Introduction
L'obiettivo di questo metodo è quello di creare un modello riproducibile per grave ipertensione arteriosa polmonare indotto dal flusso in ratti e misurare il suo principio emodinamico e finale istopatologici.
Arteriosa polmonare (PAH) è una sindrome clinica che comprende un progressivo aumento della resistenza vascolare polmonare che porta a insufficienza ventricolare destra e di morte. All'interno dello spettro malattia sovraordinata malattie ipertensive polmonari (PH), PAH è la forma più grave e uno che rimane senza cura 1. L'arteriopatia sottostante PAH è caratterizzata da una forma tipica di rimodellamento vascolare che occlude il lume del vaso. Muscolarizzazione delle navi e l'ipertrofia dello strato nave mediale normali non muscularized sono considerati come fenomeni malattia precoce in PAH, sono visti anche in altre forme di PH 2, e si pensa di essere reversibile 3. Come PAH undvances, lo strato intimale inizia a rimodellare, eventualmente formando caratteristiche lesioni neointimale 2. Neointimale-tipo rimodellamento vascolare polmonare è esclusivo di PAH ed è attualmente considerato essere irreversibili 4.
Come PAH è una malattia rara, i progressi nella sua comprensione patobiologico e lo sviluppo di nuove terapie hanno fatto affidamento su modelli animali. L'(MCT) modello monocrotalin nei ratti è un semplice modello singolo di successo che è stato, ed è tuttora, utilizzato di frequente. MCT è una tossina che provoca lesioni alle arteriole polmonari e infiammazione regionale 5. 60 mg / kg MCT porta ad un aumento nella pressione media arteriosa polmonare (mPAP), resistenza vascolare polmonare (PVR), e ipertrofia ventricolare destra (RVH) dopo 3 - 4 settimane 6. Il istomorfologia è caratterizzata da ipertrofia isolato mediale senza lesioni neointimale 5. la MCTratto rappresenta quindi una forma moderata di PH, e non PAH, anche se è comunemente presentato come quest'ultimo.
Nei bambini con PAH associata con uno shunt congenito sinistra a destra (PAH-CHD), aumento del flusso sanguigno polmonare è considerato come trigger essenziale per lo sviluppo di lesioni neointima 7, 8, 9. Nei ratti, aumento del flusso sanguigno polmonare può essere indotta dalla creazione di uno shunt tra l'aorta addominale e la vena cava, una tecnica descritta nel 1990 10. Alternative per la creazione di un aumento del flusso polmonare sono da pneumonectomia unilaterali o succlavia di arteria polmonare anastomosi 11. svantaggi concettuali di questi modelli sono composti da un potenziale di crescita compensatoria del restante polmone e l'attivazione della via adattativa indotta dalla pneumonectomia, o di danni iatrogeni del sistema vascolare polmonare dovutaper anastomosi arteria polmonare, sia confondendo gli effetti di aumento del flusso sanguigno polmonare.
Quando si crea uno shunt aorto-cavale e aumento del flusso sanguigno polmonare è indotta da un secondo colpo in ratti MCT-trattati, lesioni neointimale caratteristici si verificano, e una grave forma di IPA e insufficienza del ventricolo destro associato (RVF) sviluppano 3 settimane dopo l'aumento flusso 12. La progressione emodinamica della PAH in questo modello può essere valutata in vivo mediante ecocardiografia e cateterizzazione cardiaca destra. Il istomorfologia vascolare, spessore parete del vaso, il grado di arteriolare dell'occlusione, ed i parametri della disfunzione ventricolare destra costituiscono i pilastri della ex vivo caratterizzazione dei PAH.
Questo metodo descrive i protocolli dettagliati per la chirurgia aorto-cavale shunt (AC-shunt), il cateterismo cardiaco destro, e la valutazione qualitativa e quantitativa dei istomorfologia vascolare.
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Protocol
Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal Comitato Centrale olandese per la sperimentazione animale e il Comitato Animal Care presso University Medical Center di Groningen (NL). Entrambi sono stati utilizzati ratti Wistar e Lewis con pesi tra 180 e 300 g.
1. Corpo e acclimatazione
- Dopo l'arrivo presso l'impianto di animale centrale, ratti casa in gruppi di 5 per gabbia. Nel corso di un periodo di acclimatazione di 7 giorni, abituare i ratti per la manipolazione umana, ma non eseguire alcuna procedura sperimentale.
2. Preparazione e l'iniezione di sterile Monocrotalin
- Per 1 ml di 60 mg / mL monocrotalin (MCT) soluzione, pesare 60 mg di monocrotalin in una provetta 2 mL. Aggiungere 700 microlitri di 0.9% NaCl. Aggiungere 200 ml di 1 M HCl. Riscaldare la soluzione della provetta sotto acqua corrente calda e vortex esso. Utilizzare 6 N NaOH per portare il pH verso 7.0. Utilizzare una tecnica sterile per la preparazione di MCT per iniezione in roditori. Iniettare 1 ml di sterile 60 mg / mL soluzione MCT per kg per via sottocutanea nel collo (0,3 ml di 60 mg / mL MCT per 300 g ratto). NOTA: Non preferiamo usare volumi più piccoli a causa della maggiore probabilità che la dose iniettata non sarà opportuno.
3. Aorta-Caval Chirurgia Shunt
- Anestesia.
- Riempire la camera di induzione con 5% isoflurano / 100% O 2 (flusso: 1 L / min) e posizionare il topo nella camera. Verificare la presenza di un'adeguata profondità dell'anestesia eseguendo un pizzico dito posteriore. Pesare il ratto.
- Shave e pulire l'addome su una superficie che è di circa 8 cm e larga 3 cm. Posizionare il topo sul dorso su una stuoia di calore (37 ° C) coperta da una stuoia sterile.
- Posizionare il muso in una ventilazione in maschera / cappuccio con 2 - 3% isoflurano / 100% O 2 (flusso: 1 L / min). Controllare la profondità di anestesia eseguendo un pizzico dito posteriore. Applicare una pomata oculare per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
- shunt Surgery.
- Macchia la pelle con cloruro-hexidine per la disinfezione. Iniettare 0,01 mg / kg per via sottocutanea di buprenorfina per l'analgesia post-operatoria.
- Utilizzare strumenti sterili per la chirurgia. Fare un'incisione con un # 10 bisturi nell'addome sulla linea mediana, a partire da 1 cm al di sotto del diaframma una che si estende verso il basso per appena sopra i genitali.
- Sollevare l'intestino con un tampone di cotone, coprire l'intestino in una sterile, garza bagnata (0,9% NaCl), e metterli al lato sinistro dell'animale.
- Usare tamponi di cotone per separare le membrane che fissano l'aorta addominale e la vena cava inferiore ai tessuti circostanti.
NOTA: Non sezionare le membrane tra l'aorta e la vena cava. - Utilizzando pinze scheggia, rimuovere il grasso aortica perivascolare appena sopra la biforcazione, solo sul lato destro dell'aorta e solo nel luogo in cui viene inserito l'ago.
- Usare tamponi di cotone per separare l'aorta e vena cava da mm supe 2rior al sito in cui verrà inserito l'ago in modo da creare lo spazio per un morsetto Biemer.
- In questa zona, il primo posto una legatura sciolto (5-0 di sutura) intorno all'aorta. Creare tensione legatura posizionando un morsetto Kocher su di esso, e quindi inserire il Kocher superiore all'incisione (Figura 1A). Posizionare il morsetto Biemer appena superiore alla legatura (Figur e 1A).
- Usando un tampone di cotone, comprimere la vena cava più distalmente possibile ostruire il flusso (Figura 1A). Bend un ago (18 G in questo protocollo) in un angolo di 45 gradi, con la punta dell'orifizio verso l'esterno (Figura 1A).
- Ad un angolo di 90 gradi, inserire l'ago in aorta, appena sopra la biforcazione, con l'orifizio della punta dell'ago a sinistra (Figura 1A). Manipolare la punta dell'ago a sinistra e inserirla nella vena cava.
NOTA: La punta dell'ago deve ora essere visiBLE nella vena cava (Figura 1B). - Utilizzare un secondo tampone di cotone per spingere il sangue rimanente nell'aorta fuori del sito di inserimento per prevenire la trombosi. Essiccare la zona intorno al shunt con una garza sterile affinché depositi di colla adeguatamente.
- Estrarre l'intero ago dal aorta e immediatamente applicare una goccia di colla tessuto sul sito di puntura in aorta. Assicurarsi di non incollare il tampone di cotone per il tessuto. Sganciare l'aorta.
- Verifica shunt manualmente tirando e rilasciando la legatura sul prossimale dell'aorta allo shunt. Allentamento dovrebbe colorare il distale della vena cava per lo shunt in rosso e creare turbolenze nel sito shunt.
NOTA: serraggio diventerà il sangue nella vena cava torna al rosso scuro. - Inserire l'intestino indietro nell'animale. Chiudere lo strato di muscolo e pelle con riassorbibili 4-0 punti di sutura. Ventilare l'animale con il 100% O 2 per recuperare da anestesia.
NOTA: Non lasciare un aniMal incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale.
- Chirurgia Sham.
- Eseguire tutte le procedure di cui sopra, tranne per l'inserimento dell'ago in aorta.
- la cura post-chirurgica.
- Posizionare il ratto in una singola gabbia e in un incubatore a 37 ° C fino alla mattina seguente.
- Intorno a 6 ore dopo l'intervento chirurgico, iniettare 0,01 mg / kg per via sottocutanea di buprenorfina per l'analgesia post-operatoria. Ripetere la mattina successiva se il ratto mostra segni di disagio.
NOTA: I primi 3 giorni dopo l'intervento chirurgico, i ratti tendono a mangiare e bere meno (questo è particolarmente importante quando chow o acqua potabile sono mescolati con la droga). La maggior parte dei ratti mostrano un comportamento normale 3 giorni dopo l'intervento. In caso contrario, seguire da vicino. La perdita di peso superiore al 15% in 1 settimana è considerato anormale, e tali ratti dovrebbe essere eutanasia per estrazione del volume di sangue circolante mentre sotto anestesia.
NOTA: In questo protocollo, l'animale è eutanasia per l'estrazione del volume del sangue circolante mentre sotto anestesia.
- Sacrificio 1 giorno dopo l'intervento chirurgico (MF8) per le prime risposte cellulari e funzionale per aumento del flusso sanguigno polmonare (ad esempio, geni up-regolazione o fattori di trascrizione precoce).
- Sacrificio 1 settimana dopo l'intervento chirurgico (MF14) per un fenotipo PAH vascolare in stadio precoce (ipertrofia mediale senza lesioni neointimale).
- Sacrificio 2 settimane dopo l'intervento chirurgico (MF21) per un fenotipo PAH vascolare in stadio avanzato (marcata ipertrofia mediale e formazione neointimale) con un lieve aumento nel RVP e mPAP.
- Sacrificio 3 settimane dopo l'intervento chirurgico (MF28) per un fenotipo PAH vascolare allo stadio terminale (contrassegnato occlusione neointimale) e forte elevazione RVP e mPAP. I segni clinici di insufficienza ventricolare destra sono comuni in questa fase.
- Sacrificio dopo giorno 28 (MF-RVF) Per l'insufficienza del ventricolo destro PAH associata (RVF), clinicamente definita come la dispnea, grave letargia, e perdita di peso (<10% in 1 settimana). Termina ratti quando è presente uno di questi segni. Spesso, i ratti sviluppano questi sintomi tra i giorni 28 e 35 e, se lasciato incustodito, muoiono spontaneamente durante questo intervallo di tempo.
5. Diritto Cuore Catheterization
- Anestesia.
- Riempire la camera di induzione con il 5% isoflurano / 100% O 2 (flusso: 1 L / min) e posizionare il topo nella scatola. Verificare la presenza di un'adeguata profondità dell'anestesia eseguendo un pizzico dito posteriore. Pesare il ratto.
- Shave e pulire il collo a destra-ventrale del ratto e, per il protocollo ecocardiografia torace e dell'addome superiore.
- Posizionare il ratto sulla sua schiena su una stuoia di calore (37 ° C) e posizionare il muso in una ventilazione in maschera / cappuccio con 2 - 3% isoflurano / 100% O 2 (flusso: 1 L / min). Il muso deve essere affrontato verso il ricercatore.
- protocollo ecocardiografia.
- Eseguire l'ecocardiografia secondo il protocollo descritto da Brittain et al. in JoVE 13.
- protocollo cateterizzazione.
NOTA: Questo protocollo utilizza una cannula rigida con una punta preformata piegato 20 gradi per guidare il catetere di silicio 15 cm con una sfera 2 mm dalla punta. Un ago 20-G con suo orifizio leggermente piegato verso l'interno viene utilizzato per inserire la cannula nella vena giugulare destra (vedere l'elenco dei materiali). Ratti in ogni fase della PAH progressione e di controllo possono essere utilizzati in questo protocollo.- Disinfettare il collo con il cloruro-hexidine. Fare un 1,5 cm incisione con un # 10 bisturi nella parte destra-ventraledel collo, dalla clavicola fino all'osso mandibolare.
- Stendere il tessuto con le forbici. Utilizzando una pinzetta, tirare delicatamente il tessuto a parte fino a quando appare la vena giugulare. Sezionare le membrane intorno alla vena giugulare con pinze scheggia.
- Mettere tensione sulla vena giugulare posizionando una legatura allentata (5-0 sutura) intorno al vaso. Aumentare la tensione e il nastro la legatura sulla maschera di ventilazione (Figura 2A).
- A valle del sito di inserimento, inserire una legatura allentata intorno al vaso per stringere dopo la cannula è in situ, per evitare perdite e la perdita di pressione.
- Utilizzando le maniglie di una pinza, piegare leggermente la punta di un ago 20-G con l'orifizio all'interno di condurre la cannula con il catetere.
- Introdurre la punta dell'ago 20-G nella vena e posizionare rapidamente la cannula contenente il catetere all'interno del vaso. Estrarre l'ago, e quindi chiudere la legaturache è stato preparato nel passaggio 5.3.4.
- Effettuare la cannula contenente il catetere nella vena giugulare. La punta della cannula è in una curva di 20 gradi (vedi punto 5.3.5). Manovra la cannula sotto la clavicola e far avanzare un po 'per entrare nell'atrio destro (Figura 2C).
- Per entrare nel ventricolo destro, puntare la punta della cannula verso sinistra, verso il cuore (Figura 2D). Sul monitor posto letto, una curva di pressione RV dovrebbe comparire, corrispondenti figura 2D.
- Quando la curva di pressione RV è costante, annotare la pressione del ventricolo destro sistolica e diastolica 1 (sRVP1 / dRVP1).
- Manipolare la punta della cannula e verso l'alto a sinistra. Far avanzare il catetere all'interno della cannula (Figura 2E).
- Avanzare il catetere nell'arteria polmonare principale (PA). Nessuna resistenza deve essere sentito quando si passa la valvola polmonare.
NOTA: Quando il catetere entra l'arteria polmonare principale, la dpressione iastolic aumenterà. Sul monitor posto letto, una curva di pressione PA dovrebbe comparire, corrispondenti Figura 2E. - Quando la curva di pressione PA è costante, annotare la pressione sistolica, diastolica e pressione media PA 1 (sPAP1, dPAP1, mPAP1).
- Ulteriori avanzare il catetere all'interno della cannula fino a quando la palla sulla punta del catetere viene incastrata in una arteria polmonare. Osservare la curva di pressione sulla goccia monitor al posto letto e abbinare la curva di pressione a cuneo in Figura 2F.
- Quando la curva di pressione cuneo è costante, annotare la pressione sistolica, diastolica e pressione media cuneo.
- Tirare indietro il catetere lentamente e successivamente misurare e annotare i valori per sPAP2, dPAP2, mPAP2, sRVP2, e dRVP2, come visualizzato sul monitor al posto letto.
- Quando, nel camper, un po 'tirare indietro la cannula e il catetere per misurare la pressione atriale destra (RAP) dire. La curva deve corrispondere alla curva di RAP in figura 2A.
NOTE: In questo protocollo, i topi sono eutanasia dopo il protocollo di cateterizzazione per l'estrazione del volume del sangue circolante mentre sotto anestesia.
6. Valutazione Morfologia e Morfometria
NOTA: In questo protocollo, l'animale è eutanasia per l'estrazione del volume del sangue circolante mentre sotto anestesia. Ratti in ogni fase della PAH progressione e di controllo possono essere utilizzati in questo protocollo.
- Dopo il sacrificio, estrarre i polmoni tagliando la trachea circa 5 mm al di sopra della biforcazione bronchiale ed i vasi che collegano i polmoni al cuore. Mettere i polmoni in soluzione salina fredda. Sezionare il polmone sinistro. Tagliare il bronco principale di sinistra alla biforcazione.
- Riempire una siringa da 50 ml con 4% paraformaldeide, collegare un tubo con una cannula alla siringa, e appendere la siringa circa un metro dal piano di lavoro. Montare la cannula nel bronco principale di sinistra per riempire passivamente il polmone con paraformaldeide.Maneggiare con cautela paraformaldeide.
- Incubare polmone sinistro in paraformaldeide per 48 h.
- Disidratare il polmone sinistro incubando consecutivamente in etanolo al 70% (1 h), 80% di etanolo (1 h), 90% di etanolo (1 h), 100% di etanolo (3 h), xilolo (2 h), e paraffine ( 2 h).
- Incorporare polmone sinistro in paraffina, con l'ilo del polmone di fronte alla cassetta.
- Macchiare le sezioni polmonari 4 micron inclusi in paraffina utilizzando una colorazione Verhoeff o Elastica-van Gieson, secondo le istruzioni del produttore 29. Assicurarsi che le lamine elastiche sono ben differenziate (come in figura 3). Eseguire la scansione delle sezioni colorate a 40X di ingrandimento.
- Dividere il polmone in 4 quadranti. In ogni quadrante, trovare 10 navi con un diametro esterno <50 micron (intra-acinose) e 10 navi con un diametro esterno> 50 micron (pre-acinose). Scatta una foto (2 x 40 immagini al polmone). Zoom in maniera casuale fino a 20x e fotografare ogni vasoin questo campo di vista per minimizzare errori di selezione.
- Esclusione navi che hanno / minor rapporto più lungo diametro> 2, di forma circolare incompleta, o un crollo di più di un quarto della parete del vaso.
NOTA: Un esempio di un recipiente escluso è mostrato in Figura 3b Rendere ogni immagine sullo stesso ingrandimento (40X) e comprendono una barra di scala. - Aprire ImageJ e la prima immagine. Tracciare una linea retta sulla barra di scala nella foto per impostare la scala tramite "Analyse" e "Set scala." Per "distanza nota," utilizzare il valore sulla barra della scala dell'immagine. Utilizzare micrometri (micron) come unità di lunghezza. Impostare la scala al globale.
- L'utilizzo di "selezioni a mano libera," disegnare una linea sul bordo interno della superficie luminale (Figura 3), e l'uso "su misura" (Crtl m) per misurare questa zona. Poi, tracciare una linea intorno al elast esternoic lamina (figura 3) per misurare l'area totale recipiente.
- Calcolare il luminale e diametro esterno (
) usando 
. - Calcolare lo spessore della parete utilizzando
. - Calcolare il rapporto parete / lume utilizzando
. - Calcolare il punteggio di occlusione tramite
. - Punteggio l'imbarcazione su muscolarizzazione (no, parziale o totale muscolarizzazione) (Figura 3B).
NOTA: imbarcazioni con una doppia lamina elastica per più della metà della circonferenza sono definiti come totalmente muscularized. Le navi con una doppia lamina elastica inferiore alla metà della circonferenza sono definite come parzialmente muscularized. - Punteggio l'imbarcazione sulla presenza di un Neointima (sì o no) (Figura 3C).
NOTA: le navi senza lamina elastica interna ben definita in combinazione con occlusione (spesso eccentrico) luminale sono definiti come lesioni neointimale.
) usando 
. 
. 
. 
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Representative Results
Risultati rappresentativi sono presentati nella Figura 4. I risultati presentati mostrano caratteristiche di MCT + FLOW nei ratti di Lewis nei seguenti gruppi: controllo (n = 3), MF8 (n = 5), MF14 (n = 5), MF28 (n = 5), e MF-RVF ( n = 10). Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il one-way ANOVA con correzione di Bonferroni.
60 mg / kg MCT e aumenta polmonare vantaggio il flusso di sangue ad un aumento medio del giusta pressione sistolica ventricolare (SRVP) (23 ± 6 a 56 ± 11 mmHg), pressione sistolica arteriosa polmonare (SPAP) (20 ± 4 a 54.0 ± 10 mmHg ), e media pressione arteriosa polmonare (mPAP) (16 ± 3-36 ± 4 mmHg) a 28 giorni (MF28). Rimangono altrettanto elevato fino alla fase in cui il fallimento del ventricolo destro sviluppa (MF-RVF) (Figura 4). Nelle fasi iniziali di IPA (MF8 e MF14), si osserva alcun aumento SRVP, SPAP, e mPAP. PAP diastolica e destra unaumento della pressione di prova nelle fasi tardive, ma non in modo significativo. pressioni cuneo non cambiano significativamente durante la progressione della malattia.
Il ventricolo destro del ventricolo-a-sinistra e del setto rapporto peso aumenta in modo significativo da MF14 a MF-RVF, indicando ipertrofia ventricolare destra. rapporto peso umido a secco del fegato è significativamente aumentata in fase di MF-RVF, indicando l'edema del fegato e insufficienza ventricolare destra congestizia.
Muscolarizzazione dei vasi intra-acinare <50 micron aumenta progressivamente durante la progressione PAH. Le navi di queste dimensioni di solito non hanno un livello mediale muscolare in ratti di controllo. A MF14, quasi la metà di questi vasi (43 ± 17%) ha un supporto muscolare totale (come in Figura 3B). A MF28 e MF-RVF, quasi ogni arteriole si muscularized (98,7 ± 2,5% e il 100 ± 0%). lesioni neointimale prima si verificanoa MF21, mentre a MF28 e MF-RVF, circa il 65% di tutti arteriole hanno uno strato neointimale (come in Figura 3C). Il rapporto e occlusione da parete a lume punteggi arteriolare sia aumentare in modo significativo da MF14 a MF28 (rispettivamente 10.4 ± 3,9-71,5 ± 30 (con: 7.1 ± 0.2) e 20,0 ± 2,8 a 54,7 ± 10,6 (con: 12.2 ± 0.3) ). Le caratteristiche emodinamiche e istomorfologici di progressione PAH in MCT + Portata in ratti Wistar sono simili 14.
Figura 1. Rappresentazione schematica del aorto-cavale Chirurgia Shunt. A) L'aorta viene teso e bloccato superiore al sito di inserimento. La vena cava inferiore è compresso al sito di inserimento. L'ago, piegata a 45 ° e con l'orifizio verso l'esterno, viene inserito in aorta con un angolo di 90 °. B) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Procedura cateterismo cardiaco destro e curve di pressione rappresentativi. A) La vena giugulare destra è tesa con una legatura e registrato sulla maschera di ventilazione. Il catetere viene inserito nella vena giugulare. B) Un monitor posto letto visualizzazione di un diritto un'onda di pressione ventricolare. C) Il catetere all'interno della cannula collocato nell'atrio destro dopo introduzione nella vena giugulare destra. In basso: una tipica un'onda di pressione atriale destra. D) Il catetere all'interno della cannula posizionato nel ventricolo destro. In basso: un tipico ventricul destraar onda di pressione in stadio terminale PAH. E) Il catetere viene fatto avanzare nella cannula per inserire l'arteria polmonare principale. In basso: una tipica un'onda di pressione arteriosa polmonare. F) Il catetere viene fatto avanzare nelle arterie polmonari fino a visualizzare un'onda di pressione cuneo sul monitor. In basso: una tipica un'onda di pressione di cuneo polmonare. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. vascolare Morfologia e Morfometria in controllo e PAH Ratti. A) Un normale, nave non muscularized con un punteggio di occlusione del 3,7%. B) Un arteriole totalmente muscularized con un punteggio di occlusione del 24,3%. C). Una lesione neointimale con un punteggio di occlusione del 54,1%. D) E) La misurazione della superficie totale nave e luminale (in un recipiente con una rappresentazione schematica di una lesione neointima), compresi i calcoli. Le barre rappresentano 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Rappresentante dei risultati di polmonare Emodinamica e Vascolare Morfologia / Morfometria. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il one-way ANOVA con correzioni di Bonferroni. I valori sono rappresentati come media ± SEM. con: controllo; MF (monocrotalin + flusso); RVF: insufficienza ventricolare destra; s: sistolica; D: diastolica; m: media; RVP: la pressione del ventricolo destro; PAP: pulmonarpressione arteriosa y; RAP: pressione atriale destra. RV: ventricolo destro; LV: ventricolo sinistro; IVS: setto interventricolare; BW: peso corporeo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo metodo descrive la procedura chirurgica di uno shunt aorto-cavale nei ratti pre-trattati con MCT per creare PAH indotto dal flusso e le tecniche per valutare il principio emodinamico e punti finali istopatologici che caratterizzano PAH e questo modello.
I passaggi critici all'interno del protocollo e risoluzione dei problemi
Chirurgia e post-operatorio. Durante l'intervento shunt aorto-cavale, la fase più critica è la dissezione dell'aorta e vena cava. Le membrane che racchiudono l'aorta e vena cava deve essere sezionato sufficiente a creare 1) buona visibilità della zona aortica, dove verrà inserito l'ago, e della posizione dell'ago nella vena cava dopo l'inserimento e 2) lo spazio sufficiente per bloccare l'aorta sopra del sito di inserimento. Le stesse membrane, tuttavia, sono utilizzati anche per condurre il sangue aortico attraverso il sito di puntura tra i due vasi (Figura 1). Analisi dei membrane troppo saràcausare lo shunt a perdere. colla tessuto può risolvere il perdite, ma può poi penetrare anche nel shunt, compromettendo la sua dimensione. Quando la colla ha limitato flusso attraverso lo shunt o uno dei vasi, la colla può essere rimosso delicatamente, ma rottura della vena cava o delle membrane tale comportamento può verificarsi shunt. La dimensione o adeguatezza del shunt può essere stimata confrontando la differenza di colore e il grado di turbolenza del sangue nella vena cava durante la compressione e decompressione dell'aorta prossimale con un tampone di cotone.
Un ago 18-G è stato dimostrato per creare uno shunt adeguata che si traduce in una forma coerente e riproducibile di PAH progressione a Lewis (questo articolo) e Wistar (vedi riferimento 14) ratti e di ventricolo destro sovraccarico di volume 15. Un ago 18-G creato shunt più equilibrato, un significativo aumento del flusso polmonare da un lato e un tasso di complicanze post-operatorio partire dall'altro. Il problema post-chirurgica più comune è la perdita di peso. La perdita di peso fino al 10% in 1 settimana si verifica in tutti i ratti dopo l'intervento chirurgico, presumibilmente a causa di assunzione inferiore i primi giorni dopo l'intervento chirurgico. I ratti sono sacrificati quando la perdita di peso supera il 15% in 1 settimana, in quanto questo è considerato un segno di malessere. chow liquido può migliorare l'alimentazione nella prima settimana dopo l'intervento. complicanze postoperatorie rare sono posteriori della gamba paralisi e intestino ischemia, che si traducono anche in eutanasia. In totale, meno del 5% dei ratti dovevano essere eutanasia postoperatorio.
Cateterismo. Passaggi critici durante il protocollo di cateterizzazione iniziano con la regolazione di anestesia. La profondità dell'anestesia dovrebbe essere come minimo possibile (1,5 - 2% isoflurano in questo protocollo), come un aumento della profondità dell'anestesia sembra diminuire del ventricolo destro e la pressione arteriosa polmonare, soprattutto nei ratti con insufficienza ventricolare destra. Misurazioni hanno la tendenza a become inaffidabili quando il protocollo supera i 20 minuti di durata.
Il prossimo passo critico è la manipolazione del catetere nel RV e nell'arteria polmonare principale. Questo può essere difficile. Lavaggio del catetere può aiutare a curvare il catetere nel tratto di efflusso quando la punta è bloccato in trabecole del camper. La manipolazione stessa può causare discinesia RV, che mostra curve di pressione irregolari sul monitor al posto letto. L'introduzione del catetere nel ventricolo destro e l'arteria polmonare dovrebbero funzionare senza problemi. Quando la punta si blocca alla valvola polmonare, una resistenza si fa sentire. Premendo attraverso questa resistenza può causare la valvola polmonare alla rottura, che limita l'affidabilità delle misurazioni successive.
Nel presente protocollo, i ratti vengono sacrificati dopo la procedura di cateterizzazione. In teoria, tuttavia, la vena giugulare e ferita chirurgica può essere chiuso dopo il catetere viene estratto, come animali possono vivere soloil restante sinistra vena giugulare.
Morfometria. Nella valutazione di spessore della parete vascolare e di occlusione colonne sonore, la fase più critica è quello di identificare le lamine elastiche. Per esperienza, la probabilità di successo a tal fine è la più grande con una Verhoeff o Elastica-van Gieson colorazione ben differenziato. Mentre il lume di solito può essere individuate facilmente dalla intima (per misurare la zona vascolare interna), la distinzione dei media dal avventizia può richiedere uno sguardo più da vicino (per misurare l'area vascolare esterna). Alcuni protocolli misura intimale e spessore mediale separatamente, definendo l'intima come strato tra il lume e la lamina elastica interna, e la media come strato tra la lamina elastica interna ed esterna. Questo è di solito possibile in fase iniziale MCT + FLUSSO PAH. Tuttavia, arteriole in stadio avanzato della malattia, in particolare lesioni neointimale, può visualizzare più lamine elastiche e spesso perdono l'integrità delle lamine elastiche ( Vantaggi e limiti di aggiungere il flusso come un trigger L'uso di aumento del flusso sanguigno polmonare per creare PAH nei ratti ha diversi vantaggi, il più importante è che si tratta di una nota (patologica) di attivazione fisiologica per la malattia, che favorisce traduzione di umano PAH-CHD (fisiologia di Eisenmenger), ma anche ad altre forme di PAH 9. Il modello consente la regolazione della portata variando la dimensione dell'ago durante la creazione del AC-shunt. in huuomo PAH-CHD, la chiusura dello shunt porterà alla inversione della PAH nella fase precoce della malattia, ma alla progressione di IPA negli stadi avanzati della malattia. Chiusura dello shunt in vivo permetterebbe uno per studiare l'effetto della rimozione del grilletto in diversi momenti di progressione della malattia e quindi di studiare i meccanismi di (non) inversione di PAH. Purtroppo, al momento, la chiusura dello shunt non è fattibile nel modello corrente. Gli effetti emodinamici normalizzazione (ad esempio, la rimozione di eccesso flusso e la normalizzazione della pressione arteriosa polmonare) in ratti con PAH flusso associati possono essere studiati da trapianto del polmone sinistro interessata in un topo destinatario con normale circolazione. È stato precedentemente dimostrato che la normalizzazione emodinamica, in ratti di trapianto di polmone e umano PAH-CHD chiusura di uno shunt cardiaco, porta alla regressione dell'ipertrofia mediale in fase iniziale PAH 21. Gli effetti di emodinamica normalezazione in fase avanzata di sperimentazione flow-PAH sono attualmente sconosciute. Rilevanza rispetto ai modelli alternativi Il modello MCT singolo-hit. Una iniezione sottocutanea di 60 mg / kg MCT è un modo semplice ed efficace per creare un modello di ipertensione polmonare nei ratti. MCT induce danno cellulare arteriosa polmonare endoteliale, seguita da ipertrofia dello strato muscolare delle arterie polmonari 5. Anche se i meccanismi esatti rimangono poco chiari, vari percorsi e fattori di crescita sono stati identificati che partecipano mediale ipertrofia seguente MCT. intervento farmaceutico su questi percorsi è spesso riusciti a ridurre l'ipertrofia mediale e mPAP in MCT-ratti. Tuttavia, poiché l'ipertrofia mediale è noto per avere una naturale tendenza a invertire nell'uomo 3 ed è stato anche descritto per invertire spontaneamente in MCT-ratti 16, l'effetto di questi trattamentidovrebbe essere valutato in modo critico. La MCT + FLOW modello doppio-hit. L'aggiunta di un aumento nel sangue polmonare flusso di 7 giorni dopo l'iniezione MCT altera in modo critico la (vascolare) fenotipo in maniera caratteristica a tempo-dipendente. A MF14 (7 giorni dopo l'induzione di un aumento del flusso), le navi che normalmente non muscularized iniziano a sviluppare uno strato mediale muscolare. A MF21, le mediale aumenta lo spessore e le prime lesioni si verificano neointimale. A MF28, uno strato neointima è sviluppata nella maggior parte dei vasi. Tra MF28 e MF35, la maggior parte dei ratti sviluppano insufficienza cardiaca destra e muoiono delle sue sequele. Precedenti studi su ratti flusso MCT + hanno mostrato che l'aggiunta di flusso MCT porta all'attivazione di specifici cluster di geni. In alcuni cluster, flusso contrario gli effetti indotti da MCT; in altri, il flusso maggiore di questi effetti, e un cluster conteneva i geni che sono stati specificamente up-regolati dopo che il flusso 17. Uno di questi geni specifici del flusso è lala crescita precoce risposta-1 gene 14 (Egr-1). L'inibizione precoce di Egr-1 ha portato alla attenuazione della PAH e formazione neointimale nei ratti di flusso 18 MCT +. Egr-1 è stato anche associato con neointima rimodellamento a PAH umana (PAH-CHD e PAH idiopatica) 19. Queste osservazioni aggiungono agli elementi di prova che l'aumento o disturbato flusso polmonare è un trigger essenziale per la formazione neointimale. Il modello single-hit flow-only. Nei ratti con uno shunt aorto-cavale senza MCT-iniezione, ipertensione polmonare (mPAP> 25 mmHg) si sviluppa tra 10 e 20 settimane dopo l'induzione shunt 20. A 20 settimane, l'istologia vascolare polmonare è dominato da ipertrofia mediale delle arterie pre-acinose e neo-muscolarizzazione delle arteriole intra-acinar. Sebbene alcune lesioni neointima sono stati descritti in questo modello 20, lo sviluppo di queste lesioni bisogno t o essere confermati e quantificati. Il modello Sugen-ipossia. Un altro modello comune per la PAH con lesioni neointimale è il Sugen5416-ipossia (SuHx) ratto. blocchi Sugen5416 il recettore fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF). Questo induce danno cellulare endoteliale e una cascata di segnali che, in combinazione con ipossia, evoca endoteliale apoptosi e la proliferazione 22. Dopo l'iniezione Sugen5416, il ratto viene posto in una camera ipossica per 4 settimane, su cui PAH sviluppa. Il ratto viene poi ri-esposto al normossia per 4 settimane. Composti farmacologici che hanno come target endoteliali apoptosi-resistenza o le cascate di segnalazione del TGF-B e BMP hanno dimostrato il potenziale di invertire le lesioni neointima in questo modello 23, 24, 25. Una nuova variante del modello SuHx è il modello Sugen-pneumectomy, che si traduce anche in una grave ipertensione arteriosa polmonare con lesioni neointimale > 26. Tuttavia, questo modello non è stato ancora completamente caratterizzato. Un metodo genetico innovativo per indurre PH in ratti comporta una mutazione nel BMP-recettore-2 gene, che si traduce in muscolarizzazione significativa (PH) ma senza formazione di neointima (PAH) 27. Sono stati riportati risultati paragonabili per quanto riguarda il numero di lesioni neointimale e il grado di occlusione del lume nel terminali di SuHx greggia e MCT + ratti flusso 28. Le principali differenze tra i due modelli sono: 1) che il mPAP in MCT + flusso aumenta progressivamente, mentre in SuHx, il mPAP ha dimostrato di diminuire gradualmente dopo ri-esposizione a normossia 28; 2) che il modello + flusso MCT conosce una fase precoce della malattia, caratterizzata da ipertrofia mediale e disfunzione endoteliale; 3) che il tempo necessario entrambi i modelli per raggiungere un fine-fase in cui insufficienza ventricolare destra inizia a svilupparsi (4 settimane in MCT + flusso, 8 settimane in SuHx)ef "> 28 è diverso; e 4) che Sugen5416 interferisce in un percorso molecolare (VEGF), il cui ruolo nella patogenesi della PAH è ancora chiaro Questo può ostacolare la traduzione di PAH umana.. Applicazioni o Direzioni future Le fasi della malattia distinte del modello di flusso MCT + permettono 1) per testare i meccanismi di progressione della malattia (tessuti umani, in generale, è disponibile solo post mortem o le procedure di espianto) e 2) per testare interventi in diverse strategie. Una strategia preventiva potrebbe essere iniziata la costruzione dello shunt (MF7). Un intervento precoce può essere iniziato con MF14. Questo può essere rilevante come una strategia di trattamento prima di smistare la chiusura nei bambini con uno shunt cardiaco congenito e PAH associata che ha progredito nella zona grigia tra la malattia reversibile e irreversibile. strategie di inversione possono essere avviate a MF21 MF28 o. Le fasi successive entrambi mostrano lesioni neointimale, una manifestazione di stadio terminale della PAH. </ P> In conclusione, l'aggiunta di un aumento del flusso polmonare MCT nei ratti crea un modello di PAH progressiva e grave che imita sviluppo della malattia umana. Il cateterismo cardiaco destro e la valutazione qualitativa e quantitativa del istopatologia vascolare costituiscono i capisaldi della caratterizzazione della malattia in questo e altri modelli per la PAH.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shunt Surgery | |||
| Sterile surgical gloves | |||
| Duratears Eye ointment | Alcon | 10380 | |
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Histoacryllic tissue glue | B. Braun Medical | 1050052 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Safil 4-0 sutures violet resorbable | B. Braun Medical | ||
| 18 G needle | Luer | NN1838R BD | tip bent in 45 degrees orifice to the outside |
| Gauzes 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Temgesic Buprenorphine | RB Pharmaceuticals | 5429 | subcutaneous injection |
| Sodium Chloride 0.9% | |||
| Ventilation mask Rat | |||
| Scalple blade | |||
| Biemer clamp 18 mm, 5 mm opening | AgnTho | 64-562 | |
| Heat mat | |||
| Kocher Clamp | |||
| Shaving machine | |||
| Microscope | Leica | ||
| Right Heart Catheterization | |||
| Sterile surgical gloves | |||
| Eye ointment | Duratears | ||
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Gauzes 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Needle 20 G | Luer | Tip slightly bent to the inside | |
| Cannula 20 G | Luer | to introduce catheter, tip pre-formed in 20 degrees | |
| Silastic Catheter 15 cm long | 0.5 mm ball 2 mm from tip | ||
| Pressure transducer | Ailtech | ||
| Bedside monitor Cardiocap/5 | Datex-Ohmeda | ||
| Shaving machine | |||
| 10 mL Syringe | |||
| Sodium Chloride 0.9% | for flushing | ||
| Vascular Morphology | |||
| 50 mL Syringe | |||
| 4% Formaldehyde | |||
| 18 G cannula with tube | |||
| Verhoef staining kit | Sigma-Aldrich | HT254 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en®ion=US |
| Digital slide scanner | Hamamatsu | C9600 | |
| ImageJ | |||
| Elastic (Connective Tissue Stain) | Abcam | ab150667 | http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf |
References
- Hoeper, M. M., Bogaard, H. J., Condliffe, R., et al. Definitions and diagnosis of pulmonary hypertension. J Am Coll Cardiol. 62, D42-D50 (2013).
- Stacher, E., Graham, B. B., Hunt, J. M., et al. Modern age pathology of pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 186 (3), 261-272 (2012).
- Levy, M., Maurey, C., Celermajer, D. S., et al. Impaired apoptosis of pulmonary endothelial cells is associated with intimal proliferation and irreversibility of pulmonary hypertension in congenital heart disease. J Am Coll Cardiol. 49 (7), 803-810 (2007).
- Sakao, S., Tatsumi, K., Voelkel, N. F. Reversible or irreversible remodeling in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (6), 629-634 (2010).
- Gomez-Arroyo, J. G., Farkas, L., Alhussaini, A. A., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (4), L363-L369 (2012).
- Jones, J. E. Serial noninvasive assessment of progressive pulmonary hypertension in a rat model. Am J Physiol - Heart Circ Physiol. 283 (1), 364-371 (2002).
- Hoffman, J. I., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Pulmonary vascular disease with congenital heart lesions: Pathologic features and causes. Circulation. 64 (5), 873-877 (1981).
- van Albada, M. E., Berger, R. M. Pulmonary arterial hypertension in congenital cardiac disease--the need for refinement of the evian-venice classification. Cardiol Young. 18 (1), 10-17 (2008).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Borgdorff, M. A., Berger, R. M. The role of disturbed blood flow in the development of pulmonary arterial hypertension: Lessons from preclinical animal models. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 305 (1), L1-L14 (2013).
- Garcia, R., Diebold, S. Simple, rapid, and effective method of producing aortocaval shunts in the rat. Cardiovasc Res. 24 (5), 430-432 (1990).
- Okada, K., Tanaka, Y., Bernstein, M., Zhang, W., Patterson, G. A., Botney, M. D. Pulmonary hemodynamics modify the rat pulmonary artery response to injury. A neointimal model of pulmonary hypertension. Am J Pathol. 151 (4), 1019-1025 (1997).
- van Albada, M. E., Schoemaker, R. G., Kemna, M. S., Cromme-Dijkhuis, A. H., van Veghel, R., Berger, R. M. The role of increased pulmonary blood flow in pulmonary arterial hypertension. Eur Respir J. 26 (3), 487-493 (2005).
- Brittain, E. Echocardiographic assessment of the right heart in mice. JVis Exp. (e81), (2013).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Molema, G., et al. Egr-1 expression during neointimal development in flow-associated pulmonary hypertension. Am J Pathol. 179 (5), 2199-2209 (2011).
- Borgdorff, M. A., Bartelds, B., Dickinson, M. G., Steendijk, P., de Vroomen, M., Berger, R. M. Distinct loading conditions reveal various patterns of right ventricular adaptation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (3), H354-H364 (2013).
- Ruiter, G., de Man, F. S., Schalij, I., et al. Reversibility of the monocrotaline pulmonary hypertension rat model. Eur Respir J. 42 (2), 553-556 (2013).
- van Albada, M. E., Bartelds, B., Wijnberg, H., et al. Gene expression profile in flow-associated pulmonary arterial hypertension with neointimal lesions. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (4), L483-L491 (2010).
- Dickinson, M. G., Kowalski, P. S., Bartelds, B., et al. A critical role for egr-1 during vascular remodelling in pulmonary arterial hypertension. Cardiovasc Res. 103 (4), 573-584 (2014).
- van der Feen, D. E., Dickinson, M. G., Bartelds, M. G., et al. Egr-1 identifies neointimal remodeling and relates to progression in human pulmonary arterial hypertension. Jheart lung transplant. 35 (4), 481-490 (2016).
- Rungatscher, A. Chronic overcirculation-induced pulmonary arterial hypertension in aorto-caval shunt. Microvasc Res. 94, 73-79 (2014).
- O'Blenes, S. B., Fischer, S., McIntyre, B., Keshavjee, S., Rabinovitch, M. Hemodynamic unloading leads to regression of pulmonary vascular disease in rats. J Thorac Cardiovasc Surg. 121 (2), 279-289 (2001).
- Sakao, S., Taraseviciene-Stewart, L., Lee, J. D., Wood, K., Cool, C. D., Voelkel, N. F. Initial apoptosis is followed by increased proliferation of apoptosis-resistant endothelial cells. FASEB J. 19 (9), 1178-1180 (2005).
- Spiekerkoetter, E. FK506 activates BMPR2, rescues endothelial dysfunction, and reverses pulmonary hypertension. J Clin Invest. 123 (8), 3600-3613 (2013).
- Nickel, N. P., Spiekerkoetter, E., Gu, M., et al. Elafin reverses pulmonary hypertension via caveolin-1-dependent bone morphogenetic protein signaling. Am J Respir Crit Care Med. 191 (11), 1273-1286 (2015).
- Meloche, J., Potus, F., Vaillancourt, M., et al. Bromodomain-containing protein 4: The epigenetic origin of pulmonary arterial hypertension. Circ Res. 117 (6), 525-535 (2015).
- Happé, C. M. Pneumonectomy combined with SU5416 induces severe pulmonary hypertension in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 310 (11), L1088-L1097 (2016).
- Ranchoux, B., Antigny, F., Rucker-Martin, C., et al.
- de Raaf, M. A. SuHx rat model: Partly reversible pulmonary hypertension and progressive intima obstruction. Eur Respy J. 44 (1), 160-168 (2014).
- Elastic (Connective Tissue Stain) Instructions for Use. , Available from: http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf (1506).
