Une méthodologie de lésions mécaniques neuronales simples à étudier<em&gt; Drosophila</em&gt; Dégénérescence du neuron moteur

Résumé

Nous décrivons ici une méthode simple et largement accessible pour nuire aux nerfs segmentaires dans les larves de Drosophila pour visualiser et quantifier la neurodégénérescence des neurones moteurs à la jonction neuromusculaire (NMJ) des larves du troisième stade.

Résumé

La dégénérescence des neurones se produit pendant le développement normal et en réponse aux blessures, au stress et à la maladie. Les caractéristiques cellulaires de la dégénérescence neuronale sont remarquablement similaires chez les humains et les invertébrés, de même que les mécanismes moléculaires qui conduisent ces processus. La mouche des fruits, Drosophila melanogaster , fournit un organisme modèle génétique puissant mais simple pour étudier la complexité cellulaire des maladies neurodégénératives. En fait, environ 70% des gènes humains associés à la maladie ont un homologue de Drosophila et une multitude d'outils et de dosages ont été décrits en utilisant des mouches pour étudier des maladies neurodégénératives chez l'homme. Plus précisément, la jonction neuromusculaire (NMJ) dans Drosophila s'est révélée être un système efficace pour étudier les maladies neuromusculaires en raison de la capacité d'analyser les liaisons structurelles entre le neurone et le muscle. Ici, nous rapportons un test de blessure des neurones moteurs in vivo dans Drosophila , quiProvoque de manière reproductible la neurodégénérescence au NMJ de 24 h. En utilisant cette méthodologie, nous avons décrit une séquence temporelle d'événements cellulaires entraînant une dégénérescence des neurones moteurs. La méthode de la blessure a des applications diverses et a également été utilisée pour identifier les gènes spécifiques requis pour la neurodégénérescence et pour disséquer les réponses transcriptionnelles aux lésions neuronales.

Introduction

La dégénérescence neuronale se produit pendant le développement normal et peut être causée par le processus de vieillissement naturel, les blessures, le stress ou les états pathologiques. Drosophila melanogaster , la mouche commune des fruits, fournit un organisme modèle simple et puissant pour étudier la neurodégénérolat en raison des similitudes remarquables dans les mécanismes moléculaires qui entraînent la dégénérescence des neurones. Ces similitudes sont soulignées par le fait qu'environ 70% des gènes humains associés à la maladie ont un homologue de Drosophila . ¹ De plus, de nombreux tests et outils technologiques ....

Protocole

1. Préparation des réactifs et de l'équipement

1. Préparer 1x Dissection tampon (70 mM NaCl, 5 mM de KCl, 0,02 mM de _CaCl2, 20 mM de _MgCl2, 10 mM de NaHCO _3, 115 mM de saccharose, 5 mM de trehalose, 5 mM de HEPES, pH 7,2).
2. Préparez 1x solution salée tamponnée au phosphate (PBS).
3. Préparez 1x PBT en utilisant 1x PBS avec 0,01% de Triton X-100.
4. Préparer des plaques d'agar de jus de fruits. ¹⁴ En bref, mélanger 30 g d'agar dans 700 ml de H ₂ O et un autoclave. Dissoudre 0,5 g de méthyl paraben dans 10 ml d'éthanol et ajouter une solution à 300 ml de c....

Résultats

En utilisant la procédure présentée ici, nous avons démontré que la lésion neuronale mécanique permet une dissection temporelle des événements neurodégénératifs. ^{14 , 18} La séquence des événements a été précédemment caractérisée et commence par une perturbation immédiate du cytosquelette, suivie de défauts de traite axonale, d'une accumulation de protéines ubiquitinées et d'une neuro-dégénérescence subséquente après 24 jo.......

Discussion

La blessure mécanique neuronale décrite précédemment et démontrée ici peut être utilisée pour induire une blessure / stress dans les nerfs segmentaires des larves de Drosophila . ^{4 , 5 , 6 , 14} Cette technique expérimentale a été utilisée précédemment pour disséquer la séquence temporelle des événements conduisant à une neurodégénérescence, ainsi que pour examiner les changements de t.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ciseaux de micro-dissection	Outils de science fine	15000-08
Dumont #3 Forceps	Outils de science fine	11231-30	Certaines personnes préfèrent la taille 3, tandis que d’autres préfèrent la taille 5
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Certaines personnes préfèrent la taille 3, tandis que d’autres préfèrent la taille 5
CO2 Air Tank	Tech Air	UN 1013	Différentes tailles de réservoir peuvent être achetées
CO2 Appareil d’anesthésie	Genesee Scientific	59-114
Broches en acier inoxydable, taille 0.1	Outils de science fine	26002-10
SylGard 184 Élastomère, base et agent de durcissement de silicone	Dow Corning	3097358-1004	Pour couler des plaques de dissection
Bouin’s Solution	Sigma	HT 10132-1L	L’efficacité des anticorps doit être testée dans le
paraformaldéhyde de Bouin et le PFA 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Affymetrix	FLY-8030-20	L’efficacité des anticorps doit être testée dans le
microscope stéréo de dissection de	AmScope	SM-1BZ
Source lumineuse	AmScope	HL150-AY-220V
anticorps anti-nc82	Etudes développementales Hybridoma Bank	nc82-s
anti-disques gros anticorps	Etudes développementales Hybridoma Bank	AF3
Alexa Fluor anti-raifort peroxydase	Jackson Immunoresearch	123-545-021 ; 123-585-021 ; 123-605-021	On peut vous Alexa Fluor® ; 488, 594 ou 647
Flystuff Jus de raisin Agar Premix	Genesee Scientific	47-102
Lames de microscope	Genesee Scientific	29-101
Lamelles en verre	Fisher Scientific	12-545-87
Thermo Scientific Nalgene Utility Box	Fisher Scientific	03-484C	Utilisé pour créer une chambre humide pour la récupération des larves

Bouin et PFA