Summary
Viral-avledet peptider koblet til antistoff-conjugates (ACs) er en tilnærming frammarsj på grunn av potensialet å levere molekylær nyttelast med økt svulst celle akkumulering. Utnytte vanlige metoder for å evaluere peptid Bøyning, AC og nyttelast intracellulær akkumulering og svulst målretting, hjelper denne protokollen forskere fra viktige utviklingen faser.
Abstract
Antistoff-conjugates (ACs) endret med virus-avledet peptider er en potensielt mektig klasse av svulst celle levering agenter for molekylær nyttelast brukes i kreftbehandling og tenkelig på grunn av økt mobilnettet akkumulering over gjeldende ACs. Under tidlig AC i vitro er utvikling, fluorescens teknikker og radioimmunoassays tilstrekkelig for å bestemme intracellulær lokalisering, akkumulering effektivitet og målet cellen spesifisitet. Foreløpig er det ingen enighet om standardiserte metoder for å lage celler for å vurdere AC intracellulær akkumulering og lokalisering. Den innledende testingen av ACs endret med virus-avledet peptider er viktig spesielt hvis flere kandidater har blitt konstruert. Bestemme intracellulær akkumulering av fluorescens kan påvirkes av bakgrunnen signalet fra ACs på celleoverflaten og komplisere tolkningen av akkumulering. For radioimmunoassays, vanligvis behandlet celler er fraksjonert og radioaktiviteten i ulike celle rom målt. Men cellen lysis varierer fra celle til celle og ofte kjernefysiske og cytoplasmatiske rom er ikke godt nok isolert. Dette kan gi misvisende data på nyttelast levering egenskaper. Intravenøs injeksjon av radiolabeled virus-avledet peptid-endret ACs i svulst bærer mus etterfulgt av radionuklidenes bildebehandling er en kraftfull metode for å bestemme svulst målretting og nyttelast levering egenskaper på den i vivo fasen av utvikling. Men dette er en relativt ny framgang og få grupper har evaluert virus-avledet peptid-endret ACs på denne måten. Vi beskriver behandlingen av behandlet celler mer nøyaktig evaluere virus-avledet peptid-endret AC akkumulering ved AC confocal mikroskopi og radioimmunoassays. Spesielt bundet en metode for trypsinizing celler å fjerne celleoverflaten ACs. Vi tilbyr også en metode for å forbedre cellulære fraksjoneres. Til slutt gir denne protokollen en i vivo metode bruke fantes et positron utslipp tomografi (PET) for å vurdere første svulst målretting egenskaper i svulst rentebærende mus. Vi bruker den radioisotop 64Cu (t1/2 = 12,7 h) som et eksempel nyttelast i denne protokollen.
Introduction
Antistoff-conjugates (ACs) er biopharmaceuticals som er modning i en transformerende klasse av effektiv legemidler for utviklende kreft behandlinger og påvise svulster. Består av et monoklonalt antistoff (mAb) konjugert til molekylær nyttelast som radioisotopes, små molekyler og biologiske giftstoffer, ACs er i stand til å levere disse nyttelast til kreftceller med utsøkt målet antigen tilhørighet og spesifisitet. Dermed ACs har potensiale til betydelig redusere uspesifikke toksisitet og øke nyttelasten aktivitet på webområdet svulst. Terapeutisk, er ACs transport cytotoksiske små molekyler (ofte referert til som antistoff-stoff conjugates) godkjent for behandling av pasienter med brystkreft og Hodgkins lymfom som har mislyktes konvensjonelle behandlinger 1, 2. I tillegg ACs transport radioisotopes (ofte referert til som radioimmunoconjugates) er også under utvikling. AC transport en radioisotope for bildebehandling er godkjent for å identifisere prostata kreft metastasering 3. Med mange mer terapeutiske ACs sendt for godkjenning 4, er optimisme høy for fremtiden for ACs å forbedre kreft omsorg 5.
Likevel, når leverer chemotherapeutics eller radioisotopes, ACs har problemer effektivt samler disse nyttelast i målcellene. Dette aspektet referert i mange tilfeller manglende evne av ACs å gi langvarig sykdom-fri overlevelse eller Høykontrast tumor imaging 6,7. Generelt, når ACs binde deres mål antigenet er de internalisert gjennom en prosess kjent som reseptor-mediert endocytose. ACs deretter fanget inne endosomes og smugles i lysosomer til fornedrelse og nyttelast slipp 8. Intracellulær menneskehandel prosessen gir utfordringer for ACs å oppnå en høy nyttelast spesifisitet og effekt mot mål kreftceller. For eksempel mange antigener som Her2 (mål for terapeutisk AC Trastuzumab-emtansine) kan resirkulere opptil 85% av bundet antistoffer i første 30 min 9. Videre, når fornedrelse skjer, utgitt chemotherapeutics og radioisotopes kan aktivt eksporteres av økt uttrykk og/eller aktivitet av membran forbundet transport proteiner 10,11. Lysosome fornedrelse også hindrer leveringen av romanen biologiske nyttelast som terapeutiske enzymer og oligonucleotides som kan være deaktivert 12,13. Prinsipielt er kreftcelle svært effektiv på lertid nødvendig intracellulær akkumulering av payloads levert av ACs.
Denne protokollen beskriver hvordan du implementerer konseptet ACs-kombinert med virus-avledet peptider, spesielt for å unnslippe endosome entrapment og lokalisere til cellekjernen. Med slike raffinement å manipulere vertssystemer cellen, er det ikke overraskende at utviklingen av virus-avledet proteiner og peptider som potensielle biopharmaceuticals lenge er inngrodd i terapeutisk forskning 14. Angi vertsceller for millioner av år virus har utviklet seg til å erverve en eksepsjonell samling av proteiner utnytte normal fysiologiske pattedyr celle systemer for å effektivt. For virus som er internalisert via reseptor-mediert endocytose, er de også utfordret med rømmer handel til lysosome der angrep av en lokalisert konsentrasjon av proteaser kan være problematisk for overlevelse. Et godt preget viral-avledet peptid benyttet i narkotika-leveranser for å unnslippe endosome entrapment er humant immunsviktvirus transactivator transkripsjon (Tat) protein 15. TAT er stand til å unnslippe endosome entrapment ved sensing lav-pH da protein conformational endringer skje slik at Tat å sette seg inn i og forstyrre endosomal membran 16. Dette resulterer i Tat-nyttelast conjugates tilgang cytoplasma. Det andre viral manipulasjon elementet relatert til denne protokollen er fremgangsmåten som brukes til å levere terapeutiske gener og narkotika til kjernen 17. Virus har utviklet for å kunne manipulere verten celle maskiner for å komme videre forbi de kjernefysiske membranen av passerer gjennom kjernefysiske pore komplekse (NPC). Mobilnettet makromolekyler inneholder (eller binde proteiner som inneholder) kjernefysiske lokalisering signaler (NLSs) nødvendige for binding til kjernefysiske transportere proteiner (f.eks karyopherins α og β), som gir de nødvendige bevegelsene gjennom NPC. Virus har utviklet proteiner inneholder NLS sekvenser som gir dem muligheten til å utnytte verten celle transport proteiner for skytling i kjernen 18.
Mange ACs tidligere er functionalized med Tat - og NLS-avledet peptider og testet for deres evne til å samle inne kreftceller og målretting svulster 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (tabell 1). Studier levere cytotoksiske nyttelast har vist at ACs endret med virus-avledet peptider er betydelig øke mobilnettet akkumulering, cytotoksisitet og svulst drepe over uforandret ACs 22,26. Felles er for denne romanen klassen av AC deres konstruksjon. Peptider inneholder vanligvis en terminal cystein gir en gratis sulfhydryl gruppe. MAbs er første reagert med en noncleavable bifunctional crosslinker som inneholder N- hydroxysuccinimide (NHS) og maleimide grupper på motsatte ender. NHS estere reagerer med primære aminer på mAb å danne amid obligasjoner. Den reagert mAb med gratis maleimide grupper er deretter reagerte med sulfhydryl grupper på peptidene å danne en thioester bånd og dermed knytte peptid og mAb. Selv homobifunctional crosslinkers ha vært brukt 28, heterobifunctional crosslinker er mer vanlig i byggingen av virus-avledet peptid-ACs 22,23,26, 31,32. Denne protokollen bruker spesielt crosslinker sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) for sin brukervennlighet og fordi den brukes i godkjent antistoff-stoffet konjugat Trastuzumab-emtansine og mange virus-avledet peptid-ACs 8,22,23,26,31,32. Natrium dodecyl sulfate polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side) er den primære metoden for først å bestemme Bøyning effektivitet og semi kvantifisere antall peptider per mAb. AC confocal mikroskopi bruker en fluorescently-merket sekundære antistoffer spesifikke for mAb er vanligvis metoden for å først vurdere intracellulær distribusjon egenskapene for virus-avledet peptid-endret ACs. Så langt, er radioisotopes de primære nyttelastene levert av virus-avledet peptid-endret ACs. Radioisotopes er en fordel fordi radioaktivitet i celler er lett kvantifisert ved gamma teller. I tillegg ACs som er oversatt til musen modeller av kreft hos mennesker gir forskere mulighet til å evaluere svulst målretting bruker molekylær tenkelig modaliteter som enkelt Foton utslipp beregnet tomografi og fantes et positron utslipp tomografi (PET) 23 , 32 , 33., bygging og godkjenningen testing metoder primært brukes av forskere gir en meget god vurdering av ACs endret med virus-avledet peptider under den første utviklingsfasen effektivt angi og levere den nyttelast inne målet celler og målet svulster.
TAT - og NLS-endret ACs har opplyst nøkkelområder for ytterligere å forbedre nyttelast levering inne kreftceller og svulster. Med hensyn til NLS-endret ACs, kan effektiviteten intracellulær opphopning være beskjedne 23,31,34. Ineffektiv intracellulær akkumulering skyldes fortsatte endosomal entrapment. I vivo svulst målretting kan også bli redusert med både Tat - og NLS-endret ACs. De aktive sekvensene av Tat og NLS inneholder flere positivt ladet rester. Knyttet til mAbs, kan den generelle kationisk være betydelig økt 35. Som en konsekvens har av Tat - og NLS-endret ACs økt opptak i friske vevet og økt rask blod klaring.
Vår gruppe utviklet en sammensatt blanding bestående av cholic acid knyttet til NLS (ChAcNLS; Figur 1). ChAcNLS endret ACs kan øke intracellulær opphopning av leverte radioisotopes og forbedre svulst målretting sammenlignet NLS-modifisert og tradisjonelle ACs 33,34. Mekanismen bak cholic syre er inspirert av evnen til å velge nonenveloped virus som ikke kan stole på membran fusion å utnytte cholic syre utløse endosome rømme gjennom dannelsen av ceramide. For eksempel rekrutter svin enteric virus cholic syre som aktiverer sphingomyelinase, som gir hydrolyse av sphingomyelin i ceramide 36,37,38. Dette destabilizes endosomal membran og tillater virus flukt. Dermed er cholic syre en annen virus-avledet komponent som utfyller NLS.
Dette feltet beveger seg fremover og fremtidige forekommer fremskritt i nyttelast levering av ACs endret med virus-avledet peptider, det er en anledning til å gi visuelle demonstrasjoner av deres biokjemiske og funksjonelle egenskaper under utviklingen. Her beskriver vi våre protokollen for innledende vurdering av virus-avledet peptid-endret ACs for effektiv ennå enkel fastsettelse av intracellulær akkumulering og svulst målretting under tidlig utvikling. Vi bruke kommersielt tilgjengelige mAbs 7G 3 og A14 som eksempel modellsystemer. Fremgangsmåte 1 beskriver bruken av SDS side som en metode som gir ' go/no go' beslutninger for konstruert ACs. Prosedyre 2 beskriver en metode med trypsinization gir forbedret visualisering av AC intracellulær distribusjon og akkumulering. Fremgangsmåten 3 beskriver en metode for forbedret intracellulær fraksjoneres å nøyaktig fastslå kjernefysiske lokalisering. I denne fremgangsmåten vi utnytter den nyttelast 64Cu (t1/2 = 12,7 h) fordi det er utsatt for mobilnettet middelklasseinnbyggere og er en fantes et positron emitter 10. Dermed beskriver prosedyren 4 i vivo svulst målretting karakterisering av PET imaging å visualisere svulst opptak i forhold til bakgrunnen (dvs. nontarget sunt vev) og finne ut om eksempelet AC kan spesielt og effektivt målet svulster. Disse metodene er tilstrekkelig for etterforskere utvikle ACs endret med virus-avledet peptider å identifisere kandidater for videre utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I vivo dyreforsøkene beskrevet ble utført etter en godkjent protokoll og etiske retningslinjer sentrum Hospitalier Universitaire de Sherbrooke etikk for dyr eksperimenter.
1. antistoff peptid Bøyning
Merk: ChAcNLS kan syntetiseres til enhver kommersiell peptid produsenten eller universitet-tilknyttede peptid synthesis tjenesten plattform. Syntese av ChAcNLS finnes i referanse 34. For prosedyrer 1 og 2 bruke mAb 7G 3, som er spesifikke for leukemi antigen IL-3Rα 39.
- I en 1,7 mL microcentrifuge tube, Forbered en 10 mg/mL (~ 1 mg totale antistoff) løsning 7G 3 i fosfat bufret saltvann (PBS), pH 7.6.
- Løs opp sulfo-SMCC i dimethyl sulfoxide (DMSO) i en konsentrasjon av 5-10 mM. Vortexing løsningen fungerer grundig best for å oppnå fullstendig oppløsning.
- Legge til røret som inneholder 7G 3 oppløst sulfo-SMCC løsningen (vanligvis mellom 5-20 μL avhengig av molar forholdet av sulfo-SMCC-til - 7G 3 ønsket). Testing sulfo-SMCC-til - 7G 3 prosenter av 10 - 25- og 50-til-1 anbefales. Inkuber ved romtemperatur 1t.
-
Rense og konsentrere det maleimide-derivatized 7G 3 ved hjelp av en ultrafiltrasjon enhet og buffer utveksling i PBS, pH 7.0. Sentrifuge 8000 x g for ca 5 min. Forkast strømme gjennom og fyll med PBS, pH 7.0 og sentrifuger igjen.
- Utføre dette 7 - 8 ganger helt utveksle bufferen. Gjenopprette konsentrert 7G 3 protein ved å plassere filter enheten opp ned i en ren microcentrifuge tube. Sentrifuger i 2 minutter på 1000 x g. gjenopprettingsvolumet bør være ca 0,3 mL
- I røret som inneholder maleimide-aktivert 7G 3, legge 2-fold molar overskudd av ChAcNLS i forhold til sulfo-SMCC-til - 7G 3 forholdet i forrige trinn og ruge over natten på 4 ° C. For eksempel hvis 10-til-1 sulfo-SMCC-til - 7G 3 forholdet ble brukt, deretter bruke 20-til-1 ChAcNLS-til - 7G 3 forholdet. Totalvolum bør ikke endres betydelig.
Merk: Selv om ChAcNLS ikke forårsaker nedbør i Bøyning prosessen er dette en mulighet som kan oppstå med andre peptider. Observere røret under reaksjonen for underskriver av nedbør, som sannsynligvis er forårsaket når peptider hydrofobe. I disse tilfellene kan det være verdt revisiting peptid rundt utforme endringer å gi økt hydrophilicity. - Konsentrere 7G 3-ChAcNLS bruker en ultrafiltrasjon enhet til ønsket konsentrasjon og buffer exchange i PBS pH 7.4 (se trinn 1.4). Utvinning avkastningen totale protein skal ≥ 75% av opprinnelige utgangsmaterialet.
- Utføre SDS-side for å evaluere de konstruert 7G 3-ChAcNLS kandidatene med en 12% polyakrylamid gel (gir tilstrekkelig separasjon av ChAcNLS konjugert tunge og lette kjedene fra nonconjugated kjeder). Bland 10 μg av 7G 3-ChAcNLS i lasting buffer inneholder 2 μL β-mercaptoethanol og laste inn i brønnen.
- Angi riktig spenning (120 V 1t for en 12% gel) og kjøre geleelektroforese. Slutte geleelektroforese når Coomassie fargestoff foran når bunnen av gel.
Merk: Ikke la Coomassie fargestoff front drives av gel. - Fjern gel fra geleelektroforese apparatet og skyll med destaining løsning som inneholder 10% v/v av iseddik og 20% v/v metanol.
- Ta et bilde av gel og med linjalen og måle avstanden (cm) overført for standarder og 7G 3 conjugates. Beregne oppbevaring faktor (Rf) verdien, som er avstanden overført med gel lengden (fra hvor protein er lastet Coomassie overføring foran). Plot molekylvekt (MW) i loggen mot Rf-verdien fra hver protein standard og ekstrapolere størrelsen på 7G 3 conjugates.
- Beregn antall peptider per antistoff ved å dele forskjellen i MW 7G 3 conjugates og uendret 7G 3 ved 1768.5 g/mol (MW av ChAcNLS).
- Ta digitale bilder av Coomassie-farget gel og utføre densitometry analyse. På dette punktet, kan bly utvelgingsprosessen være basert på AC med maksimalt antall ChAcNLS molekyler som ikke inneholder betydelige samlede arter.
2. AC confocal mikroskopi for intracellulær akkumulering evaluering
Merk: Det er viktig å teste celle selektivitet av intracellulær opphopning av peptid-modifisert mAbs før utvikle formuleringer med en payload rundt. Fordi Tat har også vist seg å ha en tilbøyelighet for uspesifikke celle penetrasjon, er det verdt første analyse intracellulær akkumulering og celle selektivitet før foretaket kostbare utvikling trinn med dyre nyttelast. Derfor bør prosedyren 1 også endre isotype bestemt irrelevante kontroll mAbs. For resten av protokollen vil vi arbeide med ACs endret med 10 ChAcNLS molekyler per antistoff. En skjematisk inkludert nøkkeltrinn for prosedyrer 2 og 3 er beskrevet i figur 2.
Advarsel: Dette trinnet av protokollen innebærer håndtering og manipulering av paraformaldehyde. Følg instruksjonene fra produsenten når du håndterer.
- Behandle målcellene TF-1a med 200 nM i 7G 3-ChAcNLS inkludert endret kontroll mAbs. Inkuber 5 x 106 antigen-positive celler med conjugates 1t på 37 ° C.
- 1 h, fjerne nedbryting og vaskes med 1 mL 3 x i iskalde PBS. Legge til friske medier og Inkuber en ekstra time på 37 ° C.
-
Den ekstra timen, fjerne nedbryting og vaskes 3 x i 1 mL iskald PBS. Legg til 0,5 mL PBS inneholder 0,25% trypsin og ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) på 37 ° C for 3 opp til 30 min.
Merk: Under piloten testing anbefales ikke trypsinize celler for å finne forskjellene i AC intracellulær akkumulering. Denne protokollen fremmer bruk av trypsin og viser vi hvordan dette forbedrer vurdering av intracellulær akkumulering effektive forskjellige AC kandidater.- Teste de ulike tidspunktene for inkubasjon visuelt merker for alle cellene blir koblet fra. I tillegg ruge celle dele med levedyktighet flekker løsninger og utføre flyt cytometric analyse som beskrevet tidligere 40.
- Nøytralisere trypsin med 1,5 mL cellekultur RPMI 1640 media/10% fosterets bovin serum. Sentrifuge cellene på 500 x g i 5 min, fjerne nedbryting og vaske 3 x i 0,5 mL iskald PBS.
- Fastsette celler i 0,5 mL PBS som inneholder 1% paraformaldehyde og 1% Sukrose på is 30 min. vask celler 3 x i 0,5 mL iskald PBS og sentrifuge 250 x g for 5 min. Permeabilize celler i 0,5 mL PBS 0,15 prosent Triton X-100 for 5 min på is. Vask celler i iskalde PBS og gjenta sentrifugering.
-
Suspendere celler i 0,1 mL PBS inneholder 2 μg/mL (eller produsenten anbefalte konsentrasjon) av en anti-Trouble (isotype bestemt) Fc sekundære polyklonale antistoff konjugert til AlexaFluor 647 1t ved romtemperatur i mørket.
- Sentrifuge 250 x g for 5 min og vask celler 3 x i 0,5 mL iskald PBS. Suspendere celler i 0,5 mL PBS.
PAUSE: Celler kan lagres i kjøleskapet.
Merk: Det er viktig å velge en sekundær antistoff som gjenkjenner den riktige isotype av mAb rundt. AF647 er valgt på grunn av sine infrarød utslipp, som ikke forstyrrer propidium iodide (PI) flekker av kjernen.
- Sentrifuge 250 x g for 5 min og vask celler 3 x i 0,5 mL iskald PBS. Suspendere celler i 0,5 mL PBS.
- Legge til PI i en konsentrasjon av 10 μg/mL beholderen med celler. Deretter montere 1 x 105 celler på glass lysbilder med monterer medier og dekk med et glass dekkglassvæske.
- Undersøke celler med en Plan Apo 60 X nedsenking oljeobjektiv NA 1.42 på en invertert laserskanning AC confocal mikroskop. Oppdage PI fluorescens 488 nm argon laser og spectral skanning prisme satt til 600-650 nm. AF647 bruke fluorescens 633 nm helium-neon laser og spectral skanning prisme satt for 650-700 nm. Samle fluorescens utslipp fra PI og AF647 sekvensielt.
Merk: Bruke den samme innstillingen hele evaluering og sammenligning av cellene. Men må du justere innstillinger for trypsinized celler i forhold til ikke-trypsinized celler. - Bruk mikroskop programvare for å hente bilder. Samle bilder ved hjelp av føljetong vannrett optisk deler av 1024 x 1024 piksler med 2 X linje snitt tatt på 0,5 μm intervaller gjennom hele cellen tykkelsen. Presentere bildene som stablet z-anslag fra fire påfølgende skiver på maksimal fluorescens intensiteten.
- Analysere celler med mikroskopet programvare. Registrere mobilnettet fordelingsmønster av conjugates. Evaluere om intracellulær fluorescens i cytoplasma er gruppert og nær cellen overflaten eller diffuse og homogen. Også vurdere relativ fluorescens intensiteten per celle.
3. radiolabeled AC konstruksjon og mobilnettet fraksjoneres for vurdering av 64 Cu intracellulær levering effektivitet
FORSIKTIG: Prosedyrer 3 og 4 involverer håndtering og manipulering av radioaktivitet. Før du utfører disse trinnene, bør forskere har godkjent sikkerhetsopplæring og protokoller godkjent fra deres hjem institusjonens stråling sikkerhet myndighet.
Merk: Prosedyrene 3 og 4 bruker vi mAb A14, som er spesifikk for invasiv blære kreft antigen IL-5Rα41. Også er alle eksperimentene tidsavhengig grunnet den korte halveringstiden av 64Cu. Generelt, er det best å ikke vente siste 1 uke å utføre i vitro eksperimenter og ikke lengre enn 72 h for studier i vivo .
- I en 1,7 mL tube avbryte 2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic syre (NOTA-NHS) DMSO til en konsentrasjon av 10 mM.
- Reagere 50-fold molar overskudd av NOTA-NHS med A14 (2 mg starter materiale) i 0.1 M natriumbikarbonat ved pH 8.6 1t ved romtemperatur i et volum ≤ 0,5 mL (siste NOTA-NHS volumet ikke bør overstige 2% v/v av totalt volum).
- Rense og buffer-utveksling NOTA-A14 bruker en ultrafiltrasjon enhet i PBS, pH 7.6 (se trinn 1.4).
- Etterfølgende feste ChAcNLS, følger du trinnene 1.2 til 1.6.
- Reagere NOTA-A14-ChAcNLS (250 μg grupper) med 100 megabecquerel (MBq) av 64CuCl2 i 0.1 M natriumbikarbonat, pH 5.5 1t på 37 ° C ≤ 0,1 mL. 64 Cu produseres på TR-PET-cyclotron på CIMS 42.
- Konsentrere 64Cu-A14-ChAcNLS i PBS pH 7.4 bruker en ultrafiltrasjon enhet til ønsket konsentrasjonen (se trinn 1.4).
-
Bestemme radiolabeling effektiviteten av 64Cu-A14-ChAcNLS av instant tynne lag kromatografi (ITLC) bruker kromatografi strimler og 0.1 M, pH 5.5 natriumsitrat (ITLC eluent) som løsemiddel. Bruke 0,5 μL aliquot reaksjon løsningen til ITLC strip. Utføre en autoradiograph av stripen og få et digitalt bilde.
- Utføre densitometry å få andelen bundet og gratis 64Cu. Hvis gratis 64Cu innhold > 5%, gå tilbake til forrige trinn og utføre flere rensing.
- I tillegg Utfør SDS-side med Coomassie flekker for å evaluere samlinger. Utføre en annen SDS-side etterfulgt av en autoradiograph av gel for å fastslå om det er radiolabeled samlet arter.
-
Affinitet bindende kvalitet sjekkpunkt: ruge 64Cu-A14 conjugates på økende konsentrasjoner (0-100 nM) i duplikat med 1 x 106 målet celler per mL. Beregne uspesifikke bindende, blande like prøver av 64Cu-A14 conjugates med celler i nærvær av 100-fold molar overskudd av umerkede A14.
- Etter 1 h inkubasjon på is, vask celler og telle totalt bundet antistoff prøver og totale uspesifikke bundet antistoff prøver en gamma-teller. Vise bestemte binding (totalt bundet antistoff - uspesifikke bundet antistoff) mot reaktive gratis 64Cu-A14 (nM) brukes i analysen. Bestemme dissosiasjon konstant (Kd) av lineær regresjon bruker grafisk programvare.
- For 64Cu mobilnettet akkumulering studier: behandle celler med 100 nM av 64Cu-merket A14 conjugates 1t, 6 h, og 24 h på 37 ° C som tidligere beskrevet33. Inkluder ekstra parametere som behandling i nærvær av uforandret A14 å blokkere IL-5Rα nettsteder og 4 ° C blokkere reseptor-mediert internalisering.
- Samtidig definert poeng, som beskrevet tidligere i trinn 2.3 - 2.3.2, Legg til 0,5 mL av PBS med 0,25% trypsin og EDTA på 37 ° C etterfulgt av nøytralisering og vask.
- Inkuber celler i plasma membranen lyseringsbuffer som inneholder 1% NP-40, 10 mM Tris pH 7.5 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 buffer på is 10 min. sentrifuge plasma membran-lysed cellene på 90 x g i 5 min.
- Fjern nedbryting og plasser i frisk rør. Dette representerer cytoplasmatiske brøkdel. Vask kjerner 3 x i iskalde PBS og legge vasker til cytoplasmatiske brøk.
- Sikre ampuller med kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner er forseglet. Plass dem i en gamma counter kalibrert for 64Cu for å konvertere raw teller til MBq.
-
Bestemmer kvaliteten på kjerner isolasjon ved å utføre Western blot analyse for ved A/C, et begrenset kjernefysiske protein og Rab7, en rikelig cytoplasmatiske protein på hele celle lysate, kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner.
- Behandle 5 x 106 celler med 500 μL radio-immunoprecipitation-analysebuffer (RIPA) og plasma membranen lyseringsbuffer i trinn 3.12 inneholder 1%, 2% og 4% NP-40. Videre behandle isolert kjerner i 500 μL RIPA buffer å få isolerte kjernefysiske proteiner.
- Utløse isolert kjernefysiske, cytoplasmatiske og hele celle proteiner bruker 4 x prøve volumet av kaldt aceton for 60 min på 20 ° C. Sentrifuge 13.000 x g i 10 min og Dekanter nedbryting pass på ikke å løsne protein-pellets. Tilsett 100 μL av PBS å oppløse proteiner.
- Legg 10 μg protein i hver brønn av en 10% SDS side gel. Utfør geleelektroforese som beskrevet i 1.7-1.9. Utføre Western Blot transfer som beskrevet tidligere i refeference 43.
- Identifisere stigen markører som best tilsvarer en MW ~ 40 kDa. Halvert membranen på denne indikatoren. Sonde blot med høyere MW proteiner med Lamin A/C-spesifikke antistoffer. Sonde membranen med lavere MW proteiner med Rab 7-spesifikke antistoffer. Western blot er en godt kjent teknikk og beskrevet ikke i denne protokollen.
4. PET Imaging evaluering av svulst målretting
Merk: Teknikker for implanting kreftceller i mus til å generere heterotopic xenografts er godt kjent de fleste laboratorier har in-house protokoller skreddersydd for svulst systemet. Dermed er dette ikke dekket i protokollen. Den xenograft modellen blir nonobese diabetiker/alvorlig kombinert immunodeficient (NIKKER/SCID) mus bærer IL-5Rα-positiv invasiv blæren svulster HT-1376 og HT-B9. IL-5Rα-positiv invasiv blæren kreftceller utgjør > 66% av totale celler i xenograft. Derimot var bare ~ 11% av IL-5Rα-positiv HT-B9 celler inneholdt i utviklede xenografts41. Dermed gir denne modellen et utmerket eksempel for evaluering av AC svulst målretting i to svulster som representerer overskuelig pasienten svulst heterogenitet.
- I grupper som inneholder ≥ injisere 4 (NIKKER/SCID) mus, 20-30 μg (6-9 MBq) 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS og 64Cu-A14 i halen venen.
- Plass en sylindrisk phantom (24.8 mL) som inneholder 5 MBq 64Cu konvertere radioaktivt teller per sekund til injisert dose per gram vev (%ID/g) på samme dag.
- Vent 48 timer og deretter bedøve mus ved å plassere dem i en induksjon kammer med 1,5 L/min oksygen flyt med 2% isoflurane. Bruke sterilt ophthalmica salve på musen øyne etter induksjon og før plassering i PET skanner.
- Raskt overføre musen til en PET skanner tabell i headfirst utsatt posisjon med en nesen kjegle for isoflurane. Posisjon åndedrett og endetarms sonder og overvåke temperatur og åndedrett hastighet slik at fysiologiske forhold er opprettholdt under eksperimentet som tidligere beskrevet 44.
- Starte PET datainnsamling ved hjelp av en vanlig prøvetaking innstilling og en energi vindu av 250-650 keV. En 45-minutters statisk skanning per musen er vanligvis nok til å gi tilstrekkelig sammenfallende hendelser for gjenoppbygging og produksjon av høy kvalitet PET bilder.
- Etter 64Cu-AC skanningen, fjerne musen fra skanneren og sett den tilbake i buret. Tillate musen tilstrekkelig gjenopprette før retur til dyr anlegget.
- Få rekonstruert bilder med 20 gjentakelser av en tredimensjonal Maksimal sannsynlighet forventning maksimering algoritme.
-
Utføre område av interesse (ROI) analyse av svulsten og visuelt assessable organer ved hjelp av AMID programvare.
- Tegn ROIs for å få kvantitative %ID/g data av manuelt ved hjelp av innstillingen for verktøyet for 3D-Frihånd og nøye avgrense tumorer eller tilstøtende lår muskel. Teller per piksel i Avkastningen vil bli konvertert til %ID/g i forrige 4.2.
- Sammenligne 64Cu-A14, 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS bilder svulst kontrast, og kvantitative ROI % ID/g, og svulst-til-bakgrunn prosenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For prosedyren 1, bygging av 7G 3 endret med ChAcNLS med sulfo-SMCC som en crosslinker er svært pålitelig. Vanligvis når lastet opp på en 12% gel og analyseres av SDS side, dette resulterer i skjelnes gradvis økning i MW proporsjonal med økende sulfo-SMCC-til - 7G 3 prosenter brukes og tillater tunge og lette kjedene blir individuelt vurdert for ChAcNLS Bøyning (Figur 3). 7G 3 reagert på 10, 20, 25- og 50-til-1 sulfo-SMCC-til - 7G 3 prosenter etterfulgt av Rf måling og MW ekstrapolering resulterer i 3, 7, 10 og 20 ChAcNLS molekyler per 7G 3. Densitometry er prosent monomer arten > 90% for 7G 3 endret med 3-10 ChAcNLS. For 7G 3-ChAcNLS20 er samlet arter 45%. Dette viser SDS-siden er enkel, men effektiv for å velge en 7G 3-ChAcNLS bøy for videre utvikling. Selv om liten smøre med antistoff kjeder kan oppstå grunn antistoff glykosylering forstyrrer dette ikke identifikasjon av samlet arter.
Prosedyre 2 viser representant dataene forskjellene mellom bruk av trypsin og ingen trypsin når du vurderer virus-avledet peptid-endret ACs for intracellulær effektivitet akkumulering. I dette eksemplet kan evne til 7G 3-ChAcNLS å øke intracellulær opphopning evalueres i cellene behandlet med og uten trypsin (Figur 4). Men er betydningen av trypsinization tydelig når tolke opphopning av conjugates brukes til sammenligning for å bestemme AC effektivitet og selektivitet. Trypsinization tillater grunnlinjen intracellulær fluorescens nivå etableres observert med uforandret 7G 3. En kan detalj at 7G 3 er begrenset til cytoplasma i små foci. Derimot celler som ikke er trypsinized, 7G 3-spesifikt fluorescens er begrenset til celleoverflaten på grunn av overuttrykte IL-3Rα på cellens overflate. Dette gjør det vanskelig å undersøke intracellulær akkumulering og distribusjon fordi fluorescens på celleoverflaten dominerer, og dermed blokkerer den intracellulær fluorescensen fra å bli visualisert. Trypsinizing celler er også viktig når du vurderer spesifisitet som bevis med IgG-ChAcNLS. Vi kan se at det er noen ikke-spesifikk fluorescens fra celleoverflaten, men vil ikke kunne fastslå hvilket intracellulær akkumulering skyldes peptid hvis cellene ikke var trypsinized. Til slutt, uten trypsinization kan en feilaktig tolker at en nyutviklet AC ikke akkumuleres i målcellene. Sett med 7G 3-NLS, celler som ikke trypsinized fleste fluorescens er igjen fra celleoverflaten. Etter trypsinization, kan man observere at 7G 3-NLS akkumuleres, men begrenset, i målcellene.
For prosedyren 3 viser representant dataene kvalitetskontroll for konstruksjon, tilhørighet og i vitro nyttelast levering effektivitet og spesifisitet for radioisotop 64Cu med A14-ChAcNLS. Densitometry utføres på røntgen bilder tatt fra en 12% polyakrylamid gel inneholder 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS, eller 64Cu-A14-ChAcNLS viser at de radiolabeled conjugates er 100% monomer arter (figur 5A). 64 Cu-A14-ChAcNLS viser nanomolar affinitet for IL-5Rα. A14-ChAcNLS som en funksjon av økende konsentrasjoner av 64Cu-A14-ChAcNLS avslørt bestemt bindende nærmet metning i konsentrasjoner av 3-5 nM i både HT-1376 og HT-B9 celler (figur 5B). Kd 64Cu-A14-ChAcNLS på HT-1376 og HT-B9 celler var 6,4 ± 1.7 nM og 3.1 ± 0,8 nM, henholdsvis. ChAcNLS Bøyning redusert slektskap av A14 ca 2.5-fold for IL-5Rα på HT-1376 og HT-B9 celler. Gamma teller avslører at økningen av radioaktivitet i kjernen og i cytoplasma levert av 64Cu-A14-ChAcNLS er spesifikk og øker over tid (figur 6). Gamma teller vanligvis viser ca > 6-fold økning i kjernefysiske og intracellulær akkumulering i cellene behandlet med 64Cu-A14-ChAcNLS forhold til behandling med 64Cu-A14-ChAcNLS i nærvær av overskytende uforandret A14 eller når behandlingsstudier utføres på 4 ° C (figur 6A). Det er også en ≥ 3-fold økning i kjernefysiske og intracellulær opphopning av 64Cu forhold til cellene behandlet med 64Cu-A14 og 64Cu-IgG-ChAcNLS på alle tidspunkt testet (figur 6B).
Figur 7 viser viktigheten av celle fraksjoneres protokollen. HT-1376 og HT-B9 celler ble inkubert med plasma membranen lyseringsbuffer som inneholder 1%, 2% eller 4% NP-40. Isolert kjerner utelukkende inneholde Lamin A/C. tilsvarende cytoplasmatiske fraksjoner bør være eksklusivt for Rab7. Som en kontroll, bør hele celler lysed med RIPA buffer være positivt for ved a/c i begge fraksjoner. Denne protokollen viser at når du vurderer kjernefysiske brøkdel av lysed HT-1376 celler, det er ingen Rab7 tilstede. I tillegg finnes det ingen ved A/C i cytoplasmatiske brøken. Men det er en redusert mengde Rab7 i cytoplasma tatt fra celler lysed med 4% NP-40 (figur 7A). Dette tyder på det mest sannsynlig at 4% NP-40 lyseringsbuffer ødelegger de kjernefysiske membranen i tillegg til plasma membranen. Dette resulterer i en blanding av kjernefysiske proteiner med cytoplasmatiske proteiner og dermed utvanner konsentrasjonen av Rab 7. Dette forklarer redusert mengden Rab 7 stede. HT-B9 celler er enda mer følsom enn HT-1376 celler. Når behandlet med plasma membranen lyseringsbuffer er som inneholder 4% NP-40, ved A/C tydelig i cytoplasmatiske fraksjonen (figur 7B). Det er en tilsvarende reduksjon i mengden ved a/c i kjernefysiske fraksjonen. HT-B9 celler er også sensitive på 2% NP-40 lyseringsbuffer som hvor mye Rab7 i cytoplasmatiske fraksjonen er synlig redusert i forhold til 1% NP-40. Derfor bør en optimalisere mobilnettet fraksjoneres med bestemte celler rundt slik at kvantitative resultater av nyttelast akkumulering i kjernen og intracellulær plass er nøyaktige. Dette er viktig for å vurdere effektiviteten av kjernefysiske lokalisering av en roman AC.
For prosedyren 4 gir PET bildebehandling på 48 timer etter injeksjon av enten 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS eller 64Cu-A14-ChAcNLS i mus bærer HT-1376 og HT-B9 heterotopic xenografts i motsatt bakben ben visualisering av svulst målretting egenskaper (Figur 8). I vårt eksempel avslører visuell inspeksjon av PET bildene HT-1376 og HT-B9 svulst målfunksjoner 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14 og 64Cu-A14-NLS (figur 8A). Men i tilfeller der visuell inspeksjon er vanskelig som med HT-B9 tumorer kan avkastningsanalyse brukes til å bestemme svulst-til-muskel prosenter (figur 8B).
Figur 1: ChAcNLS-modifisert mAbs. NLS rester av SV-40 store T-antigen (KKKRKV) er klemt mellom spacer rester avkortet med en N-terminal-cystein. Cholic syre (grønn hakeparentes) er koblet til cystein som beskrevet tidligere 34. Etter konstruksjon og rensing av ChAcNLS, gruppen cystein sulfhydryl brukes for Bøyning via sulfo-SMCC (røde braketten; vises allerede knyttet til mAb). Merk: mAb (150 kDa) og ChAcNLS (1,8 kDa) er ikke å skalere. Tilpasset og gjengitt med tillatelse fra Paquette, forbedrer M. et al. NLS-cholic syre Bøyning til IL-5Rαspecific antistoff mobilnettet akkumulering og i vivo svulst målretting egenskaper i en blære kreft modell. Bioconjugate kjemi. Doi:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).
-
Figur 2: skjematisk av AC cellen behandlingstilnærming og etterfølgende behandling for analyse av AC Confocal mikroskopi og analyse av celle fraksjoneres kvaliteten. Røde piler tilsvarer essential fremgangsmåte 2.2, 2.3, 3.15 og 3.15.4. Tilpasset og opptrykk med tillatelse fra Beaudoin, S. et al. ChAcNLS, en roman endring antistoff-Conjugates tillater målet cellen-spesifikke Endosomal rømme, lokalisering til kjernen og forbedret Total intracellulær akkumulering. Molekylært Pharmaceutics. 13 (6), 1915-1926, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016).
Figur 3: analyse av ChAcNLS-modifisert mAbs. En redusert SDS-side viser kjører stigen (L) med tilsvarende molekylvekt kilodalton (kDa) og uforandret 7G 3 tunge og lette kjedene som referanser. De følgende banene er overføring bånd tunge og lette kjedene 7G 3 endret med 3, 7, 10 og 20 ChAcNLS.
Figur 4: analyse av mAb intracellulær distribusjon og akkumulering. AC confocal mikroskopi bilder illustrerer intracellulær 7G 3 distribusjon og relativ fluorescens akkumulering i IL-3Rα-positiv leukemi cellene behandlet med 7G 3, 7 G 3-ChAcNLS, IgG og IgG-ChAcNLS. Celler var trypsinized eller ikke trypsinized før fiksering. Kjerner er farget med propidium iodide (PI, rød), murine-Fc-AF647 fargestoff (mAb, grønn), og PI/mAb flettes. Skalaen er 50 μm. Innenfor trypsin og ingen trypsin grupper, ble bildene anskaffet med identiske instrument innstillinger mellom forskjellige ACs vises. Trypsin delen av figur 4 er tilpasset fra refefence 34 med tillatelse. Tilpasset og gjengitt med tillatelse fra Beaudoin, S. et al. ChAcNLS, en roman endring antistoff-Conjugates tillater målet cellen-spesifikke Endosomal flukt, lokalisering til kjernen og forbedret totale intracellulær akkumulering. Molekylært Pharmaceutics. 13 (6), 1915-1926, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016).
Figur 5: 64Cu-A14-ChAcNLS renhet og affinitet. (A) radiochemical renhet av 64Cu-merket A14, A14-NLS, A14-ChAcNLS ble sjekket av SDS siden etterfulgt av autoradiography. (B) bestemt bindende kurver for 64Cu-A14 og 64Cu-A14-ChAcNLS på HT-1376 og HT-B9 celler. Feilfelt viser standardavviket for eksperimentet utføres i replikere. Tilpasset og gjengitt med tillatelse fra Paquette, M., et al. NLS-cholic syre Bøyning til IL-5Rα-spesifikke antistoffer forbedrer mobilnettet akkumulering og i vivo svulst målretting egenskaper i en blære kreft modell. Bioconjugate kjemi. Doi:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).
Figur 6: 64Cu kjernefysiske og intracellulær akkumulering. Representativt eksempel på cellen behandling utført i tre eksemplarer (feilfelt betegne standardavvik) å demonstrere (A) spesifisitet og (B) akkumulering forsterkning av 64Cu-A14-ChAcNLS. % Akkumulering er presentert i kjernen (venstre panel) og total intracellulær plass (høyre panel) i forhold til den totale mengden radioaktivitet brukt under behandling av IL-5Rα-positiv invasiv blære kreftceller. Feilfelt viser standardavviket for eksperimentet utføres i replikere. * angir p ≤0.05.
Figur 7: analyse for celle fraksjoneres prosedyre. Western blot av (A) kjernefysiske og (B) Cytoplasmic fraksjoner ved A/C (topp blots, røde piler) og Rab 7 (bunnen blots, svarte piler) fra behandling av HT-1376 og HT-B9 celler i plasma membranen lyseringsbuffer som inneholder enten 1%, 2% eller 4 % NP-40. Hele celler lysed med RIPA buffer ble brukt som positive kontroll ved A/C og Rab7 i begge fraksjoner. Kjører standarder (L) vises bare i topp blots. Tre piler vises ved a/c på grunn av sin flere isoformene. Tilpasset og opptrykk med tillatelse fra Paquette, M. et al. NLS-cholic syre Bøyning til IL-5Rα-spesifikke antistoffer forbedrer mobilnettet akkumulering og i vivo svulst målretting egenskaper i en blære kreft modell. Bioconjugate kjemi. Doi:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).
Figur 8: I Vivo analyse av Tumor målretting av PET bildebehandling og analyse. (A) PET bilder på 48 timer etter injeksjon av hilsen/SCID mus HT-1376 (røde piler) og HT-B9 (blå piler) svulster intravenøst injisert med 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS og 64Cu-A14-ChAcNLS. Grønn pil er leveren opptak. Muskel ROI tegningen vist med magenta sirkel. (B) ROI HT-1376 og HT-B9 svulst-til-muskel prosenter i ACs på 48 timer etter injeksjon. Feilfelt viser standardavviket for eksperimentet i n = 10 ROIs per mus (n = 5). * angir p 0,05.
| TAT |
| CGGQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGS 20 |
| CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQ 30 |
| CGISYGRKKRRQRRR 29 |
| GRKKRRQRRRPPQGYC 22,25 |
| TRQARRNRRRRWRERQRGC 26 |
| NLS |
| CGYGPKKKRKVGG 21,23,24,27 |
| Cholic syre-CGYGPKKKRKVGG 34 |
Tabell 1: Liste over Tat og SV-40 store T-antigen avledet peptider i AC modifikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Store mål systemisk levering av anti-kreft agenter er å øke opphopning svulst området og opptak i kreftceller, og redusere uønskede bivirkninger i sunt vev. AC målrettet levering av molekylære payloads til kreftceller er en svært lovende tilnærming til å behandle og oppdage svulster. Men mangel på effekten forårsaket av endosome entrapment og ned strømmen lysosomale degradering er en viktig utfordring. Mens denne protokollen benytter ChAcNLS peptid som et eksempel for bygging av neste generasjon ACs, kan beskrevet prosedyrene tilpasses alle peptid-endret AC utviklet med sikte på å øke mengden av intracellulær leverte nyttelast til målrettet kreftceller.
De viktigste trinnene i denne protokollen er: 1) identifiserer og begrenser høy MW samlet arter; 2) av trypsinization celler før analyse for å bestemme intracellulær akkumulering; 3) utfører kvalitetssikring av mobilnettet fraksjoneres prosedyrer; og 4) utfører PET for å evaluere svulst målretting i vivo.
Det er viktig Bøyning av virus-avledet peptider å mAbs ikke resulterer i høy MW samlet arter som skyldes mest sannsynlig intramolekylære crosslinking mellom mAbs. Dette er den første bekymringen bør behandles før utvikler seg videre. Fremover med peptid-endret ACs som inneholder uønskede aggregater kan gi resultater som gir falske bevis på aspekter som intracellulær og i vivo nyttelast levering profilene. Reaktiv maleimides på mAbs er det sannsynligvis ansvarlig for kovalente aggregering. En løsning er å redusere sulfo-SMCC-til-mAb forholdet. Et annet alternativ er å bruke N-acetylen derivater av aminosyrer som Cys, Lys, hans, Ser og Thr under peptid Bøyning til maleimide-aktivert mAb 45. Nukleofil side-kjedene kan reagere med maleimide moiety av SMCC og redusere intra-antistoff crosslinking. Separasjon av størrelse utelukkelse kromatografi etter Bøyning kan også brukes til å isolere monomer arter 45. Områdespesifikke Bøyning av peptid til antistoffer kan også utføres. Antistoff karbohydrater kan for eksempel endres for Bøyning til peptider som har vist seg å effektivt produsere monomer arter 24.
SDS-siden med 12% polyakrylamid gels er en rimelig og effektiv metode for å få et bredt perspektiv av stor størrelse forskjeller i AC arter. Hvis en økning i % polyakrylamid, vil separasjon av tunge kjeder og intramolekylære arter være vanskelig å skille. Omvendt, hvis en redusert % polyakrylamid, lette kjedene er sannsynlig å løpe av gel. Gradient gels som inneholder 4-20% polyakrylamid også gir god oppbevaring Skift for tunge og lette kjedene på en enkelt gel. Blant de ulike analytiske teknikkene tilgjengelig for biomolecular analyse er høy ytelse flytende kromatografi og kapillært geleelektroforese-SDS overlegen til SDS-side for separasjon og karakterisering av ACs 46. Likevel er SDS-side en tidlig og rimelig metode for å analysere den opprinnelige konstruksjonen av disse romanen agenter og deretter bestemme følgende løpet av handlingen.
Inkubasjonstiden for celler i løsning som inneholder 0,25% trypsin (trinn 2.3), som fjerner et maksimalt antall celle-overflate proteiner og bundet ACs er viktig fordi det gir forbedret visualisering og relative økningene intracellulær opphopning mellom Referanse antistoffer. Parameterne kameraet er satt til å ta bilder med maksimal fluorescens intensitet. Dette skyldes variasjon fra celle til celle i AC som er akkumulert. Således, ta bilder med maksimal intensitet kan for celler med mindre AC akkumulering også vurderes. Men er kreft antigener vanligvis svært uttrykt på kreftceller. Hvis cellene ikke var utsettes for fordøyelsen av trypsin, ville fluorescens kommer fra ACs på celleoverflaten-dominerer bildet. I tillegg uten trypsinization kan utvikling være begrenset med ACs med subtil, men betydelig intracellulær akkumulering egenskaper.
Høy kvalitet mobilnettet fraksjoneres er viktig å nøyaktig evaluere akkumulering av 64Cu i kjernen versus cytoplasma. Muligheten for ChAcNLS å øke AC og nyttelast intracellulær akkumulering er grunn til aktive lokalisering til kjernen 34. Som fremtidige virus-peptider er utviklet, kan også disse peptider lokalisere til kjernen som en del av deres mekanisme for å øke intracellulær nyttelast effektivitet. Derfor er det viktig at mobilnettet fraksjoneres være av høy kvalitet til nøyaktig detalj denne prosessen. Denne protokollen understreker viktigheten av å evaluere kjerner for cytoplasmatiske markører og også cytoplasmatiske brøken for kjernefysisk markører. For eksempel Hu et al., utviklet AC endret med en Tat peptid og utforsket kjernefysiske oppbygging av en radioisotope nyttelast 24. Western blot analyse for calpain, en rikelig cytoplasmatiske protein, var til stede i kjernefysiske fraksjonen. Dette var sannsynligvis fordi kommersielle kjernefysiske isolasjon kits ble brukt. Denne protokollen vist at HT-1376 og HT-B9 celler nødvendig ulike konsentrasjoner av NP-40 for å isolere beriket kjerner med intakt membraner. Når HT-B9 celler var lysed med buffer hadde som inneholder 4% NP-40, ved A/C cytoplasmatiske brøkdel indikerer behandling forstyrret kjernefysiske membraner og tillatt for ved en/c angi cytoplasma. Hvis kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner ikke er isolert nøye, kan det være vanskelig å identifisere bidrag av kjernefysiske lokaliseringen å totalt intracellulær akkumulering. Det finnes rapporter om biologiske - og kunstig-avledet peptider som spesifikt målretter andre intracellulær avdelinger som endoplasmatiske retikulum, Golgi apparatet og mitokondrier 47,48,49. Dermed blir isolasjon intracellulær rom stadig viktigere.
Denne protokollen er ferdig med sin beskrivelse av 64Cu-A14-ChAcNLS målretting av HT-1376 og HT-B9 svulster. Visuell inspeksjon av PET bildene i Figur 8, det er tydelig at økt svulst PET signal i forhold til den tilgrensende redusert rundt bakgrunnen 64Cu-A14-ChAcNLS har bedre målretting av HT-1376 og HT-B9 svulster (figur 8A ). Avkastningsanalyse demonstrerer også evnen til å vurdere svulst målretting. I vårt eksempel bruker vi Avkastningen svulst-til-muskel prosenter å kvantifisere svulst målretting og vise 64Cu-A14-ChAcNLS er overlegen AC (figur 8B). PET bildebehandling kan også evalueringen av AC fremdeles i friske organer. Leveren er det primære orglet som metabolizes antistoffer. Figur 8A demonstrerer opptak i leveren er sammenlignbare i mus injisert med 64Cu-A14-ChAcNLS og 64Cu-A14. På dette tidlig utviklingsfase tyder disse dataene ChAcNLS ikke forårsaker uønskede fremdeles. 64 Cu har en halveringstid på 12,7 t, som er ikke ideelt for ACs som har flere dager. Som tidligere beskrevet i visuelle protokollen av Zeglis og Lewis er bruk av varige radioisotop zirkonium-89 (89Zr) en nyttelast som fysisk half-life er ideelt for mAbs og kan avbildes med PET 50. Dermed for evaluering svulst levering over flere dager, er 89Zr et foretrukket valg. Dette er spesielt viktig hvis terapi er et mål hvor høy svulst opptak er gunstig og øker over tid med antistoffer 7. Biodistribution bør også utført for å avgjøre personlige orgel opptak å utforske mer målretting eller fått egenskaper nylig utviklet ACs. I tillegg kan mus være predosed med uforandret spesifikt antistoff å blokkere receptor webområdene kreftceller evaluere målretting spesifisitet. Likevel gir 64Cu med PET bildebehandling og analyse av tilstrekkelig en innledende vurdering av svulsten levering egenskaper i utviklede ACs presentert i denne protokollen.
ACs endret med virus-avledet peptider har så langt vært begrenset til levering av radioisotopes. Dette er delvis på grunn av historiske årsaker og også fordi radioisotopes er lett kvantifisert i vitro og i vivo testing, og kan visualiseres ved hjelp av noninvasive hele kroppen tenkelig modaliteter. Naturligvis, ettersom dette feltet utvides til transport og levering av payloads enn radioisotopes, som chemotherapeutics, enzymer og oligonucleotides, endringer teknikkene i denne protokollen må utvikles. For eksempel må nye metoder for å vurdere intracellulær akkumulering av alternative payloads utvikles. I tillegg vil endringer i vivo evaluering bee nødvendig som disse nyttelast lett kan avbildes og derfor det vil være vanskelig å vurdere biodistribution og spesifisitet svulst opptak effektivitet. For disse grunner, bør radionuklidenes nyttelast forbli som surrogat nyttelast for fremtidig utvikling med alternative cargos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Cancer Research Society (Canada) og CIMS. Forfatterne takker Dr. Samia Ait-Mohand og Jean-Francois Beaudoin for hjelp. Dr. Angel Lopez (Universitetet i South Australia) for mAb A14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sulfo-SMCC | Thermo Scientific | 22122 | There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from. |
| Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters | EMD Millipore | UFC505096 | There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs. |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | BioRad | 1610375EDU | Mulicolor recombinant proteins from 10 - 250 kDa. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200056 | 100 or 500 mL volumes to choose from. |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Scientific | A-21235 | 1 - 10 μg/mL recommended |
| NOTA-NHS | CheMatech | C100 | |
| Lamin A/C antibody (N-18) | Santa Cruz Biotechnology | sc-6215 | |
| Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-376362 | |
| A14 mAb | BD Biosciences | 555902 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0007 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-25ML | |
| TF-1a cells | ATCC | ATCC CRL-2003 | |
| RPMI 1640 medium | ATCC | ATCC 30-2001 | |
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
| AMIDE medical imaging software | available at amide.sourceforge.net | Completely free download | |
| FluoView FV1000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Fluoview Software | Olympus | www.olympus-lifescience.com | |
| ITLC strips | Biodex | 150-771 |
References
- Verma, S., et al. Trastuzumab emtansine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 367 (19), 1783-1791 (2012).
- Younes, A., et al. Results of a pivotal phase II study of brentuximab vedotin for patients with relapsed or refractory Hodgkin's lymphoma. Journal of Clinical Oncology. 30 (18), 2183-2189 (2012).
- Bouchelouche, K., Choyke, P. L., Capala, J. Prostate specific membrane antigen- a target for imaging and therapy with radionuclides. Discovery Medicine. 9 (44), 55-61 (2010).
- Hamilton, G. S. Antibody-drug conjugates for cancer therapy: The technological and regulatory challenges of developing drug-biologic hybrids. Biologicals. 43 (5), 318-332 (2015).
- Deonarain, M. P., Yahioglu, G., Stamati, I., Marklew, J. Emerging formats for next-generation antibody drug conjugates. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (5), 463-481 (2015).
- Barok, M., Joensuu, H., Isola, J. Trastuzumab emtansine: mechanisms of action and drug resistance. Breast Cancer Research. 16 (2), (2014).
- Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23 (9), 1137-1146 (2005).
- Alley, S. C., Okeley, N. M., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (4), 529-537 (2010).
- Austin, C. D., et al. Endocytosis and sorting of ErbB2 and the site of action of cancer therapeutics trastuzumab and geldanamycin. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5268-5282 (2004).
- Bryan, J. N., et al. Comparative uptakes and biodistributions of internalizing vs. noninternalizing copper-64 radioimmunoconjugates in cell and animal models of colon cancer. Nuclear Medicine and Biology. 32 (8), 851-858 (2005).
- Chen, R., et al. CD30 Downregulation, MMAE Resistance, and MDR1 Upregulation Are All Associated with Resistance to Brentuximab Vedotin. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1376-1384 (2015).
- Fuchs, H., Weng, A., Gilabert-Oriol, R. Augmenting the Efficacy of Immunotoxins and Other Targeted Protein Toxins by Endosomal Escape Enhancers. Toxins (Basel). 8 (7), (2016).
- Olsnes, S., Sandvig, K., Petersen, O. W., van Deurs, B. Immunotoxins--entry into cells and mechanisms of action. Immunology Today. 10 (9), 291-295 (1989).
- Zheng, D., et al. Virus-derived anti-inflammatory proteins: potential therapeutics for cancer. Trends in Molecular Medicine. 18 (6), 304-310 (2012).
- Kristensen, M., Birch, D., Morck Nielsen,, H, Applications and Challenges for Use of Cell-Penetrating Peptides as Delivery Vectors for Peptide and Protein Cargos. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), (2016).
- Yezid, H., Konate, K., Debaisieux, S., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Mechanism for HIV-1 Tat insertion into the endosome membrane. Journal of Biological Chemistry. 284 (34), 22736-22746 (2009).
- Escriou, V., Carriere, M., Scherman, D., Wils, P. NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (2), 295-306 (2003).
- Pouton, C. W., Wagstaff, K. M., Roth, D. M., Moseley, G. W., Jans, D. A. Targeted delivery to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (8), 698-717 (2007).
- Anderson, D. C., et al. Tumor cell retention of antibody Fab fragments is enhanced by an attached HIV TAT protein-derived peptide. Biochemical Biophysical Research Communications. 194 (2), 876-884 (1993).
- Chen, P., et al. Nuclear localizing sequences promote nuclear translocation and enhance the radiotoxicity of the anti-CD33 monoclonal antibody HuM195 labeled with 111In in human myeloid leukemia cells. Journal of Nuclear Medicine. 47 (5), 827-836 (2006).
- Cornelissen, B., Hu, M., McLarty, K., Costantini, D., Reilly, R. M. Cellular penetration and nuclear importation properties of 111In-labeled and 123I-labeled HIV-1 tat peptide immunoconjugates in BT-474 human breast cancer cells. Nuclear Medicine and Biology. 34 (1), 37-46 (2007).
- Costantini, D. L., Chan, C., Cai, Z., Vallis, K. A., Reilly, R. M. (111)In-labeled trastuzumab (Herceptin) modified with nuclear localization sequences (NLS): an Auger electron-emitting radiotherapeutic agent for HER2/neu-amplified breast cancer. Journal of Nuclear Medicine. 48 (8), 1357-1368 (2007).
- Fasih, A., et al. (1)(1)(1)In-Bn-DTPA-nimotuzumab with/without modification with nuclear translocation sequence (NLS) peptides: an Auger electron-emitting radioimmunotherapeutic agent for EGFR-positive and trastuzumab (Herceptin)-resistant breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 135 (1), 189-200 (2012).
- Hu, M., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).
- Kameyama, S., et al. Effects of cell-permeating peptide binding on the distribution of 125I-labeled Fab fragment in rats. Bioconjugate Chemistry. 17 (3), 597-602 (2006).
- Kersemans, V., Cornelissen, B., Minden, M. D., Brandwein, J., Reilly, R. M. Drug-resistant AML cells and primary AML specimens are killed by 111In-anti-CD33 monoclonal antibodies modified with nuclear localizing peptide sequences. Journal of Nuclear Medicine. 49 (9), 1546-1554 (2008).
- Mie, M., et al. Intracellular delivery of antibodies using TAT fusion protein. Biochemical Biophysical Research Communications. 310 (3), 730-734 (2003).
- Niesner, U., et al. Quantitation of the tumor-targeting properties of antibody fragments conjugated to cell-permeating HIV-1 TAT peptides. Bioconjugate Chemistry. 13 (4), 729-736 (2002).
- Stein, S., et al. A disulfide conjugate between anti-tetanus antibodies and HIV (37-72)Tat neutralizes tetanus toxin inside chromaffin cells. FEBS Letters. 458 (3), 383-386 (1999).
- Tolstikov, V. V., Cole, R., Fang, H., Pincus, S. H. Influence of endosome-destabilizing peptides on efficacy of anti-HIV immunotoxins. Bioconjugate Chemistry. 8 (1), 38-43 (1997).
- Gao, C., Leyton, J. V., Schimmer, A. D., Minden, M., Reilly, R. M. Auger electron-emitting 111In-DTPA-NLS-CSL360 radioimmunoconjugates are cytotoxic to human acute myeloid leukemia (AML) cells displaying the CD123/CD131 phenotype of leukemia stem cells. Applied Radiation and Isotopes. 110, 1-7 (2015).
- Leyton, J. V., et al. Auger electron radioimmunotherapeutic agent specific for the CD123+/CD131- phenotype of the leukemia stem cell population. Journal of Nuclear Medicine. 52 (9), 1465-1473 (2011).
- Paquette, M., et al. NLS-cholic acid conjugation to IL-5Rα-specific antibody improves cellular accumulation and in vivo tumor-targeting properties in a bladder cancer model. Bioconjugate Chemistry. , (2018).
- Beaudoin, S., et al. ChAcNLS, a Novel Modification to Antibody-Conjugates Permitting Target Cell-Specific Endosomal Escape, Localization to the Nucleus, and Enhanced Total Intracellular Accumulation. Molecular Pharmaceutics. 13 (6), 1915-1926 (2016).
- Boswell, C. A., et al. Effects of charge on antibody tissue distribution and pharmacokinetics. Bioconjugate Chemistry. 21 (12), 2153-2163 (2010).
- Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. The crucial role of bile acids in the entry of porcine enteric calicivirus. Virology. 456-457, 268-278 (2014).
- Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. Ceramide formation mediated by acid sphingomyelinase facilitates endosomal escape of caliciviruses. Virology. 483, 218-228 (2015).
- Stancevic, B., Kolesnick, R. Ceramide-rich platforms in transmembrane signaling. FEBS Letters. 584 (9), 1728-1740 (2010).
- Testa, U., Pelosi, E., Frankel, A. CD 123 is a membrane biomarker and a therapeutic target in hematologic malignancies. Biomarker Research. 2 (1), 4 (2014).
- King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 155-166 (2000).
- Paquette, M., et al. Targeting IL-5Rα with antibody-conjugates reveals a strategy for imaging and therapy for invasive bladder cancer. Oncoimmunology. 6 (10), e1331195 (2017).
- Zeisler, S. Production of 64Cu on the Sherbrooke TR-PET cyclotron. Journal or Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 257 (1), (2004).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Roy, M., et al. A dual tracer PET-MRI protocol for the quantitative measure of regional brain energy substrates uptake in the rat. Journal of Visualized Experiments. (82), e50761 (2013).
- Wakankar, A. A., et al. Physicochemical stability of the antibody-drug conjugate Trastuzumab-DM1: changes due to modification and conjugation processes. Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).
- Liu, J., Abid, S., Lee, M. S. Analysis of monoclonal antibody chimeric BR96-doxorubicin immunoconjugate by sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis with ultraviolet and laser-induced fluorescence detection. Analytical Biochemistry. 229 (2), 221-228 (1995).
- Rege, K., Patel, S. J., Megeed, Z., Yarmush, M. L. Amphipathic peptide-based fusion peptides and immunoconjugates for the targeted ablation of prostate cancer cells. Cancer Research. 67 (13), 6368-6375 (2007).
- Zhan, J., Ge, L., Shen, J., Wang, K., Zheng, S. A trans-Golgi network retention signal YQRL fused to ricin A chain significantly enhances its cytotoxicity. Biochemical Biophysical Research Communications. 313 (4), 1053-1057 (2004).
- Zhan, J., Stayton, P., Press, O. W. Modification of ricin A chain, by addition of endoplasmic reticulum (KDEL) or Golgi (YQRL) retention sequences, enhances its cytotoxicity and translocation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 46 (1), 55-60 (1998).
- Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The bioconjugation and radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled antibodies. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
