从骨髓间充质干细胞制备血浆膜囊泡用于潜在的细胞质替代治疗

Summary

与年龄相关的疾病与细胞质组分中的多种缺陷有关。在这里，我们提出了从骨髓间充质干细胞制备质膜囊泡的方案。这种技术可能被用作细胞质替代疗法的手段，以改善或甚至逆转年龄相关表型。

Abstract

我们以前报道了通过机械挤压哺乳动物细胞产生质膜囊泡（PMV）。 PMV与线粒体缺陷Rho0细胞的融合在正常培养条件下恢复有丝分裂活性。据报道，动脉粥样硬化，2型糖尿病，阿尔茨海默病和癌症是与各种细胞类型的细胞溶质和细胞器中的多种机械和功能缺陷相关的年龄相关疾病。骨髓间充质干细胞（BMSCs）代表骨髓中独特的细胞群，具有自我更新能力，同时保持其多能性。通过PMV融合补充来自自体骨髓基质干细胞的年轻细胞质的衰老细胞提供了改善或甚至逆转年龄相关表型的有希望的方法。该方案描述了如何通过使用3的聚碳酸酯膜挤出从BMSC制备PMV1; m孔，确定线粒体的存在，并使用共聚焦显微镜检查PMV内膜电位的维持，通过离心浓缩PMV，并进行体内注射PMV至小鼠腓肠肌。

Introduction

已经投入了大量的努力来建立基因，酶和细胞替代疗法的方法。这导致了巨大的突破，甚至临床应用1，2，3。最近，基于核转移技术的有争议的线粒体替代疗法被应用于老年妇女的体外受精或携带致死线粒体DNA突变⁴ 。在年龄相关疾病中发现的缺陷，包括动脉粥样硬化，2型糖尿病，阿尔茨海默病和癌症，通常是多方面的。已经证明脂滴的积累;沉淀淀粉样蛋白;展开蛋白质在内质网中的保留;缺陷型蛋白酶体，自噬体和线粒体有助于这些疾病的发展或恶化“外套参照”> 5,6,7,8,9,10,11。目前没有可用于直接修复细胞质和细胞器故障的机制，这导致衰老和衰老表型。

我们以前通过机械挤压哺乳动物细胞报道了生物质膜囊泡（PMVs） ¹² 。除了细胞核外，膜或细胞溶质中的组分（包括蛋白质和RNA）以及细胞器如线粒体都发现在PMV中。基本上，PMV可以被认为是一个微型的去核细胞。更重要的是，PMV与线粒体缺乏的Rho0细胞的融合在正常培养条件下恢复有丝分裂活性。这是关于成立的第一份报告为细胞质替代疗法建立潜在的有效途径。

骨髓间充质干细胞（BMSCs）是通常从骨髓产生并且在培养物中容易扩增的多能祖细胞。胚胎干细胞标记Oct4，Nanog和SOX2在MSCs ^13中检测到低水平。端粒酶活性也是可测量的。此外，不存在共刺激分子和人白细胞抗原（HLA）II类分子以及MSC上的低HLA I类表达使其成为同种异体或“现成”使用的理想细胞再生医学和免疫调节应用¹⁴ 。

在这里，我们描述如何通过挤出通过具有3-μm孔隙的聚碳酸酯膜来制备来自小鼠BMSC的PMV，确定线粒体的存在并使用confoc检查PMV中膜电位的维持通过离心法制备浓缩但不聚集的PMV，并进行PMVs 体内注射到小鼠的腓肠肌中。

Protocol

8至12周龄的BALB / c小鼠购自上海实验动物中心（中国上海），并在特定的无病原菌和空调动物设施中饲养。动物护理和实验程序符合汕头大学实验动物使用和护理指南。

装置装配

1. 为了确保无菌，使用前打开组织培养罩的紫外线30分钟。
2. 拧下一次性25毫米过滤器单元，并将设备的盖子和底部浸入装有75％乙醇的200毫升玻璃杯中30分钟。该单元由医用级聚丙烯制成。
3. 使用镊子拿起装置的盖子和底部，用手摇动剩余的乙醇，并使部件在发动机罩中风干10分钟。
4. 在PBS中湿19mm聚碳酸酯膜，并将其小心地放置在机器人的支撑基质的顶部的单位。聚合物膜具有光滑，平坦的表面和轨道蚀刻的3μm孔。
5. 通过将盖子紧紧地拧紧到底部来重新组装本机。确保膜不会从中心移开。
6. 取出1 mL胰岛素注射器的针头，取1 mL PBS。将注射器连接到过滤器单元上，然后将PBS推入设备中以润湿组件，并测试是否有泄漏。

2.产生等离子体膜囊泡（PMV）

1. 建立一个BMSC文化，Nemeth et al。 ¹⁵ ，在含有15％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中。在含有5％CO _2的加湿培养箱中在37℃培养6孔板中的细胞。
2. 为了繁殖细胞，取出培养基并用0.5mL无钙PBS冲洗孔。
3. 加入0.5mL的0.25％胰蛋白酶-EDTA，并在37℃下孵育细胞3分钟轻轻敲击手掌几次，以促进细胞分离。通过加入1 mL培养基停止消化。
4. 将细胞收集在15mL锥形管中，并在台式离心机中以200xg旋转2分钟。将细胞重悬于4mL培养基中，并将细胞等分至6孔板的两个孔中。
   注意：细胞通常在约24小时达到汇合。
5. 为了产生PMV，通过胰蛋白酶消化从6孔板的一个孔（约5×10 ^5个细胞）中收获细胞，并将细胞单分散在0.5mL的培养基中。
6. 将细胞装入胰岛素注射器，将其连接到过滤器单元，并快速推动柱塞以将细胞挤压通过过滤器。丢弃挤压的介质，因为它内部只应有几个PMV。
7. 将另外0.5 mL的培养基装入注射器，并快速将其推过过滤器。收集第二次挤出的介质，其中包含各种尺寸的PMV。
8. 将150μL收集的培养基装入35 mm玻璃底盘中，使PMV沉降至底部约10分钟。使用20X物镜在装有CCD相机的倒置相差显微镜下检查PMV。

3.使用共焦显微镜检查PMV内的内容

1. 在BMSCs中进行转染，在50μL无血清DMEM中稀释2μg超螺旋质粒DNA和6μL阳离子转染试剂（ 如 PolyJet）。涡旋混匀并短暂旋转以从管的两侧收集所有液体。
2. 将稀释的溶液（从步骤3.1）滴加到稀释的DNA溶液中，强烈旋转1分钟，短暂旋转，并在室温下孵育10分钟。
3. 将已经以约30％汇合过夜的BMSCs上的旧培养基替换为2mL新鲜培养基并加入DN逐滴转染混合液。
4. 转染12小时后，用2 mL新鲜培养基更换。
5. 如上所述，为了追踪细胞质定位的蛋白质，用包含EGFP表达盒（pEGFP-N1）的质粒转染细胞。如上所述，转染48小时后通过胰蛋白酶消化获得PMV生成的细胞。
6. 为了追踪线粒体，用37℃的新鲜培养基中的线粒体染料（1μM，MitoTracker）染色细胞30分钟。
7. 为了检测线粒体的膜电位，用花青染料JC-1（5,5'，6,6'-四氯-1,1'，3,3'-四乙基苯并咪唑基碳菁碘化物）染色细胞（10μg / mL）在新鲜培养基中在37℃下培养30分钟。
   1. 用0.5mL PBS洗涤细胞三次，然后如上所述通过胰蛋白酶消化收获细胞以产生PMV。
   2. 加载150μL收集的药物将其放入35毫米玻璃底盘中，使PMV沉降至底部约10分钟。使用100X油物镜在共焦显微镜下检查PMV。
8. 要检测EGFP或线粒体染料，打开488 nm激光并在505-530 nm收集信号。要检测JC-1，打开488 nm和543 nm激光，并收集505-530 nm和560-615 nm的信号。将针孔值设置为1.4左右。

4.通过离心制备浓缩的PMV

1. 通过胰蛋白酶消化收获细胞，并如上所述在0.5mL培养基中产生PMV。
2. 在室温下在台式离心机中以1,200 xg的速度旋转PMV 5分钟。仔细吸取上清液，并将沉淀物重悬于100μL培养基中，轻柔旋转。
3. 将50μLPMV加载到35 mm玻璃底盘中，使其在室温下放置约10分钟。检查PMV在共焦显微镜下使用40X油物镜。
4. 将一系列稀释的聚乙烯亚胺（PEI）溶液加入到BMSC培养物中1小时，并检查细胞毒性的迹象。
   注意：在这里，选择2μg/ mL的PEI，因为在BMSCs中没有检测到毒性迹象。
5. 通过胰蛋白酶消化收获细胞，并加入2μg/ mL的PEI 1小时，以充电细胞膜作为防止聚集的手段。如上所述，在0.5mL培养基中产生PMV。浓缩PMV并在共焦显微镜下检查它们，如上所述。

5.将PMV注入腓肠肌肌肉

1. 为了染色膜，将1mL新鲜培养基中的CM-DiI（10mM甲基二碳酰基 - 碳青霉素）染料加入到BMSCs中30分钟。
2. 通过胰蛋白酶消化收获细胞（约5×10 ⁵ ），并将其重悬于0.5mL培养基中。加入PEI（2μg/ mL）1H。如上所述，将PMV生成并浓缩在100μL培养基中。
3. 禁食12小时后注射巴比妥钠（10mg / kg）来麻醉BALB / c小鼠。
4. 用75％乙醇清洗腓肠肌外侧。使用30 G胰岛素注射器将PMV（100μL）慢慢注入腓肠肌。
5. 施用麻醉后，在实验的持续时间内将湿纱布放在眼睛上，并用白炽灯温热鼠标直至醒来。将鼠标单独放在个别通风笼中。
6. 在术后12小时收获腓肠肌，通过颈椎脱位杀死小鼠。
7. 在腓肠肌上涂上75％的乙醇，用剪刀打开皮肤，并切开两端的整个腓肠肌。
8. 用PBS冲洗肌肉，并在荧光显微镜下使用20X物镜进行检查。
9. 用a修剪肌肉锋利的剃刀刀片去除不带荧光的部件。将强烈的红色荧光部分切成约9毫米³立方体。
10. 将每个立方体嵌入最佳切割温度介质（OCT）中，将其浸没在液氮中5分钟，并将其储存在-20°C冷冻器中直到使用。
11. 使用低温恒温器将冷冻切片切成20μm厚，并将每个部分粘附到载玻片上。用PBS冲洗一次。
12. 用斑点圆圈在该部分周围绘制一圈，并加入100μLDAPI（1μg/ mL）。在黑暗中室温孵育10分钟后吸入DAPI溶液，并用PBS洗涤三次。
13. 将样品放在样品上，用玻璃滑盖盖住，并用指甲油密封滑块。使用100X油物镜在共焦显微镜下检查切片。
14. 为了检测CM-DiI，打开543nm激光并收集560-615nm的信号。要检测DAPI，请打开405nm激光并在420-480nm收集信号。将针孔值设置为约1.4。

Representative Results

成功准备PMV的关键在很大程度上取决于过滤器单元的正确组装（ 图1 ），可以通过将1mL PBS推过膜来测试。如果发生泄漏，重新组装过滤器单元并再次测试。然而，当细胞被推过膜时，泄漏只能被可靠地测试。如果在常规显微镜下仅使用10X物镜检测到几个PMV，或者如果PMV的大小大多为1μm左右，则表明大多数单元由于组装不正确而被捕获在单元内部。尺寸在约3μm范围内的PMV在使用20X物镜的相差显微镜下检查时是主要的（ 图2 ）。由于纳米尺寸的PMV不容易可视化，所以PMV的数量比例较低。被发现有助于快速按压注射器减少膜碎片的量，这显然不能形成球形PMV。此外，在第一挤压介质中发现较小尺寸（小于1μm）的PMV，在第二挤出中回收较大的PMV。

PMV的最独特的方面是除核¹²之外的细胞组分的包围。用EGFP表达盒将BMSCs转染48小时，然后用于PMV制备。结果表明，细胞质定位的EGFP蛋白可以包封在PMV中（ 图3A ）。线粒体的外壳通过线粒体染料的染色证明，显示大部分但不是全部的PMV含有指示线粒体的绿色荧光点（ 图3 ）。一些PMV，即使是直径大到3μm的PMV，也没有显示含有线粒体的证据，这表明在一些机械约束下可能会阻止线粒体包封到PMV中。通过JC-1染色检测线粒体的膜电位，当线粒体具有正常的电位时，其发射红色荧光。结果表明，在PMVs中检测到红色荧光（ 图3 ），而绿色荧光检测不到（数据未显示），表明PMV内的线粒体功能正常。

需要PMV的浓缩方法，特别是用于体内应用以减少体积以及去除挤出过程中释放的细胞成分。在室温下以1,200×g离心5分钟后，在上清液中发现较少粒径的PMV。为了促进沉淀物的再悬浮，使用2mL圆底管进行离心。然而，大多数PMV聚集在颗粒中，特别是P较小尺寸的MV（ 图4 ）。这可能是由于膜上的粘附分子。因此，培养基补充有PEI（2μg/ mL），其浓度被定制为没有显着的细胞毒性。连接到细胞膜上的PEI的正电荷阻止了离心过程中PMV的聚集（ 图4 ）。

最后，在制备PMV之前，用CM-DiI染料对BMSCs膜进行标记（ 图5 ）。浓缩后，将PMV注射到小鼠的腓肠肌中，在手术后12小时收获，并在共焦显微镜下检查。检查腓肠肌的冷冻切片是否存在红色荧光，其在肌纤维内检测到（ 图5 ），证明PMV可能通过内吞作用递送至细胞质。值得注意的是，红色荧光在肌纤维周围发现丝状体（数据未显示），表明在注射后12小时，大部分PMV未被内吞或刚刚开始吞噬。

图1：过滤单元的装配。 （ A ）市售的聚碳酸酯膜。 （ B ）在具有20X物镜的光学显微镜下观察直径为3μm的轨道蚀刻孔。刻度棒=50μm。 （ C ）将膜放置在一次性过滤器单元的支撑基体的顶部。 （ D ）组装的过滤器单元带有膜。 请点击此处查看此图的较大版本。

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图2：骨髓基质干细胞的PMV的产生。 （ A ）将来自小鼠的骨髓基质干细胞在6孔板中培养。 （ B ）通过胰蛋白酶消化收获BMSCs（5×10 ⁵ ），并将其单分散在500μL培养基中。在具有20X物镜的光学显微镜下拍摄附着和重悬的骨髓基质干细胞的图像。 （ C ）在连接到过滤器单元之前，将细胞装入胰岛素注射器。 （ D ）将BMSCs产生的PMV加载到35mm玻璃底盘中，并使用20X物镜在倒置相差显微镜下进行检查。刻度棒=40μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

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图3：通过共焦显微镜检测PMV含量。 （ A ）转染pEGFP-N1的BMSCs 48小时产生PMV，追踪细胞质定位的EGFP蛋白，（ B ）用线粒体染料（1μM）染色的BMSCs 30分钟以追踪线粒体的存在，或（ C ）用JC-1（10μg/ mL）染色BMSCs 30分钟以确认线粒体的膜电位。从BMSCs产生的PMV被加载到35mm玻璃底盘上，并使用100X油物镜通过共焦显微镜检查。刻度棒=10μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图4：PMV浓度通过离心。通过胰蛋白酶消化收获BMSCs（5×10 ⁵ ），并重悬于0.5mL培养基中，补充有或不含2μg/ mL的PEI。产生的PMV以1,200g离心5分钟，重悬于100μL培养基中，并在共焦显微镜下用40X油物镜检查。 （ A ）PMV聚集示意图可能是离心后粘附分子相互作用引起的。 （ B ）带有PEI后保持单分散的PMV示意图。 （ C ）离心后聚集的PMV。 （ D ）由于PEI正电充电，PMVs在离心后显示较少的聚集。刻度棒=10μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

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图5：将CM-DiI标记的PMV递送至腓肠肌。从5×10 ^5个骨髓基质干细胞产生PMV，通过离心浓缩至100μL的体积，并缓慢注射到BALB / c小鼠的腓肠肌中。 （ A ）PMV注射示意图。 （ B ）用CM-DiI标记的BMSCs;刻度棒=20μm。 （ C ）由CM-DiI标记的BMSCs产生的PMV并通过共聚焦显微镜检查;刻度棒=10μm。 （ D ）术后12小时收获腓肠肌;刻度棒=20μm。 （ E - H ）通过共焦显微镜检查腓肠肌的冷冻部分;刻度棒=10μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
IsoporeTM membranes	Millipore	TSTP04700	3 mm pore
Disposable filter unit	Xinya, Shanghai, China	25 mm	Medical grade polypropylene
Insulin syringe	BD	328446	1 mL
pN1-EGFP	Clontech	6085-1
MitoTracker	Molecular Probes	M7514	Green FM, 1 μM
JC-1	Beyotime, Haimen, China	C2006	10 mg/mL
CM-DiI	Beyotime, Haimen, China	C1036	10 mM
PEI	Sigma	P3143	Mn = 75,000
Fluorescence Microscope	Nikon	Eclipse TE 2000	With CCD camera
Confocol Microscope	Carl Zeiss	LSM 510 Meta
PolyJet	SigaGen	SL100688	For cell transfection