Immunomarquage quadruple de l'ampoule olfactive pour la visualisation des codes d'identité moléculaire des axes sensoriels olfactifs

L’objectif global de cette méthode de coloration immunohistochimique est de visualiser l’expression combinée des molécules de tri axonal aux terminus axonaux des neurones sensoriels olfactifs. Cette méthode peut aider à caractériser des processus clés dans le domaine du développement olfactif, tels que le guidage axonal, la formation des synapses et la régénération des neurones sensoriels olfactifs. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet aux scientifiques de comparer et d’analyser les modèles d’expression des molécules de tri axonal dans le bulbe olfactif sans supporter de variation entre les sections.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car l’étape d’encastrement est difficile à apprendre, car la position et l’angle de l’échantillon de tissus olfactifs dans le moule sont difficiles à décrire avec des mots. Commencez avec des têtes de souris âgées d’une à deux semaines qui ont été fixées par perfusion intracardiaque de 4 % de paraformaldéhyde. Insérez une lame de ciseaux dans l’espace entre les dents supérieures et inférieures et coupez horizontalement pour retirer l’os de la mâchoire inférieure.

Ensuite, coupez l’excès de tissu à l’aide d’une pince et de ciseaux, pour laisser le tissu olfactif, y compris le bulbe olfactif et l’épithélium olfactif. Immergez le tissu olfactif dans du PBS pour éliminer l’air dans la cavité nasale, puis faites une incision verticale pour enlever la partie postérieure du cerveau et placez le tissu olfactif au fond d’un moule d’enrobage avec l’extrémité coupée vers le bas. Remplissez le moule avec un composé à température de coupe optimale, puis immergez-le dans de l’azote liquide.

Une fois que les tissus et l’OCT sont complètement congelés, équilibrez les tissus dans le cryostat à 20 degrés Celsius pendant une heure. Maintenant, faites des coupes parasaggitales en série du bulbe olfactif avec le cryostat, et collectez-les en les collant à des lames de verre revêtues de MAS. Après avoir collé, séchez immédiatement les lames avec un sèche-cheveux.

Commencez l’immunocoloration en lavant les lames séchées avec du PBS pendant cinq minutes à température ambiante. Bloquez les sites de liaison non spécifiques en incubant les lames pendant une heure avec une solution de blocage à 5 % à température ambiante. Ajoutez ensuite 400 microlitres d’un cocktail d’anticorps primaires dilués dans une solution bloquante à 1 % sur chaque lame.

Incuber les lames pendant la nuit à température ambiante. Le lendemain, jetez la solution d’anticorps primaires et lavez les lames avec du PBST trois fois pendant cinq minutes chacune à température ambiante. Ajoutez ensuite 400 microlitres d’un cocktail d’anticorps secondaires et de PBS sur chaque lame.

Protéger de la lumière et incuber pendant une heure à température ambiante. Après l’incubation, jetez la solution et lavez de nouveau les lames trois fois pendant cinq minutes chacune avec du PBS à température ambiante. Enfin, montez les lamelles sur les lames en appliquant deux gouttes de support de montage sur chaque lame, en plaçant la lamelle et en éliminant les bulles d’air.

Obtenez des images fluorescentes avec le microscope à fluorescence en utilisant le filtre approprié pour chaque fluorophore. Ajustez le temps d’exposition pour obtenir des signaux fluorescents de l’image sans saturation. Définir la structure glomérulaire par des signaux immunofluorescents de GLUT2.

Utilisez l’image J pour mesurer l’intensité de coloration des molécules de tri axonal dans les glomérules. Cette image montre une coupe du bulbe olfactif parasaggital d’une souris âgée de deux semaines immunomarquée avec des anticorps contre VGLUT2, Kirrel2 en rouge, Semaphorin 7A en vert et OLPC en bleu. L’image fusionnée démontre que les molécules de tri axonal impliquées dans la ségrégation glomérulaire sont exprimées dans un motif en mosaïque indépendant de la position.

Chaque glomérule est défini par des signaux fluorescents du marqueur présynaptique VGLUT2. Les structures glomérulaires sont entourées de lignes pointillées. L’intensité du signal des molécules de tri axonal a été mesurée dans chaque glomérule.

Comme on le voit ici, les molécules de tri axonal sont exprimées de manière différentielle dans chaque glomérule. Par exemple, le glomérule 3 présente des niveaux élevés d’OLPC, des niveaux intermédiaires de sémaphorine 7A et des niveaux inférieurs de Kirrel2, et cette différence peut être quantifiée en mesurant l’intensité de la coloration. Alors que le glomérule 4 a des niveaux élevés d’OLPC et des niveaux inférieurs de Kirrel2 et de Sémaphorine 7A.

Là encore, cette différence peut être quantifiée en mesurant l’intensité de la coloration. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’omettre la post-fixation avec du PFA et le traitement avec une solution de saccharose, qui sont normalement recommandés. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de placer plus de glomérules sur la section du bulbe olfactif unique et de la façon d’effectuer un immunomarquage de haute qualité avec plusieurs anticorps, qui peuvent être appliqués à d’autres zones du cerveau.

N’oubliez pas d’espérer, cette méthode vous aidera à réussir vos futures expériences.