Summary
Vi beskriver en metod genom vilken vi identifiera kritiska restsubstanser krävs för bindning av mänskliga eller murina monoklonala antikroppar som är riktade till den virala hemagglutinin av influensa A virus. Protokollet kan anpassas till andra virus ytan glykoproteiner och deras motsvarande neutraliserande antikroppar.
Abstract
Influensavirus uppvisar en anmärkningsvärd förmåga att anpassa sig och undvika värd immunsvaret. Ett sätt är genom antigena förändringar som sker på de ytan glykoproteiner av viruset. Generering av fly varianter är en kraftfull metod att belysa hur virus undkomma immunsystemet upptäcka och identifiera kritiska restsubstanser krävs för antikropp bindande. Här beskriver vi ett protokoll på hur till generera influensa A virus fly varianter genom att utnyttja människors eller murina monoklonala antikroppar (mAbs) riktas mot den virala hemagglutinin (HA). Med hjälp av vår teknik kännetecknas vi tidigare kritiska restsubstanser krävs för bindning av antikroppar riktade antingen i huvudet eller stjälk av den romanen aviär H7N9 HA. Protokollet kan lätt anpassas för andra virus system. Analyser av fly varianter är viktiga för modellering antigendrift, att fastställa enda nukleotid polymorfismer (SNP) som ger motstånd och virus fitness, och i utformningen av vacciner och/eller therapeutics.
Introduction
Liknar andra RNA-virus, influensa A virus besitter en felbenägen polymeras som möjliggör generering av en mängd olika antigena varianter med varje runda av replikering1,2,3. Influensavirus A har en häpnadsväckande förmåga att anpassa sig och undvika mänsklig immunsvaret via antigendrift, som uppnås genom en ackumulation av mutationer på de ytan glykoproteiner som leder till förlust av antikropp bindande. Antigendrift av de virala ytan glykoproteiner, HA och neuraminidas (NA), kräver behovet av att omformulera och administrera vaccinet årligen.
Tekniska framsteg inom isolering och generation av antigen-specifika antikroppar har gett ett stort antal vaccin-inducerad mAbs4,5,6,7,8. I sin tur har karakterisering av epitoper av mAbs som i stort sett neutralisera influensa A virus kraftigt hjälpt utvecklingen av flera universal influensa vaccin kandidater9,10,11, 12,13,14. Belysa antigena fotavtryck av en mAb avslöjar de strukturella bestämningsfaktorerna för neutralisering och möjliggör en informerad förhållningssätt mot vaccinet design. Men är det varken realistiskt eller kostnadseffektiva för laboratorier att strukturellt karakterisera omfattande paneler av mAbs genom röntgenkristallografi eller cryo-elektronmikroskopi för att kartlägga epitoper på virusantigen15, 16 , 17 , 18.
Röntgenkristallografi eller cryo-elektronmikroskopi kräver dyr utrustning, specialiserade tekniker och potentiellt en omfattande mängd tid att generera data. En alternativ och snabbare metod är att utnyttja den snabba generationen av olika viral populationer via den felbenägna RNA-beroende RNA-polymeras att generera escape mutants för att avgöra epitoper mAbs19,20, 21,22,23. Generering av fly varianter kräver inte någon särskild utrustning eller teknik och kan utföras med konventionella laboratoriereagenser och utrustning.
Här beskriver vi en metod som möjliggör för kartläggning av kritiska restsubstanser krävs för mAb bindande som känner igen influensan HA.
Protocol
försiktighet: ett antal influensavirus cirkulerar i den mänskliga befolkningen (t.ex., H1, H3) är biosäkerhet nivå 2 klass patogener som måste hanteras med omsorg och rätt personlig skyddsutrustning. Hantering av virus måste godkännas av den institutionella Review Board. Följande protokoll godkändes av den institutionella Review Board på berget Sinai.
Obs: HA-specifika antikroppar som hämmar virusreplikation kan generellt delas in i) ettor som binder på eller intill av receptorn bindningsstället på toppen av klotformiga huvudet och ii) sådana som binder distala receptor bindande domän, vilket inkluderar den laterala sidan av klotformig huvud och regionen stjälk i HA. Antikroppar som är riktade till receptorn bindningsstället förhindra engagemang av sialic acid motiv på ytan av målceller och kan mätas med en hemagglutination hämning (HI) analys. Antikroppar som är HI-negativa, såsom stjälk-specifika antikroppar fortfarande kan hämma virusreplikation, men kan endast bedömas med neutralisering analyser.
1. kategorisera antikroppar baserat på HI och neutralisering verksamhet
- HI assay
- i en V-botten plattan med 96 brunnar, tillsätt 25 µL av 1 x PBS i kolumnerna 2 till 12.
- Späd den mAb 7B2 (huvud-specifik), 6F12 (stjälk-specifik) 23 och ett isotypen kontroll till 100 µg/mL 1 x PBS och alikvotens 50 µL utspädda antikropp förberedelserna in i kolumn 1. Har även en ingen mAb-kontrollen genom att lägga till 50 µL av 1 x PBS ( figur 1A).
- Utför 2-faldig seriespädningar av antikroppar av överföring 25 µL mellan kolumn 1 och kolumn 2 och så vidare. Kassera de senaste 25 µL från kolumn 12 ( figur 1A).
Obs: Se till att inkludera en rad någon antikropp kontroll. - Späd virus beståndet (reassortant virus uttrycker HA och NA av A/California/04/09 med de interna segment av A/Puerto Rico/8/34) till 8 hemagglutination enheter/25 µL utspädd virus lager. Tillsätt 25 µL utspädda virus beståndet (8 hemagglutination) till varje brunn (rader A till G).
Obs: Antikropp och virus blandningen bör ha en slutlig volym av 50 µL med en start slutlig koncentration på 50 µg/mL. - Inkubera plattan vid rumstemperatur (RT) för 45 min.
- För återtitrering raden (H), tillsätt 50 μl 1 x PBS på brunnar H2 till H12. Tillsätt 100 µL av de 8 hemagglutination enheter/25 µL till väl H1. Seriellt späd två gånger genom att överföra 50 µL från H1 till H2, och så vidare. Kassera de senaste 50 µL från väl H12. Slutligen tillsätt 50 µL 0,5% kyckling röda blodkroppar (RBC) till alla brunnar i plattan med 96 brunnar i V-botten.
Obs: MAb proverna i analysen bör ha en slutlig volym av 100 µL: mAb (25 µL), virus (25 µL) och RBC (50 µL). Slutvolymen av ingen mAb-kontrollen bör innehålla 25 µL av 1 x PBS, 25 µL av virus och 50 µL av RBC. - Inkubera plattan vid 4 ° C för 1 h.
- Läs visuellt plattorna för HI aktivitet. Om det finns en positiv avläsning för en särskild antikropp, Fortsätt till steg 2.1 att generera fly varianter. Om antikroppen är HI-negativ, Fortsätt nedan till steg 1.2 att bedöma om antikroppen har neutraliserande aktivitet i en cell kultur assay.
Obs: En positiv avläsning av en HI-aktiva mAb indikeras av en mörk röd RBC pellet i mitten av en brunn ( figur 1B 7B2) som kommer att utgöra en tårdroppe när plattan med 96 brunnar i V-botten hålls i 45 ° vinkel. En negativ avläsning bildar inte en mörk röd RBC pelleten i brunnen ( figur 1B 6F12 och ingen mAb). Isotypen kontroll kommer inte utgör också en mörk röd RBC pellet och ser identisk med stjälk-specifika antikroppen, 6F12 eller den ingen mAb bör och styra prov ( figur 1B) 23.
- Mikroneutraliserings-analys
- plattan Madin Darby Canine njure (MDCK) celler på en densitet på 2 x 10 4 celler per brunn i en vävnad kultur behandlas plattan med 96 brunnar och inkubera vid 37 ° C och 5% CO 2 för 17 till 19 h .
Obs: Cellerna kan också tillåtas att ansluta sig till botten av brunnen för minst 4 h före användning. - i en separat plattan med 96 brunnar, utföra sju 3-faldig seriespädningar av den mänskliga mAb 4D 05 5, CR9114 17 eller isotypen IgG-kontroll, med en start koncentration på 200 µg/mL 1 X väsentliga minimalmedium (MEM) kompletteras med tosyl phenylalanyl klormetyl keton (TPCK)-behandlade trypsin (1 µg/mL) ( figur 2).
Obs: Rad A bör innehålla 75 µL utspädda antikropp (start koncentration på 200 µg/mL). Seriellt späd (3-faldigt) ner plattan genom att överföra 25 µL från rad A till rad B, och så vidare. Rader A till H bör ha en slutlig volym av 50 µL. Det finns ingen anledning att ändra tips mellan utspädning överföringar. - Späd virus beståndet (reassortant virus uttrycker HA och den NA av A/Shanghai/1/13 med det interna segmentet av A/Puerto Rico/8/34) till en 100 av vävnadsodling 50% infektiös dos (TCID 50) / 50 µL i 1 x MEM kompletteras med TPCK-behandlade trypsin (1 µg/mL) 24. Tillsätt 50 µL per brunn av utspädda virus på antikropp preparat (steg 1.2.2). Tillsätt 50 µL av 1 X MEM till oinfekterade cell kontrollbrunnarna.
- Inkubera virus-antikropp blandningar i en 37 ° C inkubator (med 5% CO 2) för 1 h.
Obs: Virus-antikropp blandningar bör ha en total volym av 100 µL: 50 µL av antikropp utspädning (steg 1.1.2) och 50 µL av virus som innehåller 100 TCID 50 (steg 1.2.3). - Aspirera media i brunnarna och tillsätt de hela 100 µL av virus-antikropp blandningar till motsvarande brunnar.
Obs: Ambitionen är gjort med hjälp av en 8-kanals hygienfilter adapter kopplad till ett vakuum. En 8 - eller 12-bra mikro-flerkanalspipett kan alternativt användas för att manuellt aspirera. Alla aspiration under inokulum borttagning eller tvättar görs från den högsta koncentrationen av antikropp till de lägsta, utan att behöva byta tips. - Tvätta enskiktslager med 200 µL 1 x PBS. Aspirera 200 µL 1 x PBS (som i steg 1.2.5). Upprepa tvätten en gång till för sammanlagt två tvättar.
- Infektera enskiktslager av MDCK celler genom att lägga till den hela 100 µL per brunnen av virus-antikropp blandningar (från steg 1.2.4) på enskiktslager och infektera/Inkubera vid 37 ° C (med 5% CO 2) för 1 h.
- Under infektionen, i en separat plattan med 96 brunnar, förbereda en annan uppsättning antikropp utspädningar. Tillsätt 150 µL av 100 µg/mL respektive antikroppen i rad A och 100 µL av 1 x MEM kompletteras med TPCK-behandlade trypsin (1 µg/mL) i raderna B till H. utför 3-faldig utspädningar genom att överföra 50 µL från rad A till rad B , och så vidare, ner till raden H. Kassera de senaste 50 µL från rad H. Den totala volymen för varje ska väl vara lika 100 µL. avsätta.
Obs: Antikropparna späds i 1 x MEM kompletteras med TPCK-behandlade trypsin (1 µg/mL). - Aspirera det virus-antikropp inokulatet från enskiktslager i steg 1.2.7 och fylla på med den hela 100 µL per brunnen av lämpliga antikropp utspädningsfaktorn bereddes i steg 1.2.8.
Obs: Om en väl innesluten en sista antikroppskoncentration på 100 µg/mL under infektionen (steg 1.2.7), sedan fylla media bör också innehålla en slutlig koncentration på 100 µg/mL (steg 1.2.8). - Inkubera under 24 h i en 37 ° C inkubator (med 5% CO 2).
- Sug ut media från 96 brunnar plattorna och tvätta med 200 µL per brunn 1 x PBS tre gånger.
- Fixa cellerna med 100 µL kallt 80% aceton för 1 h vid -20 ° C.
Obs: 80% aceton lösningen späds i dubbel destillerat (dd) H 2 O (t.ex., 80 mL 100% aceton plus 20 mL ddH 2 0). 80% aceton lösningen kan kylas på is före användning. - Tvätta cellerna med 200 µL per brunn 1 X PBS tre gånger.
- Blockera plattorna med 200 µL per brunn 5% mjölk utspätt i 1 X PBS och inkubera plattorna vid RT för 1 h.
- Tillsätt 100 µL av biotinylerade anti-influensa en nucleoprotein (NP) primär antikropp utspädd 1:2,000 1 x PBS/1% bovint serum albumin (BSA) och inkubera plattorna vid RT för 1 h.
Obs: För influensa B-virus, en influensa B-virus-specifika anti-NP antikropp bör användas. - Tvätta plattorna med 1 x PBS tre gånger.
- Tillsätt 100 µL av streptividin - pepparrotperoxidas (HRP) konjugerade antikroppar utspädd 1:3,000 1 x PBS/1% BSA och inkubera plattorna vid RT för 1 h.
- Tvätta plattorna med 200 µL 1 x PBS tre gånger.
- Lägg till HRP substrat reagens på 100 µL per brunn och inkubera i mörker vid RT.
Obs: Inkubationstiden bör optimeras före tillsats av sura stopp bufferten (nedan). Generellt sett är 15 till 30 min räcker. - Släcka reaktionen med 50 µL per brunn 5 M HCl.
FÖRSIKTIGHET: 5M HCl är ett starkt frätande reagens som kan orsaka skada på ögon, hud och slemhinnor. Tillägg av reagensen bör göras under en ventilerad huv med lämplig personlig skyddsutrustning. - Läs plattorna vid 492 nm och subtrahera bakgrunden (oinfekterade celler) brunnarna.
- Beräkna procentuell hämning med följande formel:
- om en antikropp har neutralisering aktivitet (och ingen HI aktivitet), Fortsätt till steg 2.2.
Obs: Antikroppar som saknar in vitro- neutralisering aktivitet kommer sakna HI aktivitet.
- plattan Madin Darby Canine njure (MDCK) celler på en densitet på 2 x 10 4 celler per brunn i en vävnad kultur behandlas plattan med 96 brunnar och inkubera vid 37 ° C och 5% CO 2 för 17 till 19 h .
2. Generation av Escape Mutant varianter
Obs: neutraliserande antikroppar som har eller saknar HI aktivitet analyseras ytterligare med de specifika protokoll som beskrivs nedan.
- Protokoll 1: HI-positiva/neutralisering-positiva antikroppar ( figur 3A )
- förbereda ett virus lager av 10 6 plackbildande enheter/milliliter (PFU/mL) i 1 x PBS i en 400 µL volym.
- Bered fyra utspädningar av antikropp sevärdheter i ökande koncentrationer (t.ex., 0, 0,5, 0,05 och 0,005 mg/mL) i 1 x PBS i en volym av 100 µL per utspädning.
Obs: Wild-type virus bör alltid vara passaged parallellt och i avsaknad av antikroppar. Sekvenserna av dessa överförda virus hjälper skilja mellan anpassning till cell odlingsbetingelser och fly mutationer. - Mix 100 µL 10 6 PFU/mL av virus med 100 µL av varje antikropp utspädning eller 100 µL av 1 x PBS.
- Inkubera för 1 h i en 37 ° C inkubator (med 5% CO 2). Vortex kort. Injicera 200 µL av varje blandning i specifika-patogenfria (SPF) embryonated kyckling ägg.
- Ruva äggen vid 37 ° C (utan CO 2) för 40-44 h.
- Offra virus infekterade-embryonated äggen genom inkubation vid 4 ° C i minst 6 h.
- Skörda allantoiska vätskan från äggen, som tidigare beskrivits 24 , 25.
- Utför hemagglutination analysen, som beskrivs ovan 24 , 26. Om alla allantoiska vätska förberedelser inte har hemagglutination titrar, upprepa från steg 2 med antikropp utspädningar alltifrån 0,005 mg/mL till 0.00005 mg/mL.
Obs: En mättar koncentration av en HI-positiv antikropp kan neutralisera alla närvarande viruspartiklarna. Därför kan det vara nödvändigt att minska mängden antikroppar som är närvarande i den passaging. - Bekräfta varianter av fly genom att utföra HI assay 24 (steg 1.1).
Obs: HI-aktiva antikroppar blockera HA engagemang sialic acid motiv på målceller. Därför förlorar ett virus i närvaro av dess cognate antikropp förmågan att agglutinerar röda blodkroppar (förekomst av RBC pellets). Teoretiskt, fly varianter av HI-aktiva antikroppar fortfarande kan binda sialic acid motiv även i närvaro av dess cognate antikropp och således kan agglutinerar röda blodkroppar (ingen RBC pellets). Om HI antikroppens sevärdheter är fortfarande detekterbara, upprepa protokollet från steg 2.1.2 med en högre start koncentration av antikroppen.
- Protokoll 2: HI-negativ/neutralisering-positiva antikroppar ( figur 3B )
Obs: för att generera fly varianter mot neutraliserande antikroppar som saknar HI aktivitet, viruset måste vara passaged i närvaro av ökande mängder av antikropp.- Plattan MDCK celler i en 6-well platta på en densitet på 1 x 10 6 celler per brunn och inkubera i minst 4 h i en 37 ° C inkubator (med 5% CO 2).
- Späda virus beståndet till 10 6 PFU/mL eller virus från tidigare passage i 1 x MEM med TPCK-behandlade trypsin (1 µg/mL) i en 500 µL volym.
- Förbereda en enda utspädning av antikropp (0,02 mg/mL för den ursprungliga passagen eller högre för alla efter passager) i 1 x MEM med TPCK-behandlade trypsin i en 250 µL volym.
- Mix 250 µL utspädda virus med 250 µL utspädda antikropp (+ antikropp) eller 250 µL av 1 x MEM (ingen antikropp-kontroll).
- Inkubera virus-antikropp blandningen i 30 min i en 37 ° C inkubator (med 5% CO 2).
- Aspirera media med hjälp av ett glas Pasteur pipett och tvätta enskiktslager av celler med 1 mL 1 X PBS.
- Tillsätt 500 µL av blandningarna i brunnar och inkubera i en 37 ° C inkubator (med 5% CO 2) för 1 h.
- Efter 1 h, komplettera brunnarna med 2 mL 1 x MEM med TPCK-behandlade trypsin (1 µg/mL).
- Kolla cellerna på 48 h efter infektion för tecken i cytopatisk effekt (CPE) på mikroskopet eller utföra en hemagglutination analys för att upptäcka virus tillväxt 26.
- Om det är brutto CPE i de kulturer som kompletteras med antikropp, skörda supernatanten i flera kryorör, etikett med passage nummer och förvaras vid -80 ° C.
- Spara 100 μl av supernatanten att infektera en färsk enskiktslager av MDCKs med 2 mL 1 x MEM kompletteras med TPCK-trypsin och antikropp. Kom ihåg att inkludera en ingen antikropp-kontroll för varje passage.
Obs: Öka koncentrationen av antikroppen av två gånger (eller forskaren eget gottfinnande) i nästa passage (varannan dag). - Öka koncentrationen av antikroppen i varje successiva passagen tills virus tillväxt är fortfarande lönsamt även med en slutlig koncentration 0,6 mg/ml antikroppar. Frysa de flera injektionsflaskorna av supernatanten för varje passage och förvaras vid -80 ° C.
Obs: Inga antikroppar kontroll är avgörande för att kontrollera tillväxten av virus från en passage till en annan. Om det är brutto CPE i kontrollen inga antikroppar, men ingen CPE i den + antikropp grupp, detta indikerar att koncentrationen av antikroppen var för hög och ingen fly varianter genererades. Om det är brutto CPE i kontrollen inga antikroppar, men endast måttlig CPE i den + antikropp gruppen, detta anger förekomsten av potentiella fly varianter. I nästa passage, öka volymen passage till 200 µL av supernatanten och bibehålla koncentrationen av antikroppar mot ökar sannolikheten för att generera fly varianter.
3. Isolering av fly varianter genom plack rening
- plattan MDCK celler i en 6-well platta på en densitet på 1 x 10 6 celler per brunn och inkubera i minst 4 h i en 37 ° C inkubator (med 5% CO 2).
- Späda antikropparna i 1 x MEM med TPCK-behandlade trypsin som börjar vid 300 µg/mL i en volym 250 µL och blanda med 250 µL av motsvarande escape mutant virus. Virus överförda i avsaknad av antikroppar bör också plack renas.
- Sug ut media från cellerna, tvätta med 1 x PBS tre gånger och Lägg den hela 500 µL av virus-antikropp blandningen (steg 3.2).
- Inkubera plattorna för 1 h i en 37 ° C inkubator (med 5% CO 2) se till att klippa fram och tillbaka varje 10 min för att förhindra uttorkning av enskiktslager.
- Aspirera virus-antikropp blandningar och fylla brunnarna med overlay agar media som innehåller motsvarande mängder antikroppar (300 µg/mL; steg 3.2).
- Inkubera plattan för 40-44 h i en 37 ° C inkubator (med 5% CO 2).
- Cirkel synligt plack med en blå - eller svart-färgade markör att underlätta plack plockning.
- Plocka fyra plaketter för varje fly muterade virus-antikropp kombination, liksom vildtyp virus som var överförda i MDCK celler eller ägg i avsaknad av antikropp.
- Återsuspendera plack i 100 µL av 1 x PBS.
- Injicera det hela 100 µL av plack renat escape mutant virus i 10 - dagar gamla SPF embryonated hönsägg.
- Ruva äggen för 40-44 h i en 37 ° C inkubator (utan 5% CO 2).
- Utföra en hemagglutination test för att bekräfta förekomsten av virus (steg 1.1).
4. Utvinning av Viral RNA och analys av HA sekvens Variation
- extrakt viral RNA från 200 µL av escape mutant virus allantoiska vätska med en mono-phasic lösning av fenol och guanidin isothiocyanat.
Varning: Fenol är flyktiga flytande reagens som kan orsaka hosta, andnöd och måttligt irritera huden genom kontakt. - Förstärker segmentet HA från viral RNA med hjälp av ett omvänt transkriptas och gen-specifika primrar för influensa A HA segment 27.
Anm: De universella primers för influensa B-virus som beskrivs i tabell 2 förstärker både HA (~ 1,800 bp) och NA (~ 1,500 bp) 28. - Lösa RT-PCR-produkten i en 1% agarosgel och klipp ut rätt storlek bandet (~ 1,800 bp).
- Gel extrakt PCR-produkten med en kvarts-membran med rening och skicka cDNA ut för sekvensering.
- Identifiera aminosyra återstoden krävs för antikropp bindande genom att differentiera mutationerna finns på förmodad fly varianter och anpassade vildtyp virus på grund av antingen cell kultur anpassning eller immunologiska markering.
- Klona PCR-produkten innehåller vild-typen eller fly variant HA i ett pCAGGs uttryck vektor (NotI och NheI).
- Bindning av antikroppen till fly varianten HA kan bedömas med ett av två alternativ (eller båda) beskrivs nedan.
5. Antikropp bindande analyser av fly varianter
- immunofluorescens
- plattan 293T celler på en densitet på 2 x 10 4 celler per brunn i en plattan med 96 brunnar och inkubera i 37 ° C inkubator (med 5% CO 2) för 24 h.
- Transfect cellerna med 0.10 µg per brunn av pCAGGS plasmidsna kodning escape mutant HA, virus överförda HA och vildtyps-HA (unpassaged) med användning av en transfection reagens.
- Inkubera plattorna 96 brunnar för 48 h i 37 ° C inkubator (med 5% CO 2).
- Fix med 100 µL 0,5% PARAFORMALDEHYD i 15 min på RT.
Varning: PARAFORMALDEHYD är flyktiga flytande reagens som kan orsaka hosta, andnöd och måttligt irritera huden genom kontakt. Det har utsetts som potentiellt cancerframkallande. Tillägg av reagens bör göras i en ventilerad kemisk huva. - Tvätta med PBS 1 x tre gånger. Block med 5% mjölk i 1 x PBS för 1 h på RT.
- Tvätta tre gånger med 1 x PBS. Inkubera med 5 µg/mL antikroppar av intresse för 1 h på RT.
- Inkubera med 100 µL av sekundära antikroppar (anti-humant eller antimus Alexa 488) vid en spädningsgrad av 1:2,000 1 x PBS/1% BSA för 1 h på RT i mörkret.
- Tvätta tre gånger med 1 x PBS. Iaktta cellerna på en fluorescerande Mikroskop för positiv eller negativ färgning.
- Fluorescens-aktiverad Cell sortering (FACS)
- plattan 293T celler på en densitet på 2 x 10 5 celler per brunn i en 6-well platta och inkubera vid 37 ° C (med 5% CO 2) i 24 h.
- Transfect cellerna med 0.50 µg per brunn med pCAGGS plasmider kodning escape mutant HA, virus bara anpassade HA och vildtyps-HA med en transfection reagens.
- Inkubera 6-väl plåtarna för 48 h vid 37 ° C (med 5% CO 2).
- Efter 48 h, aspirera tillväxt medier och tvätta med 1 x PBS två gånger försiktigt (se till att enskiktslager är ostört).
- Skörda de transfekterade 293T cellerna med 500 µL av FACS buffert (1 x PBS/2% fetalt kalvserum).
Obs: FACS bufferten bör vara före kyld vid 4 ° c före användning. - Centrifugera skördade 293T cellerna vid 300 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Aspirera FACS bufferten och resuspendera med 200 µL FACS buffert innehållande mAbs sevärdheter (slutlig koncentration på 1 till 5 µg/mL). Inkubera vid RT i 20 min.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 minuter vid 4 ° C. Tvätta två gånger med 500 µL av FACS buffert. Aspirera försiktigt med ett glas Pasteur-pipett att inte störa pelleten.
- Blandas med 200 µL FACS buffert innehållande sekundär antikropp konjugerat till Alexa 488 (slutspädning av 1:1, 000). Inkubera i mörker vid 4 ° C i 20 min.
- Centrifugera cellerna vid 300 g i 5 minuter vid 4 ° C. Tvätta två gånger med 500 µL av FACS buffert och sug noga ut tvättbuffert.
- Blandas i 500 µL FACS buffert och bedöma bindande mAbs eller polyklonala sera att celler transfekterade med HA av FACS.
Obs: Kom ihåg att inkludera en ingen mAb/polyklonala sera kontroll samt ett untransfected prov i experimentet.
Representative Results
Vi har tidigare använt varianter av denna metod för att generera fly varianter till mänskliga och murina mAbs inducerad av säsongsbunden influensavaccin, H7N9 vaccination eller sekventiella DNA/rekombinant HA protein vaccination4,5 ,6,7. Som beskrivits ovan, präglades först antikroppar med HI och mikroneutraliserings analyserna för att informera oss om vilka specifika protokoll att fortsätta med nästa4,5. Antikroppar 07-5D 03, 07-5F01, 07-5G 01, 07-4B03, 07-4E02 och 07-4D 05 befanns ha HI och neutralisering aktiviteter mot aviär H7N9 virus (A/Shanghai/1/2013) (tabell 1), och således protokoll 1 (steg 2.1) utnyttjades. För mAbs med neutraliserande som saknar HI aktivitet, till exempel 41-5E04, 045-051310-2B06, 042-100809-2F04 och S6-B01 (tabell 1), användes protokoll 2 (steg 2.2) för att generera fly varianter. Escape mutant kartläggning visade att många av antikropparna igen kritiska rester i olika platser på viral HA4,5 (figur 4). Medan majoriteten av HI-positiva antikroppar har escape mutant rester nära tidigare rapporterade antigena platser av den H7 HA, genereras HI-negativ antikroppar escape mutants med punktmutationer i stjälken region4,5 .
| Antikropp | Hej aktivitet | NEUT aktivitet |
| 07-5D 03 | + | + |
| 07-5F01 | + | + |
| 07-5G 01 | + | + |
| 07-4B03 | + | + |
| 07-4E02 | + | + |
| 07-4D 05 | + | + |
| 41-5E04 | - | + |
| 045-051310-2B06 | - | + |
| 042-100809-2F04 | - | + |
| S6-B01 | - | + |
Tabell 1: Tabell över antikropp HI och neutralisering aktivitet. Tio H7-specifika mAbs isolerade från individer som vaccinerats med en experimentell H7N9 vaccinet uppvisar olika in vitro- antivirala aktiviteter5.
| Forward Primer (5' till 3') | Reverse Primer (5' till 3') | Thermocylcer villkor | ||||||||
| IAV | TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG | ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT | 42 ° c i 60 min, 94 ° c under 2 min/5 cykler på 94 ° c för 20 s, 50 ° c under 30 s och 68 ° c under 3 min 30 s, följt av 40 cykler av 94 ° c för 20 s, 58 ° c under 30 s , och 68 ° c under 3 min 30 s med en sista förlängning tid vid 68 ° c i 10 min | |||||||
| IBV | GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC | CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC | 45 ° c under 60 min, 55 ° c under 30 min, 94 ° c under 2 min/5 cykler på 94 ° c för 20 s, 40 ° c under 30 s och 68 ° c under 3 min 30 s, följt av 40 cykler av 94 ° c för 20 s , 58 ° c under 30 s och 68 ° c under 3 min 30 s med en sista förlängning tid vid 68 ° c i 10 min | |||||||
Tabell 2: Universal influensa virus primers. Primer-par för förstärkning av segmenten HA influensa A27 , B28 virus och deras respektive termocyklern villkor.
Figur 1: HI assay. (A) A Schematisk för inställningen-upp en HI-analysen att testa två mus H1-specifika mAbs 7B2 (huvud-specifik) och 6F12 (stjälk-specifik) använder en plattan med 96 brunnar i V-botten, och (B) ett exempel på resultaten av en HI assay23verksamhet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: mikroneutraliserings-analys. En schematisk för att inrätta en mikroneutraliserings-analys att testa två mänskliga mAbs 4 d 055 och CR911417verksamhet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Generation av escape mutants. Den metod som föreslås kommer att vara beroende av HI och aktiviteten mikroneutraliserings utställda av antikroppen. Generering av escape mutants mot (A) kan neutraliserande HI-positiva antikroppar kräva en enda passage i ägg, medan (B) neutraliserande HI-negativ antikroppar kan innebära flera passager med ökande antikropp belopp i cell vävnadskultur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: exempel på en epitop karta över den nya aviär H7N9 HA genereras med escape mutant varianter. Vaccininducerade antikroppar isolerade från individer som vaccinerats med en kandidat H7N9 influensa vaccin användes för att generera escape mutant varianter. Varje rester anges i rött representerar platsen för viktiga aminosyror som krävs för effektiv bindning av en mAb. Data anpassades från Dunand-Henry et al., 20154. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Även om majoriteten av rester som identifierats via escape mutants har varit korrekt, är en av de stora förbehåll av detta tillvägagångssätt att punktmutationer fly varianter inte kan nödvändigtvis karta inom molekylär fotavtryck av antikroppen som bestäms av strukturella analyser. Detta beror på en mutation på en viss restprodukt förmåga att leda till en conformationaländring distala till platsen för det muterade rest, analogt med en Alloster effekt. En annan begränsning är att denna metod endast kan genomföras för neutraliserande antikroppar. antikroppar som saknar i vitro selektionstryck leder inte fly mutanter. Men kan denna begränsning övervinnas med hjälp av en panel av fly varianter genereras av tidigare kännetecknas neutraliserande antikroppar. Tan et al. används en fly variant av en neutraliserande mAb till H7N9 virus för att mappa epitop av en icke-neutraliserande antikropp7.
Dock ger klarlägga epitoper av antikroppar genom generering av fly varianter ett lönsamt alternativ till crystallography och cryo-elektron mikroskopi, vilka båda kräver en omfattande investering i utrustning. Andra alternativ är att bestämma den minimala bindande regionen mAbs använder alanin skanning eller peptid skanning/trunkering mutanter. Alanin skanning mutagenes kan kräva en betydande mängd arbete i genererar ett stort antal varianter under screening29, medan peptid skanning är begränsad till linjär epitoper30. Den metod som beskrivs i detta protokoll kräver ingen speciell utrustning eller teknik och i själva verket använder befintliga in vitro- neutralisering analyser för att generera fly varianter av antikropparna i intresse.
Protokollet för generera fly varianter som kräver flera passager (t.ex., stjälk-specifika antikroppar) är starkt beroende av start koncentrationen av antikroppar i passage 0. Det är bättre att fela på sidan av försiktighet och börja på en logg till hälften en logg som är lägre än den halv maximal hämmande koncentrationen av en antikropp och möjliggör robust virus tillväxt. Forskaren kan spekulera att en hög titer virus kultur i närvaro av immunologiska lågtryck kommer att ha en stor genetisk variation i viral befolkningen. Fly varianter kan väljas för genom att gradvis öka antikroppkoncentrationen i de följande avsnitt. I händelse av att virus tillväxten minskar, ökas mängden viral supernatanten i nästa passage samtidigt som samma mängd antikroppskoncentrationen i tidigare passage.
Syftet med en majoritet av universal influensavaccin är att framkalla ett robust antikroppssvar mot regionen stjälk i HA. Analyser av fly varianter till stjälk-specifika antikroppar är viktiga i att definiera förhållandet mellan influensa virus fitness och immunologiska trycket. Intressant nog var fly muterade virus följd stjälk-specifika mAbs alla försvagat i vivo i murina LD50 studier4. Dessa studier ger ett starkt fall för stjälk-baserade vaccination plattformar. Detta protokoll kan dessutom användas för att identifiera escape mutants till andra anti-virala föreningar, såsom liten molekyl-hämmare. Slutligen, denna metod är inte begränsat till influensa virus ytan glykoproteiner, men också kan tillämpas mer allmänt för att avgöra epitoper av andra virus glykoproteiner.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta projekt har delvis finansierats med federala medel från nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under CEIRS kontrakt HHSN272201400008C (F.K.); NIH U19AI109946-01 (F.K.); och P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 96-well clear flat bottom TC-treated culture microplate with Lid | Corning, Inc. | 353072 | Assay plate use for the microneutralization assay |
| Falcon 96-well clear V-bottom plate | Corning, Inc. | 353263 | Assay plate use for the hemagglutination inhibition assay |
| 1X Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 11095080 | Infection medium |
| Tosyl phenylalanyl chloromethyl (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Cleaves immature HA0 to HA1 and HA2 |
| Biotinylated anti-NP primary antibody (IAV) | EMD Millipore | MAB8258B | An antibody that recognizes the NP protein of influenza A viruses |
| Biotinylated anti-NP primary antibody (IBV) | EMD Millipore | MAB8260B-5 | An antibody that recognizes the NP protein of influenza B viruses |
| Streptavidin-HRP antibody | EMD Millipore | 18-152 | This is used as a secondary antibody for the biotinylated anti-NP antibody |
| HRP substrate (SIGMAFAST-OPD) | Sigma-Aldrich | P9187-5SET | o-phenylenediamine dihydrochloride water soluble substrate for HRP |
| 96-well V-bottom plate | Nunc | 249662 | Assay plate used for the hemagglutination assay |
| Chicken red blood cells | Lampire Biological Laboratories | 7201403 | Used to assess the ability of influenza virus to agglutinate |
| TRIzol | Ambion | 15596026 | Extraction of RNA |
| Superscript III | Invitrogen | 12574018 | Reverse transcriptase |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Isolation of amplified PCR product |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Transfection reagent |
| Anti-human IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11013 | Fluorescent secondary antibody for human antibodies |
| Anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Fluorescent secondary antibody for murine antibodies |
| 6-well polystyrene microplate | Corning, Inc. | 353934 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Nalgene long term storage Cryo-tubes | ThermoFisher Scientific | 5012-0020 | Freezing of viral culture supernatant |
| reassortant A/California/04/09 (H1) | Palese Laboratory | reassortant virus expressing the HA and NA of A/California/04/09 (H1N1) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) | |
| reassortant A/Shanghai/1/13 (H7) | Palese Laboratory | reassortant virus expressing the HA and NA of A/Shanghai/1/13 (H7N9) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) | |
| Bovine serum albumin solution (35%) | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| Qiagen gel extration kit | Qiagen | 28704 | Silica-membrane-based purification of DNA fragments |
References
- Shaw, M. L., Palese, P. Orthomyxoviridae: the viruses and their replication. , (2013).
- Nelson, M. I., Holmes, E. C.
- Lauring, A. S., Andino, R. Quasispecies Theory and the Behavior of RNA Viruses. PLoS Pathog. 6 (7), e1001005 (2010).
- Henry Dunand, C. J., Leon, P. E., et al. Preexisting human antibodies neutralize recently emerged H7N9 influenza strains. J Clin Invest. 125 (3), 1255-1268 (2015).
- Dunand, C. J. H., Leon, P. E., et al. Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection. Cell Host Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).
- Tan, G. S., Lee, P. S., et al. Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin. J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).
- Tan, G. S., Leon, P. E., et al. Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection. PLoS Pathog. 12 (4), e1005578 (2016).
- Smith, K., Garman, L., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Steel, J., Lowen, A. C., et al. Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain. mBio. 1 (1), (2010).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies. J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).
- Wang, T. T., Tan, G. S., et al. Vaccination with a synthetic peptide from the influenza virus hemagglutinin provides protection against distinct viral subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18979-18984 (2010).
- Impagliazzo, A., Milder, F., et al. A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen. Science. 349 (6254), 1301-1306 (2015).
- Krammer, F., Palese, P., Steel, J. Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin. Current Topics in Microbiology and Immunology. , (2014).
- Wohlbold, T. J., Nachbagauer, R., Margine, I., Tan, G. S., Hirsh, A., Krammer, F. Vaccination with soluble headless hemagglutinin protects mice from challenge with divergent influenza viruses. Vaccine. 33 (29), 3314-3321 (2015).
- Ekiert, D. C., Bhabha, G., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
- Ekiert, D. C., Friesen, R. H. E., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Dreyfus, C., Laursen, N. S., et al. Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses. Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).
- Tran, E. E. H., Podolsky, K. A., et al. Cryo-electron Microscopy Structures of Chimeric Hemagglutinin Displayed on a Universal Influenza Vaccine Candidate. mBio. 7 (2), e00257 (2016).
- Wiley, D. C., Wilson, I. A., Skehel, J. J. Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation. Nature. 289 (5796), 373-378 (1981).
- Gerhard, W., Yewdell, J., Frankel, M. E., Webster, R. Antigenic structure of influenza virus haemagglutinin defined by hybridoma antibodies. Nature. 290 (5808), 713-717 (1981).
- Jackson, D. C., Murray, J. M., White, D. O., Gerhard, W. U. Enumeration of antigenic sites of influenza virus hemagglutinin. Infect Immun. 37 (3), 912-918 (1982).
- Matsuzaki, Y., Sugawara, K., et al. Epitope Mapping of the Hemagglutinin Molecule of A/(H1N1)pdm09 Influenza Virus by Using Monoclonal Antibody Escape Mutants. J Virol. 88 (21), 12364-12373 (2014).
- Tan, G. S., Krammer, F., Eggink, D., Kongchanagul, A., Moran, T. M., Palese, P. A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).
- Geneva: World Health Organization. WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance. , (2002).
- Brauer, R., Chen, P. Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J Vis Exp. (97), e52421 (2015).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA. J Vis Exp. (42), e2057 (2010).
- Hoffmann, E., Stech, J., Guan, Y., Webster, R. G. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. ArchVirol. 146 (12), 2275-2289 (2001).
- Zhou, B., Lin, X., et al. Universal Influenza B Virus Genomic Amplification Facilitates Sequencing, Diagnostics, and Reverse Genetics. J Clin Microbiol. 52 (5), 1330-1337 (2014).
- Sidhu, S. S., Kossiakoff, A. A. Exploring and designing protein function with restricted diversity. Curr Opin Chem Biol. 11, 347-354 (2007).
- Chen, C. -W., Chang, C. -Y. Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope. J Vis Exp. (121), e55417 (2017).
