condition de traitement, suivi d'au moins 10 cellules et mesurer au moins 20 microtubules.
    4. Calculer la moyenne et l'erreur standard pour chaque condition de traitement. Analyser la différence statistique entre les conditions à l'aide du test de Student. Signaler les données dans une table et / ou dans un tableau.

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Résultats

En utilisant le protocole présenté ici, nous avons étudié les effets de docétaxel sur la dynamique des microtubules de la normale (MCF-7 CC) et le docétaxel résistant (MCF-7) TXT cellules de cancer du sein. Deux séries d'images montrent les effets de docétaxel (0,5 uM) sur la croissance et le raccourcissement des microtubules dans les cellules MCF-7 CC et MCF-7 TXT cellules (figure 1A).

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Discussion

Il existe deux méthodes principales pour mesurer microtubules instabilité dynamique: in vitro et in vivo. Dans le procédé in vitro, la tubuline purifiée est utilisée pour mesurer l' instabilité microtubules dynamique avec time-lapse interférence différentielle-microscopie à contraste amélioré par ordinateur. Dans le procédé in vivo, microinjecté tubuline fluorescente ou exprimé GFP-tubuline en microtubules est incorporé. La dynamique (croissance et de raccourcissement) des microtu...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Cette recherche est financée par la FCCS (à ZW).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Sigma-AldrichD5796
Acides aminés non essentielsLife Technologies, Invitrogen11140-050
FBSGibco, Invitrogen12483
Anti-Anti (100x)Life Technologies, Invitrogen15240-062
docétaxelSigma-Aldrich01885-5mg-F
DMEM sans rouge de phénolGibco, Invitrogen21063
Réactif CellLight *BacMam 2.0* GFP-tubulineThermoFisher ScientificC10613Réactif clé pour l’expression de la tubuline GFP dans les cellules
CellLight Réactif *BacMam 2.0* GFPThermoFisher ScientificB10383Contrôle
diméthylsulfoxyde (DMSO)Sigma-Aldrich+B9 :AA9472301pour dissoudre le decetaxel
22 mm verre coveslipFisher Scientifics12-545-101
Plaque de culture 6 puitsGreiner Bio-One Internationalculture Celi 6 puits
DeltaVision Microscopy Imaging SystemsGE HealthCe système est équipé d’une station météo pour le contrôle de la température et du CO2. Il est également équipé du logiciel Worx pour la déconvolution et le contrôle en accéléré.
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénolThermoFisher Scientific25200056
Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific HausserScientific, distribué par VWRN° de fournisseur : 1492 N° VWR : 15170-172
du Plaque de

Références

  1. Kamangar, F., Dores, G. M., Anderson, W. F. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol. 24 (14), 2137-2150 (2006).
  2. Yardley, D. A. Drug resistance and the role of combination chemotherapy in improving patient outcomes. Int J Breast Cancer. 2013, 137414(2013).
  3. Jassem, J., et al. Doxorubicin and paclitaxel versus fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide as first-line therapy for women with metastatic breast cancer: final results of a randomized phase III multicenter trial. J Clin Oncol. 19 (6), 1707-1715 (2001).
  4. Nabholtz, J. M., et al. Docetaxel and doxorubicin compared with doxorubicin and cyclophosphamide as first-line chemotherapy for metastatic breast cancer: results of a randomized, multicenter, phase III trial. J Clin Oncol. 21 (6), 968-975 (2003).
  5. Zelnak, A. Overcoming taxane and anthracycline resistance. Breast J. 16 (3), 309-312 (2010).
  6. Rivera, E. Implications of anthracycline-resistant and taxane-resistant metastatic breast cancer and new therapeutic options. Breast J. 16 (3), 252-263 (2010).
  7. Longley, D. B., Johnston, P. G. Molecular mechanisms of drug resistance. J Pathol. 205 (2), 275-292 (2005).
  8. Downing, K. H., Nogales, E. Crystallographic structure of tubulin: implications for dynamics and drug binding. Cell Struct.Funct. 24 (5), 269-275 (1999).
  9. McGrogan, B. T., Gilmartin, B., Carney, D. N., McCann, A. Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer. Biochim.Biophys.Acta. 1785 (2), 96-132 (2008).
  10. Kamath, K., Oroudjev, E., Jordan, M. A. Determination of microtubule dynamic instability in living cells. Methods Cell Biol. 97, 1-14 (2010).
  11. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 790-803 (2010).
  12. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat.Rev.Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  13. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J.Cell Sci. 122 (15), 2579-2585 (2009).
  14. Kavallaris, M. Microtubules and resistance to tubulin-binding agents. Nat.Rev.Cancer. 10 (3), 194-204 (2010).
  15. Diaz, J. F., Valpuesta, J. M., Chacon, P., Diakun, G., Andreu, J. M. Changes in microtubule protofilament number induced by Taxol binding to an easily accessible site. Internal microtubule dynamics. J.Biol.Chem. 273 (50), 33803-33810 (1998).
  16. Abal, M., Andreu, J. M., Barasoain, I. Taxanes: microtubule and centrosome targets, and cell cycle dependent mechanisms of action. Curr Cancer Drug Targets. 3 (3), 193-203 (2003).
  17. Wang, H., et al. Multiple mechanisms underlying acquired resistance to taxanes in selected docetaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (37), (2014).
  18. Lal, S., Mahajan, A., Chen, W. N., Chowbay, B. Pharmacogenetics of target genes across doxorubicin disposition pathway: a review. Curr. Drug Metab. 11 (1), 115-128 (2010).
  19. Murray, S., Briasoulis, E., Linardou, H., Bafaloukos, D., Papadimitriou, C. Taxane resistance in breast cancer: mechanisms, predictive biomarkers and circumvention strategies. Cancer Treat.Rev. 38 (7), 890-903 (2012).
  20. Kamath, K., Wilson, L., Cabral, F., Jordan, M. A. BetaIII-tubulin induces paclitaxel resistance in association with reduced effects on microtubule dynamic instability. J.Biol.Chem. 280 (13), 12902-12907 (2005).
  21. Banerjee, A. Increased levels of tyrosinated alpha-, beta(III)-, and beta(IV)-tubulin isotypes in paclitaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 293 (1), 598-601 (2002).
  22. Wiesen, K. M., Xia, S., Yang, C. P., Horwitz, S. B. Wild-type class I beta-tubulin sensitizes Taxol-resistant breast adenocarcinoma cells harboring a beta-tubulin mutation. Cancer Lett. 257 (2), 227-235 (2007).
  23. Iseri, O. D., Kars, M. D., Arpaci, F., Gunduz, U. Gene expression analysis of drug-resistant MCF-7 cells: implications for relation to extracellular matrix proteins. Cancer Chemother.Pharmacol. 65 (3), 447-455 (2010).
  24. Hembruff, S. L., et al. Role of drug transporters and drug accumulation in the temporal acquisition of drug resistance. BMC.Cancer. 8, 318(2008).
  25. Yenjerla, M., Lopus, M., Wilson, L. Analysis of dynamic instability of steady-state microtubules in vitro by video-enhanced differential interference contrast microscopy with an appendix by Emin Oroudjev. Methods Cell Biol. 95, 189-206 (2010).
  26. Sammak, P. J., Gorbsky, G. J., Borisy, G. G. Microtubule dynamics in vivo: a test of mechanisms of turnover. J Cell Biol. 104 (3), 395-405 (1987).
  27. Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. J Cell Biol. 107 (4), 1437-1448 (1988).
  28. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).
  29. Walczak, C. E. Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins. Curr Opin Cell Biol. 12 (1), 52-56 (2000).

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Mots-clés

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