Immunomarquage quadruple de l'ampoule olfactive pour la visualisation des codes d'identité moléculaire des axes sensoriels olfactifs

Le but général de cette méthode de coloration immunohistochimique est de visualiser l'expression combinée de molécules de tri des axones au niveau des terminaisons axonales des neurones sensoriels olfactifs. Cette méthode peut aider à caractériser des processus clés dans le domaine du développement olfactif, tels que le guidage des axones, la formation des synapses et la régénération des neurones sensoriels olfactifs. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet aux scientifiques de comparer et d'analyser les profils d'expression des molécules de tri des axones dans le bulbe olfactif sans subir de variations entre les sections.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car l'étape d'encapsulation est difficile à apprendre, la position et l'angle de l'échantillon de tissu olfactif dans le moule étant difficiles à décrire par écrit. Commencez avec des têtes de souris âgées d'une à deux semaines, fixées par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde à 4 %. Insérez une lame de ciseau dans l'espace entre les dents supérieures et inférieures, puis coupez horizontalement pour enlever l'os de la mâchoire inférieure.

Ensuite, retirer les tissus excédentaires à l’aide de pinces et de ciseaux, de manière à conserver le tissu olfactif, incluant le bulbe olfactif et l’épithélium olfactif. Plonger le tissu olfactif dans du PBS afin d’éliminer l’air présent dans la cavité nasale, puis effectuer une incision verticale pour retirer la partie postérieure du cerveau. Placer le tissu olfactif au fond d’un moule d’inclusion, l’extrémité coupée orientée vers le bas. Remplir le moule avec du composé optimal pour coupe cryogénique (OCT), puis plonger dans l’azote liquide.

Une fois que le tissu et l'OCT sont complètement congelés, équilibrez le tissu dans le cryostat à 20 degrés Celsius pendant une heure. Réalisez ensuite des coupes parasaquittales en série du bulbe olfactif à l’aide du cryostat, et récupérez-les en les faisant adhérer sur des lames en verre revêtues de MAS. Après fixation, séchez immédiatement les lames à l’aide d’un sèche-cheveux.

Commencer la coloration immunohistochimique en lavant les lames sèches au PBS pendant cinq minutes à température ambiante. Bloquer les sites de liaison non spécifiques en incubant les lames pendant une heure avec une solution de blocage à 5 % à température ambiante. Ajouter ensuite 400 microlitres d'un mélange d'anticorps primaires dilués dans une solution de blocage à 1 % sur chaque lame.

Incuber les lames toute la nuit à température ambiante. Le jour suivant, éliminer la solution d'anticorps primaire et laver les lames trois fois avec du PBST, cinq minutes à chaque fois, à température ambiante. Ensuite, ajouter 400 microlitres d'un mélange d'anticorps secondaires et de PBS sur chaque lame.

Protéger de la lumière et incuber pendant une heure à température ambiante. Après l'incubation, éliminer la solution et laver à nouveau les lames trois fois pendant cinq minutes chacune avec du PBS à température ambiante. Enfin, monter les lamelles sur les lames en appliquant deux gouttes de milieu de montage sur chaque lame, en plaçant la lamelle et en éliminant les bulles d'air.

Obtenez des images fluorescentes à l’aide du microscope à fluorescence en utilisant le filtre approprié pour chaque fluorophore. Ajustez le temps de pose afin d’obtenir des signaux fluorescents de l’image sans saturation. Définissez la structure glomérulaire à l’aide des signaux d’immunofluorescence de GLUT2.

Utilisez ImageJ pour mesurer les intensités de coloration des molécules de tri des axones au sein des glomérules. Cette image montre une coupe parasagittale du bulbe olfactif d'une souris âgée de deux semaines, immunomarquée avec des anticorps dirigés contre VGLUT2, Kirrel2 en rouge, la sémaphorine 7A en vert et OLPC en bleu. L'image fusionnée démontre que les molécules de tri des axones impliquées dans la ségrégation glomérulaire sont exprimées selon un patron en mosaïque indépendant de la position.

Chaque glomérule est défini par les signaux fluorescents du marqueur présynaptique VGLUT2. Les structures glomérulaires sont entourées de lignes en pointillés. Les intensités du signal des molécules de tri des axones ont été mesurées dans chaque glomérule.

Comme on le voit ici, les molécules de tri des axones sont exprimées de manière différentielle dans chaque glomérule. Par exemple, le glomérule 3 présente des niveaux élevés de OLPC, des niveaux intermédiaires de Sémaphorine 7A et des niveaux plus faibles de Kirrel2, et cette différence peut être quantifiée en mesurant l'intensité de la coloration. Alors que le glomérule 4 présente des niveaux élevés de OLPC, et des niveaux plus faibles de Kirrel2 et de Sémaphorine 7A.

Encore une fois, cette différence peut être quantifiée en mesurant l'intensité de la coloration. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de ne pas effectuer la post-fixation au PFA ni le traitement par la solution de saccharose, qui sont habituellement recommandés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment placer davantage de glomérules sur une même section du bulbe olfactif, ainsi que la manière d'effectuer une immunohistochimie de haute qualité avec plusieurs anticorps, méthode applicable à d'autres régions cérébrales.

N'oubliez pas d'espérer, cette méthode vous aidera à réussir vos expériences futures.