Summary
En protokoll for fastsettelse av relativ anti-apoptotisk aktiviteten til en anti-TNFα mAb en nøytralisering mekanisme med WEHI 164 celler er presentert her. Denne protokollen er nyttige for sammenligning nøytralisering styrken av ulike molekyler med samme biologiske funksjonalitet.
Abstract
Denne protokollen viser måling av apoptotisk aktivitet nøytralisering av TNFα i en mus fibroblast celle modell (WEHI 164) bruker en anti-TNFα mAb. I tillegg kan denne protokollen brukes til å vurdere andre anti-TNFα molekyler, som fusion proteiner. Mobilnettet modellen ansatt her er følsom for TNFα-mediert apoptose når en ekstra stressfaktor er indusert i celle kultur forhold (f.eks serum deprivasjon). Denne prosedyren eksemplifiserer hvordan du skal utføre denne analytisk analysen, utheving nøkkeloperasjoner knyttet til eksempel forberedelse, celle fortynning, apoptose induksjon og Spektrofotometri målinger som er avgjørende for å sikre vellykket resultater. Denne protokollen avslører de beste ytelse forholdene knyttet til apoptose induksjon og effektivt signal innspilling, fører til lav usikkerhet verdier.
Introduction
Biologiske styrke er kvantitative mål på biologiske aktivitet basert på de assayed produkt-attributtene som er knyttet til de relevante biologiske egenskapene, mens antallet (uttrykt i massen) er en mekanisk-måling av proteininnhold. Styrke tester, sammen med andre analytiske metoder, utføres som en del av produktet samsvar, stabilitet og sammenliknbarhet studier. I denne forstand, styrke mål som skal brukes til å vise at produktet grupper møte kritiske kvalitet attributtene (CQAs) eller akseptkriterier under alle faser av kliniske studier og etter markedet godkjenning.
Apoptose-programmert celledød, naturlig forekommende når celler er infisert med et virus, eller når cellene er stresset av et miljømessig faktor at kompromisser mobilnettet levedyktighet og funksjonen1,2. Blant annet er apoptose hemming, eller biologiske nøytralisering, en av de hovedsakelig kjent terapeutisk mekanismene av mAbs, spesielt i behandling av kroniske sykdommer, som immun-mediert inflammatoriske lidelser. Anti-TNFα molekyler utøve sitt terapeutiske egenskaper ved å blokkere samspillet av tumor nekrose faktor alpha (TNFα) med p55 og p75 celle overflate reseptorer3, dermed hindre signal trasé som til slutt fører til mobilnettet apoptose.
TNFα kan produsere betennelser i noen kroniske sykdommer4. TNFα utskilles spuriously i ekstracellulære miljøet av makrofager, som vaktposter det medfødte immunsystemet og de viktigste aktørene i denne typen sykdom5. Som en felles bane er TNFα dereguleringen forbundet med patogenesen av disse sykdommene. Uten kontroll og under konstant induksjon og celle stress induserer TNFα celle død og vev degenerasjon, slutt fører til revmatoid artritt, Crohns sykdom og andre patologisk profiler6.
TNF-antagonister som blokkerer samspillet mellom TNF og dens reseptorer har blitt stadig mer brukt som en effektiv terapi å redusere symptomer og hindre utviklingen av disse sykdommene. I dag, er anti-TNFα legemidler mye brukt til å kontrollere systemisk konsentrasjonen av denne cytokin, dermed hindre ytterligere degenerasjon av involvert vev. I denne forstand er å gi en reproduserbar og robust bioassay for å beskrive spesifikke evnen til et stoff å oppnå den biologiske effekten viktig.
I denne protokollen, kritisk trinn-identifisert under utviklingen av en nøytralisering analysen-for vellykket måling av biologiske styrke er uthevet, med særlig vekt på ferdigheter nødvendig for å utføre bio-analytiske metoden. Denne bio-analytiske metoden gir nyttig sammenlignbarhet informasjon mellom forskjellige bunker eller anti-TNFα legemidler sammenlignet med et klinisk testet referanse stoff.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av Media og løsninger
- forberede kultur medium: RPMI-1640 med 10% FBS, pH 7.4.
- Forberede analysen kultur medium: RPMI-1640 uten fenol rød, men med 1% FBS, pH 7.4.
- Forberede celle vaskeløsning: DPBS Mg - og Ca-free løsning med 0,02% EDTA, pH 7.4.
- Forberede celle avdeling løsning: 0,125% trypsin med 1 mM EDTA.
- Tine 100 mL en 0.25% løsning av trypsin-EDTA og overføre til en steril 500 mL kolbe.
- Blanding med 100 mL celle vask løsning og dispensere 15 mL dele inn 15 mL steril rørene. Butikken på 70 til-80 ° C før bruk.
- Filtrerer disse løsningene gjennom en 0.22-µm membran og varme opp til 37 ° C i minst 30 min før å bruke.
- Forberede apoptose-induksjon lagerløsning TNFα løsning på 3,3 µg/mL.
- Oppløse 20 µg av TNFα med 500 µL filter-steriliseres vann i sin primære beholder og bland fullstendig oppløsning.
- Overføre til en 15 mL steril rør og legge 5,5 mL DPBS Mg - og Ca-free løsning til dette røret. Bland forsiktig med en vortex blandebatteri.
- Aliquot løsningen i 70 µL deler. Dispensere hver aliquot 0,5 mL microtubes og butikk på-80 ° C.
- Forberede apoptose induksjon løsning: TNFα løsning på 40 ng/mL.
- Tine en aliquot av apoptose induksjon lager løsningen, rugende den i et vannbad på 25 grader i 10 min.
- Fortynne apoptose induksjon lager løsningen 40 ng/mL ved å legge til 61 µL 3.3 µg/mL TNFα løsning 4.939 mL analysen kultur medium i en 15 mL steril tube.
- Blanding av vortex mikser for 10 s, dette løsning må forberedes fersk før bruk.
- Varme opp løsningen på 37 ° C i minst 30 min før å bruke i th eneutralization analysen.
- Forberede substratløsningen: caspase 3/7 Glo løsning 7 , 8.
- Tine caspase buffer løsning (caspase 3/7 Glo buffer) 12t før bruk.
- La caspase buffer løsning og underlaget (caspase 3/7 Glo substrat) sitte separat på 25 ± 5 ° C i 30 min før blande.
- Overfør 10 mL av caspase buffer løsning til underlaget medisinglass og blanding av inversjon.
- Holde på 25 ± 5 ° C, lys-beskyttet før bruk.
Merk: Løsningen er stabil 6 h ved romtemperatur.
2. Culturing og Counting
- celle tining og første subkultur.
- Fjerne en flaske med WEHI 164 celler 9 fra fryser på-80 grader og overføre dem til en isbadet.
- Pipetter opp og ned med 1 mL av forvarmes kultur medium til frosne celler helt tine.
- Dispensere 9 mL forvarmes kultur medium på en 15 mL steril tube.
- Overføre celle suspensjon i 15-mL steril røret og bland forsiktig fem ganger av inversjon.
- Sentrifuge celle suspensjon på 125 x g for 3 min. Forkast nedbryting og disaggregate celle pellet.
- Legge til 5 mL av kultur medium til røret. Bland til cellene er helt resuspended.
- For celle opptelling, overføre 50 µL av cellen suspensjon til en 500 µL microtube og bland med 50 µL av 0,4% trypan blå. Telle celler og justere til 0,5 x 10 6 celler/mL. Se trinn 2.2, under.
- Legge til 13 mL forvarmes kultur medium i en 75 mL celle kultur kolbe.
- Dispensere nok celle suspensjon volum fra trinn 2.1.6 å oppnå 0.5 x 10 6 celler/mL i celle kultur flasken og ruge på 37 ° C og 5% CO 2 natten.
- Celle teller.
Merk: Se referanse 10.- Bruker løsningen fra trinn 2.1.6, overføre 0,05 mL til en hemocytometer og bestemme cellen tetthet under et mikroskop med trypan blå utelukkelse.
- Kvantifisere antall cellene og levedyktig.
- Juster celle suspensjoner til 0,5 x 10 6 celler/mL.
Formel 1
V kultur medium (mL) =
V kultur medium (mL) = (5 mL - V celle suspensjon)
V kultur medium (mL) = justert volumet av WEHI 164 celle suspensjon
NVC = antall levedyktig WEHI 164 celler/mL
V kultur medium (mL) = analysen kultur medium volum lagt til celle suspensjon å oppnå 0.5 x 10 6 celler/mL
0,5 x 10 6 = målet cellen tetthet
- Avdeling og andre og tredje subkultur.
Merk: Et system kan brukes å fjerne løsningene fra flasker. Engangs eller glass sterilt Pipetter kan brukes. Hvis pipette har bomull tette øverst, må den fjernes før bruk.- Fjerne kultur medium fra cellekultur T-kolbe ved hjelp av en 1 mL steril pipette og et vakuum.
- Dispensere 5 mL celle vask løsning i kulturen T-kolbe, bland forsiktig, og forkaste løsningen. Gjenta dette trinnet to ganger.
Merk: Fullstendig fjerning av kultur medium er avgjørende for effektiv celle løsgjøring. - Legge til 15 mL av cellen avdeling løsning T-flasken og la stå i 3 minutter i en inkubator på 37 ° C og 5% CO 2.
- Kontroller at tilknyttede cellene i kolbe indre veggen under mikroskopet. Fjerne celler fra kulturen T-flasken med en 20 mL steril pipette og dispensere dem inn i et 50-mL steril rør.
- Sentrifuge celle suspensjon på 125 x g for 3 min. Forkast nedbryting og resuspend pellets med en annen 5 mL kultur medium.
- Telle celler og legge nok kultur medium for å nå ønsket celle konsentrasjonen ifølge Formel 1.
- Legge denne suspensjon til 72 cm 2 T-kolbe og ruge over natten på 37 ° C og 5% CO 2.
- Subkultur cellene minst to ganger før du bruker dem i nøytralisering analysen. Gjenta trinn 2.3.1-2.3.8 for de neste to dagene.
- Analysen celle suspensjon.
- Velg en WEHI 164 subkultur som har minst tre går. Se trinn 2.1.
- Koble og telle celler etter trinn 2.2 og 2.3 av denne protokollen.
- Fortynne celle suspensjon etter Formel 1 til 0,5 x 10 6 celler/mL.
- Bruk denne mobilnettet suspensjon for nøytralisering analysen. Bland alle cellen suspensjoner av vortex blandebatteri før bruk.
3. Antistoff forberedelse og fortynninger
- kvantifisering av mAbs.
- Fastslå konsentrasjonen av referanse stoff, kontroll prøven og analytisk eksempel gjennom UV absorpsjon på 280 nm ved hjelp av deres masseutryddelse koeffisient (1.39) 11.
Merk: Opprinnelige konsentrasjoner kan hentes fra stoffet produktetiketter. Men dette må bekreftes av UV absorpsjon.
- Fastslå konsentrasjonen av referanse stoff, kontroll prøven og analytisk eksempel gjennom UV absorpsjon på 280 nm ved hjelp av deres masseutryddelse koeffisient (1.39) 11.
- mAb fortynninger.
- Dilute alle prøvene uavhengig i tre eksemplarer, med DPBS Mg - og Ca-free løsning i 2 mL microtubes, ned til 2 mg/mL. Bekrefte denne konsentrasjonen av UV absorpsjon i tre eksemplarer, bruker DPBS Mg - og Ca-free løsning samt blank.
- Blande lager protein løsninger for 5 s med en vortex mikser.
- Fortynne 100 µL av hver 2 mg/mL mAb løsning med 0.9 mL analysen kultur medium.
- Blanding for 5 s av vortex blandebatteri.
Merk: Disse løsningene har en konsentrasjon av 200 µg/mL. Fortynninger må gjøres for hver tre eksemplarer. - Fortynne 10 & #181; L hver 200 µg/mL mAb løsning med 0,99 mL analysen kultur medium. Miks for 5 s med en vortex mikser. Disse løsningene har en konsentrasjon av 2 µg/mL. Utføre føljetong fortynninger for hver tre eksemplarer før du bruker dem i nøytralisering analysen.
- Gjør anti-TNFα mAb fortynninger i tre uavhengige microplates. Lage en kopi fra hver uavhengige tre eksemplarer og dispensere dem i en microplate, som vist i tabell 1. Referanse stoff < tabell fo:keep-together.within-side = "1" fo:keep-med-next.within-side = "alltid" fo:text-align = "center" >
Plate 1 Plate 2 plate 3 Wells eksempel brønner eksempel brønner Sample B2:b11 Referanse stoff B2:B11 kontroll prøven B2:B11 analytisk Sample C2:C11 C2:C11 C2:C11 D2:D11 analytisk prøve D2:D11 Referanse stoff D2:D11 kontroll prøven E2:E11 E2:E11 E2:E11 F2:F11 kontroll prøven F2:F11 analytisk prøve F2:F11 Referanse stoff G2:G11 G2:G11 G2:G11 - Utføre mAb fortynninger av hver referanse, smake eller kontroll, som vist i tabell 2.
Merk: Anti-TNFα mAb konsentrasjonen beskrevet i denne tabellen er ikke de siste konsentrasjonene i nøytralisering analysen.
T stand 2: Anti-TNFα mAb fortynninger. Føljetong fortynninger av anti-TNFα mAbs er vist i denne tabellen. Siste konsentrasjoner beskrevet i denne tabellen er ikke konsentrasjonene i analysen, hvor anti-TNFα mAbs ble fortynnet med en faktor på 3 (mAb fortynning + kultur medium + celler suspensjon). Linjene i fet representerer fortynninger kommer fra linjene 3, 5, 7, 9 og 10; ikke-fet linjene representerer fortynning fra linjene 3, 4 og 6. Disse føljetong fortynninger gjøres bare før nøytralisering analysen. Må være forsiktig å blande av pipettering opp og ned tre ganger før utlevering av fortynninger.Plate kolonnen volum av analysen kultur medium (μL) volum av referanse stoff, analytiske prøve eller kontroll Eksempel (uL) konsentrasjon i analysen platen (ng/mL) 2 0 230 2000 3 150 150 fra linje 2 1000 4 75 75 fra linje 3 500 5 100 50 fra linje 3 333 6 75 75 fra linje 4 < td > 2507 75 75 fra linje 5 166 8 75 75 fra linje 6 125 9 75 75 fro m linje 7 83 10 75 75 fra linje 9 41 11 150 75 fra linje 10 13 - Holde platene på 25 ± 5 ° C før bruk.
4. Nøytralisering analysen med WEHI 164 celler
- blanding av vortexing alle celle suspensjoner (0,5 x 10 6 celler/mL) før utlevering på alle trinn i denne protokollen.
Merk: I denne delen, varme hver løsning på 37 ° C i 30 min før bruk. - Overføre 50 µL av cellen suspensjon til hver av 60 av microplates, flytte fra 2 til 11-kolonnen og linje B til G.
- Overføre 50 µL av mAb referanse, prøve og kontroll fortynninger i microplates. Følger mønsteret avbildet i figur 1.
- Legge til 50 µL av apoptose induksjon løsningen i hver brønn.
- Bruk cellular kontroller av 50 µL av WEHI 164 celler, utlevert i tre brønner. Få hver brønn til et endelig antall 150 µL med analysen kultur medium.
- Bruker en cytotoksisitet kontroll av en blanding av 50 µL WEHI 164 celler pluss 50 µL av apoptose induksjon løsning. Få hver brønn til et endelig antall 150 µL med analysen kultur medium.
- For TNFα kontroll, bruker 50 µL av apoptose induksjon løsningen og bringe den til 150 µL med analysen kultur medium.
- For tomt, bruker 150 µL av analysen kultur medium alene.
- Fylle de gjenværende brønnene med 150 µL av kultur medium å unngå plate fordampning virkninger.
- Gjennta punkt 4.1.1-4.1.9 to ganger i to andre microplates.
Merk: De mAb siste konsentrasjonene i microplate er: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 og 0.004 µg/mL. - Laste eksemplene i microplates, som vist i figur 1.
figur 1: disponeringen av prøvene i analysen platene. B1 til G11 er godt koordinater i microplates og beskriver plasseringen der eksempel fortynninger plasseres. Manglende koordinater er brønner fylt med kontroller og analysen kultur medium (A1-A12 og H1-H12). Tilfeldig distribusjonen av prøver (revers fortynninger i microplates) bidrar til å eliminere skjevhet i resultatene på grunn av fordampning av medium eller andre variabler. Det er best at hver microplate er gjort av en analytiker om gangen. R: referanse, S: eksempel CS: kontroll prøven, Dil: fortynning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. - Ruge tre plater på 37 ° C og 5% CO 2 for 16 ± 2 h.
- La caspase 3/7 Glo reagensen stå på 25 ± 5 ° C i 30 min før bruk.
- Legge til 100 µL av denne reagensen alle brønner, inkludert prøver og kontroller.
- Shake platene bruker en microplate vortex mikser for 3 min på 25 ± 5 ° C umiddelbart etter dispensing i brønnene.
- Ruge platene for 2,5 ± 0,5 h på 25 ± 5 ° C, beskyttet fra lys.
- Sette inn mikrofonroplates i luminometer og neste avsnitt.
5. Analyse av resultater
- benytter en programvare for luminescence deteksjon, Velg funksjonen luminescence modus og sluttpunktet.
- Velg en 96-brønns klart bunn plate og sine 80 interne brønner, utelate kolonner 1 og 12.
- Velge en integrasjon av 1250 ms og 10 s for å blande microplate før.
- Velg brønnene der referanse stoff, analytiske stoff og kontroll prøven plasseres og identifisere med deres tilsvarende konsentrasjoner.
- Lese prøvene i microplates med luminometer.
- Bruker en fjerde parameteren formel for analyser av resultater. Lage en dose-respons kurve, som vist i figur 2.
figur 2: Dose-respons kurve. Anti-TNFα mAb konsentrasjon versus luminescence (celle levedyktighet) er avbildet. En fjerde parameteren ligningen som beskriver anti-TNFα beskyttelse av mAbs ble brukt som modell. EC50 er konsentrasjonen av mAb som kan nøytralisere mengden TNFα som forårsaker 50% celledød i hver analysen, eksemplifisert i diagrammet som endring i skråningen. Barer beskriver standardavviket luminescence for hver mAb konsentrasjon. x representerer anti-TNFα Ab konsentrasjon og fremstilles som en logaritmisk funksjon i ng/mL, mens y representerer luminescence svaret i vilkårlig luminescence enheter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Merk: I den fjerde parameteren ligningen, C er effektiv konsentrasjonen 50 (EC50). Denne verdien brukes til å sammenligne den referanse stoff, analytiske prøve og kontroll prøven ved hjelp av funksjonen effektor. - For beregning av relativ potencies, løse referanse stoffet til 100% og beregne potencies av prøven og kontrollere tilsvarende.
Merk: Disse verdiene er avbildet i Figur 3.
Figur 3: matematisk formel som brukes til beregning av EC50s og deres verdier. EC50 verdier eller C parameter, har deres usikkerhet som standardfeil. En sammenligning av EC50s mellom prøven og referanse resultatene av relative styrken er også avbildet. Konfidensintervallet beregnes med en α = 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dose-respons grafen (med kontroller)
Figur 1 representerer luminescence svaret versus mAb konsentrasjon. Denne sigmoidal funksjonen eksemplifiserer caspase 3 og 7 utgivelsen i analysen kultur medium på grunn av cellen lysis. Celledød forsterkes av serum sult pluss TNFα signalering induksjon. Derfor samhandler anti-TNFα molekylet (mAb) med cytokin, begrenser (ved steric hindring) dets interaksjon med TNF celle reseptor. Dette fører til celle overlevelse på høyere mAb konsentrasjoner.
Kontrollene i metoden var: med analysen kultur medium, celler og TNFα pluss analysen kultur medium og analysen kultur mediumalone. Celler alene med analysen kultur medium under FBS sult gjennomførte ikke til apoptose, dermed utvikle luminescence. Videre celler utsatt for TNFα alene, men dyrket med kultur medium faktisk overleve.
En annen viktig kontroll er analysen kultur medium alene. Kontrollerer hjelper med forståelsen av molekylære forstyrrelser knyttet til mediet, spesielt proteiner som kan fordøye caspase underlaget, noe som indikerer en falske positive selvlysende signal. EC50 og relative styrken resultater er vist i tabell 3.
| Eksempel | EC50 | Relative styrke (%) | Konfidensintervallet (%) | RDS (%) |
| Referanse stoff | 241.5 | 100 | -- | -- |
| 243.6 | ||||
| 234.2 | ||||
| Analytiske Sample | 225.2 | 99,7 | 86.0-115.1 | 8.5 |
| 240.3 | ||||
| 258.8 | ||||
| Kontroll prøven | 230.5 | 97,1 | 86,5-108.7 | 6.9 |
| 264 | ||||
| 248.4 |
Tabell 3: relativ styrke resultatene. Analytiske prøven sammenlignet med et kjent styrke utvalg, beskrevet i tabellen som referanse, med en fast 100% styrke. Forholdet beregnes med EC50 av hvert utvalg. Intervallet er beregnet på 95% sikkerhet (α = 0,05). RSD: relative standardavviket.
Tabell 3 viser relative styrken, i prosent, mellom en referanse mAb og et utvalg under etterforskning. Antas det sammenlignbarhet er innenfor en 80-120% av referansen. Men har noen ganger referansen stor variasjon mellom grupper; Derfor kan området aksept endre. Derfor er det ønsket å velge referanse kladder i en kort periode produksjon, stramme mekanisk-egenskaper og aksept intervallet.
Denne tabellen viser at referansen har en styrke på 100%, mens analytisk utvalget har en styrke på 99,7%. Resultatet betyr at TNFα nøytralisering evnen av utvalget sammenlignes med referansen. Det forventes at sykdommer knyttet til overuttrykte av cytokin styres av disse mAbs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne karakteristikken bidrar til å bestemme en priori . biologisk atferd av et molekyl under utvikling før dyre og tidkrevende kliniske studier er utført. Det er også nyttig for parti til parti utgivelsen av en godkjent stoffet produkt. Det er verdt å nevne at disse analyser er nyttig for å avgjøre om et molekyl har en tilstrekkelig biologisk effekt om sin virkningsmekanismen. Bio-analytiske metoden presentert i denne opplæringen er kritisk viktig til sammenligning av ulike anti-TNFα molekyler. Mekanisk-metoden er denne metoden kunne fastslå, gjennom biologiske midler, styrke og effekten av et stoff som et kvalitet, noe som viser hele og fulle betydningen av funksjoner effektor.
Vanligvis kan celle apoptose respons til TNFα være en utfordrende oppgave for forskere å utføre. Feilsøking kan bli gjennomført gjennom karakterisering av den celle banken som brukes daglig før standardisere denne biologiske metoden. Et eksempel er celle respons variasjon i en tidsperiode som er knyttet til cellen linje aldring12. Dette problemet er eliminert ved hjelp av en master cellen bank frosset på-80 ° C. Den arbeider celle banken må være stor nok til å dekke kravene til en DOE studie utført av R & D eller en ett års periode for bruk i kvalitetskontroll laboratoriet. Også kan denne respons løses ved hjelp av temperatur-stabilisert løsninger før du legger dem til celler på alle trinn i denne protokollen. Minst tre går må utføres før du kjører en nøytralisering analysen og begrense tiden som cellene er dyrket i kontinuerlig kultur på grunn av tilpasning og befolkningen dynamics12,13.
TNFα molekyl må beskyttes fra fryse-Tin sykluser, som styrken av dette proteinet er betydelig svekket hvis ikke stabilisert. Formuleringer sitert andre steder14 for cytokin forberedelse er foreslått når rekonstituert cytokin skal lagres og konsentrasjonen av TNFα er avgjørende for protokollen suksess. Reaksjonsevne i en celle til et cytokin avhenger av reseptorer per celle. Derfor, den optimale TNFα konsentrasjonen avhenger på cellen linje og tetthet15,16. Vi utvannet TNFα til en siste konsentrasjon av 13,3 ng/mL og justert celle tettheten ved hjelp av en kurve rundt 25.000 celler/godt. Derfor må celle tetthet bekreftes for hver TNFα konsentrasjon.
Camacho-Villegas et al. Rapporter en TNFα siste konsentrasjon av 1,25 ng/mL; denne gruppen bruker også actinomycin D som en stress celle faktor9,17,18. Vi i stedet endret FBS fra 10% til 1% fra kultur medium analysen medium, gir et sterkt stress signal å indusere apoptose i WEHI 164 celler med TNFα alene, eliminerer en annen variabel fra protokollen. Andre grupper rapportere celle levedyktighet bruker MTT. Metoder med et luminescence substrat følsom for caspase 37, i stedet for metoden Spektrofotometri der UV-Vis absorbansen stoffer er til stede i kultur medium eller selve cellene (f.eks fenol rød absorbert av celler), kan forstyrre signalet. Dermed ble følsomheten til analysen økt med denne Ac-DEVD-pNA luminescentreactant, som tilstedeværelse av selvlysende stoffer (bakgrunn) i kultur medium ikke er forventet.
En begrensning av denne metoden er at det kan bare brukes til TNFα-sensitive celler. andre celler linjer må testes og cytokin konsentrasjonen justert for en optimalisert cellulær respons. Videre ikke kan absolutt svaret måles, vi ikke bruker en primær cellen linje eller i vivo analysen; ortogonale isotermiske titrering calorimetry (ITC) eksperimenter foreslås i stedet for første metoden justering. Informasjon fra ITC er nyttig for å etablere TNFα slektskap med en ny molekyl under utvikling og for å angi den første vilkår i biologiske metoden.
Denne metoden er nyttig for å teste nye molekyler når forskere har en referanse stoff for å få en basal relative svar; dermed anbefales evalueringen av bio-bedre eller molekylær svar knyttet til cellebeskyttelse. Den kan brukes på andre anti-TNFα proteiner. For eksempel, er det aktuelt å evaluere relativ biologiske styrken på Etanercept, Infliximab, Certolizumab eller Golimumab19. Men har alle disse anti-TNFα molekyler forskjellige interesseområder for cytokin; Derfor må konsentrasjonene justeres individuelt. En annen fordel med denne metoden er den korte tiden mellom initiering av eksperimenter og oppnåelse av resultater, noe som gjør det enkelt å utføre og billig sammenlignet med dyremodeller. Videre, denne metoden måler samspillet av mAb med et fullt aktive TNFα molekyl, antyder at mAb gjenkjenner TNFα trimer og at molekylene ikke var endret under lagring eller laboratorium manipulasjon. På den annen side, er en ren mekanisk-analysen resultatet fortsatt tvilsom. Samspillet mellom TNFα og en mAb ved hjelp av en konvensjonell ELISA kan for eksempel være en gjenstand som er knyttet til strukturelle endringer på grunn av cytokin kjemiske immobilisering; Derfor affinitet kan påvirkes, og målene kompromittert. Videre under ITC analyser, kan fortynning løsninger endre strukturen i TNFα eller mAb, dermed hemme TNFα trimer formasjon, mAb interaksjon eller artifactual epitope generasjon. Bruk av primære celler linjer i denne metoden kan være krevende; beskyttelse mot TNFα kan likevel gi interessante resultater, etterligne i vivo svar.
Vi laget denne metoden til å være lett å følge og reproduserbar. Som luminescence kan bli maskert av fenol rød eller andre UV-Vis absorbansen stoffer, kan nesten alle kultur medium additiv brukes dyrke celler. Denne endringen hjelpemidler forskere i studiet av krevende cellelinjer, med full gjenkjenning svar for levedyktigheten etter cytokin behandling. Minst tre celle passasjer og celle tetthet justeringer må utføres før nøytralisering analysen. Også stabilisere cytokin og konsentrasjonen, samt oppvarming og equilibrating CO2 konsentrasjonen i kultur medium og løsninger er avgjørende skritt for analysen suksess. Total, denne artikkelen viser trinnene nødvendig å nøytralisere TNFα cytokin med en mAb bruker en i vitro biologiske test for å sammenligne en referanse og et utvalg under utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Council of Science og teknologi (CONACYT), Mexico gi PEI CONACYT 2015 220333, uten deltakelse i utformingen av studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WEHI 164 | ATCC | CRL-1751 | Fibrosarcoma cells from Mus musculus |
| RPMI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| RPMI 1640 Medium, no phenol red | GIBCO | 11835-030 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red | GIBCO | 25200-056 | Store medium at -10 °C to -20 °C |
| DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-136 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA-020 | Store at -20 °C to -70 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG | HyClone | SH3089803 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized | HyClone | SH3007103 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8093 | Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at –20 ºC protected fromLight |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent | J.T.Baker | 8993-01 | -- |
| Sample mAb Adalimumab | Probiomed | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Reference and Control mAb Adalimumab | Abbvie | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 | SpectraMax M3 Multi-Mode |
| Microplate reader Software | Molecular Devices | -- | SoftMax Pro 6.3 GxP |
| Incubator | Revco | 30482 | Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2 |
| Laminar Flow Hood | The Baker Company | 200256 | Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2 |
References
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of programmed cell death. Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).
- Darwish, R. S. Regulatory mechanisms of apoptosis in regularly dividing cells. Cell Health Cytoskelet. 2 (1), 59-68 (2010).
- Tracey, D., et al. Tumor necrosis factor antagonist mechanism of action: A comprehensive review. Pharmacol Ther. 117 (2), 244-279 (2008).
- Körner, H., Sedgwick, J. Tumour necrosis factor and lymphotoxin: Molecular aspects and role in tissue-specific autoimmunity. Immunol Cell Biol. 74 (5), 465-472 (1996).
- Wong, M., et al. TNFa blockade in human diseases: Mechanisms and future directions. Clin Immunol. 126 (2), 121-136 (2008).
- Furst, D. E., Wallis, R., Broder, M., Beenhouwer, D. O. Tumor necrosis factor antagonists: different kinetics and/or mechanisms of action may explain differences in the risk for developing granulomatous infection. Semin Arthritis Rheum. 36 (3), 159-167 (2006).
- Karvinen, J., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence quenching assay (LANCE) for caspase-3. J Biomol Screen. 7 (3), 223-231 (2002).
- Ren, Y. G., et al. Differential regulation of the TRAIL death receptors DR4 and DR5 by the signal recognition particle. Mol Biol Cell. 15 (11), 5064-5074 (2004).
- Sud, D., Bigbee, C., Flynn, J. L., Kirschner, D. E. Contribution of CD8+ T cells to control of Mycobacterium tuberculosis infection. J Immunol. 176 (7), 4296-4314 (2006).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Apendix 3, 3 (2001).
- Ramasubramanyan, N., et al. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same. 1, ABBVIE INC. North Waukegan Road, North Chicago, IL, 60064, US. (2014).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Eskandari, M. K., Nguyen, D. T., Kunkel, S. L., Remick, D. G. WEHI 164 subclone 13 assay for TNF: sensitivity, specificity, and reliability. Immunol Invest. 19 (1), 69-79 (1990).
- Hora, M. S., Rana, R. K., Smith, F. W. Lyophilized formulations of recombinant tumor necrosis factor. Pharm Res. 9 (1), 33-36 (1992).
- Ponnappan, S., Ponnappan, U. Aging and immune function: molecular mechanisms to interventions. Antiox Redox Signal. 14 (8), 1551-1585 (2011).
- Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes. Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).
- Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use. mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).
- Männel, D. N., Falk, W. Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide. Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).
- Lis, K., Kuzawińska, O., Bałkowiec-Iskra, E. Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge. Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).
