Abstract
enfermedad isquémica del corazón (EIC), o síndrome coronario agudo (SCA), es una de las principales causas de muerte en los Estados Unidos. IHD se caracteriza por la reducción del suministro de sangre al corazón, lo que resulta en la pérdida de oxígeno a y de la necrosis subsiguiente del músculo del corazón. El modelo MI ha ganado popularidad para su uso como un modelo de isquemia-reperfusión a corto plazo y un modelo de ligadura permanente a largo plazo. A continuación, se describe un método fiable para la ligadura permanente de la LAD. Con el ratón tecnología de ingeniería genética cada vez más avanzada, y con un aumento de la disponibilidad de instrumentos quirúrgicos murinos de calidad, el ratón se ha convertido en un modelo popular para cirugías MI. Nuestro modelo quirúrgico incorpora el uso de un anestésico fácilmente reversible para la rápida recuperación del ratón; una intubación endotraqueal mínimamente invasiva sin la participación de una traqueotomía; y una toracentesis a través del sitio toracotomía original sin crear una incisión adicional en el pecho, como eshecho en algunos otros métodos, para eliminar eficazmente el exceso de sangre y el aire de la cavidad torácica. Este método es relativamente menos invasivo que otros métodos, lo que reduce drásticamente las complicaciones y mortalidad quirúrgicas y post-quirúrgicos y mejora la reproducibilidad.
Introduction
Enfermedad coronaria, o ACS, es el evento cardiovascular más prevalente y será considerado la principal causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo en 2020 1. La causa de ACS es la presencia de una trombosis de miocardio debido a la ruptura de una placa aterosclerótica coronaria que bloquea o reduce el flujo de sangre al tejido del corazón 2. Por lo tanto, hay signos clínicos consistentes con la presencia de isquemia miocárdica aguda, tales como infarto de miocardio (MI) 3, 4. MI conduce a una pérdida de masa de los cardiomiocitos y una progresión de la remodelación ventricular patológica, que puede conducir a la disfunción ventricular e insuficiencia cardíaca 5, 6.
Una de las maneras más eficaces para el estudio de la CI ha sido para imitar el infarto de miocardio humano en un modelo animal. Esto se consigue mediante la oclusión de la LAD enratones. Usando este modelo, se estudia cómo el corazón se puede proteger contra el daño resultante de la CI.
Durante la última década, los investigadores han pasado de utilizar modelos animales más grandes que los animales más pequeños, incluyendo el cambio de ratas a los ratones. El modelo de ratón más pequeño está empezando a ser preferido por muchas razones, incluyendo su pequeño tamaño, gran tamaño de la camada, de bajo coste de mantener, y período de gestación corto, así como para la disponibilidad expansiva de transgénicos y knockout de genes modelos 7. Aunque los ratones son de tamaño pequeño, nuevos instrumentos quirúrgicos diseñados específicamente para ellos han ayudado en este desarrollo. Nuestro método utiliza estos nuevos instrumentos quirúrgicos.
Mientras varios métodos implementan una traqueotomía invasiva, utilizamos un método menos invasivo de la intubación endotraqueal. El uso de la iluminación de arriba de la orofaringe, que intubar sin crear ninguna incisión, proporcionando una experiencia más segura y menos traumática para tque los animales. El ratón se coloca entonces en un ventilador y se mantuvo en isoflurano durante todo el procedimiento. Debido a la corta duración de la anestesia producida por la droga, que sólo lleva unos pocos minutos para que el animal se recupere de la anestesia, una vez que se interrumpe. Nuestro modelo quirúrgico también incluye una toracocentesis mínimamente invasiva. La cuidadosa eliminación de la sangre y el exceso de aire de la cavidad torácica usando toracentesis través de la incisión de toracotomía original ha abordado una complicación posoperatoria común de la ligadura de LAD: el neumotórax a tensión. Este método, que elimina la necesidad de las dos incisiones adicionales usados en otros métodos, uno para la traqueotomía y otro para los menos complicaciones post-quirúrgicas toracentesis-ha cedido y ha reducido drásticamente la mortalidad.
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Protocol
Este protocolo animal ha sido revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Hospital de Rhode Island.
1. La anestesia y la intubación
- Pesar el ratón para calcular la dosis de medicación para el dolor post-operatorio.
- Coloque el ratón en una cámara de inducción y entregar 4% de isoflurano para 9 - 10 min, seguimiento del animal a lo largo. A su vez en un esterilizador de cuentas caliente de modo que el aparato puede precalentar a aproximadamente 250 ° C. El precalentamiento se llevará a 15 - 20 min.
- Una vez que el ratón alcanza un plano profundo de la anestesia, con una tasa de respiración de aproximadamente 32 respiraciones / min, coloque el supina ratón en un tablero de espuma de poliestireno y el uso de una banda elástica asegurada bajo los incisivos superiores para mantener la boca abierta. Confirmar sedación mediante la realización de una pizca dedo del pie. Coloque un iluminador de alta intensidad por encima de la del ratón de manera que la orofaringe puede ser visualizado.
- El uso de fórceps curvos para abrir la mandíbula y otro parde fórceps para levantar la lengua fuera del camino. Asegúrese de intubar mientras posicionado en o ligeramente por debajo del nivel del ojo con el cuerpo del ratón. Se recomienda el uso de lupas quirúrgicas.
- Visualizar la apertura y cierre de las cuerdas vocales. Cuando está abierto, inserte un calibre 20, 1-en forma intravenosa (IV) de catéter con un introductor de aguja roma-tip. Utilice la aguja para guiar el catéter a la abertura de la tráquea, pero evitar la inserción de la aguja en la tráquea. Verificación de la correcta colocación se puede hacer usando una pipeta de transferencia de plástico.
- Transferir el ratón intubado a una superficie operativo equipado con un dispositivo de calentamiento. Conectar el ratón para un pequeño ventilador de roedores ajustado a un volumen de carrera de 150 l / carrera y una frecuencia de carrera de 130 carreras / min.
- Entregar 2,5% de isoflurano. Verificar la intubación mediante la comprobación de aumento de pecho bilateral. Verificar la anestesia mediante la realización de una pizca dedo del pie. El ratón puede necesitar 5 - 10 min en el ventilador para convertirse en completamente anestesiado.
- Tape abajo del tubo de intubación en el lugar de conexión entre el ventilador y el catéter IV. Pegue las extremidades. Colocar gotas lubricantes estériles en los ojos.
- Recorte el lado ventral izquierdo del tórax con una maquinilla de afeitar eléctrica. Polvo de la piel afeitada con toallitas secas y aplicar una pequeña capa de crema de eliminación de pelo usando un bastoncillo de algodón estéril. La crema debe permanecer en contacto con los folículos pilosos de aproximadamente 30 - 45 s.
- Mientras que los procesos de crema, colocar tres hisopos de algodón estériles en tres tubos de 1,5 ml llenos con Betadine en remojo. El uso de toallitas humedecidas con agua destilada, suavemente limpie la crema y de la piel.
- Limpiar el campo quirúrgico tres veces, alternando Betadine y 70% almohadillas isopropanol preparación estériles, limpieza en un movimiento circular en movimiento desde el centro a la periferia. Coloque un paño estéril con un agujero del tamaño de la cuarta parte sobre el campo quirúrgico del ratón.
- Limpiar el área que rodea el MOUe con 70% de etanol. Verificar la anestesia, una vez más con una pizca dedo del pie.
3. Ligadura LAD
- Coloque los instrumentos quirúrgicos en autoclave en esterilizador de cuentas caliente precalentado a 250 ° C durante aproximadamente 20 s. Coloque los instrumentos esterilizados en autoclave paño quirúrgico estéril. Don guantes quirúrgicos.
- El uso de fórceps de punta fina para levantar suavemente la piel en un punto aproximadamente 5 mm a la izquierda del cartílago xifoides prominente. Use un escalpelo quirúrgico con una hoja No. 10 para crear una incisión vertical en la piel desde este punto hacia arriba, al nivel del manubrio.
- El uso de fórceps curvos para separar suavemente las capas de piel y músculo. Abra la capa muscular, después de la incisión de la piel. Inserte dos 5-0 suturas de polipropileno a través de la capa muscular, una a cada lado de la incisión, y asegurar las suturas temporalmente con abrazaderas para sujetar la capa muscular abierta.
- Identificar y hacer una incisión en el tercer espacio intercostal, a raíz de laángulo natural de la caja torácica. Retire la cinta de los extremos izquierdo del ratón y asegurar su pata trasera izquierda a la pata trasera derecha con cinta adhesiva. Cortar una pieza de cinta más larga y asegurar su pie delantero izquierdo a la superficie de mando en una posición ligeramente elevada. Limpiar los guantes con etanol al 70%.
- Utilice un retractor para extender suavemente separar las costillas 3 ° y 4 °. Cortar una pequeña sección de una gasa estéril, aproximadamente 1 en x ½ en, y la inmersión en solución salina estéril al 0,9%. Exprima el exceso de solución salina y el uso de fórceps para insertar suavemente la gasa contra el pulmón izquierdo para evitar daño pulmonar accidental durante el procedimiento.
- eliminar suavemente el pericardio delgada con fórceps.
- Tear una pequeña cantidad de algodón de un bastoncillo de algodón estéril y rodar en una pequeña bola. Sumergir esta bola de algodón en solución salina estéril al 0,9% y limpiar suavemente sobre la superficie del corazón para apreciar las arterias. Empuje suavemente la aurícula izquierda hacia arriba y localizar las arterias coronarias bajoNeath.
- Identificar la LAD y pasar una sutura 8-0 nylon bajo la LAD; completa dos tiros para asegurar la ligadura. Si la ligadura se realiza correctamente, el ventrículo izquierdo distal de la voluntad Blanch ligadura.
- El uso de pinzas, retire la gasa insertado anteriormente, y después eliminar suavemente el retractor. Insertar un 6-in, tubo flexible de calibre 25 unida a una aguja de calibre 25 en la cavidad torácica a través de la abertura de toracotomía. Avanzar en aproximadamente 1 - 2 en de tubo en el espacio por encima del pulmón izquierdo. Devolver el ratón a una posición supina y limpiar los guantes con etanol al 70%.
- Usar 5-0 suturas de polipropileno en un patrón interrumpido sencilla para cerrar la caja torácica, manteniendo el tubo en el pecho en su lugar. Retire las dos suturas que sostienen la capa muscular abierta. Usar 5-0 suturas de polipropileno en un patrón continuo sencilla para cerrar la capa de músculo, de nuevo manteniendo el tubo en el pecho en su lugar.
- Adjuntar una jeringa de 1 ml a la aguja de calibre 25 en el tubo de pecho. Tire suavemente hacia arriba en el pasor mientras que la extracción simultáneamente gradualmente el tubo en el pecho de la cavidad torácica con fórceps. Extraer el tubo lentamente, ya que este paso elimina el exceso de aire y la sangre, que se convertiría atrapada de otro modo en la cavidad torácica y el resultado en un neumotórax.
- Una vez que la jeringa está llena, separar la jeringa de la aguja y eliminar los residuos en un vaso de precipitados de residuos o fregadero. Continuar este proceso hasta que el tubo de drenaje torácico está completamente extraído. Asegúrese de que el pecho está cerrado herméticamente.
- Disminuir el isoflurano al 1,5%. Cierre la piel con 4-0 suturas de polipropileno en un patrón interrumpido simple. Gire el vaporizador de isoflurano fuera.
- Administrar 0,1 mg / ml de buprenorfina en 0,9% de solución salina a través de una inyección intraperitoneal (IP). Tópicamente aplicar 2 mg / ml de lidocaína con 2 mg / ml de bupivacaína en 0,9% de solución salina a la incisión. Administrar entre 200 - 500 l de 0,9% de solución salina a través de una inyección subcutánea, la ampliación de la cantidad de solución salina al peso del ratón.
- Esperar 5 min después de administering los medicamentos para el dolor para eliminar el ratón desde el tubo de intubación. Esto ayuda en la transición fuera del ventilador.
- Si el ratón no tiene un aumento de pecho bilateral vez apagado el ventilador, realice la descompresión de la aguja. Para ello, introducir una aguja estéril de calibre 25 y una jeringa de 1 ml entre las nervaduras 3 y 4 de hasta que entra en la cavidad torácica, indicada por una disminución repentina en la resistencia. Tire hacia arriba suavemente el émbolo para eliminar el exceso de aire.
- Cuando el ratón demuestra una tasa de respiración bilateral adecuada y la profundidad y responde a una pizca dedo del pie, colocar el ratón en una jaula de recuperación limpio bajo una lámpara de calor. Proporcionar el ratón con alimentos húmedos y una botella de agua, el seguimiento en una campana de flujo laminar para 15 - 20 min. Monitor para un esfuerzo exagerado para respirar, sangrado excesivo, o de otras complicaciones potencialmente mortales.
- Durante los siguientes tres días, administrar 0,1 mg / ml medicamentos para el dolor de buprenorfina a través de una IP enJection dos veces al día. Monitorear el ratón diaria.
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Representative Results
Los ratones se sacrificaron los veintiocho días después de la cirugía, y los corazones se cosechan y se examinaron. Los ratones se anestesiaron con 50 - 75 mg / kg de ketamina y de 5 - 10 mg / kg de xilazina. Cuando el animal está bajo anestesia adecuada, se abre la cavidad torácica, y utilizando una aguja de calibre 23, cloruro de potasio frío (KCL, 30 mM) se inyecta en la región basal posterior del corazón. El corazón es detenido en la diástole. Para una validación adicional de la ligación, el corazón se retira del animal y se inyecta con 4% de paraformaldehído y luego 1% de colorante azul de Evan. La Figura 1 muestra la falta de azul de Evan en el ventrículo izquierdo isquémico. La figura 2 muestra una configuración adecuada intubación endotraqueal. La Figura 3 muestra la colocación del tubo en el pecho para la toracentesis en el sitio de la incisión inicial, con la capa muscular suturado cerrado alrededor del tubo antes de la extracción de aire de la ccavidad Hest. Tinción con tricromo muestra un aumento de colágeno en la región infartada (Figura 4).
Figura 1: Inyección azul de Evan. inyección de azul de Evans revela una falta de colorante en el tejido isquémico, localizado en la región infartada ventrículo izquierdo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La intubación endotraqueal. Demostración de una configuración adecuada intubación endotraqueal. El operador, el uso de lupas quirúrgicas, está sentado a nivel del ojo con el ratón. Un iluminador de alta intensidad se enfoca hacia abajo sobre la región traqueal, transiluminación la juntaropharynx. Una banda elástica se engancha detrás de los incisivos superiores, lo que permite que el operador abra la boca con las pinzas curvas. Las pinzas curvas se utilizan para mantener la lengua hacia el lado para la visualización clara. Una cánula de intubación catéter intravenoso con un introductor de aguja de punta roma de punta se hace avanzar a un ángulo ligeramente hacia arriba, mientras que la apertura y cierre de las cuerdas vocales se visualiza. Visualización de las cuerdas vocales de apertura y cierre antes de que el intento de intubación es uno de los puntos críticos para una intubación exitosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Toracentesis. La colocación del tubo del pecho usado para toracentesis, insertado en el sitio de incisión original. La capa muscular se sutura cerrado alrededorel tubo antes de que el aire dentro de la cavidad del pecho se extrae con una jeringa, y luego se retira el tubo de pecho. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: tinción con tricromo. Panel izquierdo: Corazón de control, se ligó la no-LAD. Panel derecho:, corazón infartado LAD-ligado. Tinción tricrómica (Masson) empleando solución Biebrich scarlet-ácido fucsina, solución de ácido fosfotúngstico / fosfomolíbdico, y azul de anilina revela aumento de colágeno (azul) como un marcador para la fibrosis en la región infartada ventrículo izquierdo en sección transversal. Bar = 500 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Con un uso creciente del modelo de MI en los laboratorios, el procedimiento descrito busca aumentar la tasa de eficiencia y la supervivencia de los ratones y reducir al mínimo su dolor post-operatorio y el malestar. Este protocolo se esfuerza por minimizar la mortalidad al hacer numerosas mejoras en varios aspectos del procedimiento de LAD ligación. Hay algunas distinciones. Algunos estudios de intubación murinos que utilizan ketamina y xilacina junto con isoflurano para la inducción, debido a la ventaja de su mayor duración de la anestesia, han demostrado una mayor mortalidad 8. Nuestro método utiliza sólo isoflurano para la inducción, reduciendo en gran medida el potencial de complicaciones relacionadas con las drogas. Otro protocolo de LAD ligadura similares incluye una traqueotomía, produciendo un tiempo de recuperación prolongado y una mayor necesidad de formación precisa 9. El procedimiento se describe aquí utiliza un método no invasivo de la intubación endotraqueal, resultando en lower mortalidad y una mayor reproducibilidad de los resultados. También, en vez de sólo con una máquina de afeitar eléctrica, nuestro procedimiento también utiliza crema de depilación para la eliminación de la piel, proporcionando un completamente clara visualización del campo estéril en menos de 1 min.
Otra distinción clave es el reposicionamiento del ratón, que se produce después de, en lugar de antes, las incisiones iniciales. Hacer las incisiones mientras que el ratón está en decúbito supino permite una visualización más directa y precisa de puntos de referencia tales como el cartílago xifoides, resultando así en una mayor reproducibilidad de los resultados. Nuestro método también utiliza hisopos de algodón estériles en lugar de un Cauter para el sangrado de gestión, la disminución de las lesiones por quemaduras iatrogénicas y el riesgo de infección. Aparte de estas diferencias, la inserción del tubo torácico para la toracocentesis es especialmente de la nota, ya que nuestro método no implica la creación de una nueva incisión para el tubo. Más bien, consiste en insertar el tubo en una incisión anterior, de nuevo disminuyendo mortalidad. El procedimiento se describe también incluye: (1) el uso de un retractor, lo que permite una visualización más precisa y estable de las arterias coronarias; (2) la inserción de gasa estéril en la cavidad torácica durante el procedimiento, reduciendo así el riesgo de lesiones pulmonares iatrogénicas; y (3) la administración de solución salina después del procedimiento, que se ha demostrado que tanto acortar el tiempo de recuperación y prevenir la hipotermia.
Aunque se describe un modelo de ligadura permanente, este procedimiento también puede ser modificado para un modelo de infarto agudo de miocardio. El modelo de IM agudo, también descrito como la isquemia y la reperfusión, se refiere a 30 - 60 minutos de isquemia seguida de reperfusión en el tejido del corazón 7. Un método alternativo para evaluar el tamaño del infarto o el área en riesgo después de la isquemia y reperfusión es la tinción de cloruro de trifenil tetrazolio al 2% (TTC) 10. tinción de TTC se basa en la capacidad para teñir tejidos viables después de una lesión isquémicadebido a deshidrogenasas presentes en el tejido cardíaco. Estas enzimas convierten un componente soluble en un componente rojo insoluble, delineando de este modo la región infartada 11. El modelo de IM agudo puede imitar los mecanismos que se producen en la enfermedad de corazón humano y por lo tanto puede ser una herramienta útil para la elucidación de los eventos de isquemia miocárdica 10. La ligadura de LAD se puede verificar mediante la observación de un cambio inmediato en el color del tejido, proporcionando una ventaja para este método de inducción de un infarto de miocardio. Otro método para comprobar si la ligadura de éxito es el uso de electrocardiogramas, aunque esto implica el uso de un equipo costoso y puede no ser viable para todos los laboratorios.
Como se describió anteriormente, hay varias técnicas moleculares fácil y asequible para confirmar la ligación después de cosechar el corazón. Las dos técnicas que se muestran arriba son tinción de Azul de Evans y tricrómico de tinción. colorante azul de Evan se inyecta directamente en el arco de la aorta, indicando donde hay una falta de flujo sanguíneo. Este es un método rápido y eficiente empleado inmediatamente después de cosechar el corazón para probar si el modelo fue un éxito y para medir el grado de obstrucción coronaria. Para tinción con tricromo, el corazón debe ser seccionado y después se sometieron a inmunohistoquímica. Tinción con tricromo puede indicar áreas fibróticas post-isquémicas o zonas cardiacas afectadas por la isquemia crónica. La inyección de post-operatorio ratones 2 - 24 h antes del sacrificio con 5-etinil-2'-desoxiuridina (EDU), un análogo de timidina, es un método eficaz para indicar áreas de la replicación del ADN y la proliferación celular después de la isquemia, especialmente en estudios que implican la regeneración vascular 12.
En general, las limitaciones del estudio LAD ligadura incluyen la incidencia de la mortalidad post-operatorio, causada principalmente por la presencia de arritmias cardíacas, hemorragia y neumotórax. Un toracentesis efectiva, ingenioHout incisiones torácicas adicionales (descrito en el método actual), y el cuidado postoperatorio adecuada son necesarios para evitar la morbilidad y la mortalidad en los animales. El muy cuidadosa monitorización de la hipotermia postoperatoria también es crítica. La reducción en el número de cuello y pecho incisiones (para traqueotomía y toracocentesis) se describe en el método actual ayudará a mejorar las tasas de supervivencia. La evitación de anestésicos preoperatorios inyectables descritas en el presente documento también mejorará la recuperación post-operatoria de los animales.
Con el fin de obtener una alta reproducibilidad, el modelo LAD ligadura requiere un riguroso entrenamiento y experiencia. El operador tiene que realizar varias semanas de cirugías para obtener la capacidad de hacer reproducible infartos en los sitios deseados en el corazón. Formación y experiencia son dos factores críticos para el éxito de la cirugía de ligadura de supervivencia LAD.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-Intensity Light Source | Harvard Apparatus | 72-0215 | |
| SurgiSuite Operating Platform | Kent Scientific Corporation | SurgiSuite | Uses a rechargeable, battery-operated far infrared warming pad. Charge overnight before surgery. |
| SurgiSuite LED Lighting Kit | Kent Scientific Corporation | SURGI-5003 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Preheating takes 15 - 20 min. Instruments take 20 s to sterilize. |
| Small Rodent Anesthesia System | VetEquip Inc. | 901810 | |
| Isofluorane | Piramal Enterprises | 66794-017-10 | |
| Buprenorphine | Rhode Island Hospital Pharmacy | NDC 12496-0757-1, 12496-0757-5 | |
| Surgical Loupes | Roboz | RS-6687 | |
| Small Rodent Ventilator | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| Lubricating Drops | Thermo Fisher Scientific | 19-898-350 | |
| Electric Razor | Kent Scientific Corporation | CL 9990-1201 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Medical Tape | Thermo Fisher Scientific | 18-999-380 | |
| Betadine | Thermo Fisher Scientific | 19-027136 | |
| 70% Isopropanol Wipes | Thermo Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Surgical Drapes | Braintree | SP-TS | |
| Surgical Gloves | Thermo Fisher Scientific | 18999102D | |
| 5-0 Polypropylene Sutures | Ethicon | 8630G | |
| 8-0 Nylon Sutures | Fine Science Tools | 12051-08 | |
| Platinum-Cured Tubing | Harvard Apparatus | 72-1042 | 0.3 mm inside diameter x 0.6 mm outside diameter |
| 0.9% Saline | Thermo Fisher Scientific | 19-310-207 | |
| 4-0 Polypropylene Sutures | Ethicon | 8631G | |
| 1 CC Syringe with 25-Gauge Needle | Thermo Fisher Scientific | 14-826-100 | |
| Scissors | Kent Scientific Corporation | INSS600225 | |
| Forceps | Kent Scientific Corporation | INS700100 | |
| Cotton Swabs | Thermo Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| IV Catheter, 20-Gauge | Thermo Fisher Scientific | NC9892181 | |
| Retractor | Kent Scientific Corporation | INS 750369 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11003-12 | |
| Dissecting Forceps, Straight | Kent Scientific Corporation | INS 700101 | |
| Dissecting Forceps, Curved | Kent Scientific Corporation | INS 700103 | |
| Hemostatic Forceps, Straight | Kent Scientific Corporation | INS 750451 | |
| Hemostatic Forceps, Curved | Kent Scientific Corporation | INS 750452 | |
| Tissue Forceps | Kent Scientific Corporation | INS 700131 | |
| Needle Holder | Kent Scientific Corporation | INS 600109 | |
| Scissors | Kent Scientific Corporation | INS 600225 |
References
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