Introduction
La causa principal de la mortalidad del cáncer de mama es a través de la metástasis 1, 2. Los taxanos, tales como docetaxel y paclitaxel, se utilizan actualmente como regímenes de primera línea en el tratamiento de cáncer de mama metastásico 2, 3, 4, 5, 6. Son parte de un grupo de agentes de microtúbulos orientación (MTA) que interrumpen la dinámica de los microtúbulos. Sin embargo, uno de los mayores desafíos para el uso de taxanos en el tratamiento curativo es el desarrollo de resistencia a taxanos en células cancerosas, lo que conduce a la recurrencia de la enfermedad 7. La resistencia a fármacos es responsable de más del 90% de todas las muertes entre los pacientes con cáncer de mama metastásico 7.
Los microtúbulos se forman por la polimerización de heterodímeros alfa y beta tubulinaclass = "xref"> 8, 9. La regulación precisa de la dinámica de microtúbulos es importante para muchas funciones celulares, incluyendo la polarización celular, progresión del ciclo celular, el transporte intracelular y la señalización celular. La desregulación de los microtúbulos y su dinámica va a alterar la función celular y provocar la muerte celular 10, 11. Dependiendo de la forma en que causan este desregulación, drogas MTA se pueden clasificar como agentes estabilizantes de microtúbulos (es decir, taxanos) o agentes de microtúbulos destabalizing (es decir, alcaloides de la vinca o la colchicina-sitio de agentes de unión) 20. A pesar de sus efectos opuestos sobre la masa de los microtúbulos, a una dosis suficiente, ambas clases pueden matar a las células cancerosas a través de sus efectos sobre la dinámica de los microtúbulos 21.
Los taxanos funcionan principalmente mediante la estabilización de los microtúbulos del huso 12, que conduce adesalineación cromosómico. La activación perpetua posterior de la asamblea de control de huso (SAC) detiene el celular en la mitosis. Mitótico detención prolongada provoca entonces la apoptosis 13, 14. Taxano interactúa con los microtúbulos a través del sitio de unión de taxano en β-tubulina 8, 15, que sólo está presente en tubulina ensamblada 16.
Se han propuesto múltiples mecanismos de resistencia taxano 9, 17. Estos mecanismos incluyen tanto resistencia a múltiples fármacos en general debido a la sobreexpresión de las proteínas y los taxanos específico resistencia 5, 9, 18, 19 de flujo de salida con las drogas. Por ejemplo, las células cancerosas resistentes a taxanos puede haber alterado la expresión y la función de determinadas β-bañeraUlin isotipos 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. Mediante el uso de un método in vivo para medir la inestabilidad dinámica de los microtúbulos, se muestra que, en comparación con, células MCF-7 CC parentales no resistentes 17, la dinámica de los microtúbulos de células MCF-7 TXT docetaxel resistentes son insensibles al tratamiento con docetaxel.
Para entender mejor la función de los ATM y el mecanismo exacto de taxano-resistencia en las células cancerosas, es esencial para medir la dinámica de microtúbulos. Aquí, se presenta un método in vivo de hacerlo. Mediante el uso de imágenes en vivo en combinación con la expresión de la tubulina marcado con GFP en las células, podemos medir la dinámica de los microtúbulos de las células MCF-7 TXT y células MCF-7 con CC y wiThout tratamiento con docetaxel. Los resultados pueden ayudar a diseñar fármacos más efectivos que puedan superar la resistencia taxano.
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Protocol
1. Preparación de las células de imágenes en vivo
- Cultivo de células y la siembra
- Utilice células MCF-7 de cáncer de mama seleccionados para la resistencia a docetaxel (MCF-7 TXT) y su línea celular parental no resistentes (MCF-7 CC). El proceso de selección detallada y la caracterización de estas líneas celulares seleccionadas se han descrito anteriormente 24.
- Crecer todas las células en placas de cultivo de 10 cm a 37 ° C en un medio compuesto 90% de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y 10% de suero bovino fetal (FBS) y suplementado con aminoácidos no esenciales. Mantener el medio en una atmósfera de 5% de CO 2. Mantener las células MCF-7 TXT a 5 nM de docetaxel.
- Se siembran las células en cubreobjetos de imágenes en vivo. Esterilizar cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-L-lisina 24 mm de un enjuague con alcohol 70% y luego exponerlas a radiación UV durante la noche. Coloque los cubreobjetos en una placa de cultivo de 6 pocillos de 35 mm. place un cubreobjetos en cada pocillo.
- Retire el medio de la placa de cultivo de 10 cm y se lavan las células con PBS. Añadir 0,5 ml de tripsina-EDTA al plato para desprender las células del plato. Añadir 5 ml de medio de cultivo para el plato para neutralizar la tripsina tras el desprendimiento de las células.
- Contar las células con un hemocitómetro para determinar el número de células por unidad de volumen.
- Añadir aproximadamente 10 5 células a cada pocillo basado en el número de células por unidad de volumen. Después de agitarlo suavemente, coloque la placa de nuevo en la incubadora para permitir que las células se unan a los cubreobjetos.
- La expresión de GFP-etiquetados α-tubulina
- Para ensayar la dinámica de los microtúbulos, transducir las células con GFP-etiquetados α-tubulina con el control de la transducción de GFP comercial (por ejemplo, BacMam) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Cultivar las células en el pocillo durante 36 h en una incubadora de 37 ° C de cultivo celular para permitir que comadhesión completa y 60% de confluencia.
- Calcular el volumen apropiado de GFP marcada con α-tubulina de añadir a cada pocillo, de acuerdo con la siguiente ecuación:
El número de células es el número total estimado de células en el pocillo en el momento de etiquetado y de la PPC deseado es el número de partículas por célula.
NOTA: siembra de las células MCF-7 debería haber doblado el recuento de células a partir de 10 5 a 2 x 10 5 con una PPC deseada de 20, el volumen necesario para cada cubreobjetos, por tanto, es de 40 l. Para las diferentes células, el volumen estimado a partir de la fórmula anterior puede no ser la mejor. El volumen debe ajustarse de acuerdo con el nivel de expresión real de GFP-tubulina. - Mezclar los alfa-tubulina varias veces GFP-etiquetados por inversión para asegurar una solución homogénea. No hacer vórtice.
NOTA: Para el control, el (control) de reactivo nulo carece de cualquier genética de mamíferoselementos y se pueden utilizar para ayudar a determinar los posibles efectos de baculovirus mediada y la fluorescencia de fondo. Un control de la transducción de GFP no específica también se puede utilizar, que se iluminará toda la célula. - Vuelva a colocar el medio de cultivo con medio fresco. Añadir 2 ml de nuevo medio y 40 l de GFP marcada con α-tubulina a cada pocillo.
- Agitar suavemente la placa para permitir la mezcla completa de GFP marcada con α-tubulina con el medio de cultivo. Devolver la placa a la incubadora de cultivo y se incuba durante 24 horas para permitir la expresión de GFP-tubulina.
- Tratar a las células con docetaxel
NOTA: Este experimento es ensayar el efecto de docetaxel en microtúbulos inestabilidad dinámica. Por lo tanto, las células se tratan con la concentración deseada de docetaxel.- Prepare un medio compuesto 90% de DMEM y 10% de FBS y complementado con aminoácidos no esenciales. Utilice DMEM sin rojo fenol rojo fenol porque puede interferir con la fluorescence de GFP-tubulina. Añadir la concentración deseada de docetaxel (que van desde 10 nM a 10 mM). La solución madre de docetaxel es de 10 mM en sulfóxido de dimetilo (DMSO).
- Pre-calentar el medio que contiene docetaxel a 37 ° C en la incubadora de cultivo de tejidos.
- Reemplazar el medio de cultivo normal con el medio que contiene docetaxel-e incubar durante 30 min en la incubadora de cultivo de tejidos. Debe haber al menos 3 cubreobjetos por pocillo para cada concentración de docetaxel.
2. imágenes en vivo para examinar los microtúbulos inestabilidad dinámica
- Configuración del sistema
- Realizar experimentos en una cámara mantenida a 37 ° C y 5% de CO2. Adquirir imágenes de fluorescencia por el lapso de tiempo con un sistema de microscopio equipado con un 60X, 1,42 NA aceite de lente de objetivo en un microscopio de fluorescencia invertida y con una cámara CCD.
- Configurar las células para la formación de imágenes en directo. Pre-caliente tanto el soporte de la muestra yel medio a 37 ° C. Elija un cubreobjetos para examinar. Montar el cubreobjetos de interés sobre un soporte de muestra y se incuba con 1 ml del medio que contiene docetaxel-preparada en el paso 1.3.1.
- Imágenes en vivo de los microtúbulos inestabilidad dinámica
- Identificar las células que se van a utilizar para la imagen. Ellos deben ser planos, tienen una alta intensidad de la fluorescencia de GFP expresado-tubulina, y tienen estructuras de microtúbulos claras.
- Elija una célula del grupo de células identificadas a partir del paso 2.2.1 para examinar en primer lugar. Centrarse en la zona periférica de la célula identificada. Configurar el programa para el tiempo de exposición y la frecuencia de adquisición de imágenes. A medida que el tiempo de exposición es por lo general de 0,5 s, las imágenes se adquieren cada dos s.
- Permitir un 20 minutos adicionales para los pasos de 1,33 a 2.2.3. Por lo tanto, exactamente 50 min después de la adición de docetaxel, como se describe en el paso 1.3.3, comenzar de formación de imágenes (esto es para la estandarización).
- Registrar los microtúbulos dynamics durante 2 minutos, tomar una foto cada 2 s. En total, la adquisición de 60 imágenes para la célula identificada.
- Pasar a la siguiente célula identificada y repita los pasos 2.2.2 a 2.2.4. Repetir el procedimiento hasta que se hayan reflejado 5 células. Es imperativo que hacer esto antes de que el tiempo llegue a 70 minutos después de la adición de docetaxel, tal como se describe en el paso 1.3.3.
- Para cada condición de tratamiento, repita los pasos 2.2.1 a 2.2.5 para 3 cubreobjetos diferentes. En total, la imagen 15 células, que son datos suficientes para medir la inestabilidad dinámica de los microtúbulos.
3. Procesamiento de Imágenes y Análisis de Datos
- La deconvolución de imágenes
- Deconvoluir las imágenes adquiridas para lograr una alta calidad. Abrir el programa de deconvolución equipado con el sistema de microscopio.
- Haga clic en "Proceso" y seleccione "deconvoluir." Arrastre el archivo de imagen en la ventana de "Entrada" y haga clic en "Do" El archivo de imagen se deconvolved, y eldeconvolved archivo se guarda como un archivo nuevo de forma automática.
- Generación de vídeos
- Haga clic en el archivo de imagen deconvolved para abrir con el software equipada.
- Haga clic en "Archivo" y seleccione "Guardar como película". Seleccione la opción "Formato de la película" como "AV" y el "estilo de animación" como "Adelante". Establecer la "calidad de compresión" a "100%" y la "velocidad de fotogramas" a "5 / segundo."
- Marque la casilla de "Animación a través del tiempo" y haga clic en "Do it". Se generará el video.
- Medición de acortamiento de los microtúbulos y la tasa de crecimiento
- Identificar los microtúbulos que serán utilizados para la medición. Para cada celda, sólo unos pocos microtúbulos serán capaces de tener su acortamiento o crecimiento siguieron clara y completa.
- Examine cada fotograma del vídeo para identificar el marco que muestra la longitud de partida de los microtúbulos unand el marco con los microtúbulos más extendida o acortada. Medir el cambio en longitud entre las dos microtúbulos y el tiempo transcurrido entre los dos marcos.
- Calcular la tasa de crecimiento o acortamiento dividiendo el cambio en la longitud de tiempo (la unidad es m / s). Para cada condición de tratamiento, siga al menos 10 células y medir al menos 20 microtúbulos.
- Calcular el promedio y el error estándar para cada condición de tratamiento. Analizar la diferencia estadística entre las condiciones utilizando el test de Student. Reportar los datos de una tabla y / o en un gráfico.
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Representative Results
Utilizando el protocolo presentado aquí, se estudiaron los efectos de docetaxel en la dinámica de los microtúbulos de normal (MCF-7 CC) y docetaxel resistentes (MCF-7 TXT) las células de cáncer de mama. Dos conjuntos de imágenes muestran los efectos de docetaxel (0,5 M) en el crecimiento de los microtúbulos y la manteca en MCF-7 CC y MCF-7 TXT células (Figura 1A).
También se calculó la tasa de crecimiento de los microtúbulos o acortando en estas condiciones durante las dos líneas celulares y demostramos que en 0.5 M, docetaxel inhibe significativamente en la evolución de tubulina de células MCF-7 CC, pero no células MCF-7 TXT (Figura 1B).
Figura 1: Los efectos de docetaxel en la dinámica de los microtúbuloss de las células MCF-7 TXT y células MCF-7 CC. La formación de imágenes en vivo se llevó a cabo como se describe. (A) Las imágenes seleccionadas a partir de la formación de imágenes en vivo de la dinámica de los microtúbulos en las células MCF-7 CC y las células MCF-7 TXT después del tratamiento con docetaxel 0,5 M durante 1 h. La flecha indica los microtúbulos se extienden. La punta de flecha indica los microtúbulos acortamiento. Tamaño de la barra = 5 micras. (B) La tasa de extensión y la tasa de acortamiento de los microtúbulos se miden a partir de las imágenes grabadas. Cada dato es la media de 20 mediciones a partir de al menos 8 células diferentes. La barra de error es el error estándar. ** Indica que la diferencia es estadísticamente significativa, con p <0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hay dos métodos principales para medir la inestabilidad dinámica de los microtúbulos in vitro y en vivo. En el método in vitro, la tubulina purificada se utiliza para medir la inestabilidad dinámica de los microtúbulos con lapso de tiempo diferencial de interferencia de microscopía de contraste mejorado por computadora. En el método in vivo, microinyectó tubulina fluorescente, o se expresa GFP-tubulina, se incorpora en los microtúbulos. La dinámica (crecimiento y acortamiento) de los microtúbulos a continuación, se registra por lapso de tiempo utilizando una cámara sensible en la región periférica de las células en interfase 10, 20, 25. Aunque varios tipos de microscopios se han utilizado para este propósito, el protocolo informamos aquí utiliza un microscopio de deconvolución.
In vivo, la inestabilidad dinámica se produce sólo en microtúbulos más extremos (los extremos con la β-tubulina mirando hacia fuera), mientraslos extremos menos (los extremos con la α-tubulina hacia afuera) siguen siendo la misma longitud 26. Por otro lado, por microtúbulos ensamblados in vitro, la inestabilidad dinámica se produce en ambos extremos de los microtúbulos, con los extremos además de ser más robusto que termina el signo menos 27. La principal ventaja de analizar la inestabilidad dinámica in vitro es que proporciona información sobre el mecanismo de la función específica de los diferentes agentes en la dinámica de los microtúbulos en ausencia de los mapas celulares. Por otra parte, en condiciones in vitro, la inestabilidad dinámica puede ser estudiado en ambos extremos. Esto da una idea de los mecanismos por los que las drogas o proteínas reguladoras afectan a la estabilidad de los microtúbulos en los extremos opuestos. Históricamente, los extremos menos se realiza un seguimiento mucho menor que termina el más 10. Gran parte de nuestra comprensión del comportamiento de los microtúbulos proviene de estudios en los microtúbulos ensamblados a partir de tubulina purificada in vitro. Sin embargo, mientras que muchos de los principios básicos de comportamiento de los microtúbulos obtenidos de estos estudios también se puede aplicar a los microtúbulos en las células, hay ciertas diferencias en la dinámica de los microtúbulos entre in vitro e in vivo. En las células, los microtúbulos a menudo crecen en un período de cinco a diez veces más rápidamente, y las transiciones entre el crecimiento y / o la manteca se producen ~ 10 veces más frecuentemente que con los microtúbulos ensamblados a partir de tubulina purificada in vitro. También hay cambios drásticos en la organización de los microtúbulos y la dinámica de todo el ciclo celular, que reflejan un alto grado de regulación espacial y temporal de la conducta de los microtúbulos celulares. Este comportamiento no puede ser estudiado por la investigación in vitro. Por otra parte, la regulación de la dinámica de los microtúbulos se logra mediante la modificación postraduccional tubulina, la expresión de la tubulina isotipo, y un gran grupo de mapas y otras proteínas que interaccionan con los microtúbulos que estabilizar o desestabilizar microtúbulos 28, 29. Por lo tanto, el estudio de la inestabilidad de los microtúbulos en las células vivas es mucho más fisiológicamente aplicable.
El método descrito aquí es un protocolo simple y muy fiable para estudiar la dinámica de los microtúbulos en las células vivas. Los pasos que requieren mayor atención son la selección de la célula para la observación y la determinación del tiempo de exposición. Es fundamental para seleccionar las células que son planas y tienen una alta intensidad de la fluorescencia de GFP-tubulina. También es deseable reducir la intensidad de excitación y el tiempo de exposición para evitar el desvanecimiento de la fluorescencia de GFP. Ciertamente, como todos los otros métodos in vivo, este protocolo no es adecuado para estudiar la inestabilidad dinámica de los microtúbulos en diversas condiciones manipuladas. Por ejemplo, diferentes isoformas de α- y β-tubulina pueden comportarse de manera diferente en cuanto a la dinámica de los microtúbulos. Sólo en métodos in vitro se puede utilizar para study los efectos de las isoformas tubulina de los microtúbulos purificados individuales de inestabilidad dinámica. Además, en comparación con la microinyección de tubulina marcado con fluorescencia, la expresión de la tubulina GFP-etiquetados por transfección o transducción de plásmidos puede presentar una proporción relativamente baja de señal a ruido. Sin embargo, la expresión de la tubulina marcado con GFP en las células mediante transfección o transducción de plásmidos que permite una mayor libertad para alterar experimentalmente otras características celulares.
El protocolo aquí descrita podría ser utilizado para diversos estudios. Por un lado, se puede proporcionar nuevos y críticos penetraciones con respecto a la función de los microtúbulos durante las diversas fases del ciclo celular, especialmente en la mitosis. También se puede utilizar para estudiar los efectos de diversos procesos celulares, tales como la migración, en la dinámica de microtúbulos. Por otro lado, puede ser usado para estudiar los efectos de varios inhibidores de microtúbulos (muchos de ellos son medicamentos contra el cáncer) en la dinámica de los microtúbulos en normal ycélulas cancerosas en condiciones más fisiológicas. Hemos utilizado este método para estudiar los efectos de varios fármacos para el cáncer anti-mitótico en la inestabilidad dinámica de los microtúbulos en las células resistentes y de cáncer de mama resistente no docetaxel docetaxel.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
| Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
| docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
| DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
| 22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
| 6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
| DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |
References
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