Summary
Sistemas de videomicroscopía se utilizan para examinar propiedades funcionales de las arteriolas aisladas de tejido adiposo en respuesta a estímulos fisiológicos y farmacológicos. Esta técnica se puede utilizar para examinar fenotipos microvasculares en dominios diferentes de tejido adiposo en humanos obesos.
Abstract
Mientras que la obesidad está estrechamente relacionada con el desarrollo de enfermedad metabólica y cardiovascular, poco se sabe sobre los mecanismos que rigen estos procesos. Se presume que mediadores pro-aterogénico de tejido graso especialmente en asociación con adiposidad central/visceral pueden promover cambios vasculares patógenos localmente y sistémicamente, y la idea de que la enfermedad cardiovascular puede ser la consecuencia de la disfunción del tejido adiposo sigue evolucionando. Aquí, describimos un método único de videomicroscopía que involucra el análisis de las respuestas de vasodilatador y vasoconstrictor de las arteriolas humanas pequeño intactas extraídas el depósito adiposo de seres humanos vivos. Videomicroscopía se utiliza para examinar propiedades funcionales de microvasos aislado en respuesta a estímulos fisiológicos o farmacológicos utilizando un sistema de presión que imita las condiciones de en vivo . La técnica es un método útil para comprender la fisiopatología y mecanismos moleculares que contribuyen a la disfunción vascular localmente en el medio del tejido adiposo. Por otra parte, alteraciones en la microcirculación del tejido adiposo también se han relacionado con enfermedades sistémicas. Aplicamos esta técnica para examinar las respuestas vasculares específicas de depósito en sujetos obesos. Se evaluó la vasodilatación dependiente del endotelio a aumento del flujo y de la acetilcolina en las arteriolas adiposas (50-350 μm de diámetro interno, 2-3 mm de longitud) aisladas de dos diferentes depósitos adiposos durante cirugía bariátrica desde el mismo individuo. Hemos demostrado que las arteriolas de la grasa visceral exhiben deterioro vasodilatación dependiente del endotelio en comparación con los vasos aislados del depósito subcutáneo. Los resultados sugieren que el microambiente visceral se asocia con disfunción endotelial vascular que puede ser relevante para la observación clínica a mayor adiposidad visceral a los mecanismos de la enfermedad sistémica. La técnica de videomicroscopía puede utilizarse para examinar fenotipos vasculares de diferentes depósitos de grasa, así como comparar los resultados a través de individuos con diferentes grados de disfunción metabólica y obesidad. El método puede utilizarse también para examinar las respuestas vasculares longitudinalmente en respuesta a las intervenciones clínicas.
Introduction
Videomicroscopía es una técnica útil para examinar la función vasomotora de las arteriolas pequeñas de seres humanos vivos ex vivo. Nuestro laboratorio se ha centrado en la disección de pequeños microvasos de tejido adiposo diferentes compartimentos para caracterizar los efectos de varios microambientes adiposas en la microvascularización. Una gran ventaja de esta técnica es que los vasos sanguíneos extraídos del cuerpo humano funcionales y puede ser examinados fácilmente dentro de minutos a horas después de la biopsia. Condiciones fisiológicas son mímico y constante presión transmural en el espacio intraluminal a través de cánulas micro-vidrio que recapitular muchas características en vivo . 1 , 2 además, un montaje de videomicroscopía confiable con el software de detección de borde automática permite evaluación cualitativa y cuantitativa de capacidad de vasodilatador y vasoconstrictor dependiente de endotelio - independiente y de aislados Barcos en tiempo real, que permite rápida evaluación fisiológica en respuesta a estímulos físicos y farmacológicos. 3 otras técnicas microvasculares también están disponibles como alambre miografía que tiende a ser mucho menos tiempo y medir las respuestas de tensión a varios agonistas por un transductor de fuerza.
Nuestro laboratorio ha aplicado videomicroscopía para examinar la relación entre obesidad y disfunción vascular, centrándose en los efectos de los dominios diferentes de tejido adiposo en la vasculatura. Adiposidad central con acumulación de grasa visceral abdominal ha estado más estrechamente vinculada a la producción de adipocitoquinas, disfunción metabólica y riesgo cardiometabólico. Se ha postulado que la disfunción del tejido adiposo con exceso de producción de disregulación de citocinas y adipoquinas pro-aterogénico están fuertemente implicados en estos procesos, pero moléculas reguladoras específicas y los objetivos del tratamiento siguen siendo en gran parte sin descubrir. 4 por otra parte, en el nivel local del tejido adiposo, rarefacción capilar y alteración de la perfusión se han relacionado con tejido adiposo pseudohypoxia y dysregulation metabólico. La hipótesis de que la enfermedad cardiovascular puede ser la consecuencia de la disfunción del tejido adiposo está evolucionando. Pro-aterogénico mediadores liberados de la grasa, particularmente en asociación con adiposidad central/visceral, probablemente promueven la disfunción endotelial y patógenos cambios vasculares que se pueden manifiestan localmente en la vasculatura adiposa y detectan mediante la Aquí se describe la metodología. 5
La evaluación funcional de las arteriolas aisladas del tejido adiposo es un enfoque útil para comprender la fisiopatología y mecanismos moleculares que contribuyen a la disfunción vascular en la obesidad humana. Para investigar los mecanismos que contribuyen a la disfunción específicos de depósito de grasa, se han desarrollado métodos para examinar dependiente del endotelio y - independiente respuestas vasodilatadoras de la microvascularización y evaluar la expresión de diversos regulatorios candidatos en muestras pareadas de visceral y subcutáneas (SC) tejido graso obtenidos de sujetos obesos en el momento de la cirugía bariátrica.
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Protocol
el protocolo y los ejemplos aquí descritos fueron aprobados por Boston University escuela de medicina Junta de revisión institucional (IRB, protocolo #H-25644) y se llevaron a cabo con arreglo a la declaración de Helsinki. Todos los temas siempre el consentimiento informado escrito antes de la participación.
1. preparación de soluciones y cánulas Micro-vidrio
- Prepare la solución de 4-2-hydrosyethyl-1--1-ácido solución salina ácida (HEPES). Para 1 L, disolver 8,059 g NaCl, 0,298 g KCl, 0,296 g de MgSO 4 • 7 H 2 O, 0,235 g CaCl 2 • 2 H 2 O, 0.16 g KH 2 PO 4, 0.01 g EDTA, 1,081 g D glucosa y 2,383 g HEPES ácido en 950 mL de desionizada agua. Enrasar a 1 L con agua desionizada. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH. Buffer HEPES se puede almacenar 7 días a 4 ° C.
- Preparar el 20 x acción tampón salino. Para 1 L, agregar 143,8 g NaCl, 7,0 g KCl, 5,9 g de MgSO 4 y 7.4 g CaCl 2 • 2 H 2 O en 900 mL de agua destilada. Completar volumen a 1 L con agua desionizada. Almacene la solución a 4 ° C.
- Preparar el 20 x existencias. Para 1 L, agregar 26,8 g NaHCO 3 y 0,2 g EDTA·2H 2 O en 900 mL de agua desionizada. Completar volumen a 1 L con agua desionizada. Almacene la solución a 4 ° C.
- Prepara la solución de KREBS para ser utilizado en los experimentos fisiológicos. Para 1 L, agregar 50 mL de 20 x existencias, 900 mL de agua desionizada, 50 mL de solución salina tampón, 0,99 g D-glucosa de 0.16 g KH 2 PO 4 20 x. Ajustar el pH a 7,4 con ácido clorhídrico. Para mantener el pH del buffer, revuelva constantemente y cubrir con parafina o burbuja continuamente.
- Cheque el pH cada 20 minutos hacer la solución de KREBS fresco diario.
- Hacer vidrio micro cánulas de un diámetro interior de 40-240 μm utilizando un extractor de aguja/pipeta disponible comercialmente. El tamaño de las cánulas de vidrio se determina por el tamaño del diámetro interior de los vasos sanguíneos aislados (50-350 μm). Como alternativa, comprar cristal micro cánulas del tamaño predeterminado de.
2. Preparación de reactivos
- preparar la acetilcolina (Ach, 10 -2 M, solución). Disolver 18,29 g en 10 mL de agua desionizada. Almacenar en alícuotas de 1 mL de solución madre (10 -2 M) a-80 ° C. En el día del experimento en serie diluir hasta obtener las siguientes concentraciones de trabajo: 10 -5 10 -6, 10 -7, 10 -8, 10 -9 M.
- Preparar la papaverina (2 x 10 -2 M, solución). Disolver 0,07517 g en 10 mL de agua desionizada. Preparar 10 alícuotas de μl de la solución madre y conservar a -80 ° C. en serie diluir para obtener 10 -4 10 -5 10 -6, 10 -7, 10 -8 M en el día del experimento.
- Preparar la endotelina 1 (ET-1, 2 x 10 -5 M, solución). Disolver 50 μg endotelina-1 en 1 mL de 1% BSA/PBS. Almacenar en alícuotas de 1 mL de solución madre (2 x 10 -5 M) a-80 ° C. En el día del experimento diluir hasta obtener una concentración de trabajo de 10 -10 M en el día del experimento.
- Almacenar reactivos en cualquiera de los dos-20 ° C o a-80 ° C según tipo de congelador disponible, pero no más de 6 meses.
3. Tejido adiposo y vasos preparación
- recluta hombres obesos y las mujeres (índice de masa corporal (IMC) ≥ 35 kg/m², edad ≥ 18 años) inscritos en el programa de cirugía bariátrica en el Boston Medical Center (BMC). Un total de 40 sujetos participaron en estos experimentos.
- Recoger muestras de tejido adiposo subcutáneo y visceral durante cirugías bariátricas planeadas por el cirujano realice la operación en.
- Cosecha el subcutánea adiposo tejidos de la pared abdominal inferior y visceral de grasa de mayor epiplón, respectivamente. Tamaño de la muestra de tejido adiposo típico varía de 3 a 10 mg de tejido.
- Lugar los tejidos inmediatamente frío HEPES buffer solución con un pH de 7.4 y almacenar a 4 ° C por 24 h.
Nota: Además, adiposas arteriolas pueden obtenerse individuos lean durante otros tipos de cirugías tales como reparaciones de hernia o cirugía plástica y también puede ser hecho una biopsia del depósito subcutáneo mediante biopsia de la almohadilla de grasa abdominal trans cutánea < sup clase = "xref" > 6.
- Cuidadosamente usando un microscopio de disección de tejido, micro tijeras y pinzas de micro, quitar grasa y tejido conectivo circundantes de las pequeñas arteriolas adiposas (50-350 μm de diámetro intraluminal, 2-3 mm de longitud).
- Tie off todas las ramas de las arteriolas utilizando nylon pequeña o suturas de seda antes de canular en las pipetas capilares de vidrio. Disecar cuidadosamente las arteriolas ya incluso menor daño de la pared de la arteriola provoca cambios funcionales significativos.
- Minimice la exposición de recipiente a la luz y el calor ya que puede causar vasodilatación. Puesto que puede ser a veces difícil distinguir arteriolas vénulas, identificar el tono tamaño y músculo liso de los vasos por pellizcar las puntas de los vasos. Las arteriolas son generalmente más pequeñas y demostrar mayor tono en comparación con los venules.
- Preparar la cámara de órgano. Llene lentamente las pipetas capilares de vidrio y tubo de goma con solución de KREBS utilizando una jeringa de 10 mL.
- Una vez que se llena el tubo de goma y vidrio pipetas capilares están sumergidas en solución de KREBS dentro de la cámara de órgano, canule las arteriolas sobre las pipetas aseguradas y atar ambos extremos de la arteriola con nylon o nudos de sutura de seda cuidadosamente.
- Llenar la cámara de órgano con solución de KREBS hasta 2 mL.
- Garantizar la cámara de órgano a un escenario con el microscopio invertido (objetivo magnificación 10 X / 0.25) y cámara de video.
- Encender el software de detección de borde que se transmiten en tiempo real a una tasa de muestreo de 1 kHz (1 frame/s).
- Conectar un lado de la tubería a presión a la solución de KREBS presión llenado depósitos libre de burbujas, como las burbujas pueden introducir error experimental. Conecte el otro extremo de la tubería a presión a la cámara de órgano.
- Conectar los depósitos de presión de solución llenada de KREBS con el transductor de presión con un tubo limpio.
- Control de flujo intra-luminal mediante la regulación de la altura de estos dos embalses; así, cuando depósitos son colocados a la misma altura, no hay flujo intra-luminal ocurrirá.
- Una vez todos estos procesos, encender calefacción programa bloque y software para mantener la temperatura a 37 ° C. continuamente inundar el recipiente con solución de KREBS y airear con una mezcla de gas de 5% CO 2, 21% O 2 y 74% N 2 7 , 8 a lo largo de todo el procedimiento experimental.
- Para lograr la presión deseada inside la luz de los vasos aislados aumentar gradualmente la presión intraluminal (5 mmHg, cada 5 min) a través de la unidad de control de presión en el panel de interfaz mio, hacerlo a un ritmo lento para evitar el daño de la capa endotelial.
Nota: Una vez que la presión alcance 60 mm Hg, un período de 20-30 min equilibrado es necesaria para estabilizar la nave. Se realizan todos los estudios de la función vascular en 60 mmHg y 37 ° C a pH 7,4. 7
4. Evaluación de la función Microvascular adiposo
Nota: en general, se puede produce vasodilatación endotelial dependiente de arteriola adiposo en respuesta a la fisiológica (fluir-inducido) y estímulos farmacológicos (inducida por Ach).
- La vasodilatación dependiente del endotelio, mediada por flujo después de presurización, registrar el diámetro de la arteriola grasa en reposo (Di). Esto se conoce como el diámetro basal reposo.
- Pre-constrict los vasos sanguíneos a ~ 55% del diámetro basal reposo (Dp) mediante la adición de 1 μl de endotelina-1 (ET-1, 10 − 10 M) directamente al baño y espere 5 minutos para el efecto. Repita este proceso hasta alcanzar el deseado ~ 55% previamente limitado estado.
- Después de la constricción, inducir flujo continuo en el espacio intraluminal de las arteriolas de tejido adiposo, en igualdad y direcciones opuestas de modo que una diferencia de presión puede ser desarrollada a través de la nave sin alterar la presión intraluminal media de 60 mm Hg.
Nota: por ejemplo, si un depósito se mueve hacia arriba por 10 cm de altura, otro debe mover hacia abajo 10 cm para modificar los gradientes de presión y así cambiar flujo intramural. Si se desean más precisas mediciones de tasa de flujo, un sistema medidor de flujo cuantitativo se puede aplicar al montaje experimental. - Medir la dilatación mediada por flujo de 3-5 min después de la iniciación de la inducción de flujo. Los niveles de flujo intramural (gradientes de presión) pueden ser en el rango de 0 - 100 cmH 2 O. aumentar cada incremento de gradiente de presión Δ10 cmH 2 O cada 5-6 min., hasta un máximo de 100 cmH 2 O.
Nota: Para inducir el flujo laminar estable en el lumen, ambos tamaños de punta de cánula de vidrio tienen que estar muy cerca de diámetro interno de las arteriolas; de lo contrario, se produce flujo turbulento dentro del lumen e inducir errores de medición. - Tras la evaluación del flujo-mediada por dilatación, devolver depósitos de presión a la misma altura (60 mmHg).
- Luego, arteriola y cámara de lavado quitando inmediatamente la solución de la cámara y reemplazar con la nueva solución de KREBS. Esto se hace con cuidado para no perturbar la arteriola suspendida dentro de la cámara de.
- Repetir este proceso 3 - 4 veces durante 20-30 minutos, o hasta que el buque aislado devuelve al diámetro basal reposo.
- Vasodilatación mediada por acetilcolina, dependiente de endotelio,
- cuando la arteriola adiposa ha vuelto al reclinación diámetro basal, la constricción vasos ~ 55% mediante la administración de endotelina-1 (ET-1, 10 − 10 M) directamente a la bañera, como se describe anteriormente en la sección 4.1.2.
- Después de la constricción, secuencialmente administrar dosis crecientes (2 μL) de la acetilcolina que es un receptor-medió, óxido nítrico agonista (Ach 10 -9 a 10 -5 M) directamente a la bañera. Registrar el cambio en el diámetro arteriolar 5 min después de la administración de cada dosis.
- Una vez que el buque ha llegado a una meseta después de la administración de la dosis final de Ach, lave el vaso 3 - 4 veces con solución de KREBS. Permitir que 20-30 min para el recipiente recuperar y devolver al diámetro basal de reposo. Para ayudar a mantener el pH en la comba de órgano, cambiar solución de KREBS cada 15 minutos
- Incubar la arteriola con N w - nitro - l-éster metílico de arginina (L-NAME, 10 -4 M), un inhibidor de la óxido nítrico sintasa por 30 min y luego repetir 4.2.1 y 4.2.2 caracterizar la contribución relativa de el óxido nítrico a la vasodilatación mediada por Ach.
- Evaluar la vasodilatación independiente del endotelio (función del músculo liso vascular) y la viabilidad de buque por una administración secuencial de dosis creciente de la papaverina (10 -8 a 10 -4 M) directamente a la bañera. Si el diámetro del vaso no volver a, o exceden el diámetro inicial (Di) descanso en respuesta a la papaverina (es decir, vasodilatación apropiada), considerar que el buque no viables y descartar los puntos de datos.
5. Análisis de datos y cálculo
- calcular la reactividad vascular. Uso de vasodilatación por ciento para la expresión de datos representan diferencias basales diámetro del vaso y calcular mediante la siguiente ecuación:
% vasodilatación = (DT-Dp/Di-Dp) × 100
donde DT es el diámetro registrado en un momento determinado (máximo diámetro), Dp es el diámetro registrado después de la adición del agente de vasoconstricción (es decir. ET-1 inducida por el diámetro de la constricción), y Di es el diámetro inmediatamente antes de la adición del agente de vasoconstricción (descanso diámetro basal). 9 - definir sensibilidad de vasodilatación y vasoconstricción (dosis-respuesta) a un agonista como la concentración de Ach, papaverina o ET-1 que provoca el 50% de la máxima respuesta (CE 50) que puede ser definido por un parámetro sigmoidal y trazada, como se describió anteriormente. 10
Nota: los estudios de reproducibilidad interobservador de la vasodilatación de microvessels del adiposa tiene un coeficiente de correlación alto (CC) de 0,99 (n = 10 experimentos de buque) en nuestro laboratorio.
6. Análisis estadístico
- Express continua mediciones como la media ± SEM. Estos tienden a distribuirse normalmente. Analizar la reactividad vascular en arteriolas adiposas por medidas repetidas ANOVA dos vías.
- Por otra parte, comparar el área bajo la curva (AUC) de la parcela para vasodilatación acumulativa dosis-respuesta entre grupos de tratamiento. En todos los casos, considerar P < 0.05 estadísticamente significativa.
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Representative Results
Nuestro laboratorio ha utilizado videomicroscopía examinar dependiente del endotelio y - vasodilatación independiente, así como función vasoconstrictoras de tejido adiposo arteriolas aisladas de grasa subcutánea y visceral de los seres humanos obesos. El montaje experimental característica se muestra en la figura 1A. Tejido adiposo arteriolas están suspendidas entre dos pipetas capilares de vidrio y aseguradas en su lugar con suturas dentro de la cámara de órgano como se muestra en la figura 1B. Como se describe anteriormente en la sección 5.1, respuestas arteriolares entonces pueden evaluarse examinando el buque en condiciones basales (figura 2A), seguido de la constricción con ET-1 a ~ 55% de diámetro basal (figura 2B) y luego inducida por el agonista vasodilatación y relajación del lumen vascular como mostrado en la figura 2.
Nosotros y otros hemos observado que las respuestas de vasodilatación dependiente del endotelio a aumento del flujo (shear stress)11 y12 de la Ach fueron significativamente blunted en visceral en comparación con las arteriolas adiposas subcutáneas (Figura 3A, 3B ) en la obesidad humana. Sin embargo, la vasodilatación independiente del endotelio en respuesta a la papaverina no fue alterada diferencialmente entre los dos depósitos (figura 3). Juntos, estos resultados sugieren que la disfunción vascular en dominios viscerales es en gran parte un resultado de la disfunción a nivel del endotelio, por lo menos en etapas tempranas de la enfermedad. Esta técnica permite el análisis sistemático de las respuestas de vasodilatador de arteriolas humanas pequeño intactas y puede aplicarse también a otras regiones accesibles de la vasculatura humana. El sistema ex vivo se puede manipular mediante numerosos métodos farmacológicos como respuestas a la insulina como un índice de resistencia de insulina endotelial vascular6o estudios de dosis-respuesta a la nitroglicerina a prueba de músculo liso vascular función de la capa. 12 métodos biológicos como el silenciamiento de RNA pueden también ser introducido13 potencialmente desarrollar marcos mecanicistas para la comprensión críticos reguladores que confieren la disfunción vascular en condiciones de enfermedad específica.
Figura 1: configuración de videomicroscopía. Imagen de (A) que representa los componentes de la cámara de órgano de videomicroscopía. (B) imagen de una arteriola adiposa humana montada entre dos pipetas capilares de vidrio en la cámara de órgano. Diámetro del vaso cambia en respuesta a estímulos fisiológicos y farmacológicos que pueden examinarse y cuantificados usando especializado software de análisis y un accesorio de cámara invertida en el sistema. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: ilustración de vasodilatación microvascular mediante presión videomicroscopía. Diámetro arteriolar de reposo basal (A) (diámetro de la presurización, ningún agonista o estimulación: Di) diámetro de la estrecho (B) (después de ET-1 inducida por el diámetro de la estrecho: Dp), (C) inducida por los agonistas vasodilated diámetro (después de Ach fue agregada: DT). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: vasodilatación dependiente del endotelio y - independiente en subcutánea vs arteriolas adiposas viscerales en humanos obesos. Vasodilatación dependiente del endotelio era significativamente atenuada en visceral en comparación con el tejido adiposo subcutáneo arteriolas cuando se evaluó por (A) aumentaron del flujo (emparejado los vasos subcutáneos y viscerales, números = 20), o (B) respuesta de la dosis de acetilcolina con o sin L-NAME (emparejado los vasos subcutáneos y viscerales, números = 16). (C) independiente del endotelio vasodilatación no fue alterada diferencialmente entre arteriolas viscerales y subcutáneas cuando evaluaron la respuesta a la dosis de la papaverina (emparejado los vasos subcutáneos y viscerales, números = 8). * Denota diferencias de grupo entre depósitos; †Denotes depot específicas diferencias acetilcolina con L-NAME en comparación con acetilcolina sola; NS: no significativo. Los datos se presentan como mean± SEM, p < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La disección y aislamiento de las arteriolas adiposas de los tejidos circundantes pueden ser un proceso desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva con atención al detalle y protocolo técnico. El procedimiento de microdisección requiere habilidades meticulosas y utensilios especializados la disección para evitar posibles daños en el músculo liso o endotelial celular capas de la microvascularización. Incluso pequeñas punciones accidentales en la pared arteriolar pueden prevenir presión intraluminal y resultados en un experimento fracasado. Además, la canalización de las arteriolas utilizando suturas es crucial para garantizar las arteriolas entre las puntas de la pipeta capilar de vidrio en cada extremo de la nave.
Microvasos aislado humano pueden desarrollar tono miógeno espontáneo después de 30-40 min de presurización en 60 mmHg. Sin embargo, encontramos que las arteriolas adiposas humanas generalmente tamaño 50-350 μm de diámetro luminal interno son relativamente pequeñas con escasas capas de músculo liso vascular y tienden a no desarrollar tono miógeno significativo comparado con las arteriolas del músculo esquelético. Por lo tanto inducir la constricción de las arteriolas pequeñas con ET-1 antes de la exposición a los vasodilatadores. Encontramos que la ET-1 ejerce una respuesta vasoconstrictora más previsible aunque en algunos casos puede haber variabilidad en las respuestas a los agonistas de los receptores alfa como la fenilefrina. Es imprescindible escoger los agonistas apropiados para inducir una constricción antes de ~ 55% deseado; sin embargo también es importante seleccionar la correcta cantidad de agente pre-apretado para evitar la sobre dosificación y el daño tóxico al recipiente. Logramos esto a partir de la dosis más baja de gama y valorar hasta a efecto tal como se describe en la sección 4.1.2.
Las arteriolas en el tejido adiposo están sensibles a los cambios de pH y temperatura; 14 por lo tanto, es crucial monitorear y controlar el adecuado pH (7.4) y temperatura (37 ° C) durante el proceso experimental. Videomicroscopía es un sistema bien regulado de temperatura controlada, es imprescindible vigilar el pH de la solución de KREBS durante todo el experimento para evitar cambios que pueden sesgar los resultados. Burbujeo continuo de la solución de KREBS y el reemplazo de solución cada 15 minutos durante la presurización y pasos de lavado reducen las variaciones de pH con el tiempo.
Videomicroscopía es una técnica útil para examinar las propiedades funcionales de microvasos, la técnica tiene una considerable curva de aprendizaje y puede ser mano de obra particularmente durante el proceso de aislamiento vascular. Dependiendo del tipo de tejido que una biopsia, nuestra experiencia con los microvasos del tejido adiposo ha demostrado que el procedimiento de la canulación puede tomar una cantidad significativa de tiempo y paciencia. Además, hay tiempo inherente sensibilidad a los experimentos como los vasos fuera del cuerpo tienden a perder sus propiedades fisiológicas y funcionales con el tiempo. Así, los experimentos deben realizarse dentro de la ventana viable de los vasos de minutos a horas después de la biopsia quirúrgica antes de la desintegración eventual del tejido.
La relevancia clínica y la lógica de este modelo experimental utilizando videomicroscopía para estudiar las arteriolas se apoya en nuestra capacidad de sonda directamente patofisiología en intactos todo segmentos de vasos humanos extraídos de temas de la vida, que no pueden ser replicados por la proyección de imagen no invasivas. De hecho, nuestra capacidad de acceder directamente y examinar vasos humanos disfuncionales en, por ejemplo un cuerpo obeso, nos pueden ofrecer oportunidades para profundizar en las vías que se alteran diferencialmente en condiciones de enfermedad y de novela dianas terapéuticas. Además, datos publicados de nuestro laboratorio y otros muestran que ex vivo la evaluación de función arteriolar adiposo correlaciona con en vivo las respuestas de la función endotelial sistémica en otros lechos vasculares dentro de un individuo y asociado con factores de riesgo cardiovascular incluyendo hipertensión, fumar, diabetes e inflamación. 12 , 15 , 16 también hemos publicado datos que demuestran una correlación significativa entre los resultados de immunohistochemical pertinentes a la biología de óxido nítrico en células endoteliales adiposas viscerales y la vasodilatación mediada por flujo arterial braquial sugiriendo anormalidades paralelas en adiposo y circulaciones sistémica. 17 dado el carácter sistémico de la disfunción endotelial, creemos que esta técnica representa un enfoque pragmático a estudiar tejido vascular no sólo humano sino también utilizar este método en animales y estudios clínicos longitudinales a examinar los efectos del tratamiento. También existen otras técnicas para examinar la microvascularización como alambre miografía, que tiende a ser menos técnicamente difíciles de realizar y permite medidas de tensión isométrica de vasos aislados a varios agonistas utilizando un transductor de fuerza. Mientras que este método también proporciona información sobre las propiedades fisiológicas de los microvasos, la configuración no utiliza un sistema de presión intra-luminal que puede hacerla menos apto para recapitular en vivo condiciones. Una ventaja de videomicroscopía es la capacidad de inducir una presión intraluminal relativamente constante minimizar cambios en corte en el lumen. El método puede aplicarse a los microvasos de tamaño similar en humanos y animales. 9 , 12 , 18 por último, cabe señalar que un número de sistemas disponibles comercialmente videomicroscopía está disponible para la compra y montaje; sin embargo los conceptos fisiológicos en general son bastante uniformes en todas las plataformas. 2 , 6 , 18
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Disclosures
Autores no tienen revelaciones o conflictos de interés al informe.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a los voluntarios por su participación en estos estudios y el personal quirúrgico en el Boston Medical Center para proporcionar las biopsias de tejido adiposo. Dr. Gokce es apoyado por los institutos nacionales de subvenciones de salud (NIH) HL081587, HL114675 y HL126141. Dr. Farb es apoyado por los NIH grant HL135394 K23.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical Name | |||
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Endothelin-1 | Sigma Aldrich | E7764 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
| Nw-nito-L-arginine methyl ester hydrochloride | Sigma Aldrich | N5751 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Papaverine | Sigma Aldrich | P3510 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2Po4) | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Forceps | Finescience tools | 15000-08 | |
| Inverted microscope | Zeiss Achromat | ||
| Laboratory tubing | Euro-Pharm | 250100306F999 | |
| Needle/pippette puller | David kopf instruments | 720 | |
| Ophthalmic monofilament nylon suture | Surgical specialties | A7756N | |
| Scissors | Finescience tools | 150000-08 | |
| Vessel Chamber | DMT | VAS v.2.1 |
References
- Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96 (4), 313-326 (1999).
- Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography. J Vis Exp. (101), e50997 (2015).
- Gutterman, D. D., et al. The Human Microcirculation: Regulation of Flow and Beyond. Circ Res. 118 (1), 157-172 (2016).
- Fuster, J. J., Ouchi, N., Gokce, N., Walsh, K. Obesity-Induced Changes in Adipose Tissue Microenvironment and Their Impact on Cardiovascular Disease. Circ Res. 118 (11), 1786-1807 (2016).
- Farb, M. G., et al. Reduced adipose tissue inflammation represents an intermediate cardiometabolic phenotype in obesity. J Am Coll Cardiol. 58 (3), 232-237 (2011).
- Farb, M. G., et al. WNT5A-JNK regulation of vascular insulin resistance in human obesity. Vasc Med. 21 (6), 489-496 (2016).
- Durand, M. J., Phillips, S. A., Widlansky, M. E., Otterson, M. F., Gutterman, D. D. The vascular renin-angiotensin system contributes to blunted vasodilation induced by transient high pressure in human adipose microvessels. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307 (1), H25-H32 (2014).
- Farb, M. G., et al. Cyclooxygenase inhibition improves endothelial vasomotor dysfunction of visceral adipose arterioles in human obesity. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 349-355 (2014).
- Park, S. Y., et al. Impact of age on the vasodilatory function of human skeletal muscle feed arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (2), H217-H225 (2016).
- Ives, S. J., et al. Human skeletal muscle feed arteries studied in vitro: the effect of temperature on alpha(1)-adrenergic responsiveness. Exp Physiol. 96 (9), 907-918 (2011).
- Grizelj, I., et al. Reduced flow-and acetylcholine-induced dilations in visceral compared to subcutaneous adipose arterioles in human morbid obesity. Microcirculation. 22 (1), 44-53 (2015).
- Farb, M. G., et al. Arteriolar function in visceral adipose tissue is impaired in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (2), 467-473 (2012).
- Tanner, M. J., et al. Dynamin-Related Protein 1 Mediates Low Glucose-Induced Endothelial Dysfunction in Human Arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2016).
- Ives, S. J., et al. alpha1-Adrenergic responsiveness in human skeletal muscle feed arteries: the impact of reducing extracellular pH. Exp Physiol. 98 (1), 256-267 (2013).
- Dharmashankar, K., et al. Nitric oxide synthase-dependent vasodilation of human subcutaneous arterioles correlates with noninvasive measurements of endothelial function. Am J Hypertens. 25 (5), 528-534 (2012).
- Truran, S., et al. Adipose and leptomeningeal arteriole endothelial dysfunction induced by beta-amyloid peptide: a practical human model to study Alzheimer's disease vasculopathy. J Neurosci Methods. 235, 123-129 (2014).
- Karki, S., et al. Forkhead box O-1 modulation improves endothelial insulin resistance in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1498-1506 (2015).
- Shahid, M., Buys, E. S. Assessing murine resistance artery function using pressure myography. J Vis Exp. (76), (2013).
