Summary
Здесь представлен протокол для высокоточных экспериментов FRET на уровне одиночной молекулы. Кроме того, эта методика может быть использована для идентификации трех конформационных состояний в лиганд-связывающем домене рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA). Определение точных расстояний является первым шагом на пути к построению структурных моделей, основанных на экспериментах FRET.
Abstract
Здесь представлен протокол о том, как проводить высокоточные измерения расстояний между точками с использованием резонансной передачи энергии Феррером (FRET) на одномолекулярном уровне в режиме многопараметрического детектирования флуоресценции (MFD). MFD максимизирует использование всех «измерений» флуоресценции для уменьшения фотофизических и экспериментальных артефактов и позволяет измерять междоузельное расстояние с точностью до ~ 1 Å в жестких биомолекулах. Этот метод был использован для идентификации трех конформационных состояний лигандсвязывающего домена рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA) для объяснения активации рецептора при связывании лиганда. При сравнении известных кристаллографических структур с экспериментальными измерениями они согласуются в пределах менее 3 Å для более динамичных биомолекул. Сбор ряда дистанционных ограничений, охватывающих всю размерность биомолекул, позволит обеспечить структурную модель динамической биомолекулыэс.
Introduction
Основная цель исследований в области структурной биологии - раскрыть связь между структурой и функцией биомолекулярных машин. Первое визуальное впечатление о биомолекулах ( например, белках и нуклеиновых кислотах) произошло в 1950-х годах благодаря развитию рентгеновской кристаллографии 1 , 2 . Рентгеновская кристаллография обеспечивает статическую структурную информацию с высоким разрешением, ограниченную упаковкой кристалла. Таким образом, присущая иммобильность рентгеноструктурных моделей избегает динамической природы биомолекул, фактора, который влияет на большинство биологических функций 3 , 4 , 5 . Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) 6 , 7 , 8 предоставил альтернативное решение проблемы путем решения структурных моделей в водных растворах. Большое преимуществоЯМР является его способность восстанавливать внутреннюю динамическую природу биомолекул и конформационных ансамблей, что помогает прояснить внутренние взаимоотношения между структурой, динамикой и функцией 3 , 4 , 5 . Тем не менее, ЯМР, ограниченный размером выборки и большим количеством образца, требует сложных стратегий маркировки для более крупных систем. Поэтому существует острая необходимость в разработке альтернативных методов структурной биологии.
Исторически, резонансная передача энергии Ферстера (FRET) 9 не играла важной роли в структурной биологии из-за неправильного представления о том, что FRET обеспечивает низкие точности измерения расстояния. Цель этого протокола - пересмотреть способность FRET определять расстояния в нанометровом масштабе, чтобы эти расстояния можно было использовать для построения структурных моделей биомолекул. Первая экспериментальная проверкаЗависимость R - 6 от эффективности FRET была сделана Стерьером в 1967 г. 10 путем измерения полипролинов различной длины в качестве «спектроскопической линейки». Аналогичный эксперимент был выполнен на уровне одиночной молекулы в 2005 г. 11 . Молекулы полипролина оказались неидеальными, и, таким образом, молекулы двухцепочечной ДНК позднее были использованы 12 . Это открыло окно для точных измерений расстояния и идею использования FRET для определения структурных свойств биомолекул.
FRET оптимален, когда интервал расстояний между точками составляет от ~ 0,6-1,3 R 0 , где R 0 - расстояние Фёрстера. Для типичных флуорофоров, используемых в одномолекулярных экспериментах FRET, R 0 ~ 50 Å. Как правило, FRET предлагает множество преимуществ по сравнению с другими методами в том, что он способен разрешать и дифференцировать структуры и динамику вГетерогенные системы: (i) Из-за предельной чувствительности флуоресценции, одномолекулярные эксперименты FRET 13 , 14 , 15 , 16 могут разрешать гетерогенные ансамбли, непосредственно подсчитывая и одновременно характеризуя структуры своих отдельных членов. (Ii) Комплексные пути реакции могут быть непосредственно дешифрованы в одномолекулярных FRET исследованиях, поскольку синхронизация ансамбля не требуется. (Iii) FRET может получить доступ к широкому спектру временных областей, которые охватывают более чем 10 десятилетий во времени, охватывая широкий спектр биологически релевантной динамики. (Iv) Эксперименты FRET могут быть выполнены в любых условиях растворения как in vitro, так и in vivo . Комбинация FRET с флуоресцентной микроскопией позволяет изучать молекулярные структуры и взаимодействия непосредственно в живых клетках 15 , 16 , Sup> 17 , 18 , 19 , даже с высокой точностью 20 . (V) FRET может применяться к системам практически любого размера ( например, полипропиновые олигомеры 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , ВИЧ-обратная транскриптаза 26 и рибосомы 27 ). (Vi) Наконец, сеть расстояний, которая содержит всю размерность биомолекул, может быть использована для получения структурных моделей статических или динамических молекул 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .
Поэтому одномолекулярную FRET-спектроскопию можно использовать для получения достаточно точных расстояний, которые можно использовать для структурного моделирования с дистанционным ограничением 26 . Это возможно, используя многопараметрический детектор флуоресценции (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , который использует восемь измерений информации флуоресценции ( то есть спектр возбуждения, спектр флуоресценции, анизотропию, время жизни флуоресценции, квантовый выход флуоресценции, Макроскопическое время, интенсивность флуоресценции и расстояние между флуорофорами) для точного и точного определения расстояний. Кроме того, импульсное чередованное возбуждение (PIE) комбинируется с MFD(PIE-MFD) 42 для мониторинга флуоресценции акцептора прямого возбуждения и выбора одномолекулярных событий, возникающих из образцов, содержащих стехиометрию донор-акцептор 1: 1. В типичной ПИО-МФД-установке используются двухпульсные лазеров с чередующимся возбуждением, соединенные с конфокальным корпусом микроскопа, где детектирование фотонов разбивается на четыре разных канала в разных спектральных окнах и поляризационных характеристиках. Более подробную информацию можно найти на рисунке 1 .
Важно отметить, что FRET должен сочетаться с вычислительными методами для достижения атомно-подобных структурных моделей, которые согласуются с результатами FRET 26 , 30 . Цель настоящего протокола не состоит в том, чтобы перейти к соответствующей методологии для построения структурных моделей с расстояниями, полученными с помощью FRET. Однако эти подходы применяются в сочетании с другими методами ( например, малоугловое рассеяние рентгеновских лучейИли электронный парамагнитный резонанс), порождая область интегративной структурной биологии 43 , 44 , 45 , 46 . Нынешняя цель - проложить путь для FRET как количественного инструмента в структурной биологии. В качестве примера эта методика была использована для идентификации трех конформационных состояний в лиганд-связывающем домене (LBD) рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA). Конечной целью является преодоление вышеупомянутых ограничений и привлечение FRET среди интегративных методов, используемых для структурного определения биомолекул, путем обеспечения измеренных расстояний с высокой точностью.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка PBS-буфера и обработка камеры
ПРИМЕЧАНИЕ. Носите лабораторное пальто и одноразовые перчатки при проведении влажных химических экспериментов. При выравнивании лазера используйте средства защиты глаз.
- Подготовка буферного раствора PBS
- Растворяют 4,5 г Na 2 HPO 4 , 0,44 г NaH 2 PO 4 и 3,5 г NaCl в 400 мл дистиллированной воды. Обеспечьте pH 7,5 и стерилизуйте раствор автоклавированием на жидком цикле в течение 1 ч (в зависимости от системы автоклава).
- Возьмите 15 мл раствора PBS и смешайте его с 0,1 г древесного угля. Фильтруйте смесь, используя обычный 20-миллилитровый шприцевой фильтр с размером пор 0,2 мкм . Запечатывают и хранят буфер PBS при комнатной температуре.
- Обработка покровного стекла с микроскопом
- Добавить 500 мкл дистиллированной воды и 5 мкл полисорбата 20 неионогенного поверхностно-активного вещества (см. Список материалов)К системе камерного покровного стекла (см. Список материалов) и хорошо перемешать. Дать настояться 30 мин. Удалите раствор полисорбата 20 и дважды промойте камеру дистиллированной водой. Дайте высохнуть.
ПРИМЕЧАНИЕ. Камера готова к использованию.
- Добавить 500 мкл дистиллированной воды и 5 мкл полисорбата 20 неионогенного поверхностно-активного вещества (см. Список материалов)К системе камерного покровного стекла (см. Список материалов) и хорошо перемешать. Дать настояться 30 мин. Удалите раствор полисорбата 20 и дважды промойте камеру дистиллированной водой. Дайте высохнуть.
2. Подготовка образцов ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте разработанные маркированные нити ДНК (см. Список материалов) для создания стандартных образцов двухцепочечной ДНК (dsDNA). В разработанных олигомерах не должно быть красителей на конце полимера, чтобы избежать артефактов, которые могут скомпрометировать определенное расстояние. Последовательность ДНК следует выбирать так, чтобы она вела себя как твердое тело.
- Добавьте 1,5 мкл донорной меченой ДНК-цепи и 4,5 мкл комплементарной (акцептор-меченной или немаркированной) ДНК-цепи в микроцентрифужную пробирку и смешайте их с 24 мкл воды, свободной от нуклеазы.
ПРИМЕЧАНИЕ. В зависимости от смеси выбранных олигонуклеотидов будут генерироваться следующие образцы: no-FRET, loW-FRET или высоко-FRET-дцДНК. - Гибридизуют ДНК, используя термомиксер и следующий процесс: 95 ° С в течение 10 мин, 90 ° С в течение 10 мин, 80 ° С в течение 10 мин, 70 ° С в течение 10 мин, 60 ° С в течение 10 мин, 50 ° С В течение 10 мин, 40 ° С в течение 10 мин, 30 ° С в течение 10 мин, 20 ° С в течение 10 мин, 10 ° С в течение 10 мин и выдерживания при 5 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ. Сгенерированные стандарты дзДНК могут храниться в морозильнике -20 ° C для длительного хранения или могут быть использованы немедленно.
3. Подготовка образцов белков
Примечание: Начиная с рекомбинантной ДНК для экспрессии представляющего интерес белка в бактериальных системах, возможно мутировать остатки, из которых расстояния должны быть измерены в цистеины. Для этого используйте стандартные методы сайт-направленного мутагенеза 47 . Для облегчения очистки белка клонируют рекомбинантную и мутантную ДНК в вектор, содержащий метку очистки ( например,His-tag). Использовали лигандсвязывающий домен глутаматной субъединицы 1 (LBD) из NMB-глутаматного ионотропного рецептора (GluN1) LBD ( т.е. NMDA GluN1 LBD, клонированный в вектор pET-22b (+)).
- Экспрессия белка
- Трансформируйте ДНК-плазмиду в систему выбора 48 .
ПРИМЕЧАНИЕ. На следующих стадиях предполагается, что экспрессия растворимого белка трансформируется в Escherichia coli . Также возможна очистка, например, от трансфецированных клеток млекопитающих 49 или трансдуцированных клеток насекомых 50 , и подробные этапы могут быть найдены в другом месте. Убедитесь, что выбранный штамм E.coli подходит для интересующего белка. Например, экспрессия белков, которые содержат дисульфидные мостики, требует напряжения компетентных клеток с менее редуцирующим внутриклеточным компартментом (см. Список материалов). - Прививать стартер <EM> E. Coli, используя стерильный наконечник пипетки, чтобы собрать одну трансформированную колонию 48 . Бросьте его в 100 мл селективной среды LB (см. Список материалов) и позвольте культуре расти в течение ночи при 37 ° C.
- Подготовить бульон LB (см. Список материалов). Автоклавируйте его для стерилизации.
- Прививают крупномасштабные культуры трансформированных E. coli , добавляя ночную культуру к 2 л селективной среды LB при соотношении 1: 500.
- В течение следующих нескольких часов оценивайте рост культуры, контролируя показания поглощения (Abs) культуры при 600 нм, иногда называемые оптической плотностью при 600 нм (OD 600 ), или с помощью измерителя плотности ячеек. Обратите внимание, что показания увеличиваются с течением времени.
- Вызывают экспрессию белка с конечной концентрацией 0,5 мМ изопропил-β-d-1-тиогалактопиранозида (IPTG), когда культура достигает ОП 600, равную 0,7. Встряхиваемая кишечная палочка при 20 ° С в течение 20-24 ч.
- После индукции белка таблетку E. coli центрифугируют в течение 20 мин при 3000 и 4 ° С. Отбрасывают супернатант и хранят таблетку E. coli, содержащую внутриклеточный белок при -80 ° C до использования.
- Трансформируйте ДНК-плазмиду в систему выбора 48 .
- Очистка белков
- Lyse E. coli с использованием выбранного метода лизиса ( например, ультразвук, французский пресс, кавитация азота и т . Д.) 51 .
- Спинните вниз по мембране и клеточному мусору, центрифугируя лизат в течение 1 часа при 185000 xg и 4 ° C.
- Для His-меченого белка загрузите супернатант на уравновешенную, никель-заряженную иммобилизованную колонку аффинной хроматографии (IMAC) с использованием быстрой белковой жидкостной хроматографии (FPLC) (см. Таблицу материалов ) 52 .
ПРИМЕЧАНИЕ: буфер для уравновешивания для NMDA GluN1 LBD: 200 мМ NaCl, 20 мМ Трис и 1 мМ глицин, pH 8. Буфер для элюирования для NMDA GluN1 LBD: 200 мМ NaCl, 20 мМ Трис, 1 мМ глицина и 400 мМ имидазола, pH 8.- Промойте колонку IMAC буфером, содержащим небольшое количество (~ 12 мМ) имидазола.
- Элюируют белок из колонки IMAC с использованием линейного градиента имидазола с 12 мМ до 400 мМ.
- Диализуют белок в течение ночи в уравновешивающем буфере без имидазола 53 , помещая элюат с этапа 3.2.3.2 в диализную трубку и погружая его в уравновешивающий буфер при непрерывном перемешивании в течение 2-3 часов. Повторите, по крайней мере, еще один раз.
ПРИМЕЧАНИЕ. Этапы 3.2.3-3.2.6 предполагают очистку His-меченого белка. При очистке с помощью какого-либо другого метода соответствующим образом настройте протокол. - Определите количество белка, взяв поглощение при 280 нм диализованного белка и используя закон Бера ( единица поглощения = ε L c , где ε - коэффициент экстинкции (М -1 см -1), Которую можно получить здесь 54 ; L - длина светового пути (см); И с - концентрация белка (М)).
ПРИМЕЧАНИЕ. Существуют различные анализы количественного определения белка, включая анализ Брэдфорда и анализ на бицинхониновую кислоту. Оба дают точные результаты.
- Маркировка белков
- Добавить к очищенному протеину донор (малеимидный реактивный голубой краситель) и акцептор (малеимидный реактивный крахмальный краситель) к молярному соотношению 1: 1: 8: донор: акцептор.
- Инкубируйте смесь белка и флуорофора на льду в течение 30 мин. Возможны более длительные инкубационные периоды.
- Упакуйте 0,5 мл агарозную колонку из Ni-нитрилотриуксусной кислоты (Ni-NTA) (см. Список материалов) и уравновешите ее, используя тот же буфер для уравновешивания, что и на этапе 3.2.3, в то время как этот белок инкубируют.
ПРИМЕЧАНИЕ. Сохраняйте количество загруженного белка в соответствии со способностью связывания смолы. - Через 30 минутКубированием, загружают смесь белок / флуорофор на колонку, полученную на стадии 3.3.3, и очищают гравитационным потоком.
- Смыть избыток флуорофора с 5 мл уравновешивающего буфера.
- Элюируйте маркированный белок самотеком из колонки четыре раза с 0,5 мл элюирующего буфера. Поскольку белок уже очищен от других белков, градиент не требуется.
- Проверяйте каждый элюат спектрофотометром UV-Vis, чтобы определить, какая фракция содержит меченый белок. Сканирование оптической плотности от 230 до 700 нм для обеспечения того, чтобы пики поглощения от белка (280 нм) и каждого флуорофора (493 нм для циан-зеленого флуорофора и 651 нм для дальнего красного флуорофора) были видны в элюат.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, белок будет элюироваться во фракции 2. - Равновесили колонку обессоливания (см. Таблицу материалов ) с PBS, обработанным древесным углем (шаг 1.1).
- Загрузите меченый протеин на обессоливающую колонку с помощью гравитационного потока.
ПРИМЕЧАНИЕ. Сохраняйте количество загруженного белка в соответствии с выбранной емкостью 55 обессоливающей колонки. - Элюируют, используя 3,5 мл обработанного древесным углеродом PBS, гравитационным потоком и собирают 0,5 мл фракции элюата.
- Используйте спектрофотометр для измерения поглощения поглощения каждого элюата от 230 до 700 нм, чтобы определить, какая фракция содержит маркированный белок.
ПРИМЕЧАНИЕ. Шаги 3.3.8-3.3.11 в основном служат в качестве шага обмена буфером. Другие протоколы, которые служат этой цели, также возможны ( например, расширенный диализ). В качестве альтернативы, можно перейти сразу к шагу 3.3.8 с шага 3.3.2.
4. Измерения, необходимые в условиях ансамбля (в кювете)
- Определение постоянной Фёрстера
- Сканирование f D , флуоресцентное флуоресцентное излучение (cps), во флюориметре путем возбуждения донора на 15 нм до его максимальной длины волны поглощения, чтобы получить полное emСпектр. Контролируйте излучение, начиная с 5 нм после волны возбуждения и заканчивая 150 нм позже. Используйте условия магического угла, установив поляризатор излучения на 54,7 ° И поляризаторы возбуждения до 0 ° 56 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Для используемого здесь донорного флуорофора максимальный Abs имеет место при 490 нм; В качестве длины волны возбуждения используется 475 нм, и контролируется излучение 480-650 нм. Для акцептора максимум Abs имеет место при длине волны 645 нм; Для длины волны возбуждения используется 630 нм, и контролируется излучение от 635-735 нм. - Используйте флуориметр, чтобы выполнить сканирование возбуждения флуорофора акцептора (Abs A ) в диапазоне от 400 до 700 нм и использовать условия магического угла, установив поляризатор излучения на 54,7 ° И поляризаторы возбуждения до 0 ° 56 . Установите эмиссионный монохроматор на 15 нм после длины волны максимального излучения. Нормализовать до максимального значения exci.
- В опубликованных таблицах найдите коэффициент экстинкции акцептора, ε A (M -1 см -1 ) 56 , или используйте значения, предоставленные производителем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Значение, опубликованное для акцепторного флуорофора, используемого в этой рукописи, составляет ε A647 = 270 000 см -1 М -1 56 . - Вычислить спектральное перекрытие, используя J = Σf D · (Abs A · ε A ) · λ 4 , где f D , Abs A и ε A определены выше λ и является длиной волны (нм). Используйте рабочий лист, чтобы отобразить в столбцах все значения, зависящие от длины волны, полученные на этапах 4.1.1-4.1.3. Выровняйте их по длине волны. Выполните суммирование от минимальной длины волны излучения донора (λ min ) до максимальной длины волны поглощающего поглотителяE (λ max ).
- Вычислить постоянную Фёрстера (R o ) с использованием следующей формулы R o 6 = 8,79 × 10 -5 · J · κ 2 · Φ F, D · n -4 , где J - это спектральное перекрытие, ранее рассчитанное на этапе 4.1.4, Κ 2 Фактор ориентации, Ф F, D - квантовый выход флуоресценции донорного флуорофора, а n - показатель преломления среды, в которой находится флуорофор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте n = 1.33 (если используется водный буфер) и κ 2 = 2/3. - Найдите квантовое значение выхода донорного флуорофора (Φ F, D , Зависит от среды) в опубликованных таблицах (см. Ссылку 57) и использовать значение спектрального перекрытия, полученное на этапе 4.1.4, для вычисления конечного значения постоянной Фёрстера с использованием уравнения eqИз шага 4.1.5.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если квантовый выход недоступен, выполните шаг 4.2, приведенный ниже, для его вычисления. В этом случае используйте Ф F, D = 0,8, что соответствует времени жизни донора τ D, r = 4,0 нс.
- Сканирование f D , флуоресцентное флуоресцентное излучение (cps), во флюориметре путем возбуждения донора на 15 нм до его максимальной длины волны поглощения, чтобы получить полное emСпектр. Контролируйте излучение, начиная с 5 нм после волны возбуждения и заканчивая 150 нм позже. Используйте условия магического угла, установив поляризатор излучения на 54,7 ° И поляризаторы возбуждения до 0 ° 56 .
- Определение квантового выхода флуоресценции
ПРИМЕЧАНИЕ. Следующая процедура предполагает только динамическое гашение. Рассмотрение статического тушения см. В ссылке 56. Однако эксперименты PIE-MFD также полезны для определения квантового выхода даже в случае статической закалки (см. Результаты).- Выберите эталонный флуорофор с подобными профилями поглощения и излучения как для акцепторного, так и для донорного флуорофоров, для которых был определен квантовый выход (Φ r ).
Примечание: для донора Φ r = 0,8 и τ r = 4 нс, тогда как для акцептора Φ r = 0,32 и τ r = 1,17 нс, весКоторые соответствуют Фг и т для циан-зеленого флуорофора- и дальне-красных флуоротор-меченых олигонуклеотидов, соответственно 57 . - Измеряют распад флуоресценции с временным разрешением (f (t)), используя метод корреляции однофотонного отсчета времени (TCSPC) в условиях магического угла.
- Установите распад флуоресценции с моно- или мультиэкспоненциальной функцией распада в виде f (t) = Σ i x i e -t / τ i , где x i - доля населения и τ i - время жизни популяционной флуоресценции.
- Рассчитать среднее время жизни видов, <τ> x = Σx i τ i , Где x i - доля населения и τ i - время жизни популяционной флуоресценции.
- Использовать thФормула Φ F, D = <τ D > x * Φ r / τ r Для расчета квантового выхода флуоресценции донорного флуорофора путем включения времени жизни флуоресценции и квантового выхода эталона, а также времени жизни флуоресценции донорного флуорофора.
ПРИМЕЧАНИЕ. Этот метод предполагает динамическое тушение. Для других определений Φ F, D следуйте Lakowicz 56 .
- Выберите эталонный флуорофор с подобными профилями поглощения и излучения как для акцепторного, так и для донорного флуорофоров, для которых был определен квантовый выход (Φ r ).
5. Выравнивание эксперимента для одномолекулярного детектирования PIE-MFD (SMD)
ПРИМЕЧАНИЕ. Лучше отключить свет при проведении измерений.
- Регулировка оборудования (рисунок 1)
ПРИМЕЧАНИЕ. Для этого эксперимента используется встроенная установка MFD, изображенная на рисунке 1 , с двумя импульсными лазерами и 4 каналами обнаружения в корпусе инвертированного микроскопа. Есть похожие коммерческие системы.- Включите лазеры на 485 нм и 640 нм и все извещатели установки MFD. Откройте программное обеспечение, контролирующее приобретение и лазеры TCSPC. Убедитесь, что частота повторения лазера составляет 40 МГц.
- Установите импульсную лазерную мощность 485 нм до 60 мкВт в плоскости изображения объектива с водной иммерсией 60X 1.2 NA и импульсной лазерной мощностью 640 нм до 23 мкВт в импульсном режиме с чередующимся возбуждением (PIE-MFD) 42 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Для установки PIE-MFD два лазерных импульса задерживаются в программном обеспечении контроллера лазера. Для лазерного возбуждения 485 нм каналы обнаружения TCSPC (каналы TAC) составляют 1-12 499 («подсказывающий» канал). При возбуждении лазером 640 нм каналы обнаружения TCSPC (каналы TAC) составляют 12,499-50,000 («задержанный» канал). - Добавьте объективную иммерсионную жидкость (каплю дважды дистиллированной воды) между объективом микроскопа и стеклянным предметным стеклом. Чтобы убедиться, что плоскость изображения находится внутри раствора и находится далеко от стеклянной поверхностиCe, поверните регулировочную ручку на полтора оборота после нахождения второй яркой фокальной точки из-за отражения лазеров на границе стекло-жидкость.
- Добавить 1 мкл 100 нМ родамина 110 до 50 мкл дистиллированной воды к центру покровного стекла. Убедитесь, что решение также находится в центре объектива микроскопа.
- Отрегулируйте положение отверстий (размер: 70 мкм) (направление x и y по одному), контролируя скорость счета фотонов в программном обеспечении для сбора, чтобы максимизировать количество обнаруженных фотонов.
- Стандартное измерение SMD (работа в темном помещении)
- Используйте образец с шага 5.1.4 и запишите 120 секунд скорости счета, нажав кнопку «Пуск» на панели управления с временным разрешением (TTTR) в формате «* .ht3» 58 на ПО регистрации.
- Вычислите офлайновую флуоресцентную корреляционную спектроскопию (FCS) 59 , </ Sup> 60 , 61 ( т. Е. Измерение FCS), чтобы определить характерное время диффузии, число молекул в конфокальном объеме, кинетику триплетного состояния и молекулярную яркость 62 .
- Откройте программное обеспечение для FCS (Kristine, MFD suite). Выберите экспериментальные настройки, нажав «Параметры» -> «Выберите Настроить». Выберите файл с похожими экспериментальными настройками и нажмите «получить параметры из файла», чтобы прочитать информацию заголовка в файле.
- Выберите «Operate» -> «Correlate» для выполнения FCS.
ПРИМЕЧАНИЕ. Убедитесь, что номера каналов правильно указаны и что установлен флажок «TAC Gate» (каналы TCSPC), чтобы соответственно выбрать каналы подсказки или задержки. - Выберите «Operate» -> «Global Fit of Correlation Curves», чтобы открыть процедуру подгонки. Используйте «уравнение № 24» на softwarE и нажмите «Старт».
ПРИМЕЧАНИЕ. Уравнение № 24 в программном обеспечении описывает функцию автокорреляции ( G c ) свободно диффундирующих флуоресцентных молекул по трехмерному гауссовскому профилю освещения, например 61 :
Где N - среднее число молекул в объеме детектирования, x T - доля молекул, оказывающих кинетику триплетного состояния, с характерным временем t T , t c - время корреляции, t diff - время диффузии, связанное с геометрическим Параметр ω , а ω описывает гауссовский профиль освещенности. После подгонки обратите внимание на время диффузии и число молекул в конфокальном объеме.
- Добавить 10 мкл 100 нМ родамина 101 в 50 мкл дистиллированнойВоды и хорошо перемешать. Поместите эту смесь поверх покрывающего стекла и убедитесь, что капля находится в центре объектива. Нажмите кнопку «Пуск» на панели управления TTTR, чтобы записать 120 секунд данных в формате TTTR.
- Добавьте 1 мкл 100нМ дальне-красного флуорофора в 50 мкл дистиллированной воды и хорошо перемешайте. Поместите эту смесь в центр объектива. Нажмите кнопку «Пуск» и запишите 120 секунд данных в формате TTTR.
- Поместите 50 мкл дистиллированной воды в центр объектива. Нажмите кнопку «Пуск» и запишите 300 секунд данных в формате TTTR.
- Поместите 50 мкл буфера PBS в центре объектива. Нажмите кнопку «Пуск» и запишите 300 секунд данных в формате TTTR.
- Взять 1 мкл смеси из шага 5.1.4 и смешать с 50 мкл дистиллированной воды. Поместите эту смесь на покровное стекло. Сначала нажмите кнопку «Пуск» и соберите 10 секунд данных в режиме TTTR. Затем проанализируйте ТТTR, используя программное обеспечение для анализа времени жизни флуоресценции (BIFL) (Paris, MFD suite), как описано в шаге 5.3.
ПРИМЕЧАНИЕ. Проверьте количество пакетов в секунду из программного обеспечения выбора и анализа пакетов 26 , 61 . Если уровень всплеска составляет около 35 каждые 10 секунд, он подходит для одномолекулярного измерения. - Продолжайте записывать скорость счета в формате TTTR в течение 1,5 ч ( т. Е. TCSPC при SMD), чтобы рассматривать как одномолекулярный стандарт измерения.
ПРИМЕЧАНИЕ. Из-за большого размера файла разбейте необработанные файлы «* .ht3» в файлы меньшего размера для загрузки и обработки с использованием BIFL.
- Анализ стандартных образцов с использованием BIFL
- Откройте программное обеспечение BIFL (Париж).
- Выберите настройку PIE в автоматическом всплывающем окне «подтвердить настройку» и прочитайте заголовок, выбрав файл с аналогичными экспериментальными настройками. Нажмите «Получить параметры дляM file ". Нажмите« OK ». Обратите внимание, что всплывающее окно закрывается и интегрируется в парижский интерфейс. Нажмите« OK »в разделе« Далее ».
- Выберите файлы для анализа, нажав «Выбрать» в «Массив путей данных», чтобы выбрать измерение для анализа.
- Нажмите «Зеленый разброс» (для измерения воды), «Зеленый BG» (для измерения в буфере), «Зеленая толстая» (для измерения 2 Rh измерения уровня Rhodamine 110), «Красный разброс» (для измерения воды) «Красный BG» (для измерения буфера или воды), «Red thick» (для 20-нм измерения Rhodamine 101), «Желтый разброс» (для измерения воды), «Желтый BG» (для измерения буфера) и «Желтая губка» (для 2 нм красного флуорофора).
- Нажмите «ОК» в разделе «Далее».
ПРИМЕЧАНИЕ. «Зеленый» канал соответствует сигналу зеленых детекторов в «подсказках» каналов TCSPC.4, Красный канал соответствует сигналу красных детекторов в «быстрых» каналах TCSCP. «Желтый» канал соответствует сигналу красных детекторов в каналах задержки TCSPC.
- Нажмите «Adjust» («Настроить») рядом с «Data cut Burstwise» для настройки параметров выбора одной молекулы. В новом всплывающем окне выберите одномолекулярные события с двумя стандартными отклонениями от среднего времени прибытия интерфотонов («dt»), изменив время прихода на интерфотон в «Threshold» и минимальное количество фотонов на одно событие молекулы при «min . #. " Нажмите «Вернуться», чтобы закрыть всплывающее окно. Нажмите «ОК» в разделе «Далее».
ПРИМЕЧАНИЕ. Порог, в единицах мс, зависит от скорости счета фона. Типичное минимальное количество используемых фотонов равно 60. - Отрегулируйте начальное время жизни флуоресценции «Параметры цветового подбора» ( например , от, до и свертку) для генерацииD-флуоресценции на «зеленый», «красный» и «желтый» цвета. В том же окне настройте значения «от» и «до» для «Приглашение» и «Задержка». Нажмите «Вернуться», чтобы закрыть всплывающее окно. Нажмите «ОК» в разделе «Далее».
ПРИМЕЧАНИЕ. Убедитесь, что установлен флажок двухцветного возбуждения. «От» и «до» соответствуют начальной и конечной ячейкам на гистограмме распада флуоресценции (номер канала TAC). Если исходные параметры подгонки выбраны правильно, функция фитирования добавляется к флуоресцентным спадам на каждом канале. - Выберите местоположение на жестком диске, в которое необходимо сохранить все обработанные файлы ascii в родительской папке.
ПРИМЕЧАНИЕ. Париж обрабатывает все выбранные пакеты и создает несколько выходных файлов ascii, которые могут использоваться другими программами для визуализации ( например, пакет Margarita MFD).
6. Стандарты и выборка dsDNAurements
- Добавить 500 мкл PBS-буфера в камеру с покровным стеклом и поместить каплю дистиллированной воды между камерой и линзой. Нажмите кнопку «Пуск» на педали управления и соберите 5 минут данных в режиме TTTR, чтобы использовать их для анализа.
- Возьмите небольшое количество (обычно около 0,1 мкл, концентрация около 1 мкМ) стандарта dsDNA, добавьте его в буфер PBS и хорошо перемешайте. Сначала соберите 10 с данных, нажав «Пуск». Затем проверьте пакет, чтобы получить 35 всплесков за 10 секунд (как на этапах 5.2.7 и 5.3). Наконец, собрать> 2 часа данных в формате TTTR, как описано выше.
- Проанализируйте собранные данные для образцов ДНК, как на этапе 5.3.3.
- Визуализируйте гистограммы пакетов, используя набор MFD (Margarita) и покажите эффективность FRET по сравнению с <τ D (A) > f или F D / F A против <τ D (A) > f .
- Открыть tОн программное обеспечение Margarita и выберите «Файл» -> «Импортировать все файлы *. ?? 4 и * .mti». Выберите родительскую папку, содержащую различные подпапки.
- Выберите параметры для визуализации, щелкнув рядом с «X» (абсцисса) одного из параметров, полученных из Парижа ( например, tau green или <τ D (A) > f ); Аналогично повторите это для ординаты «Y», чтобы выбрать желаемый параметр для визуализации ( например, эффективность FRET, F D / F A или S PIE PIE).
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае эффективность FRET, F D / F A или S PIE правильна для правильной скорости счета фона в зеленых, красных и желтых каналах; Для квантовых выходов донора и акцептора; Для коэффициента эффективности обнаружения (g G / g R ); И для перекрестных помех (α). Здесь g G / g R = 3,7 и α = 0,017, в зависимости от инструмента. Скорость счета фонаЗависят от используемого буфера, и значения квантового выхода ранее определены. - Добавьте строку FRET, открыв окно «Оверлейное уравнение», нажав «Экран» -> «Наложение уравнения». Выберите статическую строку FRET во всплывающем меню. Выберите правильное время жизни донора и параметры квантового выхода, чтобы сформировать правильную линию FRET.
ПРИМЕЧАНИЕ. Строки FRET для корреляции различных индикаторов FRET могут генерироваться.
- Определите поправочный коэффициент для возбуждения акцептора источником донорного возбуждения (β), используя параметр стехиометрии, показав эффективность FRET относительно стехиометрии (S PIE ) в Margarita (уравнение 1 ниже).
ПРИМЕЧАНИЕ: β выбирают так, чтобы образец донора имел пик при S PIE = 1,0 в стехиометрической шкале; Образец только для акцептора должен иметь стехиометрию S PIE = 0,0, а дцДНК с обеими метками должна иметь стехиометрию S PIE ~ 0,5. <Br /> ПРИМЕЧАНИЕ. Инструмент готов, и можно измерить образцы, помеченные FRET. - Измеряйте и анализируйте образцы, меченные FRET, полученные в разделе 3, следуя этапам 6.3-6.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В типичных экспериментах smFRET с использованием установки MFD (лазерные линии: 485 нм при 60 мкВт и 640 нм при 23 мкВт, раздел 5.1) образец флуоресценции разбавляют до низкой пикомолярной концентрации ( 10-12 М = 1 пМ) и помещают В конфокальном микроскопе, где субнаносекундный лазерный импульс возбуждает меченые молекулы, свободно диффундирующие через объем возбуждения. Типичный конфокальный объем <4 фемтолитров (фЛ). При таких низких концентрациях только отдельные молекулы обнаруживаются по одному. Испускаемая флуоресценция от меченых молекул собирается через объектив и пространственно фильтруется с помощью точечного отверстия. Этот шаг определяет эффективный конфокальный уровень обнаружения. Затем сигнал разбивается на параллельные и перпендикулярные компоненты в двух (или более) разных спектральных окнах ( например, «зеленый» и «красный»). Каждый канал детектора фотонов затем соединяется со скоррелированным однофотонным отсчетом времени (TCSPC) Электроника для регистрации данных ( рисунок 1 ).
После выполнения калибровки установки MFD можно начать процедуру, описанную в таблице 1 (шаги 5-6), измерение стандартов dsDNA. Затем PIE-MFD используется для анализа нескольких параметров, таких как среднее макроопределение, время жизни флуоресценции, интегрированная по всплескам анизотропия, отношение сигнала в зеленом цвете по сигналу красного цвета, длительность импульса в подсказном канале (T (G + R) | D ), длительность пакета в задержанном канале (T R | A ) и другие 65 , 66 ( рис. 2 ). Важным в этом анализе является параметр стехиометрии ( S PIE ), определяемый как:
Где F G | D = F D , F R | D = F A и F R | Являются флуоресцентные интенсивности с коррекцией фона 63 . Например, F G | D = I G | D - < B G >, Где I G | D Обнаруженная интенсивность в зеленом канале от донора и < B G > - средняя скорость счета фона на зеленом канале. Аналогичные поправки сделаны для флуоресценции акцептора от прямого возбуждения акцептора ( F R | A ) и для сенсибилизированного излучения акцептора ( F R | D ). В уравнении 1 α является поправочным коэффициентом для донора-фтоПерекрестные помехи в канале акцептора; Β - поправочный коэффициент для возбуждения акцептора источником донорного возбуждения; И γ , где
Является функцией донорных и акцепторных квантовых выходов, Φ F, D И Φ F, A , Соответственно, и эффективности детектирования на зеленых и красных детекторах, g G и g R. Используя S PIE , можно калибровать надлежащие инструментальные факторы, такие как α, β и γ , чтобы удовлетворять S PIE = 1 для образца, помеченного только донором, S PIE = 0 для образца с акцепторным типом, и S PIE = 0,5 для образца FRET. В качестве альтернативыМожно использовать:
Для получения квантового выхода второго образца, учитывая, что квантовый выход одного образца ( ), И что а также Определяются из эксперимента PIE-MFD. В этом случае предполагается, что квантовый выход высокоамплитудной дцДНК FRET равен 0,32, и определяется квантовый выход низкоуглеродной дцДНК FRET. Причина для этой процедуры состоит в том, что было отмечено, что S PIE отличается как для образцов с низким FRET, так и с высокими FRET, хотя оба они имеют один донор в одном и том же месте и только один акцептор, но при различииВ других местах. После определения правильного квантового выхода стандартных образцов, как описано в уравнении (3), эффективность FRET ( E ) по сравнению с < τ D ( A ) > f И F D / F A относительно < τ D ( A ) > f представлений используются для дальнейшей оценки. Параметрическая зависимость между эффективностью FRET ( E static ), F D / F A и < τ D ( A ) > f Параметры описываются следующей системой уравнений (уравнение 4):
Здесь F D | D - донорская флуоресценция, обнаруженная в донорском или зеленом канале; F A | D Является акцепторно-сенсибилизированным излучением; - время жизни донорной флуоресценции в отсутствие акцептора; И < τ D ( A ) > x Среднее время жизни вида, которое связано со средним временем жизни флуоресценции эмпирическим полиномом 56 , 57 . Эти уравнения известны как статические линии FRET 57 , 67 , поскольку линии должны пересекать обе популяции одинаково хорошо, в отсутствие oF ( рисунок 3 ).
В последнем случае анализируются гистограммы эффективности FRET ( рис. 4 ) с использованием анализа распределения вероятностей (PDA) для двух образцов дцДНК 68 , 69 . PDA был использован для моделирования гистограмм smFRET с высокой точностью 57 . Информация о единичных или многостатических видах может быть получена на одной гистограмме. После подгонки формы ожидаемого распределения к полученным экспериментальным данным можно обнаружить расстояние между донором и акцептором. Короче говоря, эффективность FRET, или распределения F D / F A , вычисляются сначала путем получения вероятности [ Уравнения ] наблюдения определенной комбинации фотонов, собранных в каналах обнаружения «зеленый» ( G ) и «красный» ( R ) С определенным периодом времени вл; Используйте уравнение 5:
Здесь распределение интенсивности флуоресценции P ( F ) получается из распределения полного распределения сигнала P ( S ), считая, что фоновые сигналы B G и B R распределены в соответствии с распределением Пуассона P ( B G ) и P ( F ) B R ), с известными средними интенсивностями скорости счета фона, < B G > и < B R >. Условная вероятность P ( F G , F R | F ) представляет собой вероятность наблюдения конкретной комбинации зеленых и красных флуоресцентных фотонов, F G и F R , для данного состояния FRET.
E_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Анализ КПК показывает, что расстояние между точками для высокоразрешенной дцДНК FRET составляет < R DA > E (HFRET) = 45,7 Å, тогда как для низкоуровневой дзДНК FRET, Расстояние < R DA > E (LFRET) = 59,7 Å. По сравнению с ожидаемыми расстояниями с использованием системы 26 позиционирования и скрининга FRET (FPS) ожидаемое межпаечное расстояние < R DA > E , AV (HFRET) = 44,7 Å было Найденный как полученный с использованием FPS для высокодетальной дзДНК FRET и < R DA > E , AV (LFRET) = 59.1 Å для низкоуровневой дзДНК FRET. AV - это доступный объемный расчет, встроенный в инструментарий FPS. AV - Гранулированное моделирование методом Монте-Карло, где флуорофоры представляют собой модели с тремя сферическими сферическими сферическими сферами, связанные с точкой крепления в биомеОлекула с гибким соединительным линкером 26 , 57 . Требуется коррекция для квантового выхода для low-FRET dsDNA, основанная на измеренной S PIE . При этих условиях можно получить согласие ~ 1 Å между экспериментальным значением и ожидаемым значением из AV-моделирования.Затем измеряют NMDA GluN1 LBD. NMDA-рецептор представляет собой гетеромерный, неселективный катионный канал, который требует связывания глицина и глутамата для стробирования 70 . Известно, что LBD, имеющий грейферную структуру, принимает открытую раскладушку и закрытую конфигурацию в виде грейфера при связывании лиганда на основе кристаллографической информации 71 , 72 . Для экспериментов с МФД NMDA GluN1 LBD мутировали в Ser507 и Thr701 (полноразмерная последовательность) по разные стороны отЩель, как было описано ранее. Затем его маркировали с использованием пары FRET зеленого флуорофора и темно-красного флуорофора (см. Список материалов), с R 0 52 Å. Эта конструкция использовалась для изучения движения лигандсвязывающего домена без сложности, связанной с работой с солюбилизированным рецептором. Используя эту конструкцию, были найдены по меньшей мере три конфигурации LBD. Было высказано предположение, что механизм конформационного отбора избирательно заселяет одну из идентифицированных популяций при связывании лиганда 73 . В инактивированной форме или в присутствии антагониста 5,7-дихлорокинуреновая кислота (DCKA) исследуются преимущественно состояния со средней / низкой FRET с более длительным временем жизни флуоресценции донора и большим пиком отношения донор-акцепторная флуоресценция При F D / F A = 3,3 ( фиг. 5A ). Это согласуется со стабилизацией конформации открытой щели.Анализ КПК и временного окна был использован для идентификации трех конфигураций, которые может принять LBD (high-FRET (HF) (< R DA > E = 33,9 Å), средний FRET (MF) (< R DA > E = 45,8 Å ) И состояния с низким FRET (LF) (< R DA > E = 55,8 Å)). Однако, в основном, были заполнены среды FRET и low-FRET. Это говорит о том, что высокий FRET - это состояние, которое приводит к активации NMDAR. Стоит отметить, что сопоставлены экспериментально полученные расстояния и те, которые были получены с помощью FPS с использованием силиконовой маркировки и с использованием кристаллографической информации (Идентификация банка данных белков (PDBID): 1PB7 и 1PBQ). Было обнаружено, что междюймовое расстояние для средне-FRET и низко-FRET популяций было < R DA > E , AV = 48,7 и 54,2 Å для обеих структур, соответственно ( рис. 5B). Наибольшее отклонение 2,9 Å было обнаружено в среднем состоянии FRET. Рассматривая неопределенность распределения, исходя из предположения κ 2 = 2/3, максимальная ошибка составляет 2,5% на измеренном расстоянии. Короче говоря, можно сделать вывод, что можно достичь точности Ангстрема на экспериментально определенных расстояниях.
Рисунок 1: Экспериментальная установка и регистрация данных для PIE-MFD. ( A ) Показана типичная многопараметрическая установка обнаружения флуоресценции и состоит из четырех детекторов, покрывающих два разных спектральных окна. Детекторы подключены к электронике с временным коррелированием однофотонного счета (TCSPC). ( B ) В TCSPC каждый фотон идентифицируется тремя параметрами: (i) микро-время или время после импульса возбуждения; (Ii) макро-время, или числоИмпульсов возбуждения с начала эксперимента; И (iii) номер канала. Эти три параметра необходимы для автономного анализа. ( C ) Отдельные молекулы свободно диффундируют через конфокальный объем, и фотоны испускаются, оставляя вспышку фотонов как функцию времени. ( D ) Каждый выбранный пакет соответствующим образом подгоняется и используется для отображения многомерных гистограмм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Пакетный анализ с использованием различных параметров флуоресценции. ( A ) эффективность FRET по сравнению с макромоментом, ( B ) эффективность FRET по сравнению с T (G + R) | D - T R | A и ( C ) эффективность FRET по сравнению с S PIE дляLow-FRET или 15 bp дцДНК. T (G + R) | D - длительность пакета в подсказном канале, а T R | A - длительность пакета в задержанном канале (T R | A ). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: F D / F A и срок службы донора по сравнению с эффективностью FRET. Двумерные гистограммы для представления эффективности FRET ( A ); Отношение донорской флуоресценции к акцептору, F D / F A , ( B ); И анизотропия доноров r D ( C ) в зависимости от средней продолжительности жизни флуоресценции донора в присутствии акцептора < τ D ( A ) > f . Определенные корректорыКоэффициенты: < B G > = 0,64, < B R > = 0,37, β = 0,08 (доля прямого возбуждения акцептора с донорным возбуждающим лазером), α = 0,017 и g G / g R = 3,7 Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Сравнение КПК с высокой FRET и низкой FRET dsDNA. Временное окно КПК анализ на 2 мс, с половинной шириной 6% от среднего КПД FRET. Каждое расстояние распределено по Гауссу с 6% от < R DA > E как ширина (hw DA ). ( A ) Для образца HFRET расстояние между точками равно < R DA > E (HFRET) = 45,7 Å. ( B ) Для образца LFRET расстояние составляет < R DA > E (LFRET) = 59,7 Å. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Фиг.5: PIE-MFD лигандсвязывающего домена NMDA-рецептора в присутствии антагониста DCKA. ( A ) Двумерная гистограмма F D / F A в зависимости от времени жизни донора в присутствии акцептора < τ D ( A ) > f и анизотропии донора по сравнению с < τ D ( A ) > f Для LBD с DCKA. ОдномерныйAl проекции для F D / F A и также показаны. Статическая строка FRET показана красным цветом. Чистая донорская и акцепторная флуоресценция ( F D и F A ) корректируются для фона (< B G > = 0,940 кГц и < B R > = 0,522 кГц), спектрального перекрестного рассеяния (α = 1,7%) и эффективности регистрации ( G G / g R = 3,7). По анизотропии против гистограмм < τ D ( A ) > f уравнение Перрена имеет вращательную корреляцию ρ = 2,5 нс. ( B ) КПК в момент времени 10 мс Δt. Необходимо одно государство. Модель подходит ко всем временным окнам. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
действие | Цель |
Центр лазерного луча. | |
Выровнять отверстие. | Эксперимент FCS (раздел 5). |
Выровнять детекторы. | Максимизируйте цену за тысячу показов. |
Отрегулируйте объектив коррекции. | Сведите к минимуму t diff и максимизируйте цену за тысячу показов. |
Определите функцию отклика прибора (IRF). | TCSPC @ SMD в режиме TTTR. Измерьте картину распада рассеяния. |
Определите G-фактор для каждого спектрального окна. | TCSPC @ SMD в режиме TTTR. Сравнение интенсивностей образуют хвосты распада, подходящие для поляризаций. |
Определить коэффициент эффективности обнаружения в спектральных окнах (g R / g G ). | (I) Измерения интенсивности красителя с широким спектром излучения (концентрация нМ). (Ii) Измерение контрольных правилов FRET (pM concentrция). В МФД субпопуляция должна падать на статическую линию FRET. |
Выполните окончательную проверку (время жизни и анизотропию). | Контролировать время жизни и анизотропию от одномолекулярного измерения свободно диффундирующего красителя с одним экспоненциальным распадом ( например, родамина 110). |
Определить отношение акцептора к квантовому выходу донора. | (I) График стехиометрии (S PIE ). 1. и 4.2. |
Определить скорость счета фона. | Измерения интенсивности выбранного «буфера». |
Определите перекрестный разговор (α). | Измерения интенсивности донорского красителя с учетом спектра флуоресценции и эффективности детектирования. |
Таблица 1: Этапы калибровки для экспериментов FRET в одномолекулярных экспериментах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой работе представлен протокол для выравнивания, калибровки и измерения междисковых расстояний с высокой точностью с использованием одномолекулярных FRET-экспериментов PIE-MFD. Путем тщательной калибровки всех инструментальных параметров можно повысить точность измеренных расстояний и достичь точности ангстрема. Для этого различные многомерные гистограммы используются для анализа и идентификации популяций для дальнейшей характеристики. Используя среднее время макроскопии для проверки стабильности измеренных образцов, можно исправить для донорного и акцепторного фотообесцвечивания и выбрать популяции FRET на основе параметра стехиометрии. Однако фотофизические свойства акцептора могут изменяться в зависимости от расположения метки. Таким образом, для правильной коррекции квантового выхода акцептора можно использовать распределение S PIE . Для определения гамма-фактора (ƴ) необходима правильная фотофизическая характеристика, которая вместе с другим фактом коррекции( Например, для перекрестных помех и β для акцепторного возбуждения с помощью донорного лазера), могут быть использованы для увеличения точности измеренного межпалубного расстояния. Этот подход был подтвержден с использованием двух стандартных образцов дцДНК, и была определена точность ~ 1 Å по сравнению с ожидаемыми значениями.
Для выбора различных красителей требуется адаптировать оптические элементы микроскопа, такие как дихроичные и полосовые фильтры, для размещения соответствующего спектрального окна выбранных красителей. Соответственно, необходимо выбирать импульсные лазеры. Более важно то, что выбор красителей имеет решающее значение из-за нескольких возможных фотофизических артефактов, таких как отбеливание акцепторов и доноров, мигание триплета или красителя или окрашивание красителя на поверхности белка. Эти артефакты могут скомпрометировать интерпретацию экспериментальных данных. MFD идеально подходит в этом сценарии, потому что, проверяя несколько параметров, можно идентифицировать источники этих артефактов, исправитьДля них, или, по крайней мере, знать об их существовании. Параметр ориентации диполя, большую часть времени принимаемый за κ 2 = 2/3, может привести к большим отклонениям определенного расстояния, если краситель прилипает преимущественно к поверхности биомолекул. Анизотропия образца донора, образца акцептора и донорного акцептора может помочь решить, действительно ли это предположение. В этом эксперименте было обнаружено, что максимальная ошибка составляет ~ 2,5% на измеренном расстоянии, по сравнению с несоблюдением надлежащей коррекции и получением 10-20% -ной ошибки. Квантовый выход акцептора может создать больший источник ошибки. Таким образом, S PIE важен для решения этой важной проблемы.
Можно применить подобную стратегию, чтобы понять конформационный ландшафт лиганд-связывающего домена NMDA-рецептора, чтобы понять механизм агонизма на NMDAR. Было установлено, что LBD в tПрисутствие присутствующего антагониста исключает доступность состояния с высоким FRET, постулируется, что он отвечает за открытие канала 73 . При сравнении экспериментально полученных расстояний и ожидаемых значений на основе кристаллографической информации было достигнуто согласие в пределах 3 Å. Что еще более важно, новые малонаселенные государства могут быть идентифицированы с аналогичной точностью.
Таким образом, одномолекулярные эксперименты FRET в режиме MFD 42 позволяют правильно рассчитать экспериментальные артефакты и получить междоузлие расстояние в диапазоне ~ 30-70 Å. Если вместо одного измеренного расстояния получить сеть расстояний, то можно использовать их в качестве ограничений в структурном моделировании, особенно для состояний, которые трудно охарактеризовать более стандартными методами структурной биологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов с содержанием этой статьи.
Acknowledgments
VJ и HS подтверждают поддержку от NIH R01 GM094246 до VJ. HS признает стартовые фонды в Программе творческих исследований Университета Клемсона и в Центре по оптическим материалам и инженерным технологиям в Университете Клемсона. Этот проект также был поддержан учебным стипендиатом Центра Кека по междисциплинарному обучению в области бионауки Консорциумов побережья Мексиканского залива (грант NIGMS № 1 T32GM089657-05) и стипендий Фонда Schissler для трансляционных исследований распространенных заболеваний человека в отношении DD. Содержимое является исключительно авторами и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
charcoal | Merck KGaA | K42964486 320 | |
syringe filter | Fisherbrand | 09-719C | size: 0.20 µm |
chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | 1.5 borosilicate glass, 8 wells |
microscope cover glass | Fisher Scientific | 063014-9 | size: 24 x 60-1.5 |
Nuclease free water | Fisher Scientific | 148859 | nuclease free |
tween-20 | Thermo Scientific | 28320 | 10% solution of Polysorbate 20 |
acceptor DNA strand (High FRET) | Integrated DNA Technologies | 178124895 | 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) |
acceptor DNA strand (Low FRET) | Integrated DNA Technologies | 177956424 | 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) |
donor DNA strand | Integrated DNA Technologies | 177951437 | 5´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG) |
DNA strand (No FRET) | Integrated DNA Technologies | 5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) | |
thermal cycler | Eppendorf | E6331000025 | nexus gradient |
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide | Thermo Scientific | A10254 | termed cyan-green fluorophore in the manuscript |
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Thermo Scientific | A20347 | termed far-red fluorophore in the manuscript |
Rhodamine 110 | Sigma-Aldrich | 83695-250MG | |
Rhodamine 101 | Sigma-Aldrich | 83694-500MG | |
LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426 | For culture of E. coli |
Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | Used at 100 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection |
Tetracyline | Calbiochem | 58346 | Used at 12.5 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation |
Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | Used at 15 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation |
Origami B(DE3) Competent Cells | Millipore | 70837-3 | Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges |
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755 | For induction of E. coli protein expression |
HiTrap Chelating HP | GE Life Sciences | 17-0409-01 | For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein |
Imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
PD-10 Desalting Column | GE Life Sciences | 17-0851-01 | |
AktaPurifier | GE Life Sciences | 28406264 | FPLC Instrument |
Dialysis tubing | Spectrum labs | 132562 | 15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll |
Dichroics | Semrock | FF500/646-Di01-25x36 | 500/646 BrightLight |
50/50 Beam splitter polarizer | Qioptiq Linos | G33 5743 000 | 10 x 10 film polarizer |
Green pass filer | Chroma | ET525/50m | ET525/50m 25 mm diameter mount |
Red pass filter | Chroma | ET720/150m | ET720/150m 25 mm diameter mount |
Power Meter | ThorLabd | PM200 | |
UV-Vis spectrophotometer | Varian | Cary300Bio | |
Fluorolog 3 fluorometer | Horiba | FL3-22-R3 | |
Fluorohub TCSPC controller | Horiba | Fluorohub-B | TCSPC electronics for ensemble measurements |
NanoLed 485L | Horiba | 485L | Blue diode laser |
NanoLed 635L | Horiba | 635L | Red diode laser |
Olympus IX73 Microscope | Olympus | IX73P2F | Microscope frame |
PMA 40 Hybrid Detector | PicoQuant GmbH | 932200, PMA 40 | Optimized for green detection |
PMA 50 Hybrid Detector | PicoQuant GmbH | 932201, PMA 50 | Optimized for ed shifter sensitivity |
485 nm laser | PicoQuant GmbH | LDH-D-C-485 | |
640 nm laser | PicoQuant GmbH | LDH-D-C-640 | |
Hydraharp 400 and TTTR acqusition software | PicoQuant | 930021 | Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software |
SEPIA II SLM 828 and SEPIA software | PicoQuant | 910028 | Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller. |
computer | Dell | optiplex 7010 | cpu: i7-3770 ram:16GB |
FRET Positioning and Screening (FPS) software | Heinrich Heine Unviersity | It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html | |
MFD suite | Heinrich Heine Unviersity | It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html |
References
- Kendrew, J. C.
Architecture of a protein molecule. Nature. 182 (4638), 764-767 (1958). - Kendrew, J. C., et al. A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis. Nature. 181 (4610), 662-666 (1958).
- Henzler-Wildman, K., Kern, D.
Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007). - Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-927 (2007).
- Henzler-Wildman, K. A., et al. Intrinsic motions along an enzymatic reaction trajectory. Nature. 450 (7171), 838 (2007).
- Kline, A. D., Wuthrich, K. Secondary structure of the alpha-amylase polypeptide inhibitor tendamistat from Streptomyces tendae determined in solution by 1H nuclear magnetic resonance. J. Mol. Biol. 183 (3), 503-507 (1985).
- Williamson, M. P., Havel, T. F., Wuthrich, K. Solution conformation of proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by 1H nuclear magnetic resonance and distance geometry. J. Mol. Biol. 182 (2), 295-315 (1985).
- Havel, T. F., Wuthrich, K. An evaluation of the combined use of nuclear magnetic resonance and distance geometry for the determination of protein conformations in solution. J. Mol. Biol. 182 (2), 281-294 (1985).
- Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann.Phys. 437 (1), 55-75 (1948).
- Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).
- Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 2754-2759 (2005).
- Wozniak, A. K., Schroder, G. F., Grubmuller, H., Seidel, C. A., Oesterhelt, F. Single-molecule FRET measures bends and kinks in DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18337-18342 (2008).
- Orrit, M., Bernard, J. Single Pentacene Molecules Detected by Fluorescence Excitation in a p-Terphenyl Crystal. Phys. Rev. Lett. 65 (21), 2716-2719 (1990).
- Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93, 6264-6268 (1996).
- Michalet, X., Weiss, S., Jager, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chem. Rev. 106 (5), 1785-1813 (2006).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M.
FRET imaging. Nat. Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003). - Sakon, J. J., Weninger, K. R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells. Nat Methods. 7 (3), 203-205 (2010).
- Stahl, Y., et al. Moderation of Arabidopsis root stemness by CLAVATA1 and ARABIDOPSIS CRINKLY4 receptor kinase complexes. Curr. Biol. 23 (5), 362-371 (2013).
- Fessl, T., et al. Towards characterization of DNA structure under physiological conditions in vivo at the single-molecule level using single-pair FRET. Nucleic Acids Res. 40 (16), e121 (2012).
- Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annu. Rev. Biochem. 47, 819-846 (1978).
- Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (8), 2754-2759 (2005).
- Best, R. B., et al. Effect of flexibility and cis residues in single-molecule FRET studies of polyproline. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (48), 18964-18969 (2007).
- Hoefling, M., et al. Structural heterogeneity and quantitative FRET efficiency distributions of polyprolines through a hybrid atomistic simulation and Monte Carlo approach. PLoS One. 6 (5), e19791 (2011).
- Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. , (2016).
- Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat. Meth. 9 (12), 1218-1225 (2012).
- Hickerson, R., Majumdar, Z. K., Baucom, A., Clegg, R. M., Noller, H. F. Measurement of internal movements within the 30 S ribosomal subunit using Forster resonance energy transfer. J. Mol. Biol. 354 (2), 459-472 (2005).
- Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
- Weninger, K., Bowen, M. E., Chu, S., Brunger, A. T. Single-molecule studies of SNARE complex assembly reveal parallel and antiparallel configurations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14800-14805 (2003).
- Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J. Struct. Biol. 173 (3), 497-505 (2011).
- Choi, U. B., et al. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 17 (3), 318-324 (2010).
- DeRocco, V., Anderson, T., Piehler, J., Erie, D. A., Weninger, K. Four-color single-molecule fluorescence with noncovalent dye labeling to monitor dynamic multimolecular complexes. BioTechniques. 49 (5), 807-816 (2010).
- McCann, J. J., Zheng, L., Chiantia, S., Bowen, M. E. Domain orientation in the N-Terminal PDZ tandem from PSD-95 is maintained in the full-length protein. Structure. 19 (6), 810-820 (2011).
- McCann, J. J., et al. Supertertiary structure of the synaptic MAGuK scaffold proteins is conserved. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (39), 15775-15780 (2012).
- Andrecka, J., et al. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase II elongation complex. Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).
- Muschielok, A., et al. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).
- Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the Nano-Positioning System to the Analysis of Fluorescence Resonance Energy Transfer Networks. J. Phys. Chem. B. 115 (41), 11927-11937 (2011).
- Renner, A., et al. High Precision FRET Reveals Dynamic Structures in the Drosophila Scaffold Protein Complex Stardust-DPATJ-DLin-7 Mediated by L27 Domains. Biophys. J. 106 (2), 256 (2014).
- Antonik, M., Felekyan, S., Gaiduk, A., Seidel, C. A. Separating structural heterogeneities from stochastic variations in fluorescence resonance energy transfer distributions via photon distribution analysis. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6970-6978 (2006).
- Gaiduk, A., Kühnemuth, R., Antonik, M., Seidel, C. A. Optical Characteristics of Atomic Force Microscopy Tips for Single-Molecule Fluorescence Applications. ChemPhysChem. 6 (5), 976-983 (2005).
- Eggeling, C., Fries, J., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (4), 1556-1561 (1998).
- Kudryavtsev, V., et al. Combining MFD and PIE for Accurate Single-Pair Förster Resonance Energy Transfer Measurements. ChemPhysChem. 13 (4), 1060-1078 (2012).
- Steven, A. C., Baumeister, W.
The future is hybrid. J. Struct. Biol. 163 (3), 186-195 (2008). - Cowieson, N. P., Kobe, B., Martin, J. L. United we stand: combining structural methods. Curr. Opin. Struct. Biol. 18 (5), 617-622 (2008).
- Boura, E., et al. Solution structure of the ESCRT-I complex by small-angle X-ray scattering, EPR, and FRET spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (23), 9437-9442 (2011).
- Dominguez, C., Boelens, R., Bonvin, A. M. HADDOCK: a protein-protein docking approach based on biochemical or biophysical information. J. Am. Chem. Soc. 125 (7), 1731-1737 (2003).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J Vis Exp. (27), (2009).
- Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
- Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J Vis Exp. (117), e54792 (2016).
- Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), e51206 (2014).
- Protein Sample Preparation, Handbook. GE Healthcare. , Available from: http://www.gelifesciences.com/file_source/GELS/Service%20and%20Support/Documents%20and%20Downloads/Handbooks/Protein_sample_preparation_handbook.pdf (2016).
- Li, Q., Richard, C. -A., Moudjou, M., Vidic, J. Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli. J Vis Exp. (106), e53432 (2015).
- Scopes, R. K. Protein Purification: Principles and Practice. , Springer. New York. (1993).
- Protein Extiction Coefficient Calculator. , Available from: http://www.biomol.net/en/tools/proteinextinction.htm (2016).
- Desalting Column Product booklet. GE. , Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_20161110134421.pdf (2016).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. (2007).
- Sindbert, S., et al. Accurate distance determination of nucleic acids via Forster resonance energy transfer: implications of dye linker length and rigidity. J. Am. Chem. Soc. 133 (8), 2463-2480 (2011).
- Wahl, M. Technical Note. Time Tagged Time-Resolved Fluorescence Data Collection in Life Sciences. PicoQuant. , Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/14528/technote_tttr.pdf (2010).
- Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
- Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
- Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Rev. Sci. Instrum. 76 (8), 083104 (2005).
- Iyer, V., Rossow, M. J., Waxham, M. N. Peak two-photon molecular brightness of fluorophores is a robust measure of quantum efficiency and photostability. JOSA B. 23 (7), 1420-1433 (2006).
- Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chem. Phys. Lett. 353 (5), 439-445 (2002).
- Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 102 (33), 6601-6613 (1998).
- Kühnemuth, R., Seidel, C. A. M. Principles of Single Molecule Multiparameter Fluorescence Spectroscopy. Single Mol. 2 (4), 251-254 (2001).
- Widengren, J., et al. Single-molecule detection and identification of multiple species by multiparameter fluorescence detection. Anal. Chem. 78 (6), 2039-2050 (2006).
- Sisamakis, E., Valeri, A., Kalinin, S., Rothwell, P. J., Seidel, C. A. Accurate single-molecule FRET studies using multiparameter fluorescence detection. Methods Enzymol. 475, 455-514 (2010).
- Kalinin, S., Felekyan, S., Antonik, M., Seidel, C. A. Probability distribution analysis of single-molecule fluorescence anisotropy and resonance energy transfer. The Journal of Physical Chemistry B. 111 (34), 10253-10262 (2007).
- Kask, P., et al. Two-dimensional fluorescence intensity distribution analysis: theory and applications. Biophys. J. 78 (4), 1703-1713 (2000).
- Traynelis, S. F., et al. Glutamate Receptor Ion Channels: Structure, Regulation, and Function. Pharmacol. Rev. 62 (3), 405-496 (2010).
- Furukawa, H., Gouaux, E. Mechanisms of activation, inhibition and specificity: crystal structures of the NMDA receptor NR1 ligand-binding core. EMBO J. 22 (12), 2873-2885 (2003).
- Furukawa, H., Singh, S. K., Mancusso, R., Gouaux, E. Subunit arrangement and function in NMDA receptors. Nature. 438 (7065), 185-192 (2005).
- Dolino, D. M., Rezaei Adariani,, Shaikh, S., A, S., Jayaraman, V., Sanabria, H. Conformational Selection and Submillisecond Dynamics of the Ligand-binding Domain of the N-Methyl-d-aspartate Receptor. J. Biol. Chem. 291 (31), 16175-16185 (2016).