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Bioengineering

सेलुलर संचय बढ़ाने और ट्यूमर लक्ष्यीकरण में सुधार के लिए वायरल-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स के साथ संशोधित एंटीबॉडी-conjugates का प्रारंभिक मूल्यांकन

Published: March 8, 2018 doi: 10.3791/55440
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Nuclear Medicine and Radiobiology, Université de Sherbrooke, 2Sherbrooke Molecular Imaging Center (CIMS), Université de Sherbrooke, 3Sherbrooke Institute of Pharmacology

Summary

वायरल-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स एंटीबॉडी करने के लिए युग्मित-conjugates (ACs) एक वृद्धि ट्यूमर कोशिका संचय के साथ आणविक पेलोड देने की क्षमता के कारण गति प्राप्त दृष्टिकोण है. पेप्टाइड विकार, एसी और पेलोड intracellular संचय का मूल्यांकन करने के लिए आम तरीकों का उपयोग, और ट्यूमर लक्ष्यीकरण, इस प्रोटोकॉल प्रमुख प्रारंभिक विकास चरणों के दौरान शोधकर्ताओं में मदद करता है.

Abstract

एंटीबॉडी-conjugates (ACs) वायरस व्युत्पन्न पेप्टाइड्स के साथ संशोधित एक संभावित शक्तिशाली वर्ग आणविक पेलोड के लिए कैंसर के उपचार और इमेजिंग में इस्तेमाल किया सेलुलर संचय की वजह से वर्तमान ACs पर उपयोग कर रहे हैं. जल्दी एसी के दौरान इन विट्रो विकास, प्रतिदीप्ति तकनीक और radioimmunoassays intracellular स्थानीयकरण, संचय दक्षता, और लक्ष्य कोशिका विशिष्टता का निर्धारण करने के लिए पर्याप्त हैं । वर्तमान में, एसी intracellular संचय और स्थानीयकरण के मूल्यांकन के लिए कक्षों की तैयारी के लिए मानकीकृत तरीकों पर कोई आम सहमति नहीं है । वायरस व्युत्पंन पेप्टाइड्स के साथ संशोधित ACs के प्रारंभिक परीक्षण महत्वपूर्ण है, खासकर यदि कई उंमीदवारों का निर्माण किया गया है । प्रतिदीप्ति द्वारा intracellular संचय का निर्धारण सेल सतह पर ACs से पृष्ठभूमि संकेत से प्रभावित किया जा सकता है और संचय की व्याख्या जटिल । radioimmunoassays के लिए, आम तौर पर इलाज कोशिकाओं fractionated और रेडियोधर्मिता मापा अलग सेल डिब्बों में हैं. हालांकि, कक्ष lysis कक्ष से कक्ष तक बदलता है और अक्सर परमाणु और cytoplasmic डिब्बों को पर्याप्त रूप से पृथक नहीं कर रहे हैं । यह पेलोड वितरण संपत्तियों पर भ्रामक डेटा का उत्पादन कर सकते हैं । radiolabeled वायरस के नसों में इंजेक्शन व्युत्पंन पेप्टाइड-संशोधित ACs ट्यूमर असर चूहों में रेडियोन्यूक्लाइड इमेजिंग द्वारा पीछा करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है ट्यूमर लक्ष्यीकरण और पेलोड वितरण संपत्तियों के vivo में चरण का निर्धारण करने के लिए विकास. हालांकि, यह एक अपेक्षाकृत हाल ही में उंनति और कुछ समूहों वायरस-व्युत्पन्न पेप्टाइड संशोधित इस तरीके से ACs है मूल्यांकन किया है । हम इलाज कोशिकाओं के प्रसंस्करण का वर्णन करने के लिए और अधिक सही वायरस-व्युत्पंन पेप्टाइड संशोधित एसी संचय जब फोकल माइक्रोस्कोपी और radioimmunoassays का उपयोग कर मूल्यांकन । विशेष रूप से, trypsinizing कक्षों के लिए एक विधि कक्ष सरफ़ेस बाउंड ACs को निकालने के लिए । हम भी सेलुलर अंश में सुधार के लिए एक तरीका प्रदान करते हैं । अंत में, इस प्रोटोकॉल एक vivo में ट्यूमर-असर चूहों में प्रारंभिक ट्यूमर लक्ष्यीकरण संपत्तियों के मूल्यांकन के लिए पोजीट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) का उपयोग कर विधि प्रदान करता है । हम इस प्रोटोकॉल में एक उदाहरण पेलोड के रूप में रेडियो आइसोटोप 64 घन (टी 1/2 = 12.7 एच) का उपयोग करें ।

Introduction

एंटीबॉडी-conjugates (ACs) है कि कैंसर के उपचार में सुधार के लिए और ट्यूमर का पता लगाने के लिए प्रभावी दवाओं के एक परिवर्तनकारी वर्ग में परिपक्व हो रहे हैं । radioisotopes, छोटे अणुओं, और जैविक विषाक्त पदार्थों के रूप में आणविक पेलोड के लिए एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (मॉब) संयुग्मित से बना है, ACs अति सुंदर लक्ष्य प्रतिजन संबध और विशिष्टता के साथ कैंसर कोशिकाओं को इन पेलोड देने में सक्षम हैं । इस प्रकार ACs काफी विशिष्ट विषाक्तता को कम करने और ट्यूमर साइट पर पेलोड गतिविधि को बढ़ाने की क्षमता है. चिकित्सकीय, ACs साइटोटोक्सिक छोटे अणुओं के परिवहन (सामांयतः एंटीबॉडी दवा conjugates के रूप में निर्दिष्ट) स्तन कैंसर और Hodgkin लिंफोमा जो पारंपरिक उपचार में विफल रहे है के साथ रोगियों के इलाज के लिए अनुमोदित किया गया है 1, 2. इसके अलावा, ACs ट्रांसपोर्टिंग radioisotopes (सामान्यतः radioimmunoconjugates के रूप में जाना जाता है) भी विकास में हैं. एक एसी इमेजिंग के लिए एक रेडियो आइसोटोप परिवहन प्रोस्टेट कैंसर की पहचान के लिए मंजूरी दे दी है मेटास्टेसिस 3 । के साथ कई और अधिक चिकित्सीय 4अनुमोदन के लिए प्रस्तुत acs, आशावाद के भविष्य के लिए उच्च है के लिए कैंसर की देखभाल 5में सुधार acs ।

बहरहाल, जब chemotherapeutics या radioisotopes देने, ACs कठिनाई प्रभावी ढंग से लक्ष्य कोशिकाओं के अंदर इन पेलोड जमते । यह पहलू काफी लंबे समय तक चलने रोग मुक्त अस्तित्व या उच्च कंट्रास्ट ट्यूमर इमेजिंग 6,7प्रदान करने के लिए ACs की अक्षमता में कई मामलों में योगदान देता है । सामांय में, एक बार ACs उनके लक्ष्य प्रतिजन वे एक रिसेप्टर के रूप में जाना जाता प्रक्रिया के माध्यम से आंतरिक रहे है बांध-मध्यस्थता endocytosis । ACs तो endosomes अंदर फंस और क्षरण और पेलोड रिलीज के लिए lysosomes के लिए अवैध रूप से कर रहे है 8। intracellular के लिए एक उच्च पेलोड विशिष्टता और लक्ष्य कैंसर की कोशिकाओं के खिलाफ प्रभावकारिता को प्राप्त करने के ACs के लिए तस्करी प्रक्रिया चुनौतियां बन गई । उदाहरण के लिए, Her2 (चिकित्सकीय AC Trastuzumab-emtansine के लिए लक्ष्य) जैसे कई एंटीजन पहले 30 मिनट 9में बाउंड एंटीबॉडी के 85% तक रीसायकल कर सकते हैं । इसके अलावा, एक बार गिरावट होती है, जारी chemotherapeutics और radioisotopes सक्रिय रूप से वृद्धि की अभिव्यक्ति और/या झिल्ली जुड़े परिवहन प्रोटीन 10,11की गतिविधि से निर्यात किया जा सकता है । Lysosome क्षरण भी ऐसे चिकित्सीय एंजाइमों और oligonucleotides है कि 12,13निष्क्रिय किया जा सकता है के रूप में उपंयास जैविक पेलोड के वितरण में बाधा उत्पंन करता है । संक्षेप में, कैंसर कोशिका abrogating पर अत्यंत प्रभावी पेलोड के ACs द्वारा वितरित की आवश्यक intracellular संचय है ।

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे ACs की अवधारणा को लागू करने के लिए-वायरस व्युत्पंन पेप्टाइड्स, विशेष रूप से endosome फंसाने और कोशिका नाभिक को स्थानीयकरण भागने के लिए युग्मित । इस तरह के परिष्कार के साथ मेजबान सेल प्रणालियों में हेरफेर करने के लिए, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि वायरस व्युत्पंन प्रोटीन और पेप्टाइड्स के रूप में संभावित दवाओं के विकास लंबे समय से चिकित्सीय अनुसंधान 14में बैठ गया है । लाखों वर्षों के लिए वायरस को प्रभावी ढंग से मेजबान कोशिकाओं में प्रवेश करने के लिए सामान्य शारीरिक स्तनधारी कोशिका प्रणालियों का दोहन करने में सक्षम प्रोटीन का एक असाधारण संग्रह प्राप्त करने के लिए विकसित किया है. वायरस है कि रिसेप्टर की मध्यस्थता endocytosis के माध्यम से आंतरिक रहे हैं के लिए, वे भी lysosome के लिए तस्करी भागने के साथ चुनौती दी है, जहां की एक स्थानीयकृत एकाग्रता के हमले के लिए जीवन रक्षा के लिए समस्याग्रस्त किया जा सकता है । एक अच्छी तरह से वायरल व्युत्पंन endosome फंसाने भागने के लिए दवा वितरण में उपयोग पेप्टाइड के मानव इम्यूनो वायरस प्रतिलेखन की transactivator (जैसे) प्रोटीन 15है । जैसे कम पीएच जिस पर बिंदु प्रोटीन के गठन के परिवर्तन को संवेदन द्वारा फंसाने endosome भागने में सक्षम है जैसे ही में डालने के लिए और endosomal झिल्ली 16बाधित । यह जैसे में परिणाम-पेलोड कोशिका द्रव्य का उपयोग करने में सक्षम conjugates । दूसरी वायरल इस प्रोटोकॉल से संबंधित हेरफेर तत्व को चिकित्सकीय जीन और नाभिक को दवाओं के 17देने के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण है । वायरस को सफलतापूर्वक नाभिकीय ताकना परिसर (एनपीसी) के माध्यम से गुजर द्वारा परमाणु झिल्ली पिछले प्रगति के लिए मेजबान सेल मशीनरी में हेरफेर करने के लिए विकसित किया है । सेलुलर अणुओं होते है (या प्रोटीन है कि शामिल करने के लिए बाध्य) परमाणु स्थानीयकरण संकेत (NLSs) परमाणु परिवहन प्रोटीन के लिए बाध्यकारी (जैसे karyopherins α और β) है, जो एनपीसी के माध्यम से आवश्यक आंदोलनों प्रदान करने के लिए आवश्यक । वायरस एनएलएस अनुक्रम है कि उंहें गढ़शंकर में नाभिक के लिए मेजबान सेल परिवहन प्रोटीन का उपयोग करने की क्षमता के साथ उपलब्ध कराने के शामिल करने के लिए प्रोटीन विकसित किया है 18।

कई ACs पहले जैसे-और एनएलएस-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स के साथ कार्यात्मक किया गया है और कैंसर कोशिकाओं के अंदर जमा करने के लिए और ट्यूमर को लक्षित करने की क्षमता के लिए जांच की है 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (Table 1). अध्ययन साइटोटोक्सिक पेलोड पहुंचाने का प्रदर्शन किया है कि वायरस के साथ संशोधित ACs-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स काफी सेलुलर संचय, cytotoxicity वृद्धि करने में सक्षम हैं, और unभएकै ACs 22,26पर ट्यूमर की हत्या. एसी के इस उपन्यास क्लास के लिए एक कॉमन फीचर उनका कंस्ट्रक्शन है । आमतौर पर, पेप्टाइड्स एक टर्मिनल cysteine एक मुक्त sulfhydryl समूह प्रदान कर रहे हैं । MAbs पहले एक गैर-hydroxysuccinimide ( एनएच एस) और विपरीत छोर पर maleimide समूहों से युक्त bifunctional crosslinker के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त कर रहे हैं । एन एच एस एस्टर मॉब पर प्राथमिक अमीन के साथ प्रतिक्रिया के लिए बांड के बीच फार्म का । मुक्त maleimide समूहों के साथ प्रतिक्रिया मॉब तो एक thioester बांड फार्म और इस तरह पेप्टाइड और मॉब को जोड़ने के लिए पेप्टाइड्स पर sulfhydryl समूहों के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की है । हालांकि homobifunctional crosslinkers 28इस्तेमाल किया गया है, heterobifunctional crosslinker अधिक सामांयतः वायरस व्युत्पंन पेप्टाइड के निर्माण में प्रयोग किया जाता है-ACs 22,23,26, 31,32. यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से उपयोग में आसानी के लिए crosslinker sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) का उपयोग करता है और क्योंकि यह अनुमोदित एंटीबॉडी-औषध संयुग्मी Trastuzumab-emtansine में उपयोग किया जाता है और कई वायरस-व्युत्पन्न पेप्टाइड-ACs 8,22,23,26,31,32. सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-PAGE) प्रारंभिक रूप से विकार दक्षता का निर्धारण करने के लिए और अर्द्ध मॉब प्रति पेप्टाइड्स की संख्या को बढ़ाता है के लिए प्राथमिक विधि है । फोकल माइक्रोस्कोपी एक फ्लोरोसेंट-लेबल द्वितीयक एंटीबॉडी मॉब के लिए विशिष्ट का उपयोग करते हुए आमतौर पर शुरू में वायरस-व्युत्पन्न पेप्टाइड-संशोधित ACs के intracellular वितरण गुणों का मूल्यांकन करने के लिए विधि है । इस प्रकार अब तक, radioisotopes प्राथमिक पेलोड वायरस व्युत्पन्न पेप्टाइड संशोधित ACs द्वारा वितरित कर रहे हैं । Radioisotopes लाभप्रद हैं क्योंकि कोशिकाओं में रेडियोधर्मिता आसानी से गामा गिनती से quantified है. इसके अलावा, ACs है कि मानव कैंसर के माउस मॉडल में अनुवाद कर रहे है ट्यूमर का मूल्यांकन करने की क्षमता के साथ शोधकर्ताओं प्रदान एक फोटॉन उत्सर्जन गणना टोमोग्राफी और पोजीट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) के रूप में आणविक इमेजिंग विधियों का उपयोग कर लक्ष्यीकरण 23 , 32 , 33. सामांय में, निर्माण और सत्यापन परीक्षण के तरीकों मुख्य रूप से शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया वायरस के साथ संशोधित ACs के एक बहुत अच्छा आकलन प्रदान-प्रारंभिक विकास के चरण के दौरान पेप्टाइड्स व्युत्पंन को प्रभावी ढंग से दर्ज करें और उद्धार लक्ष्य कोशिकाओं के अंदर पेलोड और ट्यूमर को लक्षित करने के लिए ।

जैसे-और एनएलएस-संशोधित ACs आगे पेलोड प्रसव के कैंसर की कोशिकाओं के अंदर और ट्यूमर के लिए सुधार के लिए महत्वपूर्ण क्षेत्रों को प्रकाशित किया है । एनएलएस के संबंध में संशोधित ACs, intracellular संचय में दक्षता 23,31,34मामूली हो सकता है । अकुशल intracellular संचय जारी endosomal फंसाने के कारण होता है. vivo में ट्यूमर लक्ष्यीकरण भी दोनों जैसे के साथ कम किया जा सकता है-और एनएलएस-संशोधित ACs । जैसे और एनएलएस के सक्रिय दृश्यों कई सकारात्मक आरोप लगाया अवशेष होते हैं । जब mAbs से जुड़ी है तो कुल मिलाकर cationic चार्ज में काफी वृद्धि की जा सकती है 35. एक परिणाम के रूप में, जैसे-और एनएलएस-संशोधित ACs स्वस्थ ऊतकों में तेज वृद्धि हुई है और तेजी से रक्त निकासी में वृद्धि हुई है ।

हमारे समूह ने एनएलएस से जुड़े cholic अम्ल से मिलकर एक समग्र यौगिक विकसित किया (ChAcNLS; चित्र 1) । ChAcNLS-संशोधित ACs दिया radioisotopes के intracellular संचय बढ़ाने के लिए और एनएलएस-संशोधित और पारंपरिक ACs 33,34की तुलना में ट्यूमर लक्ष्यीकरण में सुधार कर रहे हैं. cholic एसिड के पीछे तंत्र cholic एसिड का उपयोग करने के लिए ceramide के गठन के माध्यम से endosome भागने को ट्रिगर करने के लिए झिल्ली फ्यूजन पर निर्भर नहीं कर सकते कि चुनिंदा वायरस का चयन की क्षमता से प्रेरित है । उदाहरण के लिए, सुअर का एंट्रेंस वायरस रंगरूटों cholic एसिड कि sphingomyelinase को सक्रिय करता है, जो hydrolysis की sphingomyelin में catalyzes के लिए 36, 37, 38. यह endosomal झिल्ली स्थिर और वायरस से बचने के लिए अनुमति देता है । इस प्रकार, cholic एसिड एक और वायरस व्युत्पंन घटक है कि एनएलएस पूरक है ।

के रूप में इस क्षेत्र में आगे बढ़ता है और भविष्य की प्रगति पेलोड वितरण में वायरस व्युत्पन्न पेप्टाइड्स के साथ संशोधित ACs द्वारा होते हैं, यह प्रारंभिक विकास के दौरान उनके जैव रासायनिक और कार्यात्मक विशेषताओं के दृश्य प्रदर्शनों प्रदान करने के लिए एक उपयुक्त समय है । यहां, हम वायरस के प्रारंभिक मूल्यांकन के लिए हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन-व्युत्पन्न पेप्टाइड संशोधित प्रारंभिक चरण के विकास के दौरान intracellular संचय और ट्यूमर लक्ष्यीकरण के कुशल अभी तक सरल निर्धारण के लिए ACs । हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध mAbs 7G3 और A14 का उपयोग उदाहरण मॉडल सिस्टंस के रूप में करते हैं । प्रक्रिया 1 का उपयोग करता है एक विधि के रूप में एसडीएस पृष्ठ का वर्णन है कि ' के लिए जाओ/ प्रक्रिया 2 एक trypsinization एसी intracellular वितरण और संचय के बेहतर दृश्य के लिए अनुमति का उपयोग कर विधि का वर्णन करता है । प्रक्रिया 3 सही ढंग से परमाणु स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए बेहतर intracellular भिन्नीकरण के लिए एक विधि का वर्णन. इस प्रक्रिया में हम पेलोड 64घन (टी1/2 = 12.7 एच) का उपयोग क्योंकि यह सेलुलर समाप्ति के लिए कमजोर है और एक पोजीट्रान उत्सर्जक 10है । इस प्रकार, प्रक्रिया 4 vivo में ट्यूमर लक्ष्यीकरण लक्षण वर्णन पीईटी इमेजिंग द्वारा पृष्ठभूमि (यानी निशाना स्वस्थ ऊतकों) के सापेक्ष ट्यूमर को कल्पना करने के लिए और निर्धारित करते हैं कि क्या उदाहरण एसी विशेष रूप से और प्रभावी ढंग से कर सकते हैं लक्ष्य ट्यूमर । इन तरीकों को आगे की उंनति के लिए उंमीदवारों की पहचान करने के लिए वायरस व्युत्पंन पेप्टाइड्स के साथ संशोधित ACs विकास जांचकर्ताओं के लिए पर्याप्त हैं ।

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Protocol

vivo में पशु प्रयोगों का वर्णन एक अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था और पशु प्रयोगों के लिए केंद्र Hospitalier Universitaire de शरब्रूक एथिक्स कमेटी के नैतिक दिशानिर्देशों के तहत ।

1. एंटीबॉडी पेप्टाइड विकार

नोट: ChAcNLS किसी भी वाणिज्यिक पेप्टाइड निर्माता या विश्वविद्यालय से संबद्ध पेप्टाइड संश्लेषण सेवा मंच पर संश्लेषित किया जा सकता है । ChAcNLS के संश्लेषण में संदर्भ 34पाया जा सकता है । प्रक्रियाओं के लिए 1 और 2 मॉब 7G3, जो ल्यूकेमिया प्रतिजन IL-3Rα 39के लिए विशिष्ट है का उपयोग करें ।

  1. एक 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, एक 10 मिलीग्राम/एमएल (~ 1 मिलीग्राम कुल एंटीबॉडी) फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में 7G3 के समाधान, 7.6 पीएच तैयार करते हैं ।
  2. भंग sulfo-SMCC में dimethyl sulfoxide (DMSO) 5-10 मिमी की एकाग्रता में । समाधान भंवर अच्छी तरह से सबसे अच्छा काम करता है के लिए पूरा विघटन प्राप्त करने के लिए ।
  3. 7G3 युक्त ट्यूब में जोड़ें भंग sulfo-SMCC समाधान (आमतौर पर के बीच 5-20 μL दाढ़ के sulfo अनुपात के आधार पर-SMCC-to-7G3 वांछित). 10-, 25-, और 50-से-1 का परीक्षण sulfo-SMCC-to-7G3 अनुपात अनुशंसित है । 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
  4. शुद्ध और एक ultrafiltration उपकरण और पंजाब में बफर एक्सचेंज का उपयोग करके maleimide-derivatized 7G3 ध्यान केंद्रित, 7.0 पीएच । के माध्यम से लगभग 5 मिनट छोड़ प्रवाह के लिए 8,000 x जी में केंद्रापसारक और पंजाबियों के साथ भरें, पीएच 7.0 और फिर से केंद्रापसारक ।
    1. इस बफ़र को पूरी तरह से exchange के लिए 7-8 बार निष्पादित करें । फिल्टर डिवाइस एक साफ microcentrifuge ट्यूब में उल्टा रखकर केंद्रित 7G3 प्रोटीन पुनर्प्राप्त करें । के लिए 2 मिनट के लिए केंद्रापसारक पर 1,000 एक्स जी वसूली मात्रा लगभग 0.3 मिलीलीटर होना चाहिए
  5. maleimide-सक्रिय 7G3 युक्त ट्यूब में, पिछले चरण में प्रयोग किया जाता sulfo-SMCC-7G3 अनुपात के सापेक्ष ChAcNLS के 2-गुना दाढ़ अतिरिक्त जोड़ने और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी । उदाहरण के लिए, यदि कोई 10-से-1 sulfo-SMCC-to-7G3 अनुपात का उपयोग किया गया था, तब एक 20-से-1 ChAcNLS-7G3 अनुपात का उपयोग करें । कुल वॉल्यूम उल्लेखनीयतया परिवर्तित नहीं किया जाना चाहिए ।
    नोट: यद्यपि ChAcNLS विकार प्रक्रिया के दौरान वर्षा का कारण नहीं है यह एक संभावना है कि अंय पेप्टाइड्स के साथ हो सकता है । वर्षण के संकेत के लिए प्रतिक्रिया के दौरान ट्यूब निरीक्षण, जो सबसे अधिक संभावना है जब पेप्टाइड्स hydrophobic रहे हैं के कारण होता है । इन मामलों में यह ब्याज की पेप्टाइड पर गौर करने के लिए hydrophilicity वृद्धि प्रदान करने के लिए परिवर्तन डिजाइन करने के लिए लायक हो सकता है ।
  6. ध्यान केंद्रित 7G3-ChAcNLS एक ultrafiltration उपकरण का उपयोग कर वांछित एकाग्रता के लिए और पंजाब पीएच 7.4 में बफर एक्सचेंज (1.4 कदम देखें) । कुल प्रोटीन की वसूली उपज मूल शुरू सामग्री का ≥ 75% होना चाहिए ।
  7. एक 12% polyacrylamide जेल का उपयोग कर निर्मित 7G3-ChAcNLS उंमीदवारों का मूल्यांकन करने के लिए एसडीएस-PAGE प्रदर्शन (ChAcNLS जंजीरों से संयुग्मित nonconjugated भारी और प्रकाश श्रृंखला की पर्याप्त जुदाई प्रदान करता है) । 2 μL β-mercaptoethanol और लोड में अच्छी तरह से युक्त पृष्ठ लदान बफर में 7G3-ChAcNLS के 10 μg मिश्रण ।
  8. सेट उचित वोल्टेज (एक 12% जेल के लिए 1 एच के लिए 120 वी) और ट्रो चलाते हैं । ट्रो बंद करो जब Coomassie डाई सामने जेल के नीचे पहुंचता है ।
    नोट: Coomassie डाई सामने जेल बंद चलाने मत देना ।
  9. ट्रो तंत्र से जेल निकालें और 10% v/v हिमनदों एसिटिक एसिड और 20% वी/वी मेथनॉल युक्त समाधान के साथ कुल्ला ।
  10. जेल की एक तस्वीर ले लो और एक शासक के साथ और दूरी (सेमी) मानकों और 7G3 conjugates के लिए चले गए उपाय । अवधारण फ़ैक्टर (Rf) मान की गणना करें, जो जेल की लंबाई (जहां से प्रोटीन Coomassie माइग्रेशन के सामने लोड किया जाता है) द्वारा विभाजित की गई दूरी है. प्रत्येक प्रोटीन मानक से आरएफ मूल्यों के खिलाफ प्रवेश में आणविक वजन (मेगावाट) प्लाट और 7G3 conjugates के आकार एक्सट्रपलेशन ।
  11. १७६८.५ g/मोल (मेगावाट ChAcNLS) द्वारा 7G3 conjugates और अनसंशोधित 7G3 के बीच मेगावाट में अंतर को विभाजित करके प्रति एंटीबॉडी पेप्टाइड्स की संख्या की गणना करें ।
  12. Coomassie-दाग जेल के डिजिटल छवियों को ले लो और densitometry विश्लेषण प्रदर्शन करते हैं । इस बिंदु पर, एक नेतृत्व उंमीदवार के चयन ChAcNLS अणुओं है कि महत्वपूर्ण कुल प्रजातियों में शामिल नहीं है की अधिकतम संख्या के साथ एसी पर आधारित हो सकता है ।

2. Intracellular संचय मूल्यांकन के लिए फोकल माइक्रोस्कोपी

नोट: यह महत्वपूर्ण है selectivity के intracellular संचय के सेल का परीक्षण करने के लिए पेप्टाइड संशोधित mAbs के एक पेलोड के साथ विकसित करने से पहले ब्याज । क्योंकि जैसे भी विशिष्ट कोशिका पैठ के लिए एक प्रवृत्ति है दिखाया गया है, यह पहले intracellular संचय और सेल selectivity का विश्लेषण महंगा पेलोड के साथ महंगा विकास कदम उपक्रम के लायक है । इस कारण के लिए, प्रक्रिया 1 भी isotype विशिष्ट अप्रासंगिक नियंत्रण mAbs संशोधित करना चाहिए । प्रोटोकॉल के आराम के लिए हम एंटीबॉडी प्रति 10 ChAcNLS अणुओं के साथ संशोधित ACs के साथ काम करेंगे । प्रक्रियाओं 2 और 3 के लिए महत्वपूर्ण चरणों सहित एक योजनाबद्ध चित्रा 2में वर्णित है ।

चेतावनी: प्रोटोकॉल के इस कदम से निपटने और paraformaldehyde के हेरफेर शामिल है । हैंडलिंग जब निर्माता निर्देशों का पालन करें ।

  1. संशोधित नियंत्रण mAbs सहित 7G3-ChAcNLS के 200 एनएम के साथ लक्ष्य TF-1a कोशिकाओं का इलाज करें । 5 x 106 प्रतिजन-1 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर conjugates के साथ सकारात्मक कोशिकाओं की मशीन ।
  2. 1 ज के बाद, supernatant निकालें और बर्फ ठंडा पंजाब में 1 मिलीलीटर 3x के साथ धो लो । 37 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त घंटे के लिए ताजा मीडिया और मशीन जोड़ें ।
  3. अतिरिक्त घंटे के बाद, supernatant निकालें और 1 मिलीलीटर बर्फ ठंडा पंजाब में 3x धो लो । 30 मिनट तक 3 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.25% trypsin और ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) युक्त पंजाबियों की 0.5 मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: प्रारंभिक पायलट परीक्षण के दौरान यह trypsinize कोशिकाओं को नहीं क्रम में एसी intracellular संचय में अंतर निर्धारित करने के लिए सिफारिश की है । इस प्रोटोकॉल trypsin के उपयोग को बढ़ावा देता है और हम प्रदर्शन कैसे यह अलग एसी उंमीदवारों की intracellular संचय दक्षता का आकलन में सुधार ।
    1. सभी कोशिकाओं को अलग किया जा रहा है के लिए नेत्रहीन जांच द्वारा मशीन के लिए विभिन्न बार परीक्षण. इसके अलावा, मशीन व्यवहार्यता धुंधला समाधान के साथ सेल aliquots और प्रवाह cytometric विश्लेषण प्रदर्शन के रूप में पहले 40वर्णित है ।
    2. सेल संस्कृति RPMI १६४० मीडिया/10% भ्रूण गोजातीय सीरम के 1.5 मिलीलीटर के साथ trypsin बेअसर । 5 मिनट के लिए 500 x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक, supernatant निकालें, और 0.5 मिलीलीटर बर्फ ठंडा पंजाब में 3x धो लो ।
  4. 0.5 मिलीलीटर पंजाब में कोशिकाओं को ठीक 1% paraformaldehyde और बर्फ पर 1% सुक्रोज के लिए 30 मिनट धो कोशिकाओं 0.5 मिलीलीटर बर्फ ठंडा पंजाब में 3x और 5 min. Permeabilize कोशिकाओं के लिए 250 एक्स जी में 0.5 मिलीलीटर पंजाब से युक्त 0.15% ट्राइटन x-100 के लिए बर्फ पर 5 मिनट के लिए । आइस-कोल्ड पंजाब और दोहराने के केंद्रापसारक में कोशिकाओं को धो लें ।
  5. एक विरोधी murine (isotype विशिष्ट) एफसी माध्यमिक polyclonal एंटीबॉडी संयुग्मित के लिए 2 μg/एमएल (या की सिफारिश की एकाग्रता) युक्त में 0.1 मिलीलीटर पंजाबियों में कोशिकाओं को निलंबित 1 ज अंधेरे में कमरे के तापमान पर AlexaFluor के लिए 647 ।
    1. 5 मिनट के लिए 250 x जी पर केंद्रापसारक और धो 0.5 मिलीलीटर बर्फ ठंडा पंजाब में 3x कोशिकाओं । 0.5 एमएल पंजाब में सेल सस्पेंड ।
      ठहराव: कोशिकाओं रेफ्रिजरेटर में संग्रहित किया जा सकता है ।
      नोट: यह एक द्वितीयक एंटीबॉडी कि ब्याज की मॉब की सही isotype को पहचानता है का चयन करने के लिए आवश्यक है । AF647 अपने दूर अवरक्त उत्सर्जन है, जो propidium आयोडाइड (PI) नाभिक के दाग के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है की वजह से चुना है ।
  6. PI को कक्षों के साथ कंटेनर के लिए 10 μg/एमएल की एकाग्रता में जोड़ें । अगला, माउंट 1 x 105 कोशिकाओं पर ग्लास स्लाइड बढ़ते मीडिया और एक गिलास coverslip के साथ कवर का उपयोग कर ।
  7. एक योजना के साथ कक्षों की जांच करें एपीओ 60X तेल विसर्जन उद्देश्य NA एक उल्टे लेजर स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप पर 1.42 । 488 एनएम आर्गन लेजर और वर्णक्रमीय स्कैनिंग 600-650 एनएम के लिए निर्धारित चश्मे का उपयोग कर PI प्रतिदीप्ति का पता लगाने । AF647 प्रतिदीप्ति के लिए 633 एनएम हीलियम-नीयन लेजर और वर्णक्रमीय स्कैनिंग 650-700 एनएम के लिए सेट चश्मे का उपयोग करें । PI और AF647 अनुक्रमिक से प्रतिदीप्ति उत्सर्जन ले लीजिए ।
    नोट: मूल्यांकन और कक्षों की तुलना भर में एक ही सेटिंग का उपयोग करें । हालांकि, आप गैर-trypsinized कक्षों की तुलना में trypsinized कक्षों के लिए सेटिंग्स समायोजित करने के लिए होगा ।
  8. छवियों का अधिग्रहण करने के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें । 2x लाइन पूरे सेल मोटाई के माध्यम से 0.5 माइक्रोन अंतराल पर लिया औसत के साथ 1024 x 1024 पिक्सल के धारावाहिक क्षैतिज ऑप्टिकल वर्गों का उपयोग कर छवियों को इकट्ठा । अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता पर चार लगातार स्लाइस से खड़ी z-अनुमानों के रूप में छवियों को पेश.
  9. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के साथ कोशिकाओं का विश्लेषण. conjugates के सेलुलर वितरण पैटर्न रिकॉर्ड । विशेष रूप से, का मूल्यांकन करें कि क्या intracellular प्रतिदीप्ति कोशिका द्रव्य में समूहीकृत और कक्ष सतह के पास है या फैलाना और सजातीय । इसके अलावा प्रति सेल सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता का मूल्यांकन ।

3. Radiolabeled एसी निर्माण और 64 घन Intracellular वितरण दक्षता के मूल्यांकन के लिए सेलुलर अंशीकरण

चेतावनी: प्रक्रियाओं 3 और 4 हैंडलिंग और रेडियोधर्मिता के हेरफेर शामिल है । इन चरणों के प्रदर्शन से पहले, शोधकर्ताओं ने अपने गृह संस्थान के विकिरण सुरक्षा प्राधिकरण से अनुमोदित सुरक्षा प्रशिक्षण और प्रोटोकॉल को अनुमोदित किया जाना चाहिए ।

नोट: प्रक्रियाओं के लिए 3 और 4 हम मॉब A14, जो इनवेसिव मूत्राशय कैंसर प्रतिजन IL-5Rα41के लिए विशिष्ट है का उपयोग करें । इसके अलावा, सभी प्रयोगों 64घन के छोटे आधे जीवन के कारण समय संवेदनशील हैं । आम तौर पर, यह पिछले 1 सप्ताह प्रतीक्षा करने के लिए इन विट्रो प्रयोगों में और नहीं अब 72 से अधिक vivo अध्ययन में एच करने के लिए सबसे अच्छा है ।

  1. एक 1.7 एमएल ट्यूब सस्पेंड 2 में, 2 '-(7-(2-((2, 5-dioxopyrrolidin-1-yl) ऑक्सी) -2-oxoethyl)-1, 4, 7-triazonane-1, 4-diyl) diacetic अम्ल (नोटा-एन एच एस) को DMSO में 10 मिमी की एकाग्रता ।
  2. प्रतिक्रिया 50-नोटा के अतिरिक्त दाढ़ गुना-A14 के साथ एन एच एस (2 मिलीग्राम शुरू सामग्री) 0.1 M सोडियम बिकारबोनिट में 1 घंटे के लिए पीएच 8.6 में एक मात्रा ≤ 0.5 मिलीलीटर में (अंतिम नोटा-एन एच एस मात्रा 2% से अधिक नहीं होना चाहिए वी/
  3. शुद्ध और बफर-विनिमय नोटा-A14 में एक ultrafiltration डिवाइस का उपयोग कर, 7.6 पीएच (1.4 कदम देखें) ।
  4. ChAcNLS के बाद अनुलग्नक के लिए, 1.2-1.6 चरणों का पालन करें ।
  5. प्रतिक्रिया नोटा-A14-ChAcNLS (250 μg बैचों) के साथ 100 megabecquerel (MBq) के साथ 64CuCl2 में 0.1 M सोडियम बिकारबोनिट, पीएच 5.5 के लिए 1 ज में 37 ° c ≤ 0.1 mL. 64 घन TR पर उत्पादित है-पीईटी साइक्लोट्रॉन पर CIMS 42।
  6. 64घन-A14-ChAcNLS पंजाब पीएच 7.4 में ध्यान केंद्रित करने के लिए वांछित एकाग्रता एक ultrafiltration डिवाइस का उपयोग (1.4 कदम देखें) ।
  7. radiolabeling क्षमता का निर्धारण 64घन-A14-ChAcNLS द्वारा त्वरित पतली परत क्रोमैटोग्राफी (ITLC) का उपयोग क्रोमैटोग्राफी स्ट्रिप्स और 0.1 M, पीएच 5.5 सोडियम साइट्रेट (ITLC eluent) विलायक के रूप में । लागू ITLC पट्टी करने के लिए प्रतिक्रिया समाधान के 0.5 μL aliquot । पट्टी के एक autoradiograph प्रदर्शन और एक डिजिटल छवि प्राप्त करें ।
    1. बाध्य और मुक्त 64घन के अनुपात को प्राप्त करने के लिए densitometry निष्पादित करें । यदि निःशुल्क 64घन सामग्री > 5% है, तो पिछले चरण पर लौटें और अतिरिक्त शुद्धिकरण करें ।
    2. इसके अलावा, एसडीएस-पृष्ठ प्रदर्शन Coomassie के साथ एकत्रीकरण के दाग । एक दूसरे एसडीएस-पृष्ठ जेल के एक autoradiograph के बाद अगर वहां radiolabeled कुल प्रजातियों का निर्धारण करने के लिए प्रदर्शन करते हैं ।
  8. संबध बाइंडिंग गुणवत्ता की जांच बिंदु: मशीन 64घन-A14 conjugates में बढ़ती सांद्रता (0-100 एनएम) के साथ डुप्लिकेट में 1 x 106 प्रति मिलीलीटर लक्ष्य कोशिकाओं । गैर-विशिष्ट बाइंडिंग का अनुमान लगाने के लिए, 64घन-A14 conjugates की 100-गुना दाढ़ अतिरिक्त अनलेबल्ड A14 की उपस्थिति में कक्षों के साथ डुप्लिकेट नमूनों को मिलाएं ।
    1. बर्फ पर 1 ज की गर्मी के बाद, कोशिकाओं को धोने और एक गामा काउंटर में कुल बाउंड एंटीबॉडी नमूनों और कुल विशिष्ट बाउंड एंटीबॉडी नमूनों की गणना । ग्राफ विशिष्ट बाध्यकारी (कुल बंधे एंटीबॉडी-गैर विशिष्ट बाध्य एंटीबॉडी) प्रतिक्रियाशील मुक्त 64घन-A14 (एनएम) के खिलाफ परख में इस्तेमाल किया । पृथक्करण स्थिरांक का निर्धारण करें (Kd) रेखांकन सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके रेखीय प्रतीपगमन द्वारा ।
  9. 64घन सेलुलर संचय अध्ययन के लिए: 64घन के 100 एनएम के साथ कोशिकाओं का इलाज-लेबल A14 conjugates के लिए 1 ज, 6 एच, और 24 एच में 37 ° c पहले वर्णित के रूप में33। इस तरह के उपचार के रूप में अतिरिक्त मानकों को संशोधित A14 की उपस्थिति में IL-5Rα साइटों ब्लॉक और 4 डिग्री सेल्सियस पर रिसेप्टर मध्यस्थता internalization ब्लॉक करने के लिए शामिल हैं ।
  10. निर्धारित समय बिंदुओं पर, जैसा कि पहले चरण 2.3-2.3.2 में बताया गया है, 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.25% trypsin और EDTA युक्त पंजाब के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें बेअसर और धुलाई के बाद ।
  11. प्लाज्मा झिल्ली lysis बफर में कोशिकाओं मशीन 1% NP-40, 10 मिमी Tris पीएच 7.5, 10 मिमी NaCl, 3 मिमी MgCl2 बफर के लिए बर्फ पर 10 मिनट के लिए 90 x g पर प्लाज्मा झिल्ली-लीजड ड कोशिकाओं 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
  12. supernatant निकालें और ताजा ट्यूब में जगह है । यह cytoplasmic अंश का प्रतिनिधित्व करता है । आइस-कोल्ड पंजाब में 3x नाभिक को धोएं और cytoplasmic अंश में बहाकर डालें ।
  13. सुनिश्चित करें कि परमाणु और cytoplasmic अंशों युक्त शीशियों सील कर रहे हैं । फिर उंहें एक गामा काउंटर में जगह 64घन के लिए नपेed क्रम में MBq को कच्चे मायने में परिवर्तित ।
  14. लामिन ए के लिए पश्चिमी दाग विश्लेषण प्रदर्शन करके नाभिक अलगाव की गुणवत्ता का निर्धारण, एक प्रतिबंधित परमाणु प्रोटीन, और Rab7, पूरे सेल lysate पर एक प्रचुर मात्रा में cytoplasmic प्रोटीन, परमाणु और cytoplasmic भागों ।
    1. 5 x 106 कोशिकाओं रेडियो-immunoprecipitation परख (RIPA) बफर और 1%, 2%, और 4% NP-40 युक्त चरण 3.12 में प्लाज्मा झिल्ली lysis बफर के 500 μL के साथ इलाज । इसके अलावा, RIPA बफर के 500 μL में पृथक नाभिक के इलाज के लिए अलग परमाणु प्रोटीन प्राप्त करते हैं ।
    2. -20 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए 4x ठंडा एसीटोन का नमूना मात्रा का उपयोग कर, परमाणु, cytoplasmic और पूरे सेल प्रोटीन हाला । 10 मिनट और खिचड़ी भाषा supernatant के लिए 13,000 x जी में केंद्रापसारक को प्रोटीन गोली बेदखल नहीं सावधान किया जा रहा है । प्रोटीन भंग करने के लिए पंजाबियों के 100 μL जोड़ें ।
    3. 10% एसडीएस-पृष्ठ जेल के प्रत्येक कुआं में प्रोटीन की 10 μg लोड । 1.7-1.9 में वर्णित के रूप में ट्रो निष्पादित करें । पहले refeference 43में वर्णित के रूप में पश्चिमी ब्लाट स्थानांतरण प्रदर्शन ।
    4. सीढ़ी मार्करों कि सबसे अच्छा ~ 40 केडीए के एक मेगावाट के अनुरूप पहचान । इस मार्कर में आधे में झिल्ली कट । लामिन के साथ उच्च मेगावाट प्रोटीन युक्त जांच दाग-विशिष्ट एंटीबॉडी । जांच के साथ कम मेगावाट प्रोटीन के साथ झिल्ली के ऄब 7 विशिष्ट एंटीबॉडी । पश्चिमी दाग एक अच्छी तरह से ज्ञात तकनीक है और इस प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं है ।

4. ट्यूमर लक्ष्यीकरण के पीईटी इमेजिंग मूल्यांकन

नोट: heterotopic xenografts उत्पन्न करने के लिए चूहों में ट्यूमर कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करने की तकनीक अच्छी तरह से जाना जाता है और सबसे प्रयोगशालाओं में उनके ट्यूमर प्रणाली के लिए सिलवाया घर प्रोटोकॉल है. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं है । xenograft मॉडल होगा मोटापे से ग्रस्त मधुमेह/गंभीर संयुक्त immunodeficient (मंजूरी/चूहों असर IL-5Rα-सकारात्मक इनवेसिव मूत्राशय ट्यूमर एचटी-१३७६ और एचटी-B9. IL-5Rα-सकारात्मक इनवेसिव मूत्राशय ट्यूमर कोशिकाओं शामिल > xenograft में कुल कोशिकाओं के 66% । इसके विपरीत, केवल ~ 11% IL-5Rα-पॉजिटिव एचटी-B9 कोशिकाओं के विकसित xenografts में शामिल थे41। इस प्रकार इस मॉडल दो ट्यूमर है कि निकट रोगी ट्यूमर विविधता प्रतिनिधित्व में लक्ष्यीकरण एसी ट्यूमर के मूल्यांकन के लिए एक उत्कृष्ट उदाहरण प्रदान करता है ।

  1. ≥ 4 (मंजूरी/SCID) चूहों वाले समूहों में, इंजेक्शन 20-30 μg (6-9 MBq) के 64घन-A14-ChAcNLS, 64घन-A14-एनएलएस, और 64घन-A14 में पूंछ नस ।
  2. एक ही दिन एक बेलनाकार प्रेत (२४.८ एमएल) के 5 MBq युक्त 64घन ऊतक के ग्राम प्रति इंजेक्शन खुराक में प्रति सेकंड रेडियोधर्मी मायने रखता है परिवर्तित (% ID/
  3. 48 घंटे रुको और फिर उंहें एक प्रेरण कक्ष में रखने के द्वारा anesthetize चूहों 1.5 एल के साथ 2% isoflurane के साथ ऑक्सीजन के प्रवाह के/ प्रेरण के बाद और पालतू स्कैनर में स्थान से पहले माउस आंखों के लिए बाँझ नेत्र मरहम लागू करें ।
  4. तेजी से isoflurane के लिए एक नाक शंकु के साथ headfirst प्रवण स्थिति में एक पालतू जानवर स्कैनर तालिका के लिए माउस स्थानांतरण । स्थिति श्वसन और गुदा जांच और तापमान और श्वसन दर की निगरानी करने के लिए सुनिश्चित करें कि शारीरिक शर्तों प्रयोग के दौरान बनाए रखा है के रूप में पहले वर्णित 44।
  5. एक नियमित नमूना मोड सेटिंग और 250-650 कीव के एक ऊर्जा खिड़की का उपयोग कर पीईटी डेटा अधिग्रहण शुरू करें । आमतौर पर, एक 45 मिनट स्थिर प्रति माउस स्कैन पुनर्निर्माण और उच्च गुणवत्ता पीईटी छवियों के उत्पादन के लिए पर्याप्त संपाती घटनाओं प्रदान करने के लिए पर्याप्त है ।
  6. 64घन-AC स्कैन करने के बाद, स्कैनर से माउस निकालें और उसे पिंजरे में वापस रखें । पशु सुविधा के लिए लौटने से पहले पर्याप्त रूप से ठीक करने के लिए माउस के लिए अनुमति दें ।
  7. एक तीन आयामी अधिकतम संभावना अपेक्षा अधिकतम एल्गोरिथ्म की 20 पुनरावृत्ति का उपयोग कर खंगाला छवियों को प्राप्त करें ।
  8. ब्याज के क्षेत्र प्रदर्शन (रॉय) ट्यूमर और नेत्रहीन assessable के बीच सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अंगों का विश्लेषण ।
    1. 3d मुक्तहस्त उपकरण सेटिंग का उपयोग करके मात्रात्मक% ID/g डेटा प्राप्त करने के लिए ROIs आरेखित करें और ट्यूमर या सन्निकट जांघ मांसपेशी को सावधानीपूर्वक चित्रित । ROI में प्रति पिक्सेल की गणना पिछले चरण 4.2 से% ID/g में रूपांतरित की जाएगी ।
  9. 64घन-A14, 64घन-A14-ChAcNLS, 64घन-A14-एनएलएस ट्यूमर कंट्रास्ट, और मात्रात्मक ROI% ID/जी, और ट्यूमर के लिए पृष्ठभूमि अनुपात के लिए छवियों की तुलना करें ।

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Representative Results

प्रक्रिया 1 के लिए, एक crosslinker के रूप में sulfo-SMCC का उपयोग ChAcNLS के साथ संशोधित 7G3 के निर्माण बहुत विश्वसनीय है । आमतौर पर, जब एक 12% जेल पर भरी हुई है और एसडीएस द्वारा विश्लेषण-पृष्ठ, sulfo-SMCC-7G3 अनुपात में वृद्धि करने के लिए आनुपातिक मेगावाट में भेद stepwise वृद्धि में इस परिणाम और भारी और प्रकाश श्रृंखला के लिए अनुमति देता है के लिए व्यक्तिगत रूप से मूल्यांकन किया जा ChAcNLS विकार (चित्र 3) । 7G3 10 पर प्रतिक्रिया व्यक्त की, 20, 25-, और 50 के लिए-1 sulfo-SMCC-7G3 के अनुपात आरएफ माप और मेगावाट एक्सट्रपलेशन परिणामों के बाद में 3, 7, 10, और ChAcNLS प्रति 20 7G3 अणुओं । densitometry द्वारा, प्रतिशत मोनोमर प्रजातियों है > 90% 3-10 ChAcNLS के साथ संशोधित 7G3 के लिए । 7G3 के लिए-ChAcNLS20 कुल प्रजातियों में 45% है । यह दर्शाता है एसडीएस-पृष्ठ आगे के विकास के लिए एक 7G3-ChAcNLS संयुग्मी चयन के लिए अभी तक प्रभावी सरल है । हालांकि, एंटीबॉडी श्रृंखला के साथ मामूली धब्बा एंटीबॉडी कारण हो सकता है glycosylation यह कुल प्रजातियों की पहचान के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है ।

प्रक्रिया 2 के लिए, प्रतिनिधि डेटा trypsin का उपयोग कर के बीच अंतर प्रदर्शित करता है और कोई trypsin जब intracellular क्षमता संचय के लिए वायरस व्युत्पन्न पेप्टाइड-संशोधित ACs का मूल्यांकन । इस उदाहरण में, अपने intracellular संचय बढ़ाने के लिए 7G3-ChAcNLS की क्षमता के साथ और trypsin (चित्रा 4) के बिना इलाज कोशिकाओं में मूल्यांकन किया जा सकता है । हालांकि, trypsinization का महत्व स्पष्ट है जब conjugates के संचय की व्याख्या करने के लिए एसी दक्षता और selectivity निर्धारित तुलना के लिए इस्तेमाल किया । Trypsinization आधारभूत intracellular प्रतिदीप्ति स्तर के लिए अनुमति देता है के रूप में संशोधित 7G3 के साथ मनाया स्थापित किया जाना है । एक विस्तार कर सकते है कि 7G3 छोटे घावों में कोशिका द्रव्य तक ही सीमित है । इसके विपरीत, कोशिकाओं है कि trypsinized नहीं कर रहे हैं, 7G3-विशिष्ट प्रतिदीप्ति सेल सतह पर IL-3Rα के व्यक्त करने के कारण कोशिका सतह तक ही सीमित है । यह मुश्किल intracellular संचय और वितरण की जांच करने के लिए बनाता है क्योंकि सेल की सतह पर प्रतिदीप्ति हावी है और इस तरह intracellular प्रतिदीप्ति से ब्लॉक visualized जा रहा है । Trypsinizing कोशिकाओं को भी महत्वपूर्ण है जब आईजीजी के साथ सबूत के रूप में विशिष्टता का मूल्यांकन-ChAcNLS । हम देख सकते है कि वहां सेल सतह से कुछ गैर विशिष्ट प्रतिदीप्ति है, लेकिन पेप्टाइड की वजह से intracellular संचय के स्तर को निर्धारित करने में सक्षम नहीं होगा अगर कोशिकाओं trypsinized नहीं थे । अंत में, बिना trypsinization एक झूठा व्याख्या कर सकता है कि एक नव विकसित एसी लक्ष्य कोशिकाओं के अंदर जमा नहीं करता है । के रूप में 7G3-एनएलएस के साथ देखा, कोशिकाओं है कि प्रतिदीप्ति के बहुमत trypsinized नहीं कर रहे है फिर से सेल सतह से है । trypsinization के बाद, एक का पालन कर सकते है कि 7G3-एनएलएस जमा करता है, हालांकि लक्ष्य कोशिकाओं के अंदर सीमित है ।

प्रक्रिया 3 के लिए, प्रतिनिधि डेटा निर्माण, संबध के लिए गुणवत्ता नियंत्रण प्रदर्शित करता है, और इन विट्रो पेलोड प्रसव दक्षता और विशिष्टता के लिए रेडियो आइसोटोप 64 घन A14-ChAcNLS के साथ । Densitometry एक 12% polyacrylamide जेल से लिया रेडियोग्राफिक छवियों पर प्रदर्शन किया जिसमें 64घन-A14, 64घन-A14-एनएलएस, या 64घन-A14-ChAcNLS पता चलता है कि radiolabeled conjugates 100% मोनोमर प्रजातियों (आंकड़ा 5 ए) हैं । 64 घन-A14-ChAcNLS IL-5Rα के लिए nanomolar संबध दिखाता है । 64घन-A14-ChAcNLS की सांद्रता बढ़ाने के एक समारोह के रूप में A14-ChAcNLS दोनों एचटी-१३७६ और एचटी-B9 कोशिकाओं (चित्रा 5B) में 3-5 एनएम के सांद्रता पर संतृप्ति से संपर्क किया विशिष्ट बंधन पता चला । 64घन-A14-ChAcNLS पर एचटी-१३७६ और एचटी-B9 कोशिकाओं के लिए केडी क्रमशः 6.4 ± 1.7 एनएम और 3.1 ± 0.8 एनएम था । ChAcNLS विकार A14 के अपनत्व कम लगभग 2.5-5Rα एचटी-१३७६ और एचटी-B9 कोशिकाओं पर आईएल के लिए गुना । गामा गिनती पता चलता है कि नाभिक में रेडियोधर्मिता की वृद्धि और 64घन-A14-ChAcNLS द्वारा दिया कोशिका द्रव्य में विशिष्ट है और समय के साथ बढ़ जाती है (चित्रा6). गामा गिनती आम तौर पर लगभग प्रदर्शित करता है > 6-A14-ChAcNLS के साथ उपचार की तुलना में 64घन-A14-अतिरिक्त की उपस्थिति में ChAcNLS-intracellular में परमाणु और कोशिकाओं में संचय में वृद्धि A14 या जब उपचार अध्ययन 4 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 6A) पर प्रदर्शन कर रहे हैं. वहां भी है एक ≥ 3-नाभिकीय और intracellular संचय में वृद्धि 64घन के साथ इलाज कोशिकाओं के सापेक्ष 64घन-A14 और 64घन-आईजीजी-ChAcNLS सभी समय अंक (चित्रा घमण्ड) का परीक्षण किया ।

चित्रा 7 कोशिका भिन्नीकरण प्रोटोकॉल के महत्व को दर्शाता है. एचटी-१३७६ और एचटी-B9 कोशिकाओं प्लाज्मा झिल्ली lysis बफर 1%, 2%, या 4% NP-40 युक्त के साथ मशीन थे । पृथक नाभिक विशेष रूप से शामिल होना चाहिए लामिन A/तदनुसार cytoplasmic अंश Rab7 के लिए अनंय होना चाहिए । एक नियंत्रण के रूप में, RIPA बफ़र के साथ लीजड ड पूरे कक्ष दोनों अंशों में लामिन के लिए धनात्मक होना चाहिए । इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि जब लीजड ड एचटी-१३७६ कोशिकाओं के नाभिकीय अंश का मूल्यांकन करते हैं, तो वहां कोई Rab7 मौजूद नहीं है । इसके अलावा, cytoplasmic अंश में उपस्थित कोई लामिन क/ हालांकि, 4% NP-40 (चित्रा 7A) के साथ लीजड ड कक्षों से ली गई कोशिका द्रव्य में Rab7 की मात्रा कम है । यह सबसे अधिक संभावना पता चलता है कि 4% NP-40 lysis बफर प्लाज्मा झिल्ली के अलावा परमाणु झिल्ली को बाधित कर रहा है । यह cytoplasmic प्रोटीन के साथ परमाणु प्रोटीन के मिश्रण में परिणाम और इस तरह ऄब 7 की एकाग्रता को पतला । यह ऄब 7 उपस्थित की कम राशि बताते है । एचटी-B9 कक्ष एचटी-१३७६ कक्षों से भी अधिक संवेदनशील हैं. जब प्लाज्मा झिल्ली lysis बफर के साथ इलाज 4% NP-40, लामिन ए/सी स्पष्ट रूप से cytoplasmic अंश में देखा जाता है (चित्रा 7B) । नाभिकीय अंश में लामिन ए/सी की मात्रा में इसी कमी है । एचटी-B9 कोशिकाओं को भी संवेदनशील है पर 2% np-40 lysis बफर के रूप में cytoplasmic अंश में Rab7 की मात्रा दिख रहा है कम के सापेक्ष 1% np-40 । इस प्रकार, एक ब्याज की विशेष कोशिकाओं के साथ सेलुलर अंश का अनुकूलन इतना है कि नाभिक और intracellular अंतरिक्ष में पेलोड संचय के मात्रात्मक परिणाम सटीक रहे हैं चाहिए । यह एक उपंयास एसी के परमाणु स्थानीयकरण की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

प्रक्रिया 4 के लिए, या तो 64घन-A14, 64घन-A14-एनएलएस, या 64घन-A14-ChAcNLS में चूहों असर हिंदुस्तान टाइंस-१३७६ और एचटी-B9 heterotopic के इंजेक्शन पर पीईटी इमेजिंग-विपरीत हिंद पैर के लिए अनुमति देता है ट्यूमर के दृश्य के लिए टार्गेटिंग गुण (चित्र 8) । हमारे उदाहरण के रूप में, पीईटी छवियों के दृश्य निरीक्षण एचटी-१३७६ और एचटी-B9 ट्यूमर लक्ष्यीकरण क्षमताओं का 64घन-A14-ChAcNLS, 64घन-A14, और 64घन-A14-एनएलएस (चित्रा 8A) से पता चलता है । हालांकि, मामलों में जहां दृश्य निरीक्षण एचटी-B9 ट्यूमर के साथ के रूप में मुश्किल है, रॉय विश्लेषण ट्यूमर के लिए मांसपेशियों के अनुपात (चित्रा 8B) का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1: ChAcNLS-संशोधित mAbs. एसवी से एनएलएस अवशेष-40 बड़े टी-प्रतिजन (KKKRKV) स्पेसर एक N-टर्मिनल cysteine से ढकी अवशेषों के बीच सैंडविच हैं । Cholic एसिड (हरी कोष्ठक) cysteine के लिए युग्मित के रूप में पहले 34वर्णित है । निर्माण और ChAcNLS के शुद्धिकरण के बाद, cysteine sulfhydryl समूह विकार के लिए sulfo-SMCC के माध्यम से प्रयोग किया जाता है (लाल कोष्ठक; पहले से ही मॉब से जुड़ा दिखाया गया है) । नोट: मॉब (150 केडीए) और ChAcNLS (1.8 केडीए) स्केल करने के लिए नहीं हैं. अनुकूलित और Paquette, एम. एट अल एनएलएस-cholic एसिड विकार से IL-5Rαspecific एंटीबॉडी सेलुलर संचय में सुधार और vivo में ट्यूमर-लक्ष्यीकरण गुणों में एक मूत्राशय कैंसर मॉडल की अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । Bioconjugate केमिस्ट्री. दोी: 10.102/acs. bioconjchem. 8b00077. (2018) ।
-

Figure 2
चित्रा 2: एसी सेल उपचार के दृष्टिकोण और फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण के लिए और कोशिका भिन्नीकरण गुणवत्ता के विश्लेषण के लिए बाद में प्रसंस्करण की योजनाबद्ध. लाल तीर आवश्यक कदम 2.2, 2.3, 3.15, और 3.15.4 के अनुरूप है । अनुकूलित और Beaudoin, एस एट अल. ChAcNLS, एंटीबॉडी-Conjugates लक्ष्य सेल विशिष्ट Endosomal एस्केप, नाभिक को स्थानीयकरण की अनुमति के लिए एक उपंयास संशोधन, और बढ़ाया कुल Intracellular संचय से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । आणविक Pharmaceutics. 13 (6), 1915-1926, दोी: 10.1021/acs. molpharmaceut. 6b00075 (2016).

Figure 3
चित्र 3: ChAcNLS-संशोधित mAbs का विश्लेषण. एक को कम करने एसडीएस-kilodalton में इसी आणविक भार (केडीए) और संशोधित 7G3 भारी और प्रकाश श्रृंखला के संदर्भ के रूप में के साथ चल सीढ़ी (एल) दिखा पृष्ठ । निंनलिखित गलियों 7G3 से भारी और प्रकाश श्रृंखला के प्रवासन बैंड है 3, 7, 10, और 20 ChAcNLS के साथ संशोधित ।

Figure 4
चित्रा 4: मॉब Intracellular वितरण और संचय का विश्लेषण । फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों intracellular 7G3 वितरण और IL-3Rα पॉजिटिव ल्यूकेमिया कोशिकाओं 7G3, 7G3-ChAcNLS, आईजीजी, और आईजीजी-ChAcNLS के साथ इलाज में रिश्तेदार प्रतिदीप्ति संचय illustrating । कोशिकाएँ trypsinized थीं या निर्धारण से पूर्व trypsinized नहीं थीं. नाभिक propidium आयोडाइड (पीआई; रेड), एंटी-murine-एफसी-AF647 डाई (मॉब; ग्रीन), और PI/मॉब मर्ज के साथ दाग रहे हैं । स्केल 50 माइक्रोन है । trypsin और कोई trypsin समूहों के भीतर, छवियों को दिखाया अलग ACs के बीच समान साधन सेटिंग्स के साथ प्राप्त कर रहे थे. चित्रा 4 के trypsin भाग अनुमति के साथ refefence 34 से अनुकूलित है । अनुकूलित और Beaudoin, एस एट अल से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । ChAcNLS, एंटीबॉडी-Conjugates लक्ष्य सेल विशिष्ट Endosomal एस्केप, नाभिक को स्थानीयकरण की अनुमति देने के लिए एक उपंयास संशोधन, और बढ़ाया कुल Intracellular संचय । आणविक Pharmaceutics. 13 (6), 1915-1926, दोी: 10.1021/acs. molpharmaceut. 6b00075 (2016).

Figure 5
चित्रा 5: 64घन-A14-ChAcNLS शुद्धता और अपनत्व । (क) radiochemical शुद्धता की ६४घन-लेबल A14, A14-एनएलएस, A14-ChAcNLS द्वारा एसडीएस द्वारा जाँच की गई थी-पृष्ठ के बाद autoradiography. (ख) 64घन के लिए विशिष्ट बाइंडिंग curves-A14 और 64घन-A14-ChAcNLS एचटी-१३७६ और एचटी-B9 कोशिकाओं पर. त्रुटि पट्टियां दोहराने में किए गए प्रयोग के मानक विचलन का संकेत देते हैं । अनुकूलित और Paquette, एम. एट अलसे अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । एनएलएस-cholic एसिड विकार IL-5Rα-विशिष्ट एंटीबॉडी सेलुलर संचय में सुधार और vivo में ट्यूमर-लक्ष्यीकरण गुण एक मूत्राशय कैंसर मॉडल में । Bioconjugate केमिस्ट्री. दोी: 10.102/acs. bioconjchem. 8b00077. (2018) ।

Figure 6
चित्र 6: 64घन परमाणु और Intracellular संचय । तपसिल में प्रदर्शन किया सेल उपचार के प्रतिनिधि उदाहरण (त्रुटि पट्टियों मानक विचलन निरूपित) (A) विशिष्टता और (B) 64घन-A14-ChAcNLS के संचय वृद्धि प्रदर्शित करने के लिए । % संचय नाभिक में प्रस्तुत किया जाता है (बाएँ पैनलों) और कुल intracellular अंतरिक्ष (सही पैनलों) के सापेक्ष रेडियोधर्मिता की कुल मात्रा IL-5Rα-सकारात्मक इनवेसिव मूत्राशय कैंसर कोशिकाओं के उपचार के दौरान इस्तेमाल किया. त्रुटि पट्टियां दोहराने में किए गए प्रयोग के मानक विचलन का संकेत देते हैं । * p ≤ 0.05 इंगित करता है ।

Figure 7
चित्र 7: कक्ष भिन्नीकरण प्रक्रिया का विश्लेषण. (क) परमाणु और (ख) के पश्चिमी दाग लामिन ए के लिए Cytoplasmic अंश (शीर्ष दाग; लाल तीर) और ऄब 7 (नीचे दाग; काले तीर) के इलाज से प्राप्त एचटी-१३७६ और एचटी-B9 कोशिकाओं प्लाज्मा झिल्ली lysis बफर में या तो 1%, 2%, या 4 से युक्त % NP-40. RIPA बफ़र के साथ लीजड ड पूरे कक्षों में लामिन A/C और Rab7 दोनों अंशों के लिए धनात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था । रनिंग मानकों (एल) केवल शीर्ष दाग में चित्रित कर रहे हैं । इसके मल्टीपल isoforms के कारण तीन तीरों को लामिन ए/सी के लिए दिखाया गया है । अनुकूलित और Paquette, एम. एट अल से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । एनएलएस-cholic एसिड विकार IL-5Rα-विशिष्ट एंटीबॉडी सेलुलर संचय में सुधार और vivo में ट्यूमर-लक्ष्यीकरण गुण एक मूत्राशय कैंसर मॉडल में । Bioconjugate केमिस्ट्री. दोी: 10.102/acs. bioconjchem. 8b00077. (2018) ।

Figure 8
चित्रा 8: पीईटी इमेजिंग और रॉय विश्लेषण द्वारा ट्यूमर लक्ष्यीकरण के Vivo में विश्लेषण. (क) 48 में पीईटी छवियां एच बाद मंजूरी/SCID चूहों असर एचटी-१३७६ (लाल तीर) और एचटी-B9 (नीला तीर) ट्यूमर नसों में 64घन के साथ इंजेक्शन-A14, 64घन-A14-एनएलएस, और 64घन-A14-ChAcNLS । हरा तीर जिगर के ऊपर है । मांसपेशी रॉय रानी सर्कल के साथ दिखाया ड्राइंग । (ख) रॉय एचटी-१३७६ और एचटी-B9 ट्यूमर के लिए मांसपेशियों के अनुपात में ACs 48 एच पोस्ट इंजेक्शन । त्रुटि पट्टियों में प्रयोग के मानक विचलन का संकेत देता है n = 10 ROIs प्रति माउस (n = 5) । * p 0.05 इंगित करता है ।

ताट
CGGQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGS 20
CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQ 30
CGISYGRKKRRQRRR 29
GRKKRRQRRRPPQGYC 22, 25
TRQARRNRRRRWRERQRGC 26
एनएलएस
CGYGPKKKRKVGG 21, 23, 24, 27
Cholic एसिड-CGYGPKKKRKVGG 34

तालिका 1: ताट और एसवी की सूची-40 बड़ी टी-प्रतिजन एसी संशोधनों में इस्तेमाल किया पेप्टाइड्स व्युत्पंन ।

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Discussion

विरोधी कैंसर एजेंटों की प्रणालीगत प्रसव के प्रमुख लक्ष्यों को ट्यूमर साइट पर संचय बढ़ाने के लिए कर रहे हैं, और कैंसर की कोशिकाओं के भीतर, और स्वस्थ ऊतकों में अवांछित दुष्प्रभाव कम हो । ट्यूमर कोशिकाओं को आणविक पेलोड के एसी लक्षित प्रसव के इलाज और ट्यूमर का पता लगाने के लिए एक बेहद आशाजनक दृष्टिकोण है । हालांकि, endosome फंसाने और नीचे धारा lysosomal क्षरण की वजह से प्रभावकारिता की कमी एक महत्वपूर्ण चुनौती बनी हुई है । हालांकि इस प्रोटोकॉल अगली पीढ़ी ACs के निर्माण के लिए एक उदाहरण के रूप में ChAcNLS पेप्टाइड का इस्तेमाल करता है, वर्णित प्रक्रियाओं किसी भी पेप्टाइड संशोधित एसी के लिए अनुकूलनीय है intracellular दिया पेलोड की राशि बढ़ाने के उद्देश्य से विकसित किया जा रहा है कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए ।

इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) उच्च मेगावाट समग्र प्रजातियों की पहचान करना और सीमित करना; 2) intracellular संचय का निर्धारण करने के लिए विश्लेषण करने से पहले कोशिकाओं की trypsinization; 3) सेलुलर भिन्नीकरण प्रक्रियाओं की गुणवत्ता आश्वासन प्रदर्शन; और 4) पीईटी इमेजिंग प्रदर्शन vivo मेंट्यूमर लक्ष्यीकरण का मूल्यांकन करने के लिए ।

यह महत्वपूर्ण है विकार के लिए वायरस व्युत्पंन पेप्टाइड्स mAbs उच्च मेगावाट की कुल प्रजातियों में परिणाम नहीं है कि सबसे अधिक संभावना है intramolecular crosslinking के बीच mAbs के कारण है । यह प्रारंभिक चिंता का विषय है और आगे बढ़ने से पहले इससे निपटना चाहिए । अवांछित समुच्चय वाले पेप्टाइड-संशोधित ACs के साथ आगे बढ़ परिणाम है कि intracellular और vivo पेलोड वितरण प्रोफ़ाइल में जैसे पहलुओं पर झूठे सबूत प्रदान दे सकता है । mAbs पर प्रतिक्रियाशील maleimides आबंध एकत्रीकरण के लिए सबसे अधिक जिंमेदार है । एक समाधान sulfo-SMCC-to-मॉब अनुपात को कम करने के लिए है । एक अंय विकल्प के लिए एन एसिटाइल जैसे एमिनो एसिड के डेरिवेटिव Cys, Lys, उसके, Ser, और विकार के लिए पेप्टाइड maleimide के दौरान-मॉब-सक्रिय है- 45का उपयोग करने के लिए है । nucleophilic पक्ष-जंजीरों SMCC के maleimide moiety और कमी इंट्रा एंटीबॉडी crosslinking के साथ प्रतिक्रिया करने में सक्षम हैं । वैकल्पिक रूप से, विकार के बाद आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा पृथक्करण मोनोमर प्रजातियों को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 45। साइट-एंटीबॉडी करने के लिए पेप्टाइड के विशिष्ट विकार भी किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एंटीबॉडी कार्बोहाइड्रेट विकार के लिए पेप्टाइड्स के लिए संशोधित किया जा सकता है, जो मोनोमर प्रजातियों के लिए कुशलतापूर्वक उत्पादन दिखाया गया है 24।

एसडीएस-12% polyacrylamide जैल के साथ पृष्ठ एसी प्रजातियों में बड़े आकार के मतभेदों का एक व्यापक परिप्रेक्ष्य हासिल करने के लिए एक सस्ती और प्रभावी तरीका है । यदि% polyacrylamide में वृद्धि का प्रयोग किया जाता है, तो भारी श्रृंखलाओं और intramolecular प्रजातियों का पृथक्करण करना कठिन होगा । इसके विपरीत, अगर एक कम% polyacrylamide प्रयोग किया जाता है, प्रकाश श्रृंखला बंद जेल चलाने की संभावना है । ग्रैडिएंट जैल 4-20% युक्त polyacrylamide भी एक ही जेल पर भारी और प्रकाश श्रृंखला के लिए अच्छा प्रतिधारण पाली प्रदान करते हैं । विभिंन विश्लेषणात्मक आणविक विश्लेषण, उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी और केशिका ट्रो-एसडीएस के लिए उपलब्ध तकनीक के अलावा जुदाई और 46के ACs के लक्षण वर्णन के लिए एसडीएस-पृष्ठ से बेहतर हैं । बहरहाल, एसडीएस-पृष्ठ एक जल्दी और सस्ती विधि के लिए इन उपंयास एजेंटों के प्रारंभिक निर्माण का विश्लेषण और फिर कार्रवाई के बाद पाठ्यक्रम पर फैसला है ।

समाधान में कोशिकाओं की मशीन 0.25% trypsin (2.3 कदम) है, जो सेल की एक अधिकतम संख्या को हटा सतह प्रोटीन और बंधे ACs महत्वपूर्ण है क्योंकि यह सुधार दृश्य और intracellular संचय में सापेक्ष वृद्धि के लिए अनुमति देता है के बीच संदर्भ एंटीबॉडी । कैमरा पैरामीटर अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता पर छवियों पर कब्जा करने के लिए सेट कर रहे हैं । यह सेल से सेल के लिए एसी की राशि है कि जमा है में भिंनता के कारण है । इस प्रकार, अधिकतम तीव्रता पर छवियों पर कब्जा कम एसी संचय के साथ कोशिकाओं के लिए भी मूल्यांकन किया जा करने के लिए अनुमति देता है । हालांकि, कैंसर एंटीजन आमतौर पर ट्यूमर कोशिकाओं पर अत्यधिक व्यक्त कर रहे हैं । यदि कोशिकाओं trypsin द्वारा पाचन के अधीन नहीं थे, तो प्रतिदीप्ति सेल में ACs से निर्गत-सतह छवि पर हावी होगा । इसके अलावा, trypsinization विकास के बिना सूक्ष्म लेकिन महत्वपूर्ण intracellular संचय गुणों के साथ ACs के साथ सीमित किया जा सकता है.

उच्च गुणवत्ता सुनिश्चित सेलुलर अंश सही कोशिका द्रव्य बनाम नाभिक में 64 घन के संचय का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है । ChAcNLS की क्षमता एसी और पेलोड intracellular संचय बढ़ाने के लिए नाभिक के लिए सक्रिय स्थानीयकरण के कारण है 34। भविष्य वायरस-पेप्टाइड्स विकसित कर रहे हैं के रूप में, इन पेप्टाइड्स भी intracellular पेलोड दक्षता बढ़ाने के लिए अपने तंत्र के हिस्से के रूप में नाभिक को स्थानीयकृत कर सकते हैं । इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है कि सेलुलर भिन्नीकरण उच्च गुणवत्ता के लिए सही विस्तार से इस प्रक्रिया है । यह प्रोटोकॉल cytoplasmic मार्करों के लिए नाभिक के मूल्यांकन के महत्व और परमाणु मार्करों के लिए भी cytoplasmic अंश पर बल देता है. उदाहरण के लिए, हू एट अल., एक जैसे एक ताट पेप्टाइड के साथ संशोधित एसी विकसित की है और एक रेडियो आइसोटोप पेलोड के परमाणु संचय 24 का पता लगाया । calpain के लिए पश्चिमी दाग विश्लेषण, एक प्रचुर मात्रा में cytoplasmic प्रोटीन, परमाणु अंश में मौजूद था । यह सबसे अधिक संभावना थी क्योंकि वाणिज्यिक परमाणु अलगाव किट का इस्तेमाल किया गया । इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया है कि एचटी-१३७६ और एचटी-B9 कोशिकाओं एनपी-40 के विभिंन सांद्रता की आवश्यकता के लिए बरकरार झिल्ली के साथ समृद्ध नाभिक अलग करने के लिए । जब एचटी-B9 कोशिकाओं बफर के साथ लीजड ड थे 4% NP-40, लामिन ए/सी cytoplasmic अंश में मौजूद था उपचार के विघटन परमाणु झिल्ली का संकेत है और लामिन में प्रवेश करने के लिए एक/ यदि परमाणु और cytoplasmic अंश सावधानी से पृथक नहीं किए गए तो कुल intracellular संचय के लिए परमाणु स्थानीयकरण के योगदान की पहचान करना कठिन हो सकता है. जैविक और कृत्रिम रूप से व्युत्पंन पेप्टाइड्स की रिपोर्ट है कि विशेष रूप से endoplasmic जालिका, Golgi तंत्र, और mitochondria 47,48,49के रूप में अंय intracellular डिब्बों को लक्षित । इस प्रकार intracellular डिब्बों का अलगाव तेजी से प्रासंगिक होता जा रहा है.

एचटी-१३७६ और एचटी-B9 के ट्यूमर के A14-ChAcNLS लक्ष्यीकरण के 64घन के अपने विवरण के साथ यह प्रोटोकॉल खत्म हो जाता है । चित्रा 8में पीईटी छवियों के दृश्य निरीक्षण से, यह वृद्धि हुई ट्यूमर पालतू संकेत से स्पष्ट है आसंन आसपास के पृष्ठभूमि के सापेक्ष कम 64घन-A14-ChAcNLS एचटी-१३७६ और एचटी-B9 ट्यूमर का बेहतर लक्ष्यीकरण है (चित्रा 8A ). रॉय विश्लेषण भी ट्यूमर लक्ष्यीकरण का मूल्यांकन करने की क्षमता को दर्शाता है । हमारे उदाहरण में, हम रॉय ट्यूमर का उपयोग करने वाली मांसपेशी अनुपात ट्यूमर लक्ष्यीकरण मात्रा और प्रदर्शन के लिए 64घन-A14-ChAcNLS सुपीरियर एसी (चित्रा 8B) है । पीईटी इमेजिंग भी स्वस्थ अंगों में एसी sequestering के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है । जिगर प्राथमिक अंग है कि metabolizes एंटीबॉडी है । चित्रा 8A को दर्शाता है जिगर में 64घन-A14-ChAcNLS और 64घन-A14 के साथ इंजेक्शन चूहों में तुलनीय है । इस प्रारंभिक विकास के दौर में, इस डेटा का सुझाव ChAcNLS अवांछित sequestering कारण नहीं है । 64 घन 12.7 एच के एक आधे जीवन है, जो ACs है कि कई दिनों के आधे जीवन के लिए आदर्श नहीं है । के रूप में पहले Zeglis और लुईस द्वारा दृश्य प्रोटोकॉल में वर्णित है, लंबे समय के उपयोग के रेडियो आइसोटोप zirconium-89 (89 Zr) रहते थे एक पेलोड जिसका शारीरिक आधा जीवन mAbs के लिए आदर्श है और पीईटी 50 द्वारा imaged किया जा सकता है । इस प्रकार, कई दिनों में ट्यूमर डिलीवरी के मूल्यांकन के लिए, 89Zr एक पसंदीदा विकल्प है । यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है अगर चिकित्सा एक लक्ष्य है जहां उच्च ट्यूमर तेज अनुकूल है और एंटीबॉडी के साथ समय के साथ बढ़ जाती है 7. पुनर्वितरण के लिए व्यक्तिगत अंग का निर्धारण करने के लिए भी किया जाना चाहिए आगे लक्ष्यीकरण या नव विकसित ACs के sequestering गुण का पता लगाने के लिए । इसके अलावा, चूहों को संशोधित विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ खुराक के लिए ट्यूमर कोशिकाओं पर रिसेप्टर साइटों को ब्लॉक करने के लिए लक्ष्यीकरण विशिष्टता का मूल्यांकन किया जा सकता है । फिर भी, पीईटी इमेजिंग और ROI विश्लेषण के साथ 64घन पर्याप्त रूप से विकसित इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत ACs के ट्यूमर वितरण संपत्तियों की एक प्रारंभिक आकलन प्रदान करते हैं ।

इस प्रकार अब तक, ACs वायरस व्युत्पंन पेप्टाइड्स के साथ संशोधित radioisotopes के वितरण के लिए प्रतिबंधित किया गया है । यह आंशिक रूप से ऐतिहासिक कारणों से है और इसलिए भी क्योंकि radioisotopes आसानी से इन विट्रो में और vivo में परीक्षण के दौरान quantified हैं, और गैर इनवेसिव पूरे शरीर इमेजिंग विधियों का उपयोग कर visualized किया जा सकता है । स्वाभाविक रूप से, इस क्षेत्र के रूप में परिवहन और radioisotopes के अलावा अन्य पेलोड के वितरण के लिए फैलता है, जैसे chemotherapeutics, एंजाइमों, और oligonucleotides, इस प्रोटोकॉल में वर्णित तकनीकों में संशोधन करने के लिए विकसित किया जाना होगा. उदाहरण के लिए, वैकल्पिक पेलोड के intracellular संचय के मूल्यांकन के लिए उपंयास तरीकों को विकसित करना होगा । इसके अलावा, vivo मूल्यांकन में संशोधन के लिए आवश्यक मधुमक्खी के रूप में इन पेलोड आसानी से नहीं किया जा सकता है और इसलिए यह वितरण, विशिष्टता का आकलन करने के लिए मुश्किल हो जाएगा, और ट्यूमर के ऊपर दक्षता । इन कारणों के लिए, रेडियोन्यूक्लाइड पेलोड वैकल्पिक कार्गो के साथ भविष्य के विकास के लिए किराए के पेलोड के रूप में रहना चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

यह काम कैंसर रिसर्च सोसायटी (कनाडा) और CIMS द्वारा वित्त पोषित किया गया । लेखकों ने डॉ॰ समिया Ait-मोहनी और जीन-फ्रेंकोइस Beaudoin को सहायता के लिए धन्यवाद दिया । एंजेल लोपेज (दक्षिण ऑस्ट्रेलिया के विश्वविद्यालय) मॉब A14 के लिए डॉ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sulfo-SMCC Thermo Scientific 22122 There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters EMD Millipore UFC505096 There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards BioRad 1610375EDU Mulicolor recombinant proteins from 10 - 250 kDa.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200056 100 or 500 mL volumes to choose from.
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate Thermo Scientific A-21235 1 - 10 μg/mL recommended
NOTA-NHS CheMatech C100
Lamin A/C antibody (N-18) Santa Cruz Biotechnology sc-6215
Rab7 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376362
A14 mAb BD Biosciences 555902
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Thermo Scientific NP0007
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-25ML
TF-1a cells ATCC ATCC CRL-2003
RPMI 1640 medium ATCC ATCC 30-2001
RIPA lysis and extraction buffer Thermo Scientific 89900
AMIDE medical imaging software available at amide.sourceforge.net Completely free download
FluoView FV1000 Confocal Microscope Olympus
Fluoview Software Olympus www.olympus-lifescience.com
ITLC strips Biodex 150-771

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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इंजीनियरिंग अंक 133 वायरल-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स एंटीबॉडी-conjugates एसडीएस-पृष्ठ फोकल माइक्रोस्कोपी सेलुलर भिन्नीकरण तांबा-64 पीईटी इमेजिंग
सेलुलर संचय बढ़ाने और ट्यूमर लक्ष्यीकरण में सुधार के लिए वायरल-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स के साथ संशोधित एंटीबॉडी-conjugates का प्रारंभिक मूल्यांकन
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Beaudoin, S., Paquette, M., Fafard-Couture, L., Tremblay, M. A., Lecomte, R., Guérin, B., Leyton, J. V. Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting. J. Vis. Exp. (133), e55440, doi:10.3791/55440 (2018).

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