Summary
Ett protokoll för bestämning av den relativa anti-apoptotiska effekten av en anti-TNFα mAb med en neutralisering mekanism med WEHI 164 celler presenteras här. Detta protokoll är användbara för att jämföra styrkan neutralisering av olika molekyler med samma biologiska funktioner.
Abstract
Detta protokoll visar mätningen av apoptotiska aktivitet neutralizationen av TNFα i en mus fibroblast cell modell (WEHI 164) med en anti-TNFα-mAb. Detta protokoll kan dessutom användas för att utvärdera andra anti-TNFα molekyler, såsom fusionsproteinerna. Den cellulära modell som anställd här är känslig för TNFα-medierad apoptos när en ytterligare stressfaktor induceras i cell kultur förhållanden (t.ex. serum deprivation). Detta förfarande exemplifierar hur man utföra detta analytiska assay, lyfta fram viktiga åtgärder avseende den provberedning, cell utspädning, apoptos induktion och spektrofotometrisk mätning som är avgörande för att säkerställa lyckade resultat. Detta protokoll avslöjar bästa prestanda villkoren för apoptos induktion och effektiv signal inspelning, vilket leder till låg mätosäkerhet värden.
Introduction
Biologisk potens är de kvantitativa måttet på biologisk aktivitet baserat på analyseras produktattribut som är länkade till de relevanta biologiska egenskaperna, kvantitet (uttryckt i massa) är en fysikalisk-kemisk åtgärd av proteinhalten. Potens tester, tillsammans med andra analytiska metoder, utförs som en del av produktens överensstämmelse, stabilitet och jämförbara studier. I denna mening används potens mätningar som visar att produkten batchar uppfylla den kritiska kvalitetsattribut (CQAs) eller acceptanskriterier under alla faser av kliniska prövningar och efter marknadsgodkännande.
Apoptos är programmerad celldöd, naturligt förekommande när celler är infekterad med ett virus eller när cellerna är stressade av en miljömässig faktor att kompromisser cellulära livskraft och funktion1,2. Bland annat är apoptos hämning eller biologisk neutralisation, en av de främst kända terapeutiska mekanismerna av mAbs, särskilt vid behandling av kroniska sjukdomar, såsom immunmedierade inflammatoriska sjukdomar. Anti-TNFα molekyler utöva sina terapeutiska egenskaper genom att blockera växelverkan av tumörnekrosfaktor alfa (TNFα) med p55 och p75 cell surface receptorer3, därmed förhindra signalvägar som slutligen leder till cellulära apoptos.
TNFα kan producera inflammation i vissa kroniska sjukdomar4. TNFα utsöndras förevändningar i den extracellulära miljön av makrofager, som vakter av det medfödda immunsystemet och de huvudsakliga aktörerna i denna typ av sjukdom5. Som en gemensam väg förknippas TNFα avreglering med patogenesen av dessa sjukdomar. Utan kontroll och under konstant induktion och cell stress inducerar TNFα cell death och vävnad degeneration, vilket slutligen leder till reumatoid artrit, Crohns sjukdom och andra patologiska profiler6.
TNF-antagonister som blockerar interaktionen mellan TNF och dess receptorer har använts alltmer som en effektiv behandling att minska symtomatologi och hindra progressionen av dessa sjukdomar. Anti-TNFα drog produkter används numera allmänt att styra den systemiska koncentrationen av denna cytokin, därmed förhindra ytterligare degeneration av berörda vävnader. I denna mening är det absolut nödvändigt att ge en reproducerbar och robust bioassay för att beskriva en drog specifika förmåga att uppnå sin biologiska effekt.
I detta protokoll, kritiska steg-identifierade under utvecklingen av en neutralization assay-för framgångsrik mätning av biologisk potens är markerade, med särskild tonvikt på den kompetens som behövs för att köra de bioanalytiska metoden. Bioanalytiska metoden ger användbar jämförbarhet information mellan olika partier eller anti-TNFα läkemedel jämfört med ett kliniskt testat referensämne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förberedelse av Media och lösningar
- förbereda odlingssubstratet: RPMI-1640 med 10% FBS, pH 7,4.
- Förbered analyssubstratet kultur: RPMI-1640 utan fenolrött men med 1% FBS, pH 7,4.
- Förbereda cell tvättlösning: DPBS Mg - och Ca-free lösning med 0,02% EDTA, pH 7,4.
- Förbereda cell avlossning lösning: 0,125% trypsin med 1 mM EDTA.
- Tina en 0,25% lösning av trypsin-EDTA och överför till en steril 500 mL-kolv 100 mL.
- Mix med 100 mL cell tvätta lösning och fördela 15 mL alikvoter i 15 mL sterilt rör. Butiken på -70-80 ° c fram till användning.
- Filtrera dessa lösningar genom ett 0,22 µm membran och värma upp till 37 ° C i minst 30 min före användning.
- Förbereda apoptos-induktion stamlösning TNFα lösning på 3,3 µg/mL.
- Lös 20 µg av TNFα med 500 µL filter-steriliserat vatten i dess primära behållare och blanda tills fullständig upplösning.
- Överför till en 15 mL sterilt rör och tillsätt 5,5 mL DPBS Mg - och Ca-free lösning i detta rör. Blanda försiktigt med en vortex mixer.
- Alikvot lösningen i 70 µL portioner. Fördela varje alikvot i 0,5 mL mikrorör och förvaras vid -80 ° C.
- Bered apoptos induktion: TNFα lösning vid 40 ng/mL.
- Tina en alikvot av apoptos induktion stamlösning, ruvning och det i ett vattenbad vid 25 ˚C för 10 min.
- Späda apoptos induktion stamlösning till 40 ng/mL genom att lägga till 61 µL 3,3 µg/mL TNFα lösning 4.939 mL av analyssubstratet kultur i en 15 mL sterilt rör.
- Mix av vortex mixer för 10 s; denna lösning måste beredas på nytt före användning.
- Värma upp lösningen till 37 ° C i minst 30 min före användning i th eneutralization assay.
- Bered substratlösningen: kaspas 3/7 Glo lösning 7 , 8.
- Tina kaspas buffertlösningen (kaspas 3/7 Glo buffert) 12 h innan användning.
- Låt kaspas buffertlösningen och substratet (kaspas 3/7 Glo substrat) sitter separat på 25 ± 5 ° C i 30 min innan mixning.
- Överför 10 mL av buffertlösningen kaspas till substrat injektionsflaskan och blanda genom inversion.
- Hålla 25 ± 5 ° C, ljus-skyddade fram till användning.
Obs: Lösningen är stabil i 6 h i rumstemperatur.
2. Cell Culturing och räkna
- Cell upptining och den första subkulturen.
- Ta bort en injektionsflaska med WEHI 164 celler 9 från en frys vid-80 ˚C och överföra dem till ett isbad.
- Pipettera upp och ner med 1 mL före värmde odlingsmedium tills de frusna cellerna helt Tina.
- Fördela 9 mL av pre värmde odlingsmedium på en 15 mL sterilt rör.
- Överföra cellsuspensionen i 15 mL steril röret och blanda försiktigt fem gånger genom inversion.
- Centrifugera cellsuspension vid 125 x g i 3 min. Kassera supernatanten och uppdelade cellpelleten.
- Tillsätt 5 mL odlingsmedium till röret. Blanda tills cellerna är helt resuspended.
- För cell inventering, överföra 50 µL cellsuspension till en 500 µL mikrorör och blanda med 50 µL av 0,4% trypan blå. Räkna cellerna och justera till 0,5 x 10 6 celler/mL. Nedan följer steg 2.2,.
- Lägga till 13 mL av pre värmde odlingsmedium i en 75 mL cell kultur kolv.
- Fördela tillräckligt fjädring cellvolym från steg 2.1.6 att uppnå 0,5 x 10 6 celler/mL i cell kultur kolven och inkubera vid 37 ° C och 5% CO 2 övernattning.
- Cell räknar.
Obs: Se referens 10.- Med lösningen från steg 2.1.6, överföra 0,05 mL till en hemocytometer och avgöra cell densiteten i Mikroskop med trypan blå uteslutning.
- Kvantifiera det totala antalet celler och viabla celler.
- Justera cellsuspensioner till 0,5 x 10 6 celler/mL.
Ekvation 1
V odlingsmedium (mL) =
V odlingsmedium (mL) = (5 mL - V cellsuspension)
V odlingsmedium (mL) = Justerat volymen av WEHI 164 cell suspension
NVC = antalet livskraftiga WEHI 164 celler/mL
V odlingsmedium (mL) = Assay odlingsmedium volym tillsätts cellsuspensionen att uppnå 0,5 x 10 6 celler/mL
0,5 x 10 6 = mål cell densiteten
- Cell lösgörande och den andra och tredje subkulturen.
Obs: Ett vakuumsystem kan användas för att ta bort lösningar från kolvar. Engångs eller glas sterila pipetter användas. Om pipetten har en bomull täppa överst, den måste avlägsnas före användning.- Ta bort odlingssubstratet från cellkulturen T-flask med en 1 mL steril pipett och en vakuum.
- Fördela 5 mL av cell tvätta lösning in i kulturen T-kolv, blanda försiktigt och kassera lösningen. Upprepa detta två gånger.
Obs: Fullständig borttagning av odlingssubstratet är avgörande för effektiv cell avlossning. - Tillsätt 15 mL cell avlossning lösning till T-kolven och låt stå i 3 min i en inkubator på 37 ° C och 5% CO 2.
- Verifierar avsaknad av kopplade celler i kolven innervägg under mikroskopet. Ta bort celler från kulturen T-kolv med 20 mL steril pipett och fördela dem i en 50 mL sterilt rör.
- Centrifugera cellsuspension vid 125 x g i 3 min. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten med ytterligare 5 mL odlingsmedium.
- Räkna cellerna och tillsätt tillräckligt odlingsmedium för att nå önskad cellkoncentrationen enligt ekvation 1.
- Lägg till denna suspension till en 72 cm 2 T-kolv och inkubera över natten vid 37 ° C och 5% CO 2.
- Subkultur cellerna minst två gånger innan du använder dem i neutralizationen assay. Upprepa steg 2.3.1-2.3.8 för de kommande två dagarna.
- Assay cellsuspension.
- Välj en WEHI 164 subkultur som har minst tre pass. Se steg 2.1.
- Koppla och räkna cellerna enligt steg 2.2 och 2.3 i detta protokoll.
- Späda cellsuspensionen enligt ekvation 1 till 0,5 x 10 6 celler/mL.
- Använd denna cellulära suspension för neutralisering analysen. Blanda alla cellsuspensioner av vortex mixer före användning.
3. Antikropp förberedelse och spädningar
- kvantitering av mAbs.
- Bestämma koncentrationen av referensämnet, kontrollprov och analysprov genom UV-absorption vid 280 nm med deras massutdöende koefficient (1,39) 11.
Obs: Original koncentrationer kunde tas från drogen produktetiketter. Men detta måste kontrolleras genom UV-absorption.
- Bestämma koncentrationen av referensämnet, kontrollprov och analysprov genom UV-absorption vid 280 nm med deras massutdöende koefficient (1,39) 11.
- mAb utspädningar.
- Dilute alla prover självständigt i tre exemplar, med DPBS Mg - och Ca-free lösning i 2 mL mikrorör, ner till 2 mg/mL. Bekräfta denna koncentration av UV-absorption i tre exemplar, med DPBS Mg - och Ca-free lösning som tomrummet.
- Blanda lager protein lösningarna för 5 s med en vortex mixer.
- Späda 100 µL av varje 2 mg/mL mAb lösning med 0,9 mL odlingssubstrat assay.
- Mix för 5 s av vortex mixer.
Obs: Dessa lösningar har en koncentration av 200 µg/mL. Spädningar göras för varje däcktypen. - Späd 10 & #181. L varje 200 µg/mL mAb lösning med 0,99 mL odlingssubstrat assay. Blanda i 5 s med en vortex mixer. Dessa lösningar har en koncentration av 2 µg/mL. Utföra seriespädningar för varje tre exemplar innan du använder dem i de neutralization assay.
- Gör anti-TNFα mAb utspädningar i tre oberoende mikroplattor. Göra en dubblett från varje oberoende tre exemplar och fördela dem i en mikroplattan, som anges i tabell 1. Referera ämnet < tabell fo:keep-together.within-sida = ”1” fo:keep-med-next.within-sida = ”always” fo:text-align = ”center” >
tallrik 1 tallrik 2 Plate 3 Wells prov Wells prov Wells prov B2:B11 referensämne B2:B11 kontrollprov B2:B11 analysprov C2:C11 C2:C11 C2:C11 D2:D11 analysprov D2:D11 referensämne D2:D11 kontrollprov E2:E11 E2:E11 E2:E11 F2:F11 kontrollprov F2:F11 analysprov F2:F11 referensämne G2:G11 G2:G11 G2:G11 - Utför mAb utspädningar av varje referens, prova, eller kontroll, vilket visas i tabell 2.
Obs: De anti-TNFα mAb koncentrationer beskrivs i tabellen är inte de slutliga koncentrationerna i de neutralization assay.
T möjlighet 2: Anti-TNFα mAb utspädningar. Seriespädningar av anti-TNFα mAbs demonstreras i den här tabellen. Slutliga koncentrationer beskrivs i tabellen är inte halterna i analysen, där anti-TNFα mAbs späddes med en faktor 3 (mAb utspädning + odlingsmedium + celler suspension). Raderna i fetstil representerar spädningar kommer från linjer 3, 5, 7, 9 och 10; icke-fet linjerna representerar utspädning från linjerna 3, 4 och 6. Dessa seriespädningar görs bara innan du utför de neutralization assay. Var noga med att blanda genom pipettering upp och ner tre gånger före dispensering spädningarna.Plattan kolumn volym av kultur analyssubstratet (μL) volym av referensämnet, analysprov eller kontroll Prov (uL) koncentration i Assay plattan (ng/mL) 2 0 230 2000 3 150 150 från linje 2 1000 4 75 75 från linje 3 500 5 100 50 från linje 3 333 6 75 75 från rad 4 < td > 2507 75 75 från linje 5 166 8 75 75 från linje 6 125 9 75 75 fro m linje 7 83 10 75 75 från linje 9 41 11 150 75 från linje 10 13 - Hålla plattorna på 25 ± 5 ° C fram till användning.
4. Neutralization Assay med WEHI 164 celler
- Mix av vortexa alla cell suspensioner (0,5 x 10 6 celler/mL) före dispensering vid varje steg i detta protokoll.
Obs: I det här avsnittet varm varje lösning till 37 ° C i 30 min innan användning. - Överför 50 µL cellsuspension till varje 60 brunnarna av den mikroplattor, flyttar från kolumn 2 till 11 och linje B till G.
- Överföra 50 µL av mAb referens, prov och kontroll utspädningar i mikroplattor. Följer det mönster som avbildas i figur 1.
- Lägga till 50 µL av apoptos induktion lösningen till varje brunn.
- Använda cellulära kontroller av 50 µL av WEHI 164 celler, förpackat i tre brunnar. Ta varje brunn till en slutlig volym av 150 µL med analyssubstratet kultur.
- Använder en cytotoxicitet kontroll av en blandning av 50 µL av WEHI 164 celler plus 50 µL apoptos induktion lösning. Ta varje brunn till en slutlig volym av 150 µL med analyssubstratet kultur.
- För the TNFα kontroll, Använd 50 µL av lösningen för induktion av apoptos och föra den till 150 µL med kultur analyssubstratet.
- För blindtestet, Använd 150 µL av kultur analyssubstratet ensam.
- Fylla återstående brunnarna med 150 µL av odlingssubstrat att undvika plattan avdunstning effekter.
- Upprepa steg 4.1.1-4.1.9 två gånger i två andra mikroplattor.
Obs: MAb slutliga koncentrationerna i de mikroplattan är: 0,666, 0.333 0.167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 och 0,004 µg/mL. - Läses in proverna i mikroplattor, som anges i figur 1.
figur 1: Disposition av prover i assay plattorna. B1-G11 är väl koordinater i mikroplattor och beskriver de positioner där provspädningar placeras. Saknas koordinater finns brunnar fyllda med kontroller och kultur analyssubstratet (A1-A12 och H1-H12). Denna slumpmässig fördelning av prover (framåt och bakåt utspädningar i mikroplattor) hjälper till att eliminera snedvridning i resultaten på grund av avdunstning av medium eller andra variabler. Är det bäst att varje mikroplattan görs av en analytiker på en gång. R:, S: referensprov, CS: kontrollprov, Dil: utspädning. Klicka här för att se en större version av denna siffra. - Ruva tre plattorna vid 37 ° C och 5% CO 2 för 16 ± 2 h.
- Låt kaspas 3/7 Glo reagensen stå på 25 ± 5 ° C i 30 min innan användning.
- Tillsätt 100 µL av reagensen i alla brunnar, inklusive prover och kontrollerna.
- Skaka plattorna med en mikroplattan vortex mixer för 3 min på 25 ± 5 ° C omedelbart efter dispensering i brunnar.
- Inkubera plattorna för 2,5 ± 0,5 h på 25 ± 5 ° C, skyddas från ljus.
- Infoga microplates till luminometern och slutför nästa avsnitt.
5. Analys av resultat
- användande en mjukvaran för Luminiscens detektering, Välj funktionen luminiscens läge och endpoint.
- Välj en 96 brunnar clear-botten plattan och dess 80 inre wells, exklusive kolumner 1 och 12.
- Välj en integration tid av 1 250 ms och 10 s för blandning mikroplattan före behandlingen.
- Välj brunnarna där referensämne, analytisk substans och kontrollprov ska placeras och identifiera sig med deras motsvarande koncentrationer.
- Läsa de provexemplar som placeras i mikroplattor med luminometern.
- Använda en fjärde parameter ekvationen för analyser av resultaten. Diagram en dos-respons kurva, som avbildas i figur 2.
figur 2: dos-responskurva. Anti-TNFα mAb koncentration kontra luminiscens (cellviabilitet) avbildas. En fjärde parameter ekvationen anti-TNFα skydd av mAbs användes som modell. EC50 är koncentrationen av mAb som kan neutralisera mängden TNFα som orsakar 50% celldöd i varje analys, exemplifieras i grafen som förändringen i sluttningen. Barer beskriver standardavvikelsen för Luminiscens för varje mAb koncentration. x representerar anti-TNFα Ab koncentration och avbildas som en logaritmisk funktion i ng/mL medan y representerar luminiscens svaret i godtyckliga luminiscens enheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Obs: I fjärde parameter ekvationen, C är den effektiva koncentrationen 50 (EC50). Detta värde används för att jämföra det referensämne och analysprov kontrollprov med hjälp av funktionen effektor. - För att beräkna de relativa potenser, fixa referensämnet till 100% och beräkna potencies av provet och styra följaktligen.
Obs: Dessa värden återges i figur 3.
figur 3: matematisk ekvation används för att beräkna EC50s och deras värden. EC50-värden, eller C parametrar, har deras osäkerhet som skildras som standard fel. En jämförelse av EC50s mellan prov och referens resultaten av relativ potens skildras också. Konfidensintervallet beräknas med en α = 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dos-respons kurva (med reglage)
Figur 1 representerar luminiscens svaret kontra mAb koncentration. Sigmoidal funktionen exemplifierar kaspas 3 och 7 release i kultur analyssubstratet på grund av cellys. Celldöd förstärks av serum svält plus TNFα signalering induktion. Därför, den anti-TNFα-molekylen (mAb) interagerar med den cytokin, hämma (av sterisk hinder) dess interaktion med TNF cell receptorn. Detta orsakar cellöverlevnad vid högre mAb koncentrationer.
De kontroller som används i metoden var: celler med assay kultur medium, celler plus TNFα plus assay odlingsmedium och assay kultur mediumalone. Celler ensam med analyssubstratet kultur under FBS svält inte genomgå till apoptos, därigenom utveckla luminiscens. Dessutom överlevde celler utsätts för TNFα ensam men odlade med odlingssubstratet faktiskt.
En annan viktig kontroll är kultur analyssubstratet ensam. Detta styr hjälper till med förståelsen av molekylära störningar avser medium, särskilt proteiner som kan smälta kaspas-substrat, vilket indikerar en falskt positiva självlysande signal. De EC50 och relativ potens resultaten skildras i tabell 3.
| Prov | EC50 | Relativa potens (%) | Konfidensintervall (%) | RDS (%) |
| Referensämne | 241,5 | 100 | -- | -- |
| 243,6 | ||||
| 234,2 | ||||
| Analysprov | 225,2 | 99,7 | 86,0-115,1 | 8,5 |
| 240,3 | ||||
| 258,8 | ||||
| Kontrollprov | 230,5 | 97,1 | 86,5-108,7 | 6,9 |
| 264 | ||||
| 248,4 |
Tabell 3: relativ potens resultat. Analysprovet jämförs med en känd potens prov, beskrivs i tabell som referens, med en fast 100% styrka. Förhållandet beräknas med EC50 av varje prov. Intervallet beräknas vid 95% konfidens (α = 0,05). RSD: relativ standardavvikelse.
Tabell 3 visar den relativa potensen, i procent, mellan en referens mAb och ett prov under utredning. Jämförbarhet antas inom intervallet 80-120% av referensnivån. Dock har ibland referensen stor variation mellan partier; spänna av acceptans kan därför ändra. Därför är det önskvärt att välja referens partier inom en kort period av tillverkning, skärpning fysikalisk-kemiska egenskaper och acceptans intervallet.
Tabellen visar att referensen har en styrka på 100%, medan analysprovet har en potens 99,7%. Detta resultat innebär att funktionen TNFα neutralisering av provet är jämförbar med referensen. Det förväntas att sjukdomar relaterade till överuttryck av cytokin kan styras av dessa mAbs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna karakterisering hjälper till att bestämma en priori den biologiska beteenden av en molekyl under utveckling innan dyra och tidskrävande kliniska prövningar genomförs. Det är också användbart för batch-till-frisläppande av tillverkningssats av en produkt som godkända läkemedel. Det är värt att nämna att dessa analyser är användbara för att avgöra om en molekyl har en tillräcklig biologisk effekt om dess verkningsmekanism. Den bio-analytiska metod som presenteras i denna handledning är kritiskt viktigt att jämförelsen av olika anti-TNFα molekyler. Trots den gemensamma fysikalisk metoden är denna metod kunna avgöra, genom biologiska medel, potens och effekten av en drog som en kvalitet attribut, vilket visar funktionerna effektor komplett betydelse.
Vanligen, kan cell apoptos lyhördhet för TNFα vara en utmanande uppgift för forskare att utföra. Felsökning kan genomföras genom karakterisering av cell banken som används dagligen innan den ställs denna biologiska metoden. Ett exempel är den cell svar variationen inom en tidsperiod som avser cellinje åldrande12. Detta problem elimineras med hjälp av en ledar cell bank fryst vid-80 ° C. Fungerande cell banken måste vara tillräckligt stor för att täcka kraven i en DOE studie utförd av R & D eller en ettårsperiod för användning i kvalitetskontroll laboratorium. Också, denna lyhördhet kan fastställas med hjälp av temperatur-stabiliserad lösningar innan du lägger dem i celler vid varje steg under detta protokoll. Minst tre passerar måste utföras innan du kör en neutralization assay och begränsa längden av tid som celler odlas i kontinuerlig kultur på grund av anpassning och population dynamics12,13.
TNFα-molekylen måste skyddas från frysning-tining cykler, som styrkan av detta protein är väsentligen undergrävs om inte stabiliserats. Formuleringar ovan någon annanstans14 för cytokin förberedelse är föreslog när den rekonstituerade cytokin kommer att lagras, eftersom koncentrationen av TNFα är kritiska för protokollet framgång. Lyhördhet för en cell till en cytokin beror på antalet receptorer per cell. Därför beror den optimala TNFα-koncentrationen på cell linje och densitet15,16. Vi utspädd TNFα till en slutlig koncentration på 13,3 ng/mL och justerat cell densiteten med hjälp av en kurva runt 25 000 celler per brunn. Cell densiteten måste därför kontrolleras för varje TNFα-koncentration.
Camacho-Villegas o.a. rapporterar en TNFα slutlig koncentration på 1,25 ng/mL; denna grupp använder också actinomycin D som en stress cell faktor9,17,18. Vi istället ändrade FBS från 10% till 1% från odlingssubstratet till analyssubstratet, ger en stark stress signalerar inducera apoptos i WEHI 164 celler med TNFα ensam, eliminera en annan variabel från protokollet. Andra grupper rapportera cellviabilitet använder MTT. Metoder med ett luminescence-substrat som är känsliga för kaspas 37, istället för den spektrofotometrisk metod där de UV-Vis absorbans ämnena förekommer i odlingsmediet eller cellerna själva (t.ex. fenolrött absorberas av celler), kan störa signalen. Således, analysens känslighet ökades använder denna Ac-DEVD-pNA luminescentreactant, eftersom förekomsten av självlysande ämnen (bakgrund) i odlingsmediet inte förväntas.
En begränsning med denna metod är att det endast kan tillämpas på TNFα-känsliga celler; andra celler linjer måste testas och cytokin koncentrationen justeras för en optimerad cellulära svar. Dessutom kan inte den absoluta Svaren mätas, som vi inte använder en primär cell linje eller en i vivo analys; i stället föreslås ortogonala isotermiska titrering calorimetry (ITC) experiment för inledande metod justering. Information från ITC är användbar för att etablera TNFα tillhörighet med en ny molekyl under utveckling och för att ange de ursprungliga villkoren i den biologiska metoden.
Denna metod är användbar för att testa nya molekyler när forskarna har ett referensämne för att erhålla en basal relativa svar; Således rekommenderas utvärdering av en bio-bättre eller molekylär respons avseende cellskydd. Det kan tillämpas på andra anti-TNFα-proteiner. Till exempel, gäller det att utvärdera den relativa biologiska potensen av Etanercept, Infliximab, Certolizumab eller Golimumab19. Men har alla dessa anti-TNFα-molekyler olika tillhörighet för cytokin; deras koncentrationer måste därför justeras individuellt. En annan fördel med denna metod är den korta tiden mellan inledandet av experiment och att uppnå resultat, vilket gör det lätt att köra och billig jämfört med djurmodeller. Ytterligare, denna metod mäter mAb samspel med en fullt aktiv TNFα-molekylen, vilket tyder på att mAb är erkänna den TNFα trimer och att molekylerna inte ändrades under lagring eller laboratorium manipulation. Däremot, är en ren fysikalisk analys resultatet fortfarande tveksamma. Till exempel kan samspelet mellan TNFα och en mAb som med hjälp av en konventionell ELISA vara en artefakt som avser strukturella förändringar på grund av cytokin kemiska immobilisering; Därför affinitet kan påverkas och mätningarna äventyras. Dessutom under ITC analyser, kan utspädning lösningar ändra strukturen för TNFα eller den mAb, vilket hämmar TNFα trimer bildandet, mAb interaktion eller artefaktiska epitop generation. Användning av primära celler rader i denna metod kunde vara krävande; skydd mot TNFα kan dock ge intressanta resultat, härma i vivo svaren.
Vi har utformat denna metod ska vara lätt att följa och reproducerbara. Som luminiscens inte kan maskeras av fenolrött eller andra UV-Vis absorbansen ämnen, kan nästan varje odlingsmedium tillsats användas för odling av celler. Denna ändring stöd forskarna i studien av krävande cellinjer, med en fullständig identifiering svar för lönsamhet efter cytokin behandling. Minst tre cell passager och cell densiteten justeringar måste göras innan den verkställer de neutralization assay. Även stabilisera cytokin och dess koncentration, samt uppvärmning och equilibrating CO2 koncentrationen i de odlingsmedium och lösningar är viktiga steg för assay framgång. Sammantaget visar denna artikel vilka steg behövs för att neutralisera TNFα cytokin med en mAb som med hjälp av ett in vitro- biologiska test för att jämföra en referens och ett prov under utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Detta arbete stöds av det nationella rådet för vetenskap och teknik (CONACYT), Mexiko bevilja PEI CONACYT 2015 220333, utan deltagande i utformningen av studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WEHI 164 | ATCC | CRL-1751 | Fibrosarcoma cells from Mus musculus |
| RPMI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| RPMI 1640 Medium, no phenol red | GIBCO | 11835-030 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red | GIBCO | 25200-056 | Store medium at -10 °C to -20 °C |
| DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-136 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA-020 | Store at -20 °C to -70 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG | HyClone | SH3089803 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized | HyClone | SH3007103 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8093 | Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at –20 ºC protected fromLight |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent | J.T.Baker | 8993-01 | -- |
| Sample mAb Adalimumab | Probiomed | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Reference and Control mAb Adalimumab | Abbvie | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 | SpectraMax M3 Multi-Mode |
| Microplate reader Software | Molecular Devices | -- | SoftMax Pro 6.3 GxP |
| Incubator | Revco | 30482 | Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2 |
| Laminar Flow Hood | The Baker Company | 200256 | Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2 |
References
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of programmed cell death. Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).
- Darwish, R. S. Regulatory mechanisms of apoptosis in regularly dividing cells. Cell Health Cytoskelet. 2 (1), 59-68 (2010).
- Tracey, D., et al. Tumor necrosis factor antagonist mechanism of action: A comprehensive review. Pharmacol Ther. 117 (2), 244-279 (2008).
- Körner, H., Sedgwick, J. Tumour necrosis factor and lymphotoxin: Molecular aspects and role in tissue-specific autoimmunity. Immunol Cell Biol. 74 (5), 465-472 (1996).
- Wong, M., et al. TNFa blockade in human diseases: Mechanisms and future directions. Clin Immunol. 126 (2), 121-136 (2008).
- Furst, D. E., Wallis, R., Broder, M., Beenhouwer, D. O. Tumor necrosis factor antagonists: different kinetics and/or mechanisms of action may explain differences in the risk for developing granulomatous infection. Semin Arthritis Rheum. 36 (3), 159-167 (2006).
- Karvinen, J., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence quenching assay (LANCE) for caspase-3. J Biomol Screen. 7 (3), 223-231 (2002).
- Ren, Y. G., et al. Differential regulation of the TRAIL death receptors DR4 and DR5 by the signal recognition particle. Mol Biol Cell. 15 (11), 5064-5074 (2004).
- Sud, D., Bigbee, C., Flynn, J. L., Kirschner, D. E. Contribution of CD8+ T cells to control of Mycobacterium tuberculosis infection. J Immunol. 176 (7), 4296-4314 (2006).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Apendix 3, 3 (2001).
- Ramasubramanyan, N., et al. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same. 1, ABBVIE INC. North Waukegan Road, North Chicago, IL, 60064, US. (2014).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Eskandari, M. K., Nguyen, D. T., Kunkel, S. L., Remick, D. G. WEHI 164 subclone 13 assay for TNF: sensitivity, specificity, and reliability. Immunol Invest. 19 (1), 69-79 (1990).
- Hora, M. S., Rana, R. K., Smith, F. W. Lyophilized formulations of recombinant tumor necrosis factor. Pharm Res. 9 (1), 33-36 (1992).
- Ponnappan, S., Ponnappan, U. Aging and immune function: molecular mechanisms to interventions. Antiox Redox Signal. 14 (8), 1551-1585 (2011).
- Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes. Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).
- Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use. mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).
- Männel, D. N., Falk, W. Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide. Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).
- Lis, K., Kuzawińska, O., Bałkowiec-Iskra, E. Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge. Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).
