Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Mikrofluidisk Imaging Flödescytometri genom Asymmetrisk Detektering Tidssträckning Optisk Mikroskopi (ATOM)

Published: June 28, 2017 doi: 10.3791/55840
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Hong Kong, 2Department of Mechanical Engineering, The University of Hong Kong

Summary

Detta protokoll beskriver genomförandet av ett asymmetriskt detekterings-tidsträckningsoptiskt mikroskopysystem för enkelcellsavbildning i ultrasnabbt mikrofluidiskt flöde och dess tillämpningar i bildningsflödescytometri.

Abstract

Att skala antalet mätbara parametrar, vilket möjliggör multidimensionell dataanalys och därmed högre statistikresultat, har varit den främsta trenden i den avancerade utvecklingen av flödescytometri. Att lägga till högupplösta avbildningskapacitet möjliggör särskilt den komplexa morfologiska analysen av cellulära / subcellulära strukturer. Detta är inte möjligt med standardflödescytometrar. Det är dock värdefullt för att främja vår kunskap om cellulära funktioner och kan gynna biovetenskaplig forskning, klinisk diagnostik och miljöövervakning. Att integrera bildbehandlingskapacitet i flödescytometri komprometterar analysens genomströmning, främst på grund av begränsningarna av hastighet och känslighet i kameratekniken. För att övervinna denna hastighet eller genomströmningsutmaning mot bildbehandlingsflödescytometri, samtidigt som bildkvaliteten bevaras, har asymmetrisk detektering tidsoptisk optisk mikroskopi (ATOM) visats för att möjliggöra en kontrast med enstaka cellerIngående med subcellulär upplösning vid en avbildningströmsnivå så hög som 100 000 celler / s. Baserat på bildkonceptet för konventionell tidsträckningsavbildning, som bygger på all-optisk bildkodning och -hämtning genom användning av ultrasnabba bredbandspulser, förbättrar ATOM vidare bildhantering genom att förbättra bildkontrasten hos omärkta / obestämda celler. Detta uppnås genom att få tillgång till fas-gradientinformationen hos cellerna, som är spektralkodad till single-shot bredbandspulser. Därför är ATOM särskilt fördelaktigt vid mätningar med hög genomströmning av encells morfologi och struktur - information som indikerar celltyper, tillstånd och jämna funktioner. I slutändan kan detta bli en kraftfull bildningsflödescytometriplattform för biofysisk fenotypning av celler, som kompletterar den nuvarande toppmoderna biokemiska markörbaserade cellulära analysen. I det här arbetet beskrivs ett protokoll för att fastställa nyckelmodulerna i ett ATOM-system (från optisk frontänd till data pRocessing och visualiseringsbackend), liksom arbetsflödet av bildningsflödescytometri baserat på ATOM, med användning av humana celler och mikroalger som exemplen.

Introduction

Optisk bildbehandling presenterar ett kraftfullt verktyg och en cellbaserad analys för att (nästan) icke-invasivt visualisera den detaljerade rumsliga fördelningen av många cellulära / subcellulära komponenter, vilket avslöjar en mängd morfologiska, biofysiska och biomolekylära signaturer av celler. Denna förmåga att extrahera höghaltig information från enskilda celler har emellertid generellt äventyras när en enorm och heterogen population av celler skulle undersökas. Detta markerar en gemensam avvägning i cellbaserade analyser mellan mätningens genomströmning och innehåll. Ett anmärkningsvärt exempel är att tillsats av bildningsförmåga för att flyta cytometri har resulterat i en nedskalning av genomströmning med minst 1-2 storleksordningar jämfört med den för de klassiska icke-bildande flödescytometrarna. Även om det kunde erbjuda komplex morfologisk enkelcellsanalys som inte är möjlig med standardflödescytometrar 1 saknar bildbildningsflödescytometrin i allmänhet tillräcklig genomströmning till idFöranleder cellulär heterogenitet med högt statistiskt förtroende. Detta är nödvändigt för nya upptäckter i biologi och för att få en förståelse för patogenesen av sjukdomar. Den viktigaste tekniska utmaningen ligger i den inneboende hastighetsbegränsning som införs av de gemensamma optiska bildstrategierna: laserstråleskanning ( t.ex. av galvanometriska speglar) och / eller bildsensorer ( t.ex. laddkopplad enhet (CCD) och komplementära metall- Oxidhalvledare (CMOS)). Laserscanningshastigheten begränsas i grunden av skanningsspeglarnas mekaniska inerti, medan ramhastigheten för CCD eller CMOS är begränsad av den grundläggande avvägningen mellan bildhastighet och känslighet ( dvs ökar ramhastighetsledarna till minskad signaldetekteringskänslighet , och vice versa).

Baserat på en all-optisk, ultrasnabb bildkodningsmekanism har optisk tidsträckningsavbildning visat sig som en attraktiv plattform för hög genomströmningsbildningsflödescytOmeters, utan behov av konventionella bildsensorer eller mekanisk laserskanning 2 , 3 . Detaljerade beskrivningar av arbetsprincipen för tidsträckningsavbildning finns i referenser 4 , 5 , 6 , 7 . Kortfattat består den av två utbytbara mappningssteg: (i) spektralkodning (våglängdsutrymme-kartläggning), där rums-koordinaterna för det avbildade provet kartläggs till olika våglängder över spektralen hos den ljuspulserade strålen 8 , 9 , Och (ii) en dispersiv Fourier-transformation (våglängdstidskartläggning) 9 , i vilken våglängdskomponenterna hos individuella laserpulser transformeras (sträckas) via grupphastighetsdispersion (GVD) i temporära vågformade vågformar ( Figur 1 ). En viktigFunktionen av tidsträckningsavbildning är optisk förstärkning som spelar en viktig roll för att bekämpa förlusten av känslighet på grund av ultrasnabb fotodetektion och GVD-förlust, vilket förbättrar bildens signal-brusförhållande (SNR) utan att vara förorenad av fotodetektorens brus 9 . Eftersom varje laserpuls kodar för en linjeskanning av det avbildade provet, vilket är ortogonalt för det enriktade flödet av cellerna, bestäms en effektiv linjeskanningshastighet av laserrepetitionshastigheten, vilken typiskt är bortom 10 MHz. Denna ultrasnabba operation möjliggör oskarp bildtagning av enstaka celler med en genomströmning av 10 000-100 000 celler / s ( dvs 10-100 gånger högre än konventionell bildbehandlingsflödescytometri). Som ett resultat kunde tidsträckningsavbildning hitta unika tillämpningar i hög genomströmning, encells, bildbaserad screening, särskilt när det är nödvändigt att identifiera okänd heterogenitet eller sällsynta / avvikande celler inom en stor population (tusentals miljoner cel Ls), såsom sällsynt cancercellscreening 10 eller mikroalgerklassificering 11 .

Tidsträckningsavbildning beror främst på bildfångning med ljusfält (BF), från vilken bildkontrast genereras genom ljusspridning och absorption från cellerna 2 , 3 , 9 , 10 , 11 . Sådana etikettfria, encellsavbildande förmågor kan kringgå de skadliga effekterna associerade med fluorescerande etiketter, såsom cytotoxicitet och fotobildning, och ändå tillhandahålla värdefull information för enkelcellsanalys baserad på cellulär och subcellulär struktur och morfologi. Dessa etikettfria parametrar har visat sig vara effektiva för djupbildsklassificering av celler, speciellt när en enorm cellpopulation är tillgänglig 11 ,"Xref"> 12. Men vid många tillfällen misslyckas BF-bildbehandling med tillräcklig kontrast för att avslöja den detaljerade morfologin hos de etikettfria transparenta cellerna. Olika etikettfria, faskontrast-, tidssträckta bildhanteringsmodaliteter har utvecklats för att förbättra bildkonstanten vid ultrasnabb ramhastighet 13 , 14 , 15 . Bland dessa tekniker utvecklades asymmetrisk detekterings-tidsträckningsoptisk mikroskopi (ATOM) för att avslöja fas-gradienten (differential-interferens-kontrast- (DIC) -liknande) kontrast baserad på ett koncept som liknar Schlieren-fotografering, vilket möjliggör etikett- Fri, hög kontrast avbildning av enskilda celler vid en ultrahög mikrofluidisk hastighet (upp till 10 m / s) 16 . Denna effekt kan lätt genereras genom sned detektion eller belysning genom att delvis blockera den bildkodade strålbanan eller luta strålen före fotodetektion. En annan fördel med ATOM är dess aFörmåga att samtidigt förvärva två fas-gradientkontraster längs motsatta orienteringar. Intensitetssubtraktion och summering av två motsatta kontrastbilder ger differensfas-gradientkontrast respektive absorptionskontrast från samma linjescanning. Detta arbete presenterar ett detaljerat protokoll som beskriver implementeringen av ATOM, inklusive upprättandet av den optiska installationen, provberedningen och datainsamling och visualisering. Specifikt demonstrerar detta arbete ATOM-operationen med encellsavbildning av humana blodceller, cancerceller och fytoplankton (mikroalger). Detta belyser ATOMs tillämplighet på bildbehandling av flödescytometri, inte bara inom den biomedicinska arenan utan även i marin och biobränsleforskning 17 , 18 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Provberedning

  1. Provberedning (vidhäftande celler; MCF-7-celler)
    1. Ta ut cellodlingsskålen från inkubatorn och töm kulturmediet.
    2. Skölj cellerna på en maträtt med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna alltför stort odlingsmedium.
    3. Tillsätt 3 ml av en lösning av 0,25% trypsin till odlingsskålen (diameter 100 mm) och sätt i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 4 min.
      OBS: Trypsinet löser upp adhesivproteinet hos cellerna så att de kommer att lossna från odlingsskålen.
    4. Kontrollera om alla cellerna har lossnat från odlingsrätten med hjälp av ett ljusmikroskop (10X-objektiv). Om inte, skaka försiktigt cellodlingsskålen.
    5. Tillsätt 4 ml standard odlingsmedium (formulerat med 89% Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin (PS)) för att stoppa trypsins verkan.
    6. TAvleda hela blandningen (celler i trypsinlösning och odlingsmedium) till ett centrifugrör och centrifugera i 5 min vid 200 x g.
    7. Ta bort all vätska och suspendera cellerna i 1 ml 1x PBS (pH-värde: 7,4, förvärmt till 37 ° C).
  2. Provberedning (odlade mikroalger)
    1. Överför odlade mikroalger och odlingsmedium ( t.ex. havsvatten, agar eller färskvatten) till nya glasodlingsrör (~ 15 ml) i ett volymförhållande (mikroalger till odlingsmedium) på 1: 5 för att etablera Ett nytt subkulturmedium.
    2. Placera glaskulturrören i en dammsäker kammare under konstant belysning genom konstgjord belysning från lysrör enligt en ljus / mörk (LD) -cykel (vanligtvis LD 16: 8) under 72-120 h före experimentet.
    3. Överför de subkulturerade proven till ett centrifugrör och blanda väl.

2. ATOM System Setup


Figur 1: Schematisk av ett ATOM-system. En bredbandspulserad laser används för att leverera ultrafasta pulser till ( a ) en tidssträckningsmodul och ( b ) en in-line optisk förstärkarmodul. Tidsträckningsmodulen genererar ett tåg av temporära vågformer, vilka var och en är repliken av laserkällans våglängdsspektrum ( dvs. våglängd-till-tid-mappning). Förstärkarmodulen används för förlustkompensation för pulssträckning (dispersion). Den utsträckta pulsen är då ( c ) spatialt dispergerad av ett diffraktionsgitter som bildar en 1D spektral duschbelysning där individuella våglängdskomponenter reläeras av ett relälinspar och fokuseras av objektivlinsen på olika positioner på den flytande cellen inuti ( d ) Mikrofluidisk chip. Detta är processen för spektralkodning. DeSpektralkodat ljus kommer igen att passera cellen genom en annan objektivlins och en spegel, som återgår till diffraktionsgitteret och rekombineras som en rumsligt oispercerad pulserad stråle. Den här bildkodade pulserande strålen är då ( E ) delas i två vägar, så att båda strålarna är delvis blockerade med ( f ) knivkanten, men från motsatta håll, innan de kopplas i fibrerna. Dessa två strålar representerar de två (motsatta) kodade fas-gradientkontrasterna hos den slutliga bilden. För samtidig detektering av båda signalkontrastema genomgår en av signalerna ( g ) en tidsfördröjningslinje, så att de två signalerna multiplexeras (interfolieras) i tid. En höghastighetsfotodetektor och realtidsoscilloskop används för datainsamling. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Time st Retch-modulen
    1. Använder en bredband femtosekund (fs) eller picosekund (ps) pulserad laserkälla med en rekommenderad mittvåglängd i nära infraröd (NIR) intervall, 800-1,500 nm.
      OBS! Den typiska pulsbredden som krävs kan sträcka sig från sub-100 fs till några ps. Detaljerade krav för de pulserande laserkällorna framgår av Referens 4 och 5. Viktiga mätvärden framhävs i Tabell 1 .
      1. Se till att laserkällan har en hög repetitionshastighet, som borde vara i megahertzregimen (t ex MHz) för att säkerställa ultrasnabb bildbehandling i ATOM. Ställ också in den högsta utmatningslaserkraften långt under skadaffektens tröskelvärde för fiberkaviteten, ungefär 1 kW.
      2. Se till att den pulserande laserkällan har en bra skott-till-skott temporal och spektral stabilitet.
        OBS: Typisk tolerans i spektralamplitud fluktuationen bör hållas inom 1,2% 19 , 20 ,Ss = "xref"> 21, som uppnåtts av fiberlägeslåsad laser i denna inställning.
        OBS: Den optiska bandbredden för laserkällan förväntas vara 10-100 nm, vilket är nödvändigt för att garantera en tillräcklig bildsynsynsfält (FOV) i encellsimaging 21 .
    2. Genom en fiberkollimator kopplar du den laserpulserade strålen till en enstaka dispersiv optisk fiber, i vilken pulserna sträcker sig via grupphastighetsdispersion (GVD) ( Figur 1a ).
      ANMÄRKNING: Detta är processen efter vilken spektrumet för varje puls är kortlagt på tiden som en våglängdssvepad vågform ( dvs. våglängd-till-tid-mappning).
      OBSERVERA: Den totala nödvändiga GVD bör vara tillräcklig för att säkerställa att den totala ATOM-bildupplösningen inte påverkas av våglängd-till-tiden-kartläggningsprocessen (Se diskussionen). I NIR-intervallet bör typgodkännandet typiskt vara långt över 0,1 ns / nm. Till exempel används en enkelmodig fiber som används i dennaS nuvarande inställning ger en total GVD på 0,38 ns / nm runt våglängden på 1 060 nm (en total fiberlängd av 10 km).
  2. Spektralkodningsmodul
    1. Konstruera ett optiskt mikroskopsystem för att utföra den spektralkodade avbildningen av cellerna som strömmar längs den mikrofluidiska kanalen, såsom illustreras i figur 1 .
      OBS: Nyckelkomponenterna i detta optiska mikroskop omfattar: (1) ett diffraktionsgaller, en teleskopreläslinsmodul (RL1 och RL2 i figur 1 ) och två objektivlinser (Obj1 och Obj2 i Figur 1 ).
      1. Först belyser den tidssträckta och kollimerade strålen på ett diffraktionsgitter (överföringsgitter används i denna inställning) för att generera en spektraldusch ( figur 1c ).
        OBS: Effekten av den diffrakterade strålen ( dvs diffraktionseffektivitet) kan maximeras genom att justera tHan gitter orientering stängd för Littrow konfiguration.
      2. Konfigurera de två relälinserna (RL1 och RL2) i ett 4-f bildsystem ( dvs placera diffraktionsgitteret på brännplanet RL1 och separera RL1 och RL2 med ett avstånd som motsvarar summan av deras brännvidd. Kommer då att avbildas på objektivets Obj1 bakre fokusplan).
      3. Justera spektralduschen noggrant för att fylla Obj1, så att spektralduschen kan projiceras och fokuseras på mikroskopets bildplan.
        OBS: Här är NA av objektivlinsen (Obj1 i Figur 1 ) 0.75.
      4. Placera en annan objektivlins (Obj2 i Figur 1 ) med en liknande NA och en planspegel vid den bakre öppningen på denna objektivlins (Obj2), så att spektralbromsstrålen kan inriktas för att dubbla passera bildplanet och återgå till Diffraktionsgitter.
      5. JusteraParet av objektiv (Obj1 och Obj2) så att deras fokalplan överlappar varandra. Kontrollera om spektralduschen dubbelt passerar bildplanet på samma plats och återgår till gallret efter samma väg. Om inte, utför ytterligare justering och avstämning av det optiska systemet.
        OBS: Det återvände ljuset ska passera genom en ytterligare strålklyvare, så att ljuset kan överföras till en asymmetrisk detektionsmodul.
      6. Justera den optiska förstärkarförstärkningen på lämplig nivå, så att den resulterande signalen kan detekteras av fotodetektorn med en bra SNR, som vanligtvis är> 10 dB.
      7. Placera och justera mikrofluidiska chipets position på provplattformen och se till att spektralduschen, och därmed bildningsområdet, placeras över mikrofluidkanalen ( Figur 1d ).
        OBS: Den spektrala duschen är upplyst ortogonalt i flödesriktningen för fluidum inuti mMikrofluidiskt chip, så att den strömmande rörelsen automatiskt utför tvådimensionella (2D) skanningar.
  3. Asymmetrisk detektionsmodul
    1. Placera en ytterligare strålklyvare för att separera den bildade kodade strålen i två ( Figur 1e ).
      OBS: Varje strålkopia är delvis blockerad av en knivkant.
    2. Mäta och spela in strålens optiska effekt före strålblocket. Placera sedan manuellt knivkanterna (monterad på ett linjärt översättningssteg) så att de grovt blockerar halva strålen (genom visuell inspektion). Därefter använder du den optiska effektmätaren för att övervaka strålkraften medan du finjusterar positionen av knivkanterna genom att översätta dem över strålen.
      OBS! Det föreslås att den optimala positionen är där kraften minskas med ~ 50% av det ursprungliga värdet ( dvs det obegränsade fallet). Detta är villkoret som ger den bästa kombinationen av bildsignalStyrka och bildkontrastförbättring.
    3. Upprepa steg 2.3.2 för en annan strålkopia. Observera att orienteringen av det partiella strålblocket för en strål ska vara motsatt med avseende på den andra strålen ( Figur 1f ).
    4. Koppla ihop de två delvis blockerade strålarna i två separata, enkelmodiga fiberarmar genom tvåfiberkollimatorer.
      OBS! En av armarna har en extra fiberlängd som fungerar som en fiberbaserad fördröjningslinje för att införa en tidsfördröjning i förhållande till den andra repliken (utan fördröjningslinjen) ( Figur 1g ). Båda riktas till en enkel fiber av en fiberkopplare före fotodetektion. Tidsfördröjningen bör vara tillräckligt lång för att temporärt separera de två replikerna och tillräckligt kort för att undvika temporär överlappning med nästa vågform ( dvs. de två replikerna är alltid tidsinterfolierade och tidsmultiplexerade i en enda fiber före detektering ( figur 2a )).
    5. KepsTure och digitalisera de detekterade optiska signalerna med realtidsoscilloskopet. Observera att bandbredden och därmed samplingsfrekvensen för oscilloskopet ska vara tillräckligt hög för att säkerställa att de inte påverkar den slutliga bildupplösningen (Se diskussionen).
      OBS! Här krävs med en GVD på 0,38 ns / nm en uppkopplingsbandbredd och samplingshastighet på> 20 GHz respektive> 40 GSa / s.

3. Experimentella förfaranden

  1. Provbelastning
    1. Utför cellräkning under ett konventionellt faskontrastmikroskop i en standardhemocytometer.
    2. Justera celltätheten genom att späda med 1x PBS (med fjädervatten för mikroalger) och blanda väl med en pipett.
      OBS: Den föreslagna koncentrationen är från 10 5 till 10 6 celler / ml.
    3. Montera det mikrofluidiska chipet på provplattformen i det optiska bildsystemet.
      OBS: Den mikrofluidiskaChip tillverkas huvudsakligen av polydimetylsiloxan (PDMS) och tillverkas med användning av standard replikgjutningsmetoden. Den mikrofluidiska kanalen är utformad med en asymmetrisk krökt kanal för att generera inriktningsflödesfokuseringseffekten, så att cellerna kan strömma i enstaka fil i bildavsnittet (med en dimension av 80 μm x 80 μm (höjd x bredd)) med hög hastighet .
    4. Överför den täthetsjusterade celllösningen till en 10 ml spruta.
    5. Anslut sprutan till inloppet på det mikrofluidiska fliset och ett centrifugalrör till mikrofluid-chipets utlopp för bortskaffande.
    6. Montera sprutan på en sprutpump och ställ in en lämplig flödeshastighet för att ge önskvärd genomströmning och för att undvika att påföra överdriven skjutkraft mellan cellerna och kanalen.
      OBS: Proverna bör ha en linjär hastighet inom 0,5 och 10 m / s. Observera att före den faktiska bildinspelningen är det ofta nödvändigt att ytterligare finjustera systemet, när det gäller att maximeraBildsignalstyrka och optimera bildfokusering genom att upprepa steg 2.2.1.4-2.2.1.6.

4. Uppgiftsinsamling

  1. Ange ett lämpligt antal datapunkter som ska sparas för varje experiment. Antalet datapunkter som ska sparas beror på provernas storlek och flödeshastighet.
    OBS: Typiskt är den inställd på 8-16 miljoner provpunkter under en samplingshastighet på 80 GSa / s.
  2. Skaffa och spara data i ett batchläge med oscilloskopet.

5. Backend Processing

Figur 2
Figur 2: Rekonstruktion av ATOM-bilder från Line Scan-spårningen. För att rekonstruera ATOM-bilderna med absorptionskontrast och differential (förstärkt) fas-gradientkontrast extraheras två uppsättningar tidsträckta pulser (se lila och gröna pulser) från( A ) det tidsmultiplexerade temporära vågformspåret och segmenteras därefter digitalt och staplas för att bilda ( b ) två 2D-bilder som visar de två motsatta fas-gradientkontrasterna. Observera att en skjuvningsoperation är nödvändig för att bilda ( c ) de distorsionsfria bilderna genom att kompensera för delindexskiftet på grund av avrundningsfelet vid upprepning av laserrepetitionshastigheten. Genom att subtrahera ( d ) rålinjescanningen från laserkällans spektralintensitetskuvert kan bakgrunden på bilderna avlägsnas. ( G ) En absorptionskontrastbild kan erhållas genom en pixel-vid-pixelintensitetssummation av bilderna ( e ) och ( f ), medan ( h ) en differentialfas-gradientkontrastbild kan erhållas från subtraktion av bilder ) Och (f). Vänligen klicka här för att se en större versionAv denna siffra.

  1. Överför data från oscilloskopet till datorerna för offline image reconstruction.
    OBS: Här lagras data i en bärbar hårddisk och överförs manuellt mellan oscilloskopet och processorns datorer. Kapaciteten på hårddisken ska vara mer än 500 GB för varje experiment.
    1. Använd nyckelåtervinningsrutinen för att digitalt stapla linjeskanningarna för att bilda en 2D-bild ( Figur 2 ).
      OBS! Det anpassade programmet (i MATLAB) producerar sedan två asymmetriska detekteringsbilder genom att separera de två tidsmultiplexerade dataseten (lila och gröna vågformer i Figur 2 ).
      1. Hämta en kontrastbild för differentialfas-gradient genom att subtrahera intensiteten hos de två asymmetriska detektionsbilderna. En absorptionskontrastbild kan erhållas genom att lägga till de två asymmetriska detektionsbilderna. Se valda bilder av MCF-7 och mikroalger iFigur 3 . Observera att bakgrundsprofilerna för enskilda bilder först ska elimineras, och deras intensiteter bör normaliseras före bildsummen och subtraktion.
    2. Generera ett bibliotek med parametrar som härrör från bilderna, såsom cellvolym, cirkuläritet och absorptionsdensitet etc. för vidare analys.
  2. Inmat databiblioteket i dataupplikationsplattformen ( Figur 4 ).
    1. Ladda biblioteket med parametrar och motsvarande rekonstruerade bilder till visualiseringsgränssnittplattformen.
    2. Ange axlarna som parametrar av intresse.
      OBS: Parametrarna är problemspecifika och definieras av användaren. De är härledda från ATOM-bilderna genom MATLAB-programmet. Här är den optiska absorptionsdensiteten hos cellen, cellområdet, cellvolymen och cellcirkulariteten tillgänglig för selektion. Välj dataset som ska visas så att varje cellbild kan visualiseras som en annan datapunkt på scatterplotten.
    3. Flytta muspekaren till varje punkt, så att motsvarande bild och andra parametrar visas i ett flytande delfönster.
      OBS: Axlarna kan ändras mellan de linjära och logaritmiska skalorna på ett interaktivt sätt.
    4. Utför ytterligare analys av någon delmängd av datamängden genom att manuellt gata på scatterplot.
      OBS: Histogrammet i varje parameter i den gateda delmängden kan plottas mot hela bibliotekets. De separata histogrammen visas i ett annat flytande delfönster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta arbete illustrerar två demonstrationer med encells bildbehandling av ATOM: en med däggdjursceller (humant perifer blodmononukleär cell s (PBMC) och bröstcancerceller (MCF-7)) och en annan med fytoplankton s (Scenedesmus och Chlamydomonas). Det första experimentet motiverades av det växande intresset för flytande biopsi för detektering, uppräkning och karakterisering av cirkulerande tumörceller (CTC) i blodet 23 . Förmågan att mäta CTC som sprids från primära tumörställen till blodflödet möjliggör undersökning av metastatisk cancerprogression 24 , 25 . Emellertid finns utmaningar vid CTC-analys: (i) CTC-talet är signifikant lägre än den orimliga mängden blodceller i helblod. Nuvarande metoder för att identifiera och återvinna CTC: erna innefattar mestadels cellberiknings- och separationssteg Class = "xref"> 26 , 27 , 28 . Emellertid förblir den förorenande bakgrunden från blodceller och / eller livskraften hos de berikade CTC: erna en oro för efterföljande molekylär analys ( t.ex. RNA-sekvensering) 29 . (Ii) CTCs är mycket heterogena när det gäller både biofysiska och biomolekylära signaturer, vilket begränsar effektiviteten av CTC-anrikningen och detektering. För detta ändamål är etikettfri bildbehandlingsflödescytometri med en hög bildkälla genomströmning ett attraktivt verktyg som möjliggör direkt avbildning och identifiering av CTC i en enorm population av blodceller, vilket minimerar eller till och med övergår till anrikningsstegen.

Det andra experimentet är särskilt relevant för storskalig fytoplanktonkarakterisering, vilket kan påverka framsteg inom miljövetenskaper ( t.ex. upptäckt av skadliga algblom (HAB) arterS = "xref"> 29 och identifieringen av mikroalgiska arter som förnybara biodieselkällor) 17 . Med hjälp av ATOM aktiveras förmågan hos hög genomströmning och högkontrast med en enda cellbildning av fytoplankton att vara värdefull för att avslöja den komplexa heterogeniteten i storlek, struktur och morfologi över olika släkt och art.

Figur 3 visar bilder av däggdjursceller, MCF-7 och PBMC (strömmar med en hastighet av ~ 10 m / s), liksom mikroalger, Scenedesmus och Chlamydomonas (strömmar med en hastighet av ~ 2 m / s), fångad av ATOM . I alla fyra fallen erhölls de två motsatta fas-gradientkontrasterna genom de två tidsmultiplexerade, asymmetriskt detekterade signalerna (beskrivna i steg 2.3). De uppvisar båda ett pseudo-tredimensionellt utseende, som liknar DIC-bilderna, vilka var och en visar två motsatta skuggningsorienteringar (kolumnerna 1 och 2 i figur 3a dvs. de absorberande enda och förbättrade differentialfas-gradientkontrasterna, kolumnerna 3 och 4 i figur 3a -d ). Observera att det inte bara kan etikettfri ATOM avslöja de suddiga encelliga bilderna utan också karakterisera cellulära strukturer med hög kontrast. I synnerhet kan vakuoler, pyrenoid och flagella i mikroalgerna tydligt visualiseras i figur 3 . Detta avbildningsattribut gör det möjligt att extrahera en rik uppsättning av identifierare härledda från de inneboende cellulära och subcellulära texturerna / morfologierna för automatisk bildbaserad klassificering.

Detta arbete visar att biofysiska egenskaper, såsom cellcirkularitet och cellstorlek, kan användas fo R klassificeringen av MCF-7 och PBMC. Observera att två kluster observeras i MCF-7-provet. Tillgängligheten med högkontrastbilder för alla datapunkter gör att vi kan granska att en av klustren motsvarar fragment / skräp ( Figur 4a ). En liknande klassificering mellan två arter av fytoplankton baserat på ATOM-bilder utfördes också. Här presenteras klassificeringsresultaten i en form av ett 2D-scatterplot som visualiseras av det anpassade användargränssnittet ( Figur 4 ). Varje annoterad datapunkt i scatterplot, som motsvarar varje cell, kan undersökas ytterligare med olika parametrar härledda från ATOM. Den motsvarande ATOM-bilden kan också interaktivt visas direkt på diagrammet. Manuell gating stöds också i detta visualiseringsgränssnitt för att underlätta ytterligare klassificering och analys.

Iles / ftp_upload / 55840 / 55840fig3.jpg "/>
Figur 3: ATOM Image Galley av mikroalger och däggdjursceller vid en ultrahurtig flythastighet (~ 2-10 m / s). (A) Scenedesmus; ( B ) klamydomonas; ( C ) bröstcancerceller, MCF-7; Och ( d ) humant PBMC. Scenedesmus och Chlamydomonas strömmar vid ~ 2 m / s, medan MCF-7 och PBMC strömmar vid 10 m / s. De vänstra två kolumnerna (kolumnerna 1 och 2) för varje celltyp representerar två motsatta fas-gradientkontraster. Kolumnerna 3 och 4 representerar absorptionskontrast respektive differential (förstärkt) fas-gradientkontrast. Skalstänger = 20 μm (i rött). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4
FiGure 4: En grafisk användargränssnitt för cytometrisk analys baserad på ATOM-bilder. I detta gränssnitt kan användaren utföra celltypklassificering och analys genom att definiera olika cellparametrar ( t.ex. cellstorlek, cirkuläritet, absorptionsdensitet etc. ) som härrör från ATOM-bilderna. Resultatet kan representeras i en scatterplot som visas i mittpanelen. Åtkomst och kontroll av olika visningsalternativ, som inkluderar byte av parametrar och skalning för x- och y-axeln (X- och Y-axelparameterns knappar) och växling mellan datasatser (datasetknapp), är möjlig. Detaljerad cellinformation (fliken Cellinformation) kan läsas genom att sväva på en viss datapunkt. För att möjliggöra snabb navigering kan användaren byta till ett annat visningsläge och samtidigt visa alla bilder på scatterplot i mittpanelen (visningsläge). Manuell gating kan också utföras för vidare analys. Gula datapunkter representerar MCF-7-cellprovet (i ( a </ B )), medan de röda datapunkterna representerar det humana PBMC-provet (i (a)) och Chlamydomonas (CHA) (i (b)). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det finns flera tekniska detaljer som kräver särskild uppmärksamhet vid installationen av ATOM-systemet. För det första är det viktigt att notera att asymmetrisk / skrå spektralkodad belysning kan införa restfasgradientkomponenter ( dvs skuggningseffekten) i absorptionskontrasten och påverka ökningen av fas-gradientkontrast i ATOM. Därför bör denna effekt av sned belysning minimeras. För det andra bör det betonas att tidsmultiplexerings- eller tidsinterleaving-ordningen med två replikor inte resulterar i någon signifikant kompromiss på bildhastigheten ( dvs linjeskanningsfrekvensen> MHz kan fortfarande bibehållas), med tanke på att den totala tidsmässiga bredden Av två stråle-replikor överstiger inte en linje-scanperiod. För det tredje beror den optimala konfigurationen av den integrerade modulen av dispersiv fiber och förstärkare på den riktade förstärkningen som specifikationen av tillgängliga förstärkare. Optisk förstärkning är essentiaJag till tiden för sträckning för att bekämpa den optiska förlusten i samband med GVD 22 . I princip kan den genomföras av vilken som helst typ av optisk förstärkare, företrädesvis i fiberformatet, så att den är kompatibel med den fiberbaserade, tidssträckande processen ( Figur 1b ). Praktiska exempel på optiska fiberbaserade optiska förstärkare innefattar erbiumdopade fiberförstärkare (EDFA, för operationsvåglängder av ~ 1500-1 600 nm), ytterbiumdopade fiberförstärkare (YDFA; för operationsvåglängder av ~ 1,060 nm), fiberramanförstärkare, Och fiberoptiska parametriska förstärkare (FOPA, för vilken operativ våglängd, i princip så länge som en pumplaserkälla är tillgänglig). Förstärkningsbullret måste också noggrant övervägas i moduldesignen. Detaljerade teorier kan ses i referens 8. En gemensam konfiguration kan innebära flera / kaskade fiberförstärkare införda mellan flera dispersiva fibersegment (var och en har en längd av några km). För ATOM aNd tidsträckningsavbildning i allmänhet, bör den typiska on-off optiska effektförstärkningen vara cirka 20-30 dB. Det bör noteras att operationsvåglängdsintervallet typiskt är begränsat till ~ 800-1,550 nm, huvudsakligen på grund av den överlägset höga optiska fiberförlusten vid kortare våglängder ( dvs. synliga våglängder). Därför är fiberbaserad ATOM på samma sätt som de flesta av tidsträckningsbildningsdemonstrationerna inte direkt tillämpliga på fluorescensavbildning där synliga ljusoperationer fortfarande är vanliga. Notera dock att ett fritt utrymme pulssträckande koncept som liknar tidsträckning, kallad fritt utrymme vinkelkirpförstärkt fördröjning (FACED), har nyligen använts för ultrasnabb laserskanning avbildning i ATOM, liksom för fluorescensavbildning Vid synliga våglängder 30 .

En annan viktig parameter som kräver subtil design är bildupplösningen. Till skillnad från klassisk ljusmikroskopi, bildenUpplösning av ATOM och generell tidsträckningsavbildning längs spektralbrusaxeln styrs av tre begränsningsregimer 22 : (i) den rumsliga dispersionsbegränsade upplösningen, som är relaterad till spektralupplösningen av diffraktionsgitteret betecknad som 5 x rumslig ; (Ii) den stationära fasen approximationsgränsen, vilken definieras som tvetydigheten hos våglängdskartläggningsprocessen 5 x SPA , som omvänd vågar med kvadratroten av GVD 22 ; Och (iii) den fotodetektorbegränsade upplösningen 5 x det , som beskriver fotodetektorens ändliga bandbredd som också kan påverka den slutliga rymdupplösningen. I allmänhet definieras det största värdet bland dessa tre parametrar som bildupplösningen av ATOM, 5 x ( dvs 5 x = max { 5 x rumslig , 5 SPA , 5 x det }). Det är alltid önskvärt att säkerställa att den slutliga upplösningen är begränsad i rymd-dispersionen ( dvs δx = δ x rumslig > δ x SPA > δ x det ). Därför måste både GVD (steg 2.2.1.1) och bandbredd (steg 2.3.5) hos fotodetektorn vara tillräckligt höga för att uppfylla detta tillstånd. Å andra sidan utvärderas bildupplösningen längs flödesriktningen av diffraktionsgränsen. Detta är bara sant när Nyquist provtagningsförhållanden är nöjda (det vill säga laserens repetitionshastighet (R, Hz) och flödeshastigheten för cellerna (F, i m / s) bör ställas så att pixelstorleken i Flödesriktningen är F / R < 2δ y, där 8 y är den diffraktionsbegränsade upplösningen längs flödesriktningen). Observera att gitterets specifikationer ( t.ex. </ Em> spårdensitet) och objektivlinsen ( t.ex. den numeriska bländaren (NA)) ska vara noggrant utformad för att matcha den riktade upplösningen.

Medan den nuvarande ATOM-demonstrationen och protokollet visar att datainsamlingen görs av oscilloskop och databehandlingen följs offline är det mer gynnsamt att uppnå realtid, kontinuerlig datainsamling, bearbetning och till och med analys, speciellt utnyttja förmågan att uppnå Den ultrasnabba och högkontrastavbildningsförmågan som tas med av ATOM. För detta ändamål bör en signalbehandlingsenhet med hög prestanda och hög genomströmning antas, såsom en grafisk bearbetningsenhet (GPU) och / eller en fältprogrammerbar grindmatris (FPGA) som har visats ha förmågan att Uppnå en databehandling genomströmning så hög som ~ 1-10 GB / s. Detta är kompatibelt med ATOM: s ultrafina provtagningsförmåga ( dvs ~ 10 GSa / s). Integrationen av ATOM och en högkapacitets databehandling aCcelerator möjliggör ett nytt paradigm i datastyrda biologiska studier, särskilt vid upplösning av den okända heterogeniteten mellan olika enskilda celler i en enorm befolkning. Sådan teknik kan också ge en ny generation klinisk forskning, i vilken sällsynta, avvikande celler under sjukdomsprocessen kan kvantifieras på etikettfri sätt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar herr P. Yeung för att förbereda MCF-7 för oss. Detta arbete stöddes delvis av bidrag från forskningsrådet för Hongkongs särskilda förvaltningsregion, Kina (Projekt nr 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 och HKU 720112E), innovations- och tekniskt stödprogram (ITS / 090/14 ) Och HKU: s utvecklingsfond.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nikon Plan Fluorite Physiology Objectives 40X Nikon MRF07420 Objective lens (Obj2)
Olympus Plan Fluorite Objective, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40X Olympus RMS40X-PF Objective lens (Obj1)
N-BK7 Plano-Convex Lenses Thorlabs LA1145-C For relaying spectral shower
FC/APC Fiber Collimation Package Thorlabs F220APC-1064 For outputing and collecting laser pulses
Pellicle beamsplitter Thorlabs BP145B3 For making beam replica
Protected silver mirror Thorlabs PF10-03-P01 For reflecting light
800-1650nm 12GHz single mode DC-coupled NIR Photoreceiver Newport 1544-B For converting light into electrical signal
Infiniium High-Performance Oscilloscope Agilent DSOX91604A To save the light-converted electrical signals
HI1060 optical fiber Corning HI1060 Optical fiber for time-stretch
YTTERBIUM DOPED FIBER AMPLIFIER Keopsys KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA Optical in-line amplifier
Holographic grating Wasatch Photonics 020305-6 Grating
Infuse/Withdraw Syringe Pumps Harvard Apparatus PHD 2000 Syringe pump for sample loading in micro-fluidic channels

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lau, A. K. S., Wong, T. T. W., Shum, H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Imaging Flow Cytometry: Methods and Protocols. Barteneva, N. S., Vorobjev, I. A. , Springer New York. New York, NY. 23-45 (2016).
  2. Goda, K., Tsia, K. K., Jalali, B. Serial time-encoded amplified imaging for real-time observation of fast dynamic phenomena. Nature. 458 (7242), 1145-1149 (2009).
  3. Goda, K., Jalali, B. Dispersive Fourier transformation for fast continuous single-shot measurements. Nat Photon. 7 (2), 102-112 (2013).
  4. Lau, A. K., Shum, H. C., Wong, K. K., Tsia, K. K. Optofluidic time-stretch imaging - an emerging tool for high-throughput imaging flow cytometry. Lab Chip. 16 (10), 1743-1756 (2016).
  5. Lau, A. K. S., Tang, A. H. L., Xu, J., Wong, X. W., Y, K. K., Tsia, K. K. Optical Time Stretch for High-Speed and High-Throughput Imaging - From Single-Cell to Tissue-Wide Scales. IEEE J. Sel. Top. in Quant. Electron. 22 (4), (2016).
  6. Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Appl Phys Rev. 3 (1), 011102 (2016).
  7. Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Applied Physics Reviews. 3 (011102), (2016).
  8. Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
  9. Goda, K., Solli, D. R., Tsia, K. K., Jalali, B. Theory of amplified dispersive Fourier transformation. Physical Review A. 80 (4), 043821 (2009).
  10. Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
  11. Lai, Q. T. K., et al. High-throughput time-stretch imaging flow cytometry for multi-class classification of phytoplankton. Opt. Express. 24 (25), 28170-28184 (2016).
  12. Chen, C. L., et al. Deep Learning in Label-free Cell Classification. Sci Rep. 6, 21471 (2016).
  13. Fard, A. M., et al. Nomarski serial time-encoded amplified microscopy for high-speed contrast-enhanced imaging of transparent media. Biomed Opt Express. 2 (12), 3387-3392 (2011).
  14. Lau, A. K., et al. Interferometric time-stretch microscopy for ultrafast quantitative cellular and tissue imaging at 1 mum. J Biomed Opt. 19 (7), 76001 (2014).
  15. Mahjoubfar, A., Chen, C., Niazi, K. R., Rabizadeh, S., Jalali, B. Label-free high-throughput cell screening in flow. Biomed Opt Express. 4 (9), 1618-1625 (2013).
  16. Wong, T. T., et al. Asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) for ultrafast high-contrast cellular imaging in flow. Sci Rep. 4, 3656 (2014).
  17. Mata, T. M., Martins, A. A., Caetano, N. S. Microalgae for biodiesel production and other applications: A review. Renew Sustainable Energy Rev. 14 (1), 217-232 (2010).
  18. Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton. Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).
  19. Wei, X., et al. Coherent Laser Source for High Frame-Rate Optical Time-Stretch Microscopy at 1.0 µm. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (5), 384-389 (2014).
  20. Wei, X., et al. Breathing laser as an inertia-free swept source for high-quality ultrafast optical bioimaging. Opt. Lett. 39 (23), 6593-6596 (2014).
  21. Xu, Y., Wei, X., Ren, Z., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Ultrafast measurements of optical spectral coherence by single-shot time-stretch interferometry. Sci Rep. 6, 27937 (2016).
  22. Tsia, K. K., Goda, K., Capewell, D., Jalali, B. Performance of serial time-encoded amplified microscope. Opt. Express. 18 (10), 10016-10028 (2010).
  23. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nat Rev Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
  24. Kling, J. Beyond counting tumor cells. Nat Biotech. 30 (7), 578-580 (2012).
  25. Hodgkinson, C. L., et al. Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer. Nat Med. 20 (8), 897-903 (2014).
  26. Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Sci Transl Med. 5 (179), (2013).
  27. Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Scientific Reports. 3, 1259 (2013).
  28. Karabacak, N. M., et al. marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nat. Protocols. 9 (3), 694-710 (2014).
  29. Krebs, M. G., et al. Molecular analysis of circulating tumour cells-biology and biomarkers. Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 129-144 (2014).
  30. Wu, J., et al. Ultrafast Laser-Scanning Time-Stretch Imaging at Visible Wavelengths. Light Sci Appl. , (2016).

Tags

Engineering Mikroskopi bildningsflödescytometri mikrofluidisk tidsträckningsavbildning genomskärning med hög genomströmning enkelcellsanalys
Mikrofluidisk Imaging Flödescytometri genom Asymmetrisk Detektering Tidssträckning Optisk Mikroskopi (ATOM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, A. H. L., Lai, Q. T. K.,… More

Tang, A. H. L., Lai, Q. T. K., Chung, B. M. F., Lee, K. C. M., Mok, A. T. Y., Yip, G. K., Shum, A. H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM). J. Vis. Exp. (124), e55840, doi:10.3791/55840 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter