Summary
Questo protocollo descrive l'implementazione di un sistema di microscopia ottica a tempo determinato di rilevamento asimmetrico per l'imaging a celle singole in flusso microfluidico ultravioletto e le sue applicazioni nella citometria a flusso di immagini.
Abstract
La scalabilità del numero di parametri misurabili, che consente l'analisi multidimensionale dei dati e quindi risultati statistici di fiducia, è stata la principale tendenza nello sviluppo avanzato della cytometria a flusso. In particolare, l'aggiunta di capacità di risoluzione ad alta risoluzione consente l'analisi morfologica complessa delle strutture cellulari / sub-cellulari. Questo non è possibile con i citometri di flusso standard. Tuttavia, è utile per avanzare la nostra conoscenza delle funzioni cellulari e può beneficiare della ricerca sulla scienza della vita, della diagnostica clinica e del monitoraggio ambientale. Incorporare le capacità di imaging in cytometry di flusso compromette il throughput del dosaggio, soprattutto a causa delle limitazioni sulla velocità e la sensibilità nelle tecnologie della fotocamera. Per superare questa sfida di velocità o di throughput che affronta la citometria di flusso di imaging pur conservando la qualità dell'immagine, è stata dimostrata la microscopia ottica di rilevazione di tempo (ATOM) di rilevamento asimmetrico per consentire l'immaginazione ad alta contrastoCon una risoluzione subcellulare, con una velocità di imaging fino a 100.000 cellule / s. Sulla base del concetto di imaging della convenzionale imaging time-stretch, che si basa sulla codifica e il recupero dell'immagine ottica in tutto l'ottica mediante l'uso di impulsi laser a banda larga ultra-veloce, ATOM migliora ulteriormente le prestazioni dell'immagine migliorando il contrasto dell'immagine delle cellule non-etichettate / non colorate. Ciò è ottenuto accedendo alle informazioni di gradiente delle cellule delle cellule, che sono codificate in modo spettrale in impulsi a banda larga single-shot. Di conseguenza, ATOM è particolarmente vantaggioso nelle misurazioni ad alta velocità della morfologia e della texture delle singole cellule - informazioni che indicano tipi di cellule, stati e perfino funzioni. In definitiva, questo potrebbe diventare una potente piattaforma di citometria a flusso di imaging per la fenotipizzazione biofisica delle cellule, completando l'attuale stato di avanzamento dei test biochimici-marcatori cellulari. Questo lavoro descrive un protocollo per stabilire i moduli chiave di un sistema ATOM (da frontend ottico a dati pRocessing e visualization backend), così come il flusso di lavoro della citometria a flusso di imaging basato su ATOM, utilizzando le cellule umane e le microalghe come esempi.
Introduction
L'imaging ottico presenta un potente strumento e un test basato su cellule (quasi) non invasivo visualizza la distribuzione spaziale dettagliata di molti componenti cellulari / subcellulari, scoprendo così una moltitudine di firme morfologiche, biofisiche e biomolecolari delle cellule. Tuttavia, questa capacità di estrarre informazioni di contenuto elevato da singole cellule è stata generalmente compromessa quando una popolazione enorme e eterogenea di cellule doveva essere studiata. Ciò segna un comune compromesso nei test basati su cellule tra il throughput di misura e il contenuto. Un esempio notevole è che l'aggiunta di capacità di imaging alla cytometria a flusso ha provocato un down-scaling del throughput di almeno 1-2 ordini di grandezza rispetto a quello dei citometri di flusso non-imaging classici. Sebbene possa offrire un'analisi complessa morfologica delle singole cellule che non è possibile con i citometri standard di flusso 1 , la citometria a flusso di imaging generalmente manca di un throughput sufficiente a idImpongono l'eterogeneità cellulare con elevata fiducia statistica. Ciò è necessario per nuove scoperte in biologia e per acquisire una comprensione della patogenesi delle malattie. La principale sfida tecnica è rappresentata dal limite di velocità inerente imposto dalle comuni strategie di imaging ottico: scansione a raggi laser ( ad es., Con specchi galvanometrici) e / o sensori di immagine ( ad es., Dispositivo accoppiato a carica (CCD) Ossido semiconduttore (CMOS)). La velocità di scansione laser è intrinsecamente limitata dall'inerzia meccanica degli specchi di scansione, mentre la frequenza di fotogramma di CCD o CMOS è limitata dal compromesso fondamentale tra velocità di imaging e sensibilità ( vale a dire aumentando la frequenza del fotogramma porta a una sensibilità di rilevamento del segnale ridotta , e viceversa).
Basato su un meccanismo di codifica dell'immagine ultra-ottica e ultra-veloce, la visualizzazione ottica di time-stretch è stata dimostrata come una piattaforma attraente per il cyt di flusso di imaging ad alta velocitàSenza bisogno dei sensori di immagine convenzionali o scansione laser meccanica 2 , 3 . Le descrizioni dettagliate del principio di funzionamento dell'immagine a tratti di tempo si trovano nei riferimenti 4 , 5 , 6 , 7 . In breve, è costituito da due passi di mappatura intercambiabili: (i) codifica spettrale (mappatura spazio-lunghezza d'onda), in cui le coordinate spaziali del campione imaged vengono mappate a lunghezze d'onda diverse attraverso lo spettro della trave 8 , 9 , E (ii) una trasformazione di Fourier dispersiva (mappatura della lunghezza d'onda) 9 , in cui i componenti di lunghezza d'onda dei singoli impulsi laser vengono trasformati (allungati) tramite dispersione di velocità di gruppo (GVD) in forme d'onda temporali (a onda d'onda). Un importanteLa caratteristica della ripresa temporale è l'amplificazione ottica, che svolge un ruolo fondamentale nella lotta contro la perdita di sensibilità dovuta alla fotorivelazione ultra veloce e alla perdita di GVD, migliorando così il rapporto segnale / rumore (SNR) senza essere contaminati dal rumore del fotorivelatore 9 . Poiché ogni impulso laser codifica una linea di scansione del campione esaminato, ortogonale al flusso unidirezionale delle celle, una velocità di scansione efficace è determinata dalla velocità di ripetizione del laser, che è tipicamente oltre 10 MHz. Questa operazione ultra veloce consente di catturare immagini senza cifre a singola cella con un throughput di 10.000-100.000 celle / s ( vale a dire 10-100 volte superiori alla citometria di flusso di imaging convenzionale). Di conseguenza, l'imaging temporale potrebbe trovare applicazioni uniche in screening ad alta velocità, a singola cellula, in particolare quando vi sia la necessità di identificare eterogeneità sconosciuta o cellule rari / aberranti all'interno di una popolazione considerevole (da migliaia a milioni di persone). cel Ls), quali rari screening delle cellule tumorali 10 o la classificazione micro-alghe 11 .
L'imaging a tratti di tempo si basa prevalentemente sulla cattura di immagini in campo luminoso (BF), da cui viene generato il contrasto dell'immagine mediante la dispersione della luce e l'assorbimento dalle cellule 2 , 3 , 9 , 10 , 11 . Tali funzionalità di imaging a singola cellula senza etichetta potrebbero escludere gli effetti nocivi associati alle etichette fluorescenti, come la citotossicità e la fotolibrazione, e tuttavia forniscono informazioni preziose per l'analisi delle singole cellule basate sulla texture e sulla morfologia cellulare e sub cellula. Questi parametri senza etichetta sono dimostrati efficaci per la classificazione profonda delle immagini delle cellule, soprattutto quando è disponibile un'enorme popolazione cellulare di 11 ,"Xref"> 12. Tuttavia, in molte occasioni, l'imaging BF non riesce a fornire un sufficiente contrasto per rivelare la morfologia dettagliata delle celle trasparenti senza etichetta. Sono state sviluppate diverse modalità di imaging senza etichette, a contrasto di fase e di allungamento del tempo per migliorare il contrasto dell'immagine a velocità fotogrammi ultra veloci 13 , 14 e 15 . Tra queste tecniche, è stata sviluppata una microscopia ottica di rilevamento asimmetrico (ATOM) per rivelare il contrasto di fase (contrasto differenziale-interferenza-contrasto (DIC)) basato su un concetto simile alla fotografia Schlieren, Libera, ad alto contrasto di singole cellule ad una velocità microfluidica ultrasuoni (fino a 10 m / s) 16 . Questo effetto può essere facilmente generato mediante rilevamento o illuminazione obliqua bloccando parzialmente il percorso del fascio codificato in immagine o inclinando il fascio prima della fotodetazione. Un altro vantaggio di ATOM è il suo aPossibilità di acquisire simultaneamente due contrasti gradienti gradienti lungo orientamenti opposti. La sottrazione dell'intensità e la somma di due immagini a contrasto contrario rappresentano rispettivamente il contrasto gradiente differenziale di fase e il contrasto di assorbimento dalla stessa linea di scansione. Questo lavoro presenta un protocollo dettagliato che descrive l'implementazione di ATOM, tra cui la creazione dell'installazione ottica, la preparazione del campione e l'acquisizione e la visualizzazione di dati. In particolare, questo lavoro dimostra l'operazione di ATOM con l'imaging a cellule singole di cellule del sangue umano, cellule tumorali e fitoplancton (microalga). Ciò evidenzia l'applicabilità dell'ATOM alla citometria a flusso di imaging, non solo nell'arena biomedica, ma anche nella ricerca sul marino e sul biocarburante 17 , 18 .
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Protocol
1. Preparazione del campione
- Preparazione del campione (cellule aderenti, cellule MCF-7)
- Estrarre il piatto di coltura cellulare dall'incubatore e scollegare il mezzo di coltura.
- Sciacquare le celle su un piatto con una soluzione salina fosforata tamponata (PBS) per rimuovere il mezzo di coltura eccessivo.
- Aggiungere 3 ml di una soluzione di trypsina allo 0,25% al piatto di coltura (diametro di 100 mm) e metterlo in un incubatore di 37 ° C e 5% di CO 2 per 4 min.
NOTA: La tripsina scioglie la proteina adesiva delle cellule in modo che possano staccarsi dal piatto di coltura. - Controllare se tutte le celle sono state staccate dal piatto della coltura utilizzando un microscopio leggero (obiettivo 10X). In caso contrario, scuotere delicatamente il piatto della coltura cellulare.
- Aggiungere 4 ml del campione di coltura standard (formulato con l'89% Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% penicillina-streptomicina (PS)) per fermare l'azione della tripsina.
- TRaggruppare l'intera miscela (cellule in soluzione di trysina e mezzo di coltura) in un tubo di centrifuga e centrifugare per 5 min a 200 x g.
- Rimuovere tutto il fluido e riassemblare le cellule in 1 ml di 1x PBS (valore pH: 7,4, pre-riscaldato a 37 ° C).
- Preparazione del campione (microalghe coltivate)
- Trasferire i micro-alghe coltivate e il mezzo di coltura ( ad esempio, acqua di mare, agar o acqua dolce) a nuovi tubi di coltura di vetro (~ 15 mL) in un rapporto di volume (microalga e campione di coltura) di 1: 5 per stabilire Un nuovo mezzo di sottocultura.
- Posizionare i tubi di coltura di vetro in una camera antipolvere sotto continua illuminazione mediante illuminazione artificiale da lampade fluorescenti secondo un ciclo chiaro / scuro (LD LD: 16) per 72-120 h prima dell'esperimento.
- Trasferire i campioni sub-coltivati in un tubo di centrifuga e mescolare bene.
2. Installazione del sistema ATOM
Figura 1: Schema di un sistema ATOM. Un laser pulsato a banda larga viene impiegato per fornire impulsi ultravioletti a ( a ) un modulo di allungamento del tempo e ( b ) un modulo di amplificazione ottico in linea. Il modulo di allungamento del tempo genera un treno di forme d'onda temporali, ognuna delle quali è la replica dello spettro di lunghezza d'onda della sorgente laser ( cioè, mappatura della lunghezza d'onda alla volta). Il modulo di amplificazione è usato per compensare la perdita di impulsi (dispersivi). L'impulso allungato è quindi ( c ) sparsi disperso da una griglia di diffrazione, formando un'illuminazione a spettro spettrale 1D in cui i singoli componenti della lunghezza d'onda vengono trasmessi da una coppia di lenti del relè e concentrate dalla lente obiettivo su posizioni diverse sulla cella che scorre all'interno del ) Chip microfluidico. Questo è il processo di codifica spettrale. IlLa luce codificata spettalmente passerà di nuovo la cella attraverso un'altra lente obiettivo e uno specchio, ritornando alla griglia di diffrazione e ricombinando come un fascio pulsato spianato in modo non disperso. Quindi questo fascio pulsato codificato dall'immagine è E ) suddivisi in due percorsi, in modo tale che entrambi i fasci siano parzialmente bloccati con ( f ) il bordo della lama, ma da direzioni opposte, prima di essere accoppiate alle fibre. Questi due fasci rappresentano i due contrasti contrassegnati dalla fase gradiente (opposta) dell'immagine finale. Per la rilevazione simultanea di entrambi i segnali di segnale, uno dei segnali subisce ( g ) una linea di ritardo di tempo, in modo tale che i due segnali siano multipli (interlacciati) nel tempo. Per l'acquisizione dati vengono utilizzati un fotorivelatore ad alta velocità e un oscilloscopio in tempo reale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Tempo st Modulo retch
- Impiegare una sorgente laser a pulsazione a banda larga a banda larga (fs) oa picoseconda (ps) con una lunghezza d'onda consigliata nel campo vicino a infrarossi (NIR), 800-1.500 nm.
NOTA: la larghezza di impulso tipica richiesta può variare da sotto-100 fs a qualche ps. I requisiti dettagliati delle sorgenti laser pulsati possono essere visualizzati nei riferimenti 4 e 5. Le metriche importanti sono evidenziate nella tabella 1 .- Assicurarsi che la sorgente laser abbia un'alta frequenza di ripetizione, che dovrebbe essere nel regime di megahertz ( ad esempio, decine di MHz) per garantire immagini ultra veloci in ATOM. Inoltre, impostare la potenza laser picco di uscita ben al di sotto della soglia di potenza danneggiata della cavità di fibre, circa 1 kW.
- Assicurare una buona stabilità temporale e spettrale della fonte laser pulsata.
NOTA: La tolleranza tipica nella fluttuazione di ampiezza spettrale dovrebbe essere mantenuta entro l'1,2% di 19 , 20 ,Ss = "xref"> 21, come raggiunto dal laser bloccato in modalità fibra in questa configurazione.
NOTA: La larghezza di banda ottica della sorgente laser dovrebbe essere di 10-100 nm, che è essenziale per garantire una sufficiente visualizzazione campo di visualizzazione (FOV) in un'immagine a singola cella 21 .
- Attraverso un collimatore di fibre, accoppiare il fascio laser a una fibra ottica dispersiva a singolo modo in cui gli impulsi vengono allungati tramite dispersione di velocità di gruppo (GVD) ( Figura 1a ).
NOTA: Questo è il processo dopo il quale lo spettro di ogni impulso viene mappato sul tempo come una forma d'onda a lunghezza d'onda ( cioè, mappatura da lunghezza d'onda a tempo).
NOTA: il totale di GVD richiesto dovrebbe essere sufficiente per garantire che la risoluzione dell'immagine complessiva di ATOM non sia influenzata dal processo di mappatura della lunghezza d'onda (vedi discussione). Tipicamente, nella gamma NIR, il GVD dovrebbe essere ben oltre 0.1 ns / nm. Ad esempio, una fibra monomodale impiegata in questoS fornisce una totalità di GVD di 0,38 ns / nm attorno alla lunghezza d'onda di 1.060 nm (una lunghezza totale di fibre di 10 km).
- Impiegare una sorgente laser a pulsazione a banda larga a banda larga (fs) oa picoseconda (ps) con una lunghezza d'onda consigliata nel campo vicino a infrarossi (NIR), 800-1.500 nm.
- Modulo di codifica dello spettro
- Costruire un sistema ottico del microscopio per eseguire l'imaging codificato spettriforme delle celle che fluiscono lungo il canale microfluidico, come illustrato nella figura 1 .
NOTA: I componenti chiave di questo microscopio ottico comprendono: (1) una griglia di diffrazione, un modulo telescopico a lenti a relé (RL1 e RL2 in figura 1 ) e due obiettivi obiettivi (Obj1 e Obj2 in figura 1 ).- Innanzitutto, illuminare il fascio allungato e collimato su una griglia di diffrazione (la griglia di trasmissione è impiegata in questa configurazione) per generare una doccia spettrale ( Figura 1c ).
NOTA: La potenza del fascio diffrattato ( cioè l' efficienza di diffrazione) può essere massimizzata regolando tL'orientamento della grata chiuso alla configurazione di Littrow. - Configurare le due lenti a relè (RL1 e RL2) in un sistema di imaging a 4 f ( cioè, posizionare la griglia di diffrazione sul piano focale di RL1 e separare RL1 e RL2 per una distanza pari alla somma delle loro lunghezze focali. Sarà quindi imaging sul piano focale posteriore dell'obiettivo obiettivo Obj1).
- Allineare accuratamente la doccia spettrale per riempire l'apertura posteriore dell'Obj1, in modo che la doccia spettrale possa essere proiettata e concentrata sul piano di immagine del microscopio.
NOTA: Qui la NA della lente obiettivo (Obj1 in Figura 1 ) è 0,75. - Posizionare un altro obiettivo obiettivo (Obj2 in figura 1 ) con un NA simile e uno specchio piano nell'apertura posteriore di questa lente obiettivo (Obj2), in modo tale che il fascio di doccia spettrale possa essere allineato a doppio passaggio del piano di immagine e tornare al Griglia di diffrazione.
- RegolareLa coppia di obiettivi obiettivi (Obj1 e Obj2) in modo tale che i loro piani focali si sovrappongono tra di loro. Controllare se la doccia spettrale abbassa due volte il piano immagine nella stessa posizione e torna alla griglia seguendo lo stesso percorso. In caso contrario, eseguire ulteriori allineamenti e sintonizzazione del sistema ottico.
NOTA: La luce di ritorno dovrebbe passare attraverso un separatore di raggi aggiuntivi, in modo tale che la luce possa essere trasmessa a un modulo di rilevamento asimmetrico. - Regolare il guadagno dell'amplificatore ottico ad un livello adeguato, in modo che il segnale risultante possa essere rilevato dal fotorivelatore con un buon SNR, che è tipicamente> 10 dB.
- Posizionare e regolare la posizione del chip microfluidico sulla piattaforma del campione e assicurarsi che la doccia spettrale, quindi la zona di imaging, sia posizionata sul canale microfluidico ( figura 1d ).
NOTA: La doccia spettrale è illuminata ortogonalmente alla direzione di flusso dei fluidi all'interno del mChip microfluidico, in modo tale che il movimento fluido esegua automaticamente scansioni bidimensionali (2D).
- Innanzitutto, illuminare il fascio allungato e collimato su una griglia di diffrazione (la griglia di trasmissione è impiegata in questa configurazione) per generare una doccia spettrale ( Figura 1c ).
- Costruire un sistema ottico del microscopio per eseguire l'imaging codificato spettriforme delle celle che fluiscono lungo il canale microfluidico, come illustrato nella figura 1 .
- Modulo di rilevamento asimmetrico
- Posizionare un separatore di fascio aggiuntivo per separare due fasci codificati con immagine ( figura 1e ).
NOTA: Ogni copia del fascio è parzialmente bloccata da un bordo di coltello. - Misurare e registrare la potenza ottica della trave prima del blocco del fascio. Quindi, posizionare manualmente i bordi del coltello (montati su uno stadio di traduzione lineare) in modo da bloccare approssimativamente la metà della trave (mediante ispezione visiva). Successivamente, utilizzare il misuratore di potenza ottica per controllare la potenza del fascio, regolando perfettamente la posizione dei bordi del coltello traducendoli sul fascio.
NOTA: Si suggerisce che la posizione ottimale sia dove il potere è diminuito di ~ 50% del valore originale ( cioè il caso sbloccato). Questa è la condizione che fornisce la migliore combinazione del segnale di immaginePotenza e contrasto dell'immagine. - Ripetere la fase 2.3.2 per un'altra replica del fascio. Si noti che l'orientamento del blocco del fascio parziale per un fascio deve essere opposto rispetto all'altro fascio ( figura 1f ).
- Coppie le due travi parzialmente bloccate in due bracci separati in fibra a singolo modo tramite collimatori a due fibre.
NOTA: Una delle braccia ha una lunghezza extra di fibre, che funge da linea di ritardo a fibra, per introdurre un ritardo di tempo rispetto all'altra replica (senza linea di ritardo) ( Figura 1g ). Entrambi sono diretti ad una sola fibra da un accoppiatore di fibre prima della fotodetrazione. Il tempo di ritardo dovrebbe essere abbastanza lungo per separare temporaneamente le due repliche e abbastanza brevi per evitare sovrapposizioni temporali con la forma d'onda successiva ( cioè, le due repliche sono sempre interleavate e multipli in una sola fibra prima del rilevamento ( Figura 2a )). - berrettoRealizzare e digitalizzare i segnali ottici rilevati con l'oscilloscopio in tempo reale. Si noti che la larghezza di banda e quindi la frequenza di campionamento dell'oscilloscopio dovrebbero essere sufficientemente elevate per garantire che non influenzino la risoluzione dell'immagine finale (vedere la discussione).
NOTA: Qui, con il GVD di 0,38 ns / nm, è richiesta una larghezza di banda di acquisizione backend e una frequenza di campionamento di> 20 GHz e> 40 GSa / s.
- Posizionare un separatore di fascio aggiuntivo per separare due fasci codificati con immagine ( figura 1e ).
3. Procedure sperimentali
- Caricamento del campione
- Effettuare il conteggio delle cellule in un convenzionale microscopio a contrasto di fase in un emocitometro standard.
- Regolare la densità cellulare diluendo con 1x PBS (con acqua di sorgente per microalghe) e mescolare bene con una pipetta.
NOTA: La concentrazione suggerita è da 10 5 a 10 6 cellule / ml. - Montare il chip microfluidico sulla piattaforma di campionamento del sistema di imaging ottico.
NOTA: Il microfluidicoIl chip è costituito principalmente da polidimetilsilossano (PDMS) e viene fabbricato utilizzando il metodo di stampaggio standard di replica. Il canale microfluidico è progettato con un canale asimmetrico curvo per generare l'effetto focalizzazione del flusso inerziale, in modo tale che le celle possano fluire in singolo file nella sezione di imaging (con una dimensione di 80 μm x 80 μm (altezza x larghezza) . - Trasferire la soluzione cellulare della densità regolata in una siringa da 10 ml.
- Collegare la siringa all'ingresso del microfluidico e un tubo centrifugo alla presa del microfluidico per la raccolta.
- Montare la siringa su una pompa della siringa e impostare una portata adeguata per ottenere il passaggio desiderabile e per evitare di imporre una forza di taglio eccessiva tra le celle e il canale.
NOTA: la velocità lineare dei campioni deve essere compresa tra 0,5 e 10 m / s. Si noti che prima della registrazione effettiva dell'immagine, spesso è necessario aggiustare ulteriormente il sistema, in termini di ottimizzazione del valoreLa potenza del segnale dell'immagine e l'ottimizzazione della messa a fuoco dell'immagine ripetendo i passaggi 2.2.1.4-2.2.1.6.
4. Acquisizione dati
- Impostare un numero appropriato di punti dati da salvare per ogni esperimento. Il numero di punti dati da salvare dipende dalla dimensione e dalla portata dei campioni.
NOTA: In genere, è impostato su 8-16 milioni di punti campione con una frequenza di campionamento di 80 GSa / s. - Acquisire e salvare i dati in una modalità batch utilizzando l'oscilloscopio.
5. Elaborazione di backend
Figura 2: Ricostruzione di immagini ATOM dalla traccia di scansione di linea. Per ricostruire le immagini ATOM con il contrasto di assorbimento e differenziale differenziato (aumentato), vengono estratti due set di impulsi allungati (vedi impulsi viola e verde)(A) la traccia temporale temporale multipla temporale e quindi vengono segmentati e accatastati in forma digitale per formare ( b ) due immagini 2D che mostrano i due contrasti di sfasamento gradi opposti. Si noti che è necessaria un'operazione di taglio per formare ( c ) le immagini senza distorsioni compensando lo spostamento del sottosistema a causa dell'errore rotondo nella stima della frequenza di ripetizione del laser. Sottraendo la ( d ) scansione della linea raw dalla busta di intensità spettrale dell'origine laser, è possibile rimuovere lo sfondo delle immagini. ( G ) Un'immagine di contrasto di assorbimento può essere ottenuta con una sintesi di intensità di pixel (pixel-per-pixel) delle immagini ( e ) e ( f ), mentre ( h ) è possibile ottenere un'immagine di contrasto gradi gradiente differenziale dalla sottrazione delle immagini ) E (f). Clicca qui per visualizzare una versione più grandeDi questa figura.
- Trasferire i dati dall'oscilloscopio ai computer per la ricostruzione di immagini offline.
NOTA: Qui i dati vengono memorizzati in un disco rigido portatile e trasferiti manualmente tra l'oscilloscopio ei computer di elaborazione. La capacità del disco rigido dovrebbe essere superiore a 500 GB per ogni esperimento.- Utilizzare la routine di ricostruzione delle immagini chiave per digitalizzare le scansioni in linea per formare un'immagine 2D ( Figura 2 ).
NOTA: Il programma personalizzato (in MATLAB) produce quindi due immagini di rilevamento asimmetrico separando i due set di dati multipli in tempo (forme d'onda viola e verde in Figura 2 ).- Ottieni un'immagine di differenza differenziale gradiente di fase sottraendo le intensità delle due immagini di rilevamento asimmetrico; Un'immagine di contrasto di assorbimento può essere ottenuta aggiungendo le due immagini di rilevamento asimmetrico. Vedere immagini selezionate di MCF-7 e microalghe inFigura 3 . Si noti che i profili di fondo delle singole immagini vanno prima eliminati e le loro intensità dovrebbero essere normalizzate, prima delle operazioni di sommazione e sottrazione dell'immagine.
- Generare una libreria di parametri derivanti dalle immagini, come il volume delle cellule, la circolarità e la densità di assorbimento, ecc. Per ulteriori analisi.
- Utilizzare la routine di ricostruzione delle immagini chiave per digitalizzare le scansioni in linea per formare un'immagine 2D ( Figura 2 ).
- Inserisci la libreria di dati nella piattaforma di visualizzazione dati ( Figura 4 ).
- Caricare la libreria dei parametri e le corrispondenti immagini ricostruite sulla piattaforma di interfaccia di visualizzazione.
- Impostare gli assi come parametri di interesse.
NOTA: i parametri sono specifici per i problemi e sono definiti dall'utente. Sono derivate dalle immagini ATOM da parte del programma MATLAB. Qui la densità di assorbimento ottico della cellula, dell'area cellulare, del volume delle cellule e della circolarità delle cellule sono disponibili per la selezione. Seleziona il set di dati da visualizzare, in modo che ogni immagine della cella possa essere visualizzata come un punto dati diverso sulla trama di dispersione. - Spostare il cursore del mouse su ciascun punto, in modo che l'immagine corrispondente e altri parametri siano visualizzati in una sotto-finestra flottante.
NOTA: Gli assi possono essere cambiati tra le scale lineari e quelle logaritmiche in modo interattivo. - Eseguire ulteriori analisi di qualsiasi sottoinsieme del set di dati girando manualmente sulla trama di dispersione.
NOTA: L'istogramma di ogni parametro del sottosistema gated può essere tracciata in relazione a quelli dell'intera libreria. Gli istogrammi separati vengono visualizzati in un'altra finestra secondaria flottante.
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Representative Results
Questo lavoro illustra due dimostrazioni di immagini a singola cellula di ATOM: una con cellule di mammiferi (cellule mononucleate di sangue periferico umano umano (PBMC) e cellule tumorali del seno (MCF-7)) e un altro con fitoplancton (Scenedesmus e Chlamydomonas). Il primo esperimento è stato motivato dal crescente interesse per la biopsia liquida per la rilevazione, l'enumerazione e la caratterizzazione delle cellule tumorali circolanti (CTC) nel sangue 23 . La capacità di misurare i CTC diffusi dai siti tumorali primari al flusso sanguigno consente di esaminare la progressione del cancro metastatico 24 , 25 . Tuttavia, nelle analisi CTC esistono sfide: (i) il conteggio CTC è significativamente inferiore alla quantità esorbitante di cellule del sangue nel sangue intero. I metodi attuali di identificazione e recupero dei CTC riguardano principalmente passaggi di arricchimento e separazione delle cellule Class = "xref"> 26 , 27 , 28 . Tuttavia, lo sfondo contaminante delle cellule del sangue e / o la vitalità dei CTC arricchiti rimangono una preoccupazione per l'analisi molecolare successiva ( ad es. Sequenziamento di RNA) 29 . Ii) i CTC sono altamente eterogenei in termini di firme biofisiche e biomolecolari, limitando l'efficienza dell'arricchimento e del rilevamento del CTC. A tal fine, la citometria a flusso di imaging senza etichette con un elevato throughput di immagini è uno strumento accattivante che consente l'imaging diretto e l'identificazione dei CTC all'interno di un'enorme popolazione di cellule del sangue, riducendo al minimo o addirittura superando le fasi di arricchimento.
Il secondo esperimento è particolarmente importante per la caratterizzazione di fitoplancton su larga scala, che può influenzare i progressi nelle scienze ambientali ( ad esempio, la rilevazione di specie di fioritura algale dannosa (HAB)S = "xref"> 29 e l'identificazione delle specie microalgiche come fonti di biodiesel rinnovabili) 17 . Attivato da ATOM, la capacità di immagini ad alta produttività e ad alta contrasto di una singola cellula di fitoplancton potrebbe essere utile per rivelare la complessa eterogeneità delle dimensioni, della struttura e della morfologia tra diversi generi e specie.
La figura 3 mostra le immagini delle cellule di mammiferi, MCF-7 e PBMC (che fluiscono ad una velocità di ~ 10 m / s), così come microalghe, Scenedesmus e Chlamydomonas (che scorrono ad una velocità di ~ 2 m / s) . In tutti e quattro i casi, i due contrasti a gradi gradi opposti sono stati ottenuti dai due segnali rilevati time-multiplex, asimmetricamente rilevati (descritti nel punto 2.3). Entrambi presentano un aspetto pseudo-tridimensionale, simile alle immagini DIC, ciascuna delle quali presenta due orientamenti opposti opposti (colonne 1 e 2 della Figura 3a
Questo lavoro dimostra che le proprietà biofisiche, come la circolarità delle cellule e le dimensioni delle cellule, possono essere utilizzate R la classificazione di MCF-7 e PBMC. Si noti che due campioni sono osservati nel campione MCF-7. La disponibilità di immagini ad alto contrasto per tutti i punti dati ci permette di verificare che uno dei cluster corrisponda a frammenti / detriti ( Figura 4a ). È stata inoltre eseguita una classificazione simile tra due specie di fitoplancton basate sulle immagini ATOM. Qui i risultati della classificazione vengono presentati in una forma di un diagramma di dispersione 2D visualizzata dall'interfaccia utente personalizzata ( Figura 4 ). Ogni punto di dati annotato nella trama di dispersione, corrispondente a ciascuna cella, può essere ulteriormente esplorato con diversi parametri derivanti da ATOM. La corrispondente immagine ATOM può anche essere visualizzata in modo interattivo direttamente sulla trama. Il gating manuale è supportato anche in questa interfaccia di visualizzazione per facilitare ulteriormente la classificazione e l'analisi.
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Figura 3: Cella di immagini ATOM di microalga e cellule di mammiferi ad una velocità di flusso ultra-veloce (~ 2-10 m / s). (A) Scenedesmus; B ) Chlamydomonas; C ) cellule tumorali del seno, MCF-7; E ( d ) PBMC umano. I Scenedesmus e Chlamydomonas sono scesi a ~ 2 m / s mentre MCF-7 e PBMC sono scesi a 10 m / s. Le due colonne a sinistra (colonne 1 e 2) per ciascun tipo di cella rappresentano due contrasti a gradi gradi opposti. Le colonne 3 e 4 rappresentano rispettivamente il contrasto di assorbimento e il differenziale differenziale differenziato (aumentato). Barre di scala = 20 μm (in rosso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Fi4: un'interfaccia utente grafica per l'analisi citometrica basata su immagini ATOM. In questa interfaccia, l'utente può eseguire classificazioni e analisi di tipo cellulare definendo diversi parametri di cella ( ad es. Dimensioni delle celle, circolarità, densità di assorbimento, ecc. ) Derivanti dalle immagini ATOM. Il risultato può essere rappresentato in una trama di dispersione visualizzata nel pannello centrale. È possibile accedere e controllare varie opzioni di visualizzazione, tra cui modificare i parametri e la scalatura per gli assi x e y (pulsanti dei parametri degli assi X e Y) e commutare tra i set di dati (pulsante Dataset). Le informazioni sulla cella dettagliate (scheda Informazioni sulla cella) possono essere lette facendo scorrere su un determinato punto dati. Per abilitare la navigazione rapida, l'utente può cambiare in un'altra modalità di visualizzazione e visualizzare contemporaneamente tutte le immagini sullo scatterplot nel pannello centrale (pulsante di visualizzazione). Possono essere eseguiti anche ganci manuali per ulteriori analisi. I punti di dati gialli rappresentano il campione di cellule MCF-7 (in ( a </ Strong>)) e Scenedesmus (SCE) (in ( b )), mentre i punti dati rossi rappresentano il campione umano PBMC (in (a)) e Chlamydomonas (CHA) (in (b)). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ci sono diversi dettagli tecnici che richiedono un'attenzione particolare durante l'installazione del sistema ATOM. In primo luogo è indispensabile notare che l'illuminazione spettrale codificata asimmetrica / obliqua potrebbe introdurre componenti di gradienti residui di fase ( ossia l'effetto di ombra) nel contrasto di assorbimento e influenzare il miglioramento del contrasto gradiente di fase in ATOM. Pertanto, questo effetto dell'illuminazione obliqua dovrebbe essere ridotto al minimo. In secondo luogo, va sottolineato che il sistema di multiplexing temporale o di interlazione temporale che comporta due repliche non comporta alcun compromesso significativo sulla velocità di imaging ( cioè può essere mantenuta la velocità di scansione di linea di> MHz), dato che la larghezza temporale totale Di due repliche di raggio non supera un periodo di scansione di linea. In terzo luogo, la configurazione ottimale del modulo integrato di fibre dispersive e di amplificatori dipende dal guadagno mirato come specifica degli amplificatori disponibili. L'amplificazione ottica è essentiaL al processo di allungamento del tempo per combattere la perdita ottica associata a GVD 22 . In linea di principio, può essere implementato da qualsiasi tipo di amplificatore ottico, preferibilmente nel formato in fibra, in modo tale che sia compatibile con il processo di allungamento temporale a fibra ( Figura 1b ). Esempi pratici di amplificatori ottici a fibre ottiche comprendono amplificatori a fibre ottiche a fibre ottiche (EDFA, per lunghezze d'onda operative di ~ 1.500-1.600 nm), amplificatori a fibre ottiche doppiate a base di ytterbium (YDFA, per lunghezze d'onda di funzionamento ~ 1.060 nm), amplificatori di fibra Raman, E amplificatori parametrici ottici in fibra ottica (FOPA; per ogni lunghezza d'onda di funzionamento, in linea di principio, fintanto che è disponibile una sorgente laser a pompa). Anche il rumore dell'amplificatore deve essere considerato attentamente nel disegno del modulo. La teoria dettagliata si può vedere nel Riferimento 8. Una configurazione comune potrebbe includere più amplificatori di fibre in cascata inseriti tra più segmenti di fibra dispersiva (ognuno ha una lunghezza di pochi chilometri). Per ATOM aNd in generale, il tipico guadagno ottico on-off dovrebbe essere di circa 20-30 dB. Va notato che l'intervallo di lunghezze d'onda di funzionamento è tipicamente limitato a ~ 800-1.550 nm, principalmente a causa della perdita di fibre ottiche estremamente elevate a lunghezze d'onda più brevi ( cioè lunghezze d'onda visibili). Pertanto, allo stesso modo della maggior parte delle dimostrazioni di imaging a tempo stretch, l'ATOM a fibre non sarà immediatamente applicabile all'immagine a fluorescenza dove le operazioni di luce visibile sono ancora in comune. Tuttavia, si noti che un concetto di stretching a tempo libero simile a quello del tempo, detto ritardo angolare-chirp-enhanced free space (FACED), è stato recentemente utilizzato per la scansione ultra-scansiva laser in ATOM, nonché per l'imaging di fluorescenza A lunghezze d'onda visibili 30 .
Un altro parametro importante che richiede una considerazione sottile di progettazione è la risoluzione dell'immagine. A differenza della microscopia leggera classica, l'immagineLa risoluzione di ATOM e l'imaging generale lungo l'asse della doccia spettrale è regolata da tre regimi di limitazione 22 : (i) la risoluzione spaziale-dispersione limitata, che è correlata alla risoluzione spettrale della griglia di diffrazione, denotata come δ x spaziale ; (Ii) il limite di approssimazione in fase stazionaria, definito come l'ambiguità del processo di mappatura della lunghezza d'onda δ x SPA , che inversamente scala con la radice quadrata di GVD 22 ; E (iii) la risoluzione limitata di fotorivelatore δ x det , che descrive la larghezza di banda finita del fotorivelatore che potrebbe anche influenzare la risoluzione spaziale finale. In generale, il valore più grande tra questi tre parametri è definito come la risoluzione dell'immagine di ATOM, δx ( cioè δx = max { δ x spaziale , δ
Mentre la dimostrazione e il protocollo ATOM attuali dimostrano che l'acquisizione dei dati avviene tramite oscilloscopio e l'elaborazione dei dati viene seguita in modalità non in linea, è più favorevole ottenere in tempo reale, l'acquisizione continua dei dati, l'elaborazione e anche l'analisi, in particolare sfruttando la capacità di raggiungere Le capacità di acquisizione delle immagini ultraveloci e ad alto contrasto portate da ATOM. A tal fine, si dovrebbe adottare un'unità di elaborazione del segnale ad alte prestazioni e ad alta velocità, ad esempio un'unità di elaborazione grafica (GPU) e / o un array di gate programmabili in campo (FPGA), che hanno dimostrato di avere la capacità di Ottenere un throughput di elaborazione dati fino a ~ 1-10 GB / s. Questo è compatibile con la capacità di campionamento ultra veloce di ATOM ( cioè ~ 10 GSa / s). L'integrazione di ATOM e un'elaborazione di dati ad alta velocità aIl ccelerator consente un nuovo paradigma negli studi biologici basati su dati, specialmente nell'individuare l'eterogeneità sconosciuta tra diverse singole cellule all'interno di un'enorme popolazione. Tale tecnologia potrebbe anche potenziare una nuova generazione di ricerche cliniche in cui rara, aberrante cellule durante il processo di malattia possono essere quantificate in modo etichettato.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo P. P. Yeung per aver preparato l'MCF-7 per noi. Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da sovvenzioni del Consiglio di Grant per la Ricerca della Regione Amministrazione Speciale di Hong Kong, Cina (progetto n. 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 e HKU 720112E), il Programma di sostegno all'innovazione e alla tecnologia (ITS / 090/14 ) E il Fondo di Sviluppo Universitario di HKU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Plan Fluorite Physiology Objectives 40X | Nikon | MRF07420 | Objective lens (Obj2) |
| Olympus Plan Fluorite Objective, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40X | Olympus | RMS40X-PF | Objective lens (Obj1) |
| N-BK7 Plano-Convex Lenses | Thorlabs | LA1145-C | For relaying spectral shower |
| FC/APC Fiber Collimation Package | Thorlabs | F220APC-1064 | For outputing and collecting laser pulses |
| Pellicle beamsplitter | Thorlabs | BP145B3 | For making beam replica |
| Protected silver mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | For reflecting light |
| 800-1650nm 12GHz single mode DC-coupled NIR Photoreceiver | Newport | 1544-B | For converting light into electrical signal |
| Infiniium High-Performance Oscilloscope | Agilent | DSOX91604A | To save the light-converted electrical signals |
| HI1060 optical fiber | Corning | HI1060 | Optical fiber for time-stretch |
| YTTERBIUM DOPED FIBER AMPLIFIER | Keopsys | KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA | Optical in-line amplifier |
| Holographic grating | Wasatch Photonics | 020305-6 | Grating |
| Infuse/Withdraw Syringe Pumps | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Syringe pump for sample loading in micro-fluidic channels |
References
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