Summary
Här beskrivs en snabb jämviktsdialys (RED) -metod för att mäta läkemedelsbindning till caseum från lung-tuberkulosskador och hålrum. Protokollet används också med en skummig makrofag-härledd matris som är en effektiv surrogat till kaseum.
Abstract
Utrotningen av tuberkulos sjukdom kräver läkemedelsregimer som kan tränga igenom de flera skikten av komplexa lungskador. Läkemedelsfördelning i fallhålorna i hålrum och lesioner är särskilt avgörande eftersom de hamnar subpopulationer av läkemedelstoleranta bakterier som också vanligen kallas persister. Befintliga metoder för mätning av läkemedelspenetration vid tuberkulosskador innebär kostsamma och tidskrävande farmakokinetiska studier in vivo kopplade till bioanalytiska eller bildtekniker. In vitro- mätningen av läkemedelsbindning till caseummakromolekyler föreslogs som ett alternativ till sådana tekniker eftersom denna bindning hindrar passiv diffusion av läkemedelsmolekyler genom caseum. Snabb jämviktsdialys är ett snabbt och pålitligt system för att utföra plasmaprotein och vävnadsbindningsstudier. I detta protokoll använde vi en snabb jämviktsdialys (RED) -enhet för att mäta läkemedelsbindning till homogenat av caseum som är excisEd från lesioner och håligheter hos tuberkulosinfekterade kaniner. Protokollet beskriver också hur man genererar en surrogatmatris från lipidladdade THP-1-makrofager för användning i stället för caseum. Denna caseum / surrogatbindningsanalys är ett viktigt verktyg vid upptäckt av tuberkulosläkemedel och kan anpassas för att hjälpa till att studera läkemedelsfördelning i lesioner eller abscesser orsakade av andra sjukdomar.
Introduction
Behandlingen av pulmonell tuberkulos sjukdom kräver effektiv distribution av läkemedel i olika typer av lesioner. Nekrotiska lesioner och håligheter innehåller fallhaltiga centra som hamnar subpopulationer av drogtoleranta eller "beständiga" bakterier. 1 , 2 Kavitetssjukdomen är förknippad med sämre härdningsgrader och dålig prognos. 3 , 4 Tidigare studier har visat, med hjälp av kvantitativa och bildtekniker, att förmågan att penetrera fallum varierar signifikant från en läkemedelsklass till en annan. 5 , 6 Dessa metoder kräver emellertid användning av djursinfektionsmodeller som är långsamma och tråkiga. En in vitro- analys som mäter läkemedelsbindning till ex vivo- caseum utformades. Denna bindning visade sig omvänt korrelera med läkemedelspenetration i fallhaltiga granulomer och är följaktligenAnvänds som ett prediktivt verktyg. 7
Ewilibrium dialys anses vara den standardiserade metoden för plasma-proteinbindningsstudier. Den snabba jämviktsdialysen (RED) -anordningen ger ett snabbt, lättanvänt och pålitligt system för att utföra sådana analyser. 8 Enheten består av två komponenter: engångsinlägg, engångsinsatser bestående av 2 kamrar separerade av en vertikal cylinder av halvpermeabelt membran; Och återanvändbara basplattor som kan rymma upp till 48 insatser åt gången. Dialysmembranet har en 8 kDa molekylvikt cut-off (MWCO) som är idealisk för läkemedels-makromolekylbindningsstudier. Det höga ytarea-till-volymförhållandet i membranfacket möjliggör snabb dialys och jämviktning. Både insatserna och bottenplattan har validerats för minimal icke-specifik bindning. Kombinationen av den röda enheten med bioanalytiska tekniker ger noggranna uppskattningar av de obundna fraktionerna av droger i pLasma. 8 , 9
Även om den ursprungligen utformades för att mäta plasmaproteinbindning, har den RÖDA anordningen använts i flera vävnadsbindande studier med användning av homogenat. 10 , 11 I detta protokoll mäter vi läkemedelsbindning till kaseum, de nekrotiska skräpen skars ut från de nekrotiska skadorna och håligheterna hos tuberkulosinfekterade kaniner. Den akellulära och icke-vaskulära naturen hos fallmaterialet gör det lätt att homogenisera till en homogen suspension som är kompatibel med analysen.
Med tanke på att caseum är tråkigt att producera och svårt att komma med, har protokollet också validerats för användning med en surrogatmatris som framställs från skumma makrofager. THP-1 monocyt-härledda makrofager induceras med oljesyra för att ackumulera multipla lipidkroppar som ger dem sitt "skumma" utseende. Dessa lipidbelastade celler skördas ochBearbetas för att producera en matris som vi använder som en surrogat till caseum. Denna studie har visat att läkemedelsbindning till denna surrogatmatris korrelerar väl med bindning till kaseum, vilket effektivt efterliknar in vivo- processen som hindrar läkemedelspenetration i fallös kärna av granulomer och kaviteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Samtliga djurstudier utfördes i enlighet med Guide för skötsel och användning av försöksdjur i National Institutes of Health med godkännande från Institutional Animal Care och användning kommitté NIAID (NIH), Bethesda, MD. Alla studier med M. tuberculosis utfördes i ett laboratorium med biosäkerhet inneslutningsnivå 3 (BSL-3).
1. Kanin infektionsmodell och Caseum Collection
- Infektera Nya Zeeland vita kaniner med M. tuberculosis med hjälp av en näsa-bara aerosol exponeringssystem såsom tidigare beskrivits. 12, 13 Låt infektionen att utvecklas under 12-16 veckor. Stillsamma kaninerna med 35 mg / kg ketamin och 5 mg / kg xylazin intramuskulärt, euthanize kaninerna med 0,22 ml / kg pentobarbitalnatrium och fenytoinnatrium intravenöst och fortsätt med obduktion.
- Med hjälp av en pincett och en skalpell, ta bort lungor från bröstet cavitet. Från varje lunglobe, dissekera individuella håligheter och stora nekrotiska granulom med hjälp av en skalpell. Skruva försiktigt bort fallet från hålrummet och granulomaväggarna. Väg, registrera och lagra prover i 2 ml skruvförslutna rör vid -20 ° C tills de är färdiga för användning.
- Gamma-bestråla de infektiösa caseumproverna vid 3 MegaRad på torris för att göra dem smittfria och säkra för användning i ett BSL-2-lab.
2. In Vitro Generation of Caseum Surrogate From THP-1 Cells
- Växa THP-1-monocyter i RPMI 1640-medium (2 mM L-glutamin och 10% fetalt bovint serum) i T175-cellodlingskolvar (80 ml / kolv). Inkubera kolvarna i en 5% CO2-atmosfär vid 37 ° C i 3-4 dagar.
- Centrifugera kulturen från en T175 kolv i två 50 ml koniska rör vid 150 xg i 5 min. Kassera supernatanten och suspendera pelleten i 10 ml RPMI 1640 media.
- Pipettera 5 μl av denna odling i ett 1,5 ml rör innehållande 45 μl trypan blå. Blanda noggrant genom pipettering. Överföring 10 mikroliter till en hemocytometer och räkna antalet viabla THP-1-monocyter (ofärgade) med användning av ett ljusmikroskop (10X förstoring). Beräkna antalet viabla celler per ml av kulturen. Späda ut det med RPMI-medium till den slutliga densiteten av 1,25 x 10 6 celler / ml.
- Belastning 40 ml av kulturen på en stor cellkulturplatta (50 x 10 6 celler / platta). Lägga 40 mikroliter av 100 ^ M PMA (forbol 12-myristate13-acetat ställdes i etanol) och låt cellerna att vidhäfta över natt i inkubatorn.
OBS: Slutlig koncentration av PMA är 100 Nm. - Utspädd ren oljesyra (OA) (0,89 g / ml) i etanol till en koncentration av 0,1 M (dvs 31,7 pl OA i 968,3 mikroliter etanol). Späd denna lösning i färskt förvärmt RMPI mediet till en koncentration av 10 mM. Späd denna OA suspension till 0,4 mM (slutlig arbetskoncentration) i RPMI-medium förvärmas till 37 ° C.
- Ta bort den befintliga media och icke-härda celler från cellodlingsplattoma och tillsätt försiktigt 40 ml av 0,4 mM OA till THP-1-makrofagerna (THP-M). Inkubera vid 37 ° C i inkubatorn över natten.
- Använd ett ljusmikroskop vid 40x förstoring för att visuellt bekräfta närvaron av många lipidkroppsupptagningar i varje THP-M. Ta bort allt RPMI-medium från cellodlingsplattorna och tvätta de vidhäftade cellerna försiktigt två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med en 50 ml serologisk pipett.
OBS: Lipidkroppar uppträder som små, klara, sfäriska strukturer i cytoplasman av THP-M. - Tillsätt 40 ml 5 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) i PBS till varje platta. Inkubera i 15 minuter vid 37 ° C.
- Lossa de skumma makrofagerna (FM) genom att upprepade gånger pipettera upp och ner över ytan av hela plattan med en 10 ml serologisk pipett. Överför cellsuspensionen till ett 50 ml koniskt rör och snurra ner vid 150 xg under 5 minuter.
- Resuspendera cellpelleten i 10 ml PBS (tredje PBS-tvätt) aNd överföring till en förvägd 15 ml konisk rör. Snurra ner igen vid 150 xg i 5 min. Aspirera försiktigt supernatanten med hjälp av en serologisk pipett och kassera.
- Mata FM-pellets till 3 frys-tina cykler för att lysa cellerna och inkubera dem vid 75 ° C i 20-30 min till denatureringsproteiner i matrisen. Förvara pelletsen vid -20 ° C tills den är klar för användning.
3. Rapid Equilibration Dialysis (RED) Assay
- Förbered 10 mM stamlösningar av alla testföreningar i dimetylsulfoxid (DMSO). Späd till 500 μM arbetslösningar i DMSO före varje analys.
- Väg röret innehållande caseum-surrogatpelleten. Dra av vikten av det tomma röret för att härleda vikten av pelleten ensam. Tillsätt 2-3 metallpärlor per rör och, med hjälp av en vävnadshomogenisator vid 1200 stroke / min under 1 min, störa caseum eller surrogatmatrisen i PBS (1: 9 vikt / volym) för att uppnå 10x utspädd suspension av varje matris.
- Spike 6.5 μL av 500ΜM lösning av testföreningen i 643,5 μl av homogenatet för att uppnå slutkoncentrationen av 5 | iM (<1% DMSO) och virvel.
- Placera de röda insatserna i bottenplattan. Tillsätt 200 μL av läkemedelspikad matris i donorkammaren (röd ring) av varje RED-insats och 350 μl PBS i varje mottagarkammare. Förbered 3 insatser för varje testförening (trippelprover). Tätningsplatta med en självhäftande plåtförsegling och inkubera vid 37 ° C på termomixern vid 200 rpm (1 xg) i 4 timmar.
- Efter inkubationen blanda försiktigt innehållet i givar- och mottagarkamrarna genom att pipettera upp och ner 2-3 gånger. Pipettera ut 20 μl alikvoter av homogenat från donorkamrarna och tillsätt till 20 μl ren PBS i ett 1,5 ml rör (1: 1). På liknande sätt pipetterar du 20 μl alikvoter av PBS-prover från mottagarkamrarna och lägger till 20 μl rent homogenat (matris matchning). 8
OBS: Matrix-matchning eliminerar neEd för 2 separata kalibreringskurvor (i homogenat och PBS) som ska göras för kvantitativ analys. Innehållet i givarkammaren kan sedimentera över tiden. Blanda försiktigt innehållet med pipettering före avlägsnande av alikvoter.
4. LC-MS kvantifiering och dataanalys
- Tillsätt 160 μl 1: 1 metanol: acetonitril innehållande 500 ng / ml diklofenak eller 10 ng / ml verapamil (intern standard) till varje rör och virvel för att fälla ut proteiner. Centrifugera vid 10 000 xg under 5 min för att sedimentera fällningen och överföra supernatanter i 96-brunns djupbrunnsplattor för analys av vätskekromatografi-masspektrometri (LCMS). 7
- Bygg kalibreringskurvorna från 1-1000 nM för varje testförening medan samma matriskomposition hålls som proven ovan. Kvantifiera koncentrationen av testförening i prover från donator- och mottagarkamrarna med användning av en LC-MS-metod.
- Beräkna den obundna fraktionen ( f u ) oF läkemedlet i utspädd matris med användning av ekvation 1. Beräkna fu i outspädd matris med användning av ekvation 2 ( D = utspädningsfaktor på 10). 14
- Kontrollera återhämtningen (massbalansen) för varje förening med användning av ekvation 3 för att identifiera föreningar med stabilitet / metabolism / icke-specifika bindningsfrågor.
OBS: Återvinning faller vanligtvis mellan 70% och 130%. 15
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av detta protokoll, har vi testat hundratals läkemedel tuberkulos utvecklingsföreningar för deras förutspådde effektivitet vid inträngande caseum. Figur 1 visualiserar de grundläggande koncepten för den RÖDA analysen. Dialysmembranet av de röda skären möjliggör obundna små molekyler att diffundera från givaren väl till mottagaren väl slutligen uppnå en jämvikt mellan de båda avdelningarna. Små molekyler som är bundna till makromolekyler såsom proteiner eller lipider är fångade i donator väl. Kvantitativ analys av proverna från båda facken tillåter beräkning av den obundna fraktionen (fu) för varje liten molekyl i caseum eller surrogat matris. Denna fraktion har visats direkt korrelerar med läkemedelspenetration i caseum in vivo. 7 Såsom fig 2 illustrerar med hjälp av MALDI (matrisassisterad laserdesorption / jonisering) mass spectroMetriska bilder, ju högre f u , desto mer diffunderar läkemedlet till caseum. Följaktligen överensstämmer detta med hypotesen att när läkemedelsmolekyler diffunderar in i den yttre kanten av fallet från dess gränssnitt med cellulära skikt av lesionen, bindar bindning till fallösa makromolekyler läkemedlet, vilket förhindrar att det diffunderas ytterligare i fallkärnan. En provpanel av 18 anti-tuberkulosläkemedel anges i tabell 1 tillsammans med deras fu i både caseum och surrogatet. Såsom visas i figur 3 är matrisen framställd från THP-1-härledda skumma makrofager en effektiv surrogat till sant fallum. Bindning i båda matriserna korrelerar starkt med varandra.
Figur 1: Illustration av RED-analysen. Under inkubation, läkemedelsmolekyler som förblir obundet till makromolekyler iMatrisen diffunderar över dialysmembranet. Över tid etableras en jämvikt mellan koncentrationen av obundna läkemedelsmolekyler i både donatorns och mottagarens brunnar. Alla makromolekyler (proteiner, lipider, etc. ) och bundna läkemedelsmolekyler fångas in i donorkammaren. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Drug penetration in vivo . Förhållandet mellan fraktionen obundet ( fu ) och diffusion i caseum in vivo , bestämd genom MALDI (matrixassisterad laser desorption / jonisering) masspektrometri avbildning för sex anti-tuberkulosläkemedel. Ionkartor är av representativa lungskador och signalintensiteten indikeras av skalfältet till vänster. H Ematoxylin och Eosin (H & E) färgning av intilliggande sektioner visas under jonkartorna. Svart / vit konturlinjer markerar fallets centrum för varje lesion. Reprinted (anpassad) med tillstånd från Sarathy et al . 7 Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Korrelation mellan de obundna fraktionerna ( fu ) av 18 anti-tuberkulosläkemedel i caseum och surrogatmatrisen. Den bäst lämpliga linjen bestämdes med användning av linjär regression. Godhet med passform uttrycks som R2-värdet. Reprinted (anpassad) med tillstånd från Sarathy et al . 7k "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Caseum f u (%) | Surrogat f u (%) | |
| Ethambutol | 35,2 ± 4,4 | 38,8 ± 5,6 |
| isoniazid | > 99,9 | > 99,9 |
| Acetyl-isoniazid | > 99,9 | > 99,9 |
| p-aminosalicylsyra syra | 54,7 ± 1,4 | 51,1 ± 11,2 |
| rifampicin | 5,13 ± 0,2 | 7,3 ± 0,6 |
| rifapentin | 0,5 ± 0,1 | 1,1 ± 0,1 |
| moxifloxacin | 13,5 ± 3,7 | 16,8 ± 1,8 |
| levofloxacin | 8,34 ± 0,4 | 16,3 ± 3,1 |
| Gatifloxacin | 16,3 ± 4,2 | 18,8 ± 2,9 |
| linezolid | 29,3 ± 3,6 | 27,9 ± 2,2 |
| Posizolid | 10,7 ± 1,7 | 17,6 ± 4,5 |
| Sutezolid | 30,1 ± 8,7 | 21,7 ± 1,7 |
| Radezolid | 5,2 ± 0,8 | 7,6 ± 1,9 |
| Tedizolid | 8,8 ± 1,8 | 13,7 ± 2,7 |
| Clofazimine | <0,01 | <0,01 |
| Bedaquiline | <0,01 | <0,01 |
| PA-824 | 7,31 ± 2,2 | 3,6 ± 0,2 |
| OPC67683 | 0,04 ± 0,02 | 0,02 ± 0,002 |
Tabell 1: Fraktion obundet (fu) av de 18 TB-droger testade i caseum och ersättningsbindningsanalys. Alla resultat är uttryckta som medelvärde ± standardavvikelse. Omtryckt (anpassad) med tillstånd från Sarathy et al. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lungnekrotiska lesioner och håligheter hos tuberkulosinfekterade patienter innehåller subpopuleringar av bakterier som är motstridiga mot läkemedelsbehandling. Fallkärnorna i dessa strukturer är särskilt ansvariga för att hysa dessa persister i en extracellulär miljö. 16 Gynnsam fördelning av antibakteriella medel i dessa avlägsna platser antas vara en viktig determinant av tuberkulosläkemedelseffektivitet. Före validering av detta protokoll fanns det inga tillgängliga in vitro- tekniker som kunde förutsäga fördelningen av läkemedelsdetekteringsföreningar i fallösa skador. Som ett resultat var utvärderingen av läkemedelsfördelning i dessa kritiska foci starkt beroende av djurinfektionsmodeller, lesionscentrerade farmakokinetiska studier och MALDI-masspektrometri-bildtekniker. 5 , 17
In vitro- analysen beskrev hanRe är ett snabbt och effektivt sätt att förutsäga drogpenetration i tuberkulosskador utan tedium och kostnad för farmakokinetiska studier in vivo . Protokollet är en modifikation av plasmaproteinbindningsanalysen som ursprungligen var den avsedda användningen av den RÖDA anordningen. Homogenisering av vävnadsprover till en pipettbärbar konsistens medger att bindning av vävnadsprotein kan mätas med användning av samma anordning. Detta protokoll kan utföras med caseum om det är tillgängligt från djurinfektionsmodeller. Såsom figur 1 förklarar binder läkemedelsmolekyler till makromolekyler i caseum / surrogathomogenat, vilket håller det i donorkammaren, medan de obundna läkemedelsmolekylerna är fritt att diffundera över det halvpermeabla membranet i mottagarkammaren. Den obundna fraktionen ( fu ) balanserar mellan båda facken under inkubationsperioden. Som figur 2 illustrerar är mycket högbundna föreningar ( fu <1%) som är almoSt helt fångade i donorkammaren är inte effektiva vid permeering av kaseum. Å andra sidan kan mindre bundna föreningar (1% < fu <100%) diffundera i fallkärnan i varierande grad; Ju högre f u , desto mer genomtränger det det nekrotiska området.
Protokollet kan också användas med en surrogatmatris härledd från lipidbelastade THP-1-makrofager som har inducerats med oljesyra. Flera betingelser för induktion av lipidkroppsackumulering testades på THP-1s. Dessa inkluderar hypoxi, exponering för bestrålad M. tuberculosis och exponering för trehalos-6,6'-dimykolat (TMD) härledd från den mykobakteriella cellväggen. Den slutliga oleinsyrainkubationskoncentrationen på 400 | im visade sig inducera topplipidkroppbildning utan att äventyra cellens livskraft och vidhäftning. 7 Utspädningen av oljesyra i förvärmda medier är avgörande för att säkerställa maximaL upplösning av fettsyran. Den resulterande surrogatmatrisen har ett jämförbart kolesterolinnehåll till äkta fall, men högre respektive lägre triglycerid och proteininnehåll. 7 Som figur 3 illustrerar, bindar bindningen av 18 anti-tuberkulosföreningar till surrogatmatrisen starkt med deras bindning till kaseum. Den nyligen genomförda studien som även inkluderade icke-kommersiella föreningar med odefinierad baktericidaktivitet visade att den FM-härledda matrisen är en effektiv surrogat till kaseum. 7 Genom att eliminera behovet av djurinfektionsmodeller ökar surrogatmatrisen framgångsrikt genomströmningen av denna analys samtidigt som den blir mer kostnadseffektiv.
Detta mångsidiga protokoll kan också användas för att testa flera föreningar samtidigt (kassettestning). Vi har tidigare visat att testning 5 läkemedelskombinationer, allt vid 5 μM, i varje insats med detta protokoll kan effektivt rangordna föreningS baserat på deras bindningsbindningar av bindemedel och sparar tid och material. En sjätte kontrollförening såsom moxifloxacin kan sättas till kassetten som en intern kontroll för att säkerställa konsistens mellan analyser och satser av caseum / surrogat. 7 Det är viktigt att protokollet körs med så lite som 20 μl av ett 10 mM föreningslager (<< 1 mg av en förening). Detta är en stor fördel tidigt i läkemedelsupptäcktsprocessen när kemister syntetiserar begränsade mängder av varje förening för screeningändamål. Den röda enhetsapparaten är automatiseringsvänlig; Basplattans mikroplattans fotavtryck gör den kompatibel med automatiserade system som är konstruerade för att hantera standardplattor med 96 brunnar.
Fastän surrogatmatrisen har visat sig framgångsrikt efterlikna bindningsegenskaperna hos ex vivo- caseum ( Figur 3 ), bekräftar vi att det kan felaktigt profilera vissa föreningar. THP-1-makrofager används vanligtvis i Den caseum surrogat bindningsanalysen är ett användbart verktyg i tuberkulos läkemedelsforskning och används i flera bly optimeringsprogram. Det kan också hjälpa till att utforma mer efFektiva kombinationsregimer baserat på individuella läkemedels förmåga att uppdelas i de olika skikten av flera lesionstyper. Protokollet kan också anpassas för att underlätta läkemedelsupptäckt för andra sjukdomar som kännetecknas av bildandet av lesioner eller abscesser där läkemedelspenetration är begränsad men kritisk för framgångsrik behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka Johnson & Johnson, TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X och Trius Therapeutics för att tillhandahålla bedaquiline, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid respektive tedizolid. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li och Danielle Weiner tillhandahöll stöd med MALDI-analys, bioanalytiska metoder, beredning av caseum-surrogatet, kemisk syntes och isolering av kaninfall. Detta arbete utfördes med finansiering från Bill och Melinda Gates Foundation, pris # OPP1044966 och OPP1024050 till V. Dartois, NIH Shared Instrumentation Grant S10OD018072, samt gemensam finansiering från Bill och Melinda Gates Foundation och Wellcome Trust för ett center of excellence För blyoptimering för sjukdomar i utvecklingsvärlden till P. Wyatt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| New Zealand White Rabbits | Covance | - | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| THP-1 monocytic cell line | ATCC | ATCC TIB-202 | |
| 175 cm² TC-Treated Flask (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
| RPMI 1640 media w/o glutamine | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
| Hyclone L-glutamine, 200 mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Oleic acid | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
| Pierce RED Device Reusable Base Plate | Fisher Scientific | PI-89811 | |
| Pierce RED Device Inserts, 50/box | Fisher Scientific | PI-89809 | |
| Pierce RED insert removal tool | Fisher Scientific | 89812 | |
| Adhesive plate seal | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco) | Life Technologies | 10010-049 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | |
| Acetonitrile | Sigma | 34998 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma | V4629 | |
| Diclofenac sodium salt | Sigma | 93484 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| 2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
| Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
| 484R Cobalt 60 Irradiator | JL Shepard | 7810-484-1 | |
| INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
| Upright Light Microscope | Leica | DM1000 | |
| Binary Liquid Chromatography system | Agilent | 1260 | Multi-compenent |
| Mass spectrometer | AB Sciex | 4000 |
References
- Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).
- Zhang, Y. Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).
- Aber, V. R., Nunn, A. J. Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy. Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).
- Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).
- Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells. Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
- Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
- Sarathy, J. P., et al. Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions. ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).
- Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding. J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).
- Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma. J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).
- Liu, X., et al. Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid. Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).
- Able, S. L., et al. Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat. Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).
- Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).
- Via, L. E., et al. Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates. Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).
- Kalvass, J. C., Maurer, T. S. Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery. Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).
- Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis. J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).
- Lenaerts, A. J., et al. Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910. Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).
- Prideaux, B., et al. High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions. Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).
