Abstract
Vurdering af antibiotisk virkning med ny lægemiddeludvikling rettet mod anaerobe bakterier er vanskelig og teknisk krævende. For at få indsigt i mulig MOA kan morfologiske ændringer forbundet med antibiotisk eksponering visualiseres ved hjælp af scanningselektronmikroskopi (SEM). Integration af SEM-billeddannelse med traditionelle killkurver kan forbedre vores indsigt i narkotikahandling og fremme udviklingen af narkotika. For at teste denne forudsætning blev killkurver og SEM-undersøgelser udført ved anvendelse af lægemidler med kendt men forskellig MOA (vancomycin og metronidazol). C. difficile celler (R20291) blev dyrket med eller uden tilstedeværelse af antibiotikum i op til 48 timer. Gennem 48 h intervallet blev cellerne samlet på flere tidspunkter for at bestemme antibiotisk effektivitet og til billeddannelse på SEM. I overensstemmelse med tidligere rapporter havde vancomycin og metronidazol signifikant baktericid aktivitet efter 24 timers behandling målt ved kolonidannende enhed (CFU) landeTing. Ved anvendelse af SEM-billeddannelse fastslog vi, at metronidazol havde signifikante virkninger på cellelængde (> 50% reduktion i cellelængde for hvert antibiotikum, P <0,05) sammenlignet med kontroller og vancomycin. Selvom det fænotypiske respons på lægemiddelbehandling ikke er blevet dokumenteret tidligere på denne måde, er de i overensstemmelse med lægemidlets MOA, der demonstrerer alsidigheden og pålideligheden af billeddannelsen og målingerne og anvendelsen af denne teknik til andre eksperimentelle forbindelser.
Introduction
Clostridium difficile er en gram positiv, sporeformende bakterie, der forårsager ca. 500.000 infektioner årligt i USA og betragtes som et hot-patogen for trusselsniveau ved Centers for Disease Control and Prevention (CDC), det højeste risikoniveau. 1 Det sidste årti har oplevet betydelig lægemiddeludvikling i antimikrobielle stoffer med aktivitet mod C. difficile . 2 , 3 In vitro- undersøgelser er en nødvendig bestanddel af lægemiddeludviklingsprocessen. 4 Traditionelt anvendes in vitro- følsomheds- og tidsdræbningsstudier til validering af fremtidige dyr og andre in vivo- undersøgelser.
Mens disse metoder tjener en vigtig rolle for evaluering af dræbende handling, opfanger de ikke cellernes fænotypiske respons på farmakologisk behandling. Ved at inkorporere scanningselektronmikroskopi (SEM) med standarD killing kinetiske undersøgelser, er en mere grundig karakterisering af de antibiotiske direkte effekter mulig. 5 , 6 , 7 Her præsenterer vi en metode, hvor SEM anvendes som et middel til profilering af effekten af antibiotikabehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering C. difficile fra forskellige miljømæssige eller kliniske kilder
- Miljøisolater: Skab overfladen af ethvert område af interesse (gulv, dør, håndtag, hylde osv. ) Ved hjælp af en præsteriliseret bomuldsmåler (let fugtet med 0,85% NaCl). 8 Sørg for at bære sterile handsker og placere vatpinden i et steriliseret rør efter færdiggørelsen.
- Kliniske isolater (afføring): Plad 10 til 100 mg kliniske afføring prøver på cefoxitin-cycloserin-fructose agar (CCFA) ved anvendelse af en inokuleringssløjfe og inkuber under strenge anaerobe betingelser i 48 - 72 timer. Opbevar isolerede kolonier af C. difficile stamme i cryovials ved -80 ° C til yderligere analyser. 7 , 9 , 10
- Beregn miljøprøverprøverne i hjernen infusion (BHI) bouillon med 0,05% natriumtaurocholat og anbring i et anaerobt kammer ved 37 ° CI 5 dage. Centrifuger 1 ml af kulturen ved 10.000 xg og resuspender pelleten i 100 μl ethanol.
- Plad de resuspenderede celler (50 μl) på cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plader og inkuber i et anaerobt kammer ved 37 ° C i 40-48 timer. Opbevar isolerede kolonier af C. difficile stamme i cryovials ved -80 ° C til yderligere analyser.
- Test mistanke om C. difficile kolonier ved hjælp af latexagglutineringsreagenset eller PCR.
2. Culturing C. difficile og Killing Kinetic Procedures
- Væk rensede miljømæssige eller kliniske C. difficile stammer på blodagarplader i et anaerobt kammer ved 37 ° C i 48 timer.
- Tag en isoleret koloni med en inokulationssløjfe, overfør den til 5 ml BHI-medium i et 15 ml rør og dyrk i 24 timer i et anaerobt kammer ved 37 ° C.
- Fortynd forkulturerne 1: 100 til ca. 10 6 kolonidannende enhedS (CFU) / ml i frisk for-reduceret BHIS (BHI plus 5 g / l gærekstrakt og 1% L-cystein) suppleret med 0,1% natriumtaurocholat og den passende koncentration af antibiotikum (T0).
- Saml en 1 ml prøve med en pipette på hvert tidspunkt (T0, T6, T24, T48) og pladen / spred en lille alikvot (100 μl i seriefortyndinger) på en blodagarplade. Lad cellerne vokse på blodagarpladen i 48 timer i et anaerobt kammer ved 37 ° C og tælle det resulterende antal kolonier for at bestemme CFU.
3. Forberedelse af prøver til scanning af elektronmikroskopi
- Saml 1 ml celler fra hvert tidspunkt i mikrocentrifugerør og centrifuger ved 10.000 xg i 10 minutter. Kassér supernatanten og vask cellerne i PBS.
- Centrifuger prøverne ved 10.000 xg i 10 minutter igen og kasserer supernatanten. Genfortyndede celler i 1 ml 4% paraformaldehyd og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
- Centrifuger prøver igen i 10 minutter ved 10,000 xg og kassere supernatant. Vask cellerne to gange med destilleret vand og redilut i 100 μl destilleret vand. Juster lydstyrken afhængigt af opløsningens turbiditet.
BEMÆRK: At lave flere serielle fortyndinger er en god ide. - Etiket dækker klip og tilsæt 40 μL af prøven på den. Inkubér i 15 minutter i en flowhætte for at fordampe væsken og lade cellerne klæbe til dækslet. Hvis der stadig er væske, skal du bruge en blæser til at fjerne væsken.
- Anbring mærket dækslip med celler i en bordsputtering maskine og tape ned. Fastgør rent guld i forstøvningsmaskinen. Tænd maskinen og start forstøvningen ved lavt tryk (50 mTorr). Coatceller i 30 s ved 80 mA, som oversætter til 20 nm guldbelægning.
- Overfør overtrukne celler til scanningselektronmikroskopet.
4. Imaging C. difficile celler på et scanning elektronmikroskop
- Vent scanningelektronmikroskopet (SEM) korrekt ved prEssing udluftningsknappen på computersoftwaren.
- Ved hjælp af carbon tape fastgøres de overtrukne dækslip på metalfasen. Når SEM er udluftet, skal døren let åbnes. Lås metalfasen i SEM-kammeret ved at skrue den ind.
- Klik på PUMP-knappen på computersoftwaren. SEM'en vil være brugbar, når systemet læser "Vac OK".
- Klik på SE-detektoren under fanen detektorer. Tænd for bjælken ved at klikke på knappen, der viser spændingen. Start billeddannelsen ved en lavere spænding (5 kV), inden du øger spændingen (op til 15 kV). Et billede vises, når strålen er tændt.
- Ved hjælp af sporingsfunktionen finder du et område på de overtrukne dækslip til billedet. Zoom ind i regionen og find stangformede strukturer; Disse er clostridium difficile .
- Zoom ind og fokuser billedet for at kalibrere systemet. Dette skal gøres på flere arbejdsafstande: 15, 9 og 5 mm. Billede i en arbejdsafstand på 5 mm.
- Tænd for digLtra høj opløsning billedbehandling mode og begynder at fokusere og optimere astigmatisme.
- Begynd at fokusere ved høj forstørrelse. Brug det grove og fine fokus skifter til dette. Juster astigmatisme for at få et klarere billede.
- Juster astigmatisme ved høj forstørrelse. For at gøre dette skal du justere astigmatismeskifterne (de ligner de fine / grove fokusknapper) og tjekke billedet for klarhed ved at zoome ind digitalt på computersoftwaren.
- Se funktionen langsom scanning for at indsamle et billede af høj kvalitet. Gem det samlede billede som en .TIFF-fil, som vil blive brugt til analyse. Sørg for, at databaret er valgt, hvis der foretages målinger under analysen.
- Indsamle billeder i forskellige vinkler (op til 52 ° ved manuelt at vende vinklen direkte på SEM. Vinklede billeder har tendens til at afsløre mere dybdeinformation.
- Skift strålespænding afhængigt af de celler, der bliver afbildet. Hold dette for det meste mellem 5 - 15 kV for alle forsøg. Når billeddannelsen er afsluttet, skal du slukke for strålen og hæve arbejdsafstanden til 20 mm. Kammeret kan derefter udluftes, og scenen kan fjernes. Kopier alle billederne til et drev for yderligere analyse.
5. Billedbehandling og analyse
- Download og installer den frit tilgængelige software, FIJI (http://fiji.sc), til computeren.
- Åbn billedfilen i FIJI.
- Ved hjælp af linjelfunktionen skal du nøjagtigt spore skalaen.
- Klik på fanen Analyser i FIJI-programmet og endelig vælg funktionen Select Scale. Der vises et vindue, der kræver indstilling af den kendte afstand baseret på skalaen. Ændre også længdenheden, og klik på OK.
- Nu, hvor programmet er kalibreret for afstand, skal du bruge liniefunktionen til at måle cellelængde. For at opnå længden, brug liniefunktionen til at spore cellen i sin helhed. Vælg fanen Analyser igen, og klik derefter på Mål. Længden skal ca.Øre i de enheder, der tidligere er angivet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Clostridium difficile er en sporeformende bakterie, og det er derfor vigtigt at bestemme morfologiske forskelle mellem vegetative og spore celler forud for enhver funktionel analyse. Figur 1 demonstrerer repræsentative billeder af vegetative celler, der blev fanget under eksponentialfasen af vækstkurven og sporcellerne. Som afbildet er vegetative celler lange, glatte, stangformede strukturer, mens sporer er små, ovale strukturer, der har et groft ydre. Funktionelt vokser og vokser vegetative celler hurtigt og er ansvarlige for virulensen af C. difficile infektioner ved at udskille toksiner, mens sporer normalt er sovende med lille aktivitet. Derfor er antibiotika hovedsagelig aktive mod vegetative celler, mens sporer normalt er resistente over for lægemiddelbehandling, på grund af flere lag, der beskytter kernen med DNA, og manglende fysiologisk aktivitet. På grund af disse fakta er flertalletAf den morfologiske analyse er fokuseret på de vegetative celler. 11 , 12
En antibiotisk drabskurve er standardmetoden til at demonstrere antibiotikabesparelse mod voksende bakterier. Koncentrationer anvendt med C. difficile stamme R20291 var baseret på MICs værdierne, 1 μg / ml for vancomycin og 0,51 μg / ml for metronidazol. 10 Som vist i figur 2 vokser kontrolcellerne og når et plateau, hvorimod de behandlede celler falder i totale kolonidannende enheder (CFU) til detektionsgrænsen (LOD), der demonstrerer bakteriedræbende virkning. Som vist er vancomycin ( figur 2A ) og metronidazol ( figur 2B ) effektive til at dræbe C. difficile ved supraMIC-koncentrationer (4xMIC). Man kan bemærke, at antibiotikumens dræningskurver ser ens ud, men stofferne har forskellige mekanismer af ac(Vancomycin forhindrer cellevægssyntese, mens metronidazol påvirker DNA-replikation). Derfor foreslår vi, at antibiotiske drabskurver måske ikke har nok af diskriminerende kraft til at give detaljerede forskelle mellem disse antibiotika. Vi brugte mikroskopi til at give mere diskrimination.
På grund af sin mikroskopiske størrelse er C. difficile ikke muligt at billede uden høj forstørrelse. Dette har givet mulighed for anvendelse af scanningselektronmikroskopi (SEM), en billeddannelsesmetode, der kan opnå opløsning ved nanometer skalaen, for at vurdere de detaljerede virkninger af antibiotikabehandling direkte på cellerne. For at demonstrere anvendeligheden af denne fremgangsmåde blev celler afbildet før og efter lægemiddelbehandling for at bestemme, hvordan morfologien ændrede sig ( Figur 3A ). Som vist blev nogle af cellevæggene påvirket, som for vancomycin, og nogle af cellerne var mindre i størrelse,Som det var tilfældet med metronidazol. For at teste om cellestørrelse blev påvirket analyserede vi cellelængde ved hjælp af programmet FIJI. Vegetativ celle størrelse kan variere nogle i kontrol kassen, men de fleste er omtrent 6 μm i længden ( figur 3B ). Når man overvejer mange celler fra de kontrollerede og behandlede indstillinger, kan man hurtigt bemærke, at cellelængden påvirkes fortrinsvis i metronidazol, men påvirkes ikke af vancomycinbehandling ( figur 3C ).
Figur 1: Differentiering mellem celletyper ved scanning af elektronmikroskopi. Vist er repræsentative billeder af Clostridium difficile vegetative og spore celler. Vegetative celler er stangstrukturer, som er lange og flagelaterede. I modsætning hertil er sporeceller små og har en grov og humpede frakke. Sporer er pseudo-farvede røde til billede purpoKun ses. Skalestænger vises på billederne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Antibiotiske tid-dræbskurver. SupraMIC-dræbskurver blev båret til fire forskellige antibiotika: vancomycin (A) , metronidazol (B) . Disse antibiotika havde signifikant dræbende virkning mod C. difficile stamme R20291 og nærmede sig detektionsgrænsen (LOD) til tælling af kolonidannende enheder (CFU). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Undersøgelse af de farmakologiske virkninger af antibiotisk behandling. Billeder af behandlede og ikke-behandlede celler blev taget på flere tidspunkter gennem de killingskinetiske undersøgelser (A) . Vist er et repræsentativt eksempel på en kontrol vegetativ celle, der blev målt for længde (B) . Behandlede og ikke-behandlede celler blev målt og sammenlignet (C) . Eksperimenter blev udført i mindst duplikat, og> 17 celler blev målt pr. Gruppe. * P <0,05 sammenlignet med kontrol- og vancomycinbehandlingsgrupper. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med den nuværende undersøgelse var at skabe en høj-gennemstrømningsmetode til isolering af C. difficile og afprøvning af antibiotikaresistibilitet ved anvendelse af scanningselektronmikroskopi (SEM) som et middel til en mere grundig karakterisering af antibiotikas farmakologiske virkning. Ved hjælp af de her beskrevne protokoller har vi vist, at billeddannelse af cellens fænotypiske respons på antibiotisk behandling kan afsløre indsigt i lægemidlets farmakologiske virkning. Samlet set tager billeddannelsesdelen af denne protokol cirka 2 timer i varighed efter opsamling af cellerne, men kan være meget mere diskriminerende end typiske dræbende kinetiske undersøgelser alene. Selvom det er teknisk krævende at lære at bruge en SEM, er forberedelsen af prøver relativt enkel og hurtig. Vi mener, at disse protokoller, der skitseres her, vil give en objektiv tilgang til evaluering af den farmakologiske virkning af antibiotikabehandling.
I betragtning af lighederne mellem tHan antibiotiske drabskurver ( figur 2 ) forsøgte vi at bestemme, om der var forskelle mellem cellens respons på farmakologisk behandling. Ved anvendelse af SEM fastslog vi, at metronidazol havde virkninger på cellelængde ved supraMIC koncentrationer af lægemidlet. Selv om disse fænotyper ikke er blevet rapporteret tidligere, er de i overensstemmelse med antibiotikernes virkningsmekanismer og foreslår en virkning på cellemetabolisme og vækst. I modsætning hertil havde vancomycin signifikante virkninger på cellevæggen, hvilket også er i overensstemmelse med dets virkningsmekanisme. 13 Mens der er ligheder mellem drabekinetikken mellem disse antibiotika, fremgår det af SEM-billederne, at der er betydelige fænotypiske forskelle. Oprettelse af et antibiotisk fænotype bibliotek vil muliggøre en mere grundig karakterisering af lægemidler, der muligvis ikke har en klar virkningsmekanisme, som det er tilfældet med ridinilazol.
becausE denne metode er teknisk udfordrende, kan det være nødvendigt at foretage ændringer for at imødegå det videnskabelige spørgsmål, herunder konsistent celleforberedelse og ændringer i forstøvning af guldbelægning. For meget belægning kan udslette eventuelle effekter på ydersiden af cellerne, men ikke tilstrækkelig belægning kan resultere i opladning af strålen og forvride billederne. For at undgå dette skal du lave prøver med forskellige mængder guldbelægning for at optimere sputteringstiden. Endelig vil konsistent metodologi mellem undersøgelser muliggøre inter-eksperimentelle sammenligninger.
En begrænsning ved anvendelse af SEM er, at den er begrænset til at observere cellemorfologiske forandringer; Derfor er funktionelle undersøgelser nødvendige for at bekræfte enhver formodet reaktion. På grund af dette mener vi, at denne billeddannelsesprotokol kan bruges til at styre funktionelle undersøgelser. På trods af denne begrænsning kan immunogold mærkning udføres ved hjælp af SEM for at bekræfte eventuelle formodede ændringer i proteinhandel eller aggregering;Vi har dog endnu ikke gennemført disse eksperimenter.
På grund af den aktive rørledning af nye antibiotika til behandling med C. difficile er en mere grundig evaluering af lægemiddelvirkning nødvendig. Som fremlagt her, tilbyder SEM en unik, høj gennemstrømning og pålidelig mulighed for at karakterisere farmakologisk virkning. Ved billeddannelse af mange forskellige antibiotiske virkninger blandt forskellige stammer af C. difficile , vil vi være i stand til at forstå, hvorfor nogle antibiotika er mere effektive end andre mod specifikke patogene stammer som 027 / NAP1 / BI epidemisk stamme. 14 SEM-analyse kan desuden være nyttigt at diskriminere antibiotiske virkninger mellem ribotyper eller stammer og kunne bruges til at studere andre bakteriearter, der demonstrerer dens brede anvendelighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75 x 25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
References
- Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
- Vickers, R. J., et al. Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection. Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).
- Shah, D., et al. Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance. Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).
- Ambrose, P. G., et al. New EMA guideline for antimicrobial development. Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).
- Bassères, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Endres, B. T., et al. A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile. Anaerobe. 40, 10-14 (2016).
- Endres, B. T., et al. Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes. Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).
- Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs. Anaerobe. 27, 31-33 (2014).
- Aitken, S. L., et al. In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent. Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).
- Basseres, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy. Gut. 24 (3), 206-212 (1983).
- Chilton, C. H., et al. Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery. J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).
- Ofosu, A. Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies. Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).
- McDonald, L. C., et al. An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile. New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).
