Summary
후각 감각 뉴런은 적절한 신경 회로를 만들기 위해 다양한 축삭 정렬 분자를 발현합니다. 이 프로토콜은 후각 감각 뉴런의 축삭 종말에 축삭 - 정렬 분자의 조합 표현을 시각화하기 위해 면역 조직 화학 염색법을 설명합니다.
Abstract
마우스 후각 시스템은 간단한 해부학 구조로 인해 신경 회로 형성 메커니즘을 연구하는 데 자주 사용됩니다. 후각 감각 뉴런 (OSN)은 단일 수상 돌기 및 단일 비 축삭 축색 돌기가있는 양극성 세포입니다. OSN은 하나의 후각 수용체 (OR) 유전자 만 발현하며, 주어진 유형의 OR을 표현하는 OSN은 그들의 축색 돌기를 후각 망막 (OB)의 불변성 사구체에 수렴시킵니다. OSN 예측의 두드러진 특징은 표현 된 OR이 축삭 투영에서 중요한 역할을한다는 점입니다. OR는 다중 axon-sorting 분자의 발현을 조절하고 OSN 축삭 말단에서 axon-sorting 분자의 조합 분자 코드를 생성한다. 따라서, OR- 특정 axon 유도 메커니즘의 분자 메커니즘을 이해하기 위해서는 동일한 사구체 내의 OSN 축삭 말단에서 그들의 발현 프로파일을 특성화하는 것이 중요합니다. 이 기사의 목적은 가능한 많은 사구체를 수집하는 방법을 소개하는 것이 었습니다e를 단일 OB 부위에 투여하고 다중 항체를 사용하여 면역 염색을 수행한다. 이것은 OB 절 사이의 얼룩 변이없이 축색 - 정렬 분자의 발현 양상을 비교 분석 할 수있게한다.
Introduction
개발하는 동안, 뉴런은 서로 정확하게 연결되어 정상적인 뇌 기능에 중요한 적절한 신경 회로를 형성합니다. 뇌의 비정상적인 신경 회로는 자폐증 및 정신 분열증과 같은 정신 장애의 원인으로 여겨지므로 신경 회로 형성 메커니즘을 이해하는 것이 신경 과학 분야의 주요 과제 중 하나입니다.
마우스 후각 시스템에서 Olfactory Epithelium (OE)의 각 감각 신경 세포 (OSN)는 오직 하나의 기능적 후각 수용체 (OR) 유전자를 발현하고 동일한 OR을 발현하는 OSNs는 축색 돌기의 고정 된 위치에서 사구체의 특정 쌍에 축삭을 수렴시킵니다. 후각 망막 (OB) 1 , 2 . 마우스 후각 시스템은 신경 회로 형성의 분자 메커니즘을 연구하기위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 연구자는 OR 표현을 활용하여 특정 s를 식별 할 수 있기 때문에OSNs의 ubtype과 명확한 사구체 구조로 OSN axons의 투영 사이트를 시각화. OSN 예측의 주목할만한 특징은 OR이 OSN 축색 돌기를 OB 3 , 4 , 5 , 6 에 투사 할 때 중요한 역할을한다는 점입니다. 보다 구체적으로, OSN 축삭 돌기가 표적 부위를 대략적으로 안내 한 후에, 이들은 분리되어 OR 의존성 방식으로 사구체를 형성한다. 이전의 연구는 OR 분자가 사구체 분리를 조절하는 축삭 정렬 분자의 발현을 조절한다는 것을 보여 주었다. 더욱이 축적 된 증거에 따르면 OR 분자는 축삭 정렬 분자의 독특한 조합에 의해 신경 신원 코드를 생성한다. 따라서, OR 의존성 사구체 분리의 메커니즘을 이해하기 위해서는 axon-sorting mol의 발현 프로파일을 특성화 할 필요가있다OSNs의 ecules.
형광 면역 염색은 특정 유전자의 발현을 시각화하는 일반적인 방법입니다. axon-sorting 분자의 단백질은 주로 OSN 축삭에 국한되어 있기 때문에 연구자들은 OBN을 이용하여 OSN에서의 발현 양상을 분석 할 필요가있다. OB의 관상 절편은 면역 염색에 일상적으로 사용되었습니다. 그러나,이 준비는 같은 OB 섹션에서 전후 축을 따라 지형 정보를 잃습니다. 따라서 우리는 OB의 내측의 parasagittal 준비를 개발했다. 이것은 같은 OB 구역에서 가능한 한 많은 주변 사구를 장착 할 수있다. 여러 항체를 이용한 면역 염색과 결합하여, OB 절 사이의 염색 변이없이 축삭 정렬 분자의 발현 양상을 비교 분석 할 수 있습니다.
또한, 면역 조직 화학 염색 방법은 PFA a와 함께 고정 후 (post-fixation)없이 제시되었다자당 치료. 이 방법을 통해 연구자는 다 변수 데이터 분석을위한 고품질의 염색 데이터를 얻을 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 후각 신경 회로 형성을 연구하는 연구자에게 강력한 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다.
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Protocol
모든 실험 절차는 도쿄 대학의 동물 실험 윤리위원회의 승인과 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 도쿄 대학의 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 솔루션 준비
- 0.01 M 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비합니다 : PBS 정제 (0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.010 M PO 4 3- , pH 7.4)를 증류수 1 L에 넣고 완전히 용해 될 때까지 실온에서 저어줍니다.
- PBS에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 준비합니다 : 100 ML PBS에 4g의 PFA를 추가합니다. 그것이 완전히 녹을 때까지 60 ° C에서 용액을 저어 준다.
- PBS에 PFA를 용해시킨 후, 1N 수산화 나트륨 (NaOH)으로 용액의 pH를 7.4로 조절한다. 그런 다음 얼음으로 식힌 다음 여과지를 통해 용액을 여과하여 미립자 물질을 제거합니다. 4 ° C에서 보관하십시오.
주의 :이 시약을 사용할 때는 적절한주의를 기울이십시오. 핸들장갑, 안전 안경 및 화학 물질 두건 아래 실험실 코트를 조심스럽게 사용하십시오.
참고 : 2 일 이내에 준비된 신선한 4 % PFA 용액을 사용하십시오.
- PBS에 PFA를 용해시킨 후, 1N 수산화 나트륨 (NaOH)으로 용액의 pH를 7.4로 조절한다. 그런 다음 얼음으로 식힌 다음 여과지를 통해 용액을 여과하여 미립자 물질을 제거합니다. 4 ° C에서 보관하십시오.
- 0.3 % Triton X - 100 (PBST)가 보충 된 0.01M PBS를 준비하십시오 : PBS의 997 ML에 트리톤 X - 100 3 ML을 추가합니다. 용액이 완전히 녹을 때까지 실온에서 교반하십시오.
- 1 % 및 5 % 블로킹 용액을 준비한다 : 탈지유 10g을 PBST 200mL에 넣고 5 % 블로킹 용액을 만든다. 그것이 완전히 녹을 때까지 실온에서 교반하십시오. PBST로 5 % 블로킹 용액을 5 번 희석하여 1 % 블로킹 용액을 제조한다.
2. Parasagittal OB 섹션의 준비
- 1 ~ 2 주령의 동물을 사용하십시오. 사구체가 명확하게 보이고 두개골로 뇌를 절단 할 수 있기 때문에이 연령대는 다음 실험에 적합합니다.
- pentobarbital (50 MG / kg 체중)의 intraperitoneal 주사로 동물을 마취. 얼음 냉 4 % P로 동물을 경련 주사한다.PBS의 FA. 조심해서 다루고 화학 물질 두건 아래에 장갑, 안전 고글 및 실험실 코트를 사용하십시오.
- 관류 후 가위로 머리를 잘라 피부를 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 가위 칼날을 위턱과 아래턱 사이의 공간에 삽입하고 수평으로 자르면서 아래턱을 제거합니다. OB 및 OE를 포함하여 후각 조직을 떠나려면 집게 및 가위로 과도한 조직을 정리하십시오.
참고 : OB를 둘러싸고있는 두개골을 제거하지 마십시오. 이것은 중간 사구체를 수직으로 똑바로 유지하기 때문에 OB를 둘러싼 두개골을 제거하지 마십시오. - 비강에있는 공기를 제거하기 위해 PBS에 후각 조직을 담그십시오. 뇌의 후부를 수직으로 잘라 내고 후각 조직을 삽입면의 아래쪽에 삽입하십시오. 몰드에 Optimal Cutting Temperature (OCT) 화합물을 채우고 액체 질소에 몰드를 담그십시오.
- 화합물에있는 조직이 완전히 얼린 후에, 그것을 cryos에서 품어 라.-20 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.
- 저온 유지 장치를 사용하여 OB의 직렬 parasagittal 섹션 (10 μm)을 만들고 MAS 코팅 유리 슬라이드에 부착하여 수집하십시오. 붙인 후 즉시 블로 드라이어로 슬라이드를 건조하십시오.
3. 1 일째 : OB 슬라이스의 4 배 Immunostaining
- RT에서 PBS로 5 분 슬라이드를 씻으십시오. 3 번 반복하십시오.
- 실온에서 5 % 차단 솔루션과 슬라이드를 1 시간 품어 비특이적 인 바인딩 사이트를 차단합니다.
- RT에서 1 % 차단 솔루션의 기본 항체 (각 슬라이드 400 μL)의 칵테일과 O / N 슬라이드를 품어. 기니피그 항 Kirrel2 항체 (1 : 1000), 염소 항 세마포린 -7A (Sema7A) 항체 (1 : 500), 래트 항 -OL- 프로토 커 들린 (OLPC) 항체 (1 : 500) 및 마우스 항 - 소 혈청 글루타메이트 트랜스 포터 2 (VGLUT2) 항체 (1 : 500).
4. 2 일째 : OB의 4 배 Immunostaining조각
- 일차 항체 용액을 버리고 RT에서 PBST로 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오. 3 번 반복하십시오.
- RT에서 PBS의 보조 항체 (각 슬라이드 400 μL)의 칵테일과 1 시간 슬라이드를 품어. 당나귀 항 마우스 Alexa Fluor 405 (1 : 400), 당나귀 방제 Alexa Fluor 488 (1 : 400), 당나귀 항 기니아 피그 Alexa Fluor 555 (1 : 400) 및 당나귀 항 - 쥐 Alexa Fluor 647 (1 : 400).
참고 : 모든 2 차 항체는 동일한 숙주에서 유래한다. 파장이 겹치지 않도록 각 1 차 항체에 대한 2 차 항체의 형광 파장을 선택하십시오. - 솔루션을 폐기하고 RT에서 PBS로 5 분 슬라이드를 씻으십시오. 3 번 반복하십시오.
- 마운트 매체로 슬라이드에 coverslips를 마운트합니다. 이를 위해, 각 슬라이드에 장착 매체 2 방울을 적용한 다음, 기포를 제거하여 coverslip을 넣어.
5. 강도 Me의구심
- 형광 현미경으로 형광 이미지를 얻습니다. Alexa Fluor 405 신호, GFP 필터 큐브 (470/40 nm 여기, 525/50 nm 방출, 500 nm 방출, 400 nm 다이크로 익 미러)에 대해 DAPI 필터 큐브 (360/40 nm 여기, 460/50 nm 방사 및 400 nm 다이크로 익 미러) 및 495 nm 다이크로 익 미러), Alexa Fluor 555 용 TRITC 필터 큐브 (545/25 nm 여기, 605/70 nm 방출 및 565 nm 다이크로 익 미러) 및 Cy5 필터 큐브 (620/60 nm 여기, 700 / 75 nm emission, 600 nm dichroic mirror)을 Alexa Fluor 647에 적용했습니다.
참고 : 채도가없는 이미지의 형광 신호를 얻으려면 노출 시간을 조정하십시오. - VGLUT2의 immunofluorescence 신호로 사구체 구조를 정의하십시오. ImageJ로 사구체 내 축삭 정렬 분자의 염색 강도를 측정합니다.
6. 데이터 분석
- 축삭 정렬 분자의 얼룩 강도에서 배경 신호를 뺍니다.
- 준비하기e 발현 데이터 매트릭스는 축삭 정렬 분자로 구성된 컬럼과 사구체로 구성된 행을 갖는다.
- 준비된 표현 데이터 세트를 사용하여 주성분 분석 (PCA)을 수행하십시오. 그런 다음 각 주 구성 요소의 PCA 점수, 기여도 비율 및 요인 부하를 얻습니다.
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Representative Results
후각 사구체지도는 OSN 축삭 1 , 2 의 초기 전역 표적화 및 사후 사구체 분리에 의해 형성됩니다. 사구체 분리는 ax / sorting 분자에 의해 매개되는 접착 성 / 반발 축삭 상호 작용에 의해 조절됩니다.이 분자의 발현 수준은 발현 된 OR 분자에 의해 결정됩니다. 사구체 분리에 관련된 axon-sorting 분자는 OB 9 에서 위치 독립적 인 모자이크 방식으로 표현됩니다. 본 연구에서는 Kirrel2 , Sema7A , OLPC , BIG-2, PCDH17 유전자를 선정 하였다. 이러한 축삭 정렬 분자 중 일부는 활성 의존적 인 방식으로 표현됩니다 ( 7 , 8 , 10) .
4 배 면역여기에 표시된 방법은 동일한 섹션에 동시에 4 개의 분자의 발현 패턴을 시각화 할 수있었습니다. 이러한 axon-sorting 분자는 위치 독립적 인 모자이크 표현을 보였으 나, 그 패턴은 동일하지 않았다 (figure 1A, B ). 사구체 구조는 VGLUT2의 형광 신호에 의해 정의됩니다 ( 그림 2A ). Axon 분류 분자 (Kirrel2, Sema7A, OLPC)는 각 사구체에서 차별적으로 발현되었다; 그러나 사구체 마커로 사용 된 VGLUT2는 사구체 사이에서 균일하게 발현되었다 ( 그림 2B, 2C ).
단일 사구체는 여러 변수로 표현되는 데이터 단위로 간주 될 수 있습니다. 이 다 변수 표현 데이터를 분석하기 위해 PCA (Principal Component Analysis)가 수행되었습니다. PCA는 새로운 좌표계를 정의하므로 첫 번째 좌표가 가장 큰 분산 데이터 세트를 가지며 각 좌표계좌표의 잔차 분산이 가장 큽니다. 발현 데이터 세트는 PCA를 거치며 제 1 및 제 2 주성분 (PC1 및 PC2)의 공간에 그려졌다 ( 도 3A ). 각 주성분의 기여 비율은 각 주성분이 변수의 전체 경향에서 얼마나 많은 비율을 나타내는지를 나타냅니다. PC1, PC2, PC3, PC4, PC5의 기여율은 각각 33.4 %, 28.2 %, 19.8 %, 17.3 %, 6.3 %였다 ( 그림 3B ). 또한 PCA는 각 주성분에 요인 적재량을 나타냈다. 제곱 팩터 로딩은 원래 변수의 분산 중 비율이 요인에 의해 설명되는 정도를 나타냅니다. PC1에서 Sema7A, OLPC 및 Kirrel2의 인자 부하는 양성 이었지만 BIG-2 및 PCDH17의 인자 부하는 그렇지 않았다 ( 그림 3C ). 이전 연구는 cyclic nucleoti가 결핍 된 돌연변이 마우스에서 이들 분자의 발현을 분석했다 후각 신호 전달 11 의 구성 요소 인 degated (CNG) 채널 유전자의 발현 정도를 조사한 결과 CNG 의존성 발현 양상은 PC1 9 의 인자 부하량과 유사 함을 보였다. 이러한 결과는 이들 분자의 다양한 발현이 CNG 채널 매개 신경 활동에 의해 생성되었음을 시사한다.
그림 1 : Parasagittal OB 섹션의 Quadruple Immunostaining. ( A ) OE & OB의 개략도. ( B ) v GLUT2 (흰색), Kirrel2 (빨간색), Sema7A (녹색) 및 OLPC (파란색)에 대한 항체로 immunostained 2 주 된 마우스의 parasagittal OB 섹션. Kirrel2 (빨간색), Sema7A (녹색) 및 OLPC (파란색)의 병합 된 이미지가 오른쪽에 표시되었습니다. 스케일 바 = 100 μm./files/ftp_upload/55893/55893fig1large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : Axon 정렬 분자의 발현 분석. ( A ) VGLUT2 (자주색), Kirrel2 (적색), Sema7A (녹색) 및 OLPC (파란색)에 대한 항체로 immunostained parasagittal 후각 전구 (OB) 섹션. 각 사구체는 VGLUT2의 형광 신호 (사전 시냅스 마커)에 의해 정의됩니다. 사구체 구조는 점선으로 둘러싸여 있습니다. ( B ) 사구체 # 1, # 3, # 4 및 # 6에서의 Kirrel2, Sema7A 및 OLPC의 발현 수준. 축삭 정렬 분자의 염색 강도는 각 사구체에서 측정되었다. ( C ) 사구체 사이의 축삭 정렬 분자와 VGLUT2의 발현 수준 비교. 이들 분자의 신호 강도는 each glomerulus. 그래프의 회색 막대는 발현 수준의 평균을 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : Axon 정렬 분자의 발현 데이터의 PCA. ( A ) 5 개의 축삭 - 정렬 분자 (Kirrel2, Sema7A, OLPC, BIG-2 및 PCDH17)의 발현 데이타 세트의 주성분 분석 (PCA) 스코어 biplots (PC1 대 PC2). 총 1799 개의 사구체를 분석했습니다. ( B ) 다섯 가지 주요 구성 요소의 기여 비율 및 누적 기여 비율. PC1, PC2, PC3, PC4 및 PC5의 기여 비율은 각각 0.334, 0.282, 0.198, 0.173 및 0.063입니다. ( C ) Kirrel의 요인 적재량2, Sema7A, OLPC, BIG-2 및 PCDH17을 사용합니다. PC1, PC2 및 PC3의 고유 값은 각각 1.67, 1.16 및 0.99입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
parasagittal OB 섹션의 4 배 면역 염색은 많은 수의 사구체에서 동시에 4 개의 축삭 정렬 분자의 발현 수준을 시각화하고 정량화 할 수있었습니다. 이러한 다변량 데이터를 PCA로 분석함으로써 이들 분자의 발현 특성을 추측 할 수 있습니다.
성공적인 염색을 위해서는 조직 샘플 준비가 매우 중요합니다. 일부 프로토콜은 조직을 4 % PFA로 후 고정시키고 cryoprotection을 위해 30 % sucrose로 치료해야한다고 제안했다. 그러나이 단계는이 프로토콜에서 생략되었습니다. 이는 대부분의 경우 이러한 단계가 염색 신호 강도를 감소시키고 배경을 증가시키기 때문입니다. 또한 염색 중 높은 배경을 피하기 위해 절편을 어느 단계에서나 말려서는 안됩니다.
최적의 염색 조건은 사용되는 조직과 항체의 종류에 따라 다릅니다. 그러므로, 그것은 필연적이다.y를 사용하여 각 실험의 특정 염색 조건을 결정합니다. 또한 1 차 항체의 농도도 중요합니다. 농도가 너무 높으면 배경이 커집니다. 그러나 농도가 너무 낮 으면 신호가 감소합니다. 따라서 고품질의 염색 결과를 얻기 위해 1 차 항체의 적절한 농도를 확인하는 것이 중요합니다. 한 가지 한계는이 방법이 동물 종에 대한 1 차 항체 및 1 차 항체 조합의 품질에 크게 의존한다는 것입니다.
OB의 코로널 섹션은 면역 염색을 위해 일상적으로 사용되었습니다. 그러나,이 프로토콜에서는, OB의 내측의 parasagittal 섹션은 단일 섹션에 더 많은 사구체를 배치 할 수 있도록 사용되었습니다. 이 섹션은 배 쪽과 뒤쪽의 축을 따라 사구체의 지형적 인 순서를 유지하기 때문에, 또한 배부 패턴을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.OSN 축삭 돌기의 돌출 부위를 결정하는 축삭 유도 분자.
이 연구에서 OB의 parasagittal 섹션은 단일 섹션에 더 많은 사구체를 배치 할 수 있도록 준비되었습니다. 또한 수평 단면은 연구자가 내측 - 외측 또는 전 - 후방 축을 따라 차이를 나타낼 때 유용 할 수 있습니다. 다중 면역 염색을 위해 사용될 수있는 항체의 개발과 함께,이 4 배 염색 방법은 OB뿐만 아니라 다른 뇌 영역에도 적용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 Mitsubishi Foundation, 다케다 과학 재단, JST PRESTO 및 JSPS KAKENHI 부여 번호 16H06144에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| Skim Milk | nacalai tesque | 31149-75 | |
| goat anti-Sema7A antibody | R&D Systems | AF2068 | |
| rat anti-OLPC antibody | Merck Millipore | MABT20 | |
| mouse anti-VGLUT2 antibody | Merck Millipore | MAB5504 | |
| goat anti-BIG-2 antibody | R&D Systems | AF2205 | |
| gunea pig anti-Kirrel2 antibody | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP | |
| donkey anti-mouse Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Wako | 162-16065 | |
| MAS coated slide glasses | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI filter cube | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP filter cube | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC filter cube | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 filter cube | KEYENCE | OP-87766 | |
| filter paper | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | M71484 |
References
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