Nous décrivons ici une méthode simple et largement accessible pour nuire aux nerfs segmentaires dans les larves de Drosophila pour visualiser et quantifier la neurodégénérescence des neurones moteurs à la jonction neuromusculaire (NMJ) des larves du troisième stade.
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Article de méthode
Une méthodologie de lésions mécaniques neuronales simples à étudier
Dans cet article
Résumé
Résumé
La dégénérescence des neurones se produit pendant le développement normal et en réponse aux blessures, au stress et à la maladie. Les caractéristiques cellulaires de la dégénérescence neuronale sont remarquablement similaires chez les humains et les invertébrés, de même que les mécanismes moléculaires qui conduisent ces processus. La mouche des fruits, Drosophila melanogaster , fournit un organisme modèle génétique puissant mais simple pour étudier la complexité cellulaire des maladies neurodégénératives. En fait, environ 70% des gènes humains associés à la maladie ont un homologue de Drosophila et une multitude d'outils et de dosages ont été décrits en utilisant des mouches pour étudier des maladies neurodégénératives chez l'homme. Plus précisément, la jonction neuromusculaire (NMJ) dans Drosophila s'est révélée être un système efficace pour étudier les maladies neuromusculaires en raison de la capacité d'analyser les liaisons structurelles entre le neurone et le muscle. Ici, nous rapportons un test de blessure des neurones moteurs in vivo dans Drosophila , quiProvoque de manière reproductible la neurodégénérescence au NMJ de 24 h. En utilisant cette méthodologie, nous avons décrit une séquence temporelle d'événements cellulaires entraînant une dégénérescence des neurones moteurs. La méthode de la blessure a des applications diverses et a également été utilisée pour identifier les gènes spécifiques requis pour la neurodégénérescence et pour disséquer les réponses transcriptionnelles aux lésions neuronales.
Introduction
La dégénérescence neuronale se produit pendant le développement normal et peut être causée par le processus de vieillissement naturel, les blessures, le stress ou les états pathologiques. Drosophila melanogaster , la mouche commune des fruits, fournit un organisme modèle simple et puissant pour étudier la neurodégénérolat en raison des similitudes remarquables dans les mécanismes moléculaires qui entraînent la dégénérescence des neurones. Ces similitudes sont soulignées par le fait qu'environ 70% des gènes humains associés à la maladie ont un homologue de Drosophila . 1 De plus, de nombreux tests et outils technologiques pour étudier les maladies neurodégénératives humaines ont été développés et utilisés dans la Drosophila . 2 , 3 Dans Drosophila , la jonction neuromusculaire (NMJ) permet d'analyser les propriétés cellulaires et électrophysiologiques et s'est avérée être un système important d'étude de la maladie neuromusculaire due à la N visibleConnexions euron-muscle. 2 Dans cette étude, nous décrivons un test de blessure des neurones in vivo dans les larves de Drosophila qui permet une lésion reproductible des nerfs segmentaires. Cette blessure par motoneurone entraîne une séquence temporelle d'événements cellulaires entraînant une neurodégénérescence à la blessure après 24 h de NMJ. La capacité de reproduire les motoneurons causés par les lésions neurodégénératives a diverses applications telles que l'identification des gènes spécifiques requis pour le processus dégénératif, la dissection des réponses transcriptionnelles aux lésions neuronales et l'analyse des cascades de signalisation de protection. 4 , 5 , 6 Cette méthode a également été utilisée en association avec une microfluidique pour étudier la dégénérescence neuronale et la régénération chez les animaux vivants. 7
Nous utilisons un dosage quantitatif établi pour examiner le dégénérescence des neurones moteursÀ la Drosophila NMJ après une blessure mécanique. Ce dosage est basé sur le fait que la perte de membrane présynaptique et les protéines précèdent le désassemblage du réticulum subsynaptique (SSR) caractérisé par les plis de membrane du muscle postsynaptique. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Ce dosage permet de quantifier les "empreintes synaptiques" où le neurone pré-synaptique a perdu la connexion avec le muscle postsynaptique adjacent. Le processus dégénératif s'est avéré être progressif dans tout le développement larvaire 12 et ne peut être pris en compte par une modification du développement synapse ou de la germination. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 L'annonceLe recours à une lésion mécanique par rapport à des mutations préexistantes est qu'il permet la dissection de la séquence temporelle d'événements cellulaires conduisant à une neurodégénérescence au NMJ. 13
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Protocole
1. Préparation des réactifs et de l'équipement
- Préparer 1x Dissection tampon (70 mM NaCl, 5 mM de KCl, 0,02 mM de CaCl2, 20 mM de MgCl2, 10 mM de NaHCO 3, 115 mM de saccharose, 5 mM de trehalose, 5 mM de HEPES, pH 7,2).
- Préparez 1x solution salée tamponnée au phosphate (PBS).
- Préparez 1x PBT en utilisant 1x PBS avec 0,01% de Triton X-100.
- Préparer des plaques d'agar de jus de fruits. 14 En bref, mélanger 30 g d'agar dans 700 ml de H 2 O et un autoclave. Dissoudre 0,5 g de méthyl paraben dans 10 ml d'éthanol et ajouter une solution à 300 ml de concentré de jus de fruits (raisins ou pommes). Mélanger concentré dans une solution de gélose autoclavée et verser dans les couvercles de boîtes de Petri de 10 mm x 35 mm.
REMARQUE: le prémélange de grappe de pâte à raisin peut également être acheté auprès de diverses entreprises (voir Tables de matériaux ). - Obtenez des pinces de taille 5 qui permettent de blesser mécaniquement les larves.
- Utilisez Drosophila CO 2 standard appareil d'anesthésie à base de base.
2. Sélection de Larves de Drosophila
- Prenez un flacon ou une bouteille de larves errantes de troisième stade contenant de la Drosophila qui a été cultivée à 25 ° C.
- Sélectionnez dix 2 individuelles e ou 3 e stade larvaire basé sur l' apparence. Les larves du troisième stade peuvent être identifiées par l'apparition de spiracles branchés antérieurs, tandis que les larves du deuxième stade sont plus petites et ont plus de spiracles antérieurs en forme de club.
REMARQUE: Les étapes de larves peuvent également être identifiées par chronométrage. À 25 ° C, les larves du deuxième stade apparaissent environ 48 h après l'éclosion et les larves du troisième stade se déplacent environ 24 heures plus tard. Si vous êtes intéressé par l'examen de la neurodégénérescence au NMJ, les larves du deuxième stade doivent être blessées.
3. Préparation des larves de Drosophila pour blessures mécaniques
- Choisissez soigneusement des larves individuelles par une pince ou un pinceau, soit prudenteDe ne pas le compresser de toute façon.
- Placez directement dix larves dans un plat en verre contenant du PBS 1X Froid ou un tampon de dissection pour éliminer tout débris alimentaire et ralentir la motilité larvaire.
4. Lésions mécaniques et traitement des larves de la drosophile
- Placez chaque larve individuelle sur un appareil d'anesthésiant au CO 2 .
- Sous un microscope à dissection, faites rouler soigneusement chaque larve sur leur côté dorsal afin de visualiser les nerfs segmentaires à travers la cuticule.
- La taille de la position 5 pince environ 1/2 à 2/3 de la longueur de la larve à partir des crochets de la bouche. Une fois positionné, pincer environ 1/3 de la cuticule ventrale contenant les nerfs segmentaires avec des pinces de taille 5.
- Pour s'assurer que les nerfs segmentaires larvaires sont blessés, appliquer une force suffisante pour écraser les nerfs segmentaires, mais laisser la cuticule intacte. Pour déterminer la quantité de force correcte, écraser 10 larves et assurerLe taux de mortalité après 5 h est inférieur à 50%.
- Après une blessure, transférer soigneusement les larves vers une plaque d'agar de jus de fruits contenant environ 0,5 g de pâte de levure. Placez chaque larve de sorte que son extrémité antérieure est sur la pâte de levure, pour une alimentation continue malgré une motilité perturbée.
REMARQUE: Pour s'assurer que les nerfs segmentaires larvaires ont été blessés, une motilité larvaire perturbée peut être observée après transfert à la plaque d'agar. Les larves blessées sont effectivement paralysées postérieurement au site de blessure, mais peuvent encore bouger les crochets de la bouche et se nourrir. Un taux de mortalité élevé chez les animaux après une blessure est fréquent, donc il est préférable de blesser 20 à 50% de plus d'animaux que nécessaire pour une expérience. - Placez des plaques de gélose contenant de la levure et 10 larves blessées dans le fond d'une boîte de Petri vide 100 x 15 mm. Couvrez cette assiette de Petri, contenant maintenant les larves blessées sur une plaque d'agar avec une serviette en papier humide, en veillant à ce que la serviette en papier ne touche pas les larves ou les plaques d'agar. Placez ceciBoîte de Petri dans un récipient plus grand étanche à l'air, à la RT.
- Récupérer les larves pour la dissection après des périodes spécifiées (6, 12 ou 24 h) après une blessure.
REMARQUE: Pour examiner les effets immédiats de la blessure sur le cytosquelette axonal, les larves peuvent être disséquées directement après une blessure. Pour examiner les défauts de transport axonal, les larves peuvent être disséquées environ 6 h après une blessure. Environ 12 h après la blessure, une accumulation de protéines ubiquitinées peut être observée et 24 h après une blessure, une dégénérescence des neurones moteurs au NMJ peut être observée.
5. Analyse de la neurodégénérescence au NMJ
- Dissection Drosophila larvaire NMJ comme décrit précédemment. 15 , 16 En bref, les larves d'épingles sur une assiette de Sylgard, coupent la surface dorsale et filent avec des goupilles dans une goutte de tampon de dissection pour exposer la musculature de la paroi du corps. Réparer les larves dans soit 4% de paraformaldéhyde (PFA), soit la solution de Bouin en fonction de l'antiCorps utilisés pour visualiser les neurones et les muscles.
REMARQUE: la fixation de PFA doit être utilisée si des étiquettes de protéines fluorescentes, telles que Green Fluorescent Protein (GFP), doivent être visualisées car le fixateur de Bouin peut être trop sévère. - Effectuer une immunofluorescence, qui a été décrite précédemment 11 , 13 , 16 , pour marquer simultanément les neurones moteurs pré-synaptiques et les plis musculaires post-synaptiques (SSR) adjacents. Visualiser les membranes présynaptiques et les axones avec de la peroxydase de raifort conjuguée à la fluorescence (1: 300) 17 et les zones actives peuvent être colorées en utilisant un anticorps anti-Bruchpilot (Brp) (nc82; 1: 100; Development-Studies Hybridoma Bank). Diffusez simultanément les muscles post-synaptiques avec un anticorps anti-Dics Large (Dlg) (1: 10 000). 18
- Effectuer un dosage établi pour quantifier la neurodégénérescence au NMJ comme décrit précédemment. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 En bref, visualiser simultanément des NMJ individuels pour les compartiments avant et après la synaptique. Tous les boutons étiquetés avec des marqueurs postsynaptiques mais pas des marqueurs présynaptiques indiquent des sites de neurodégénérescence ( figure 1 ). Le nombre moyen de boutons par NMJ ainsi que le nombre moyen de NMJ par animal peuvent être quantifiés.
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Résultats
En utilisant la procédure présentée ici, nous avons démontré que la lésion neuronale mécanique permet une dissection temporelle des événements neurodégénératifs. 14 , 18 La séquence des événements a été précédemment caractérisée et commence par une perturbation immédiate du cytosquelette, suivie de défauts de traite axonale, d'une accumulation de protéines ubiquitinées et d'une neuro-dégénérescence subséquente après 24 jo...
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Discussion
La blessure mécanique neuronale décrite précédemment et démontrée ici peut être utilisée pour induire une blessure / stress dans les nerfs segmentaires des larves de Drosophila . 4 , 5 , 6 , 14 Cette technique expérimentale a été utilisée précédemment pour disséquer la séquence temporelle des événements conduisant à une neurodégénérescence, ainsi que pour examiner les changements de t...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
Nous tenons à remercier tous les membres des Keller et Magie Labs de l'Université Quinnipiac pour des suggestions utiles. En particulier, nous aimerions remercier Barron L. Lincoln II pour le développement de ce test de blessure au Keller Lab. Nous aimerions également remercier le baccalauréat des arts et de la science Quinnipiac Grant-In-Aid décerné à LC Keller.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Ciseaux de micro-dissection | Outils de science fine | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Outils de science fine | 11231-30 | Certaines personnes préfèrent la taille 3, tandis que d’autres préfèrent la taille 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Certaines personnes préfèrent la taille 3, tandis que d’autres préfèrent la taille 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Différentes tailles de réservoir peuvent être achetées |
| CO2 Appareil d’anesthésie | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Broches en acier inoxydable, taille 0.1 | Outils de science fine | 26002-10 | |
| SylGard 184 Élastomère, base et agent de durcissement de silicone | Dow Corning | 3097358-1004 | Pour couler des plaques de dissection |
| Bouin’s Solution | Sigma | HT 10132-1L | L’efficacité des anticorps doit être testée dans le |
| paraformaldéhyde de Bouin et le PFA 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Affymetrix | FLY-8030-20 | L’efficacité des anticorps doit être testée dans le |
| microscope stéréo de dissection de | AmScope | SM-1BZ | |
| Source lumineuse | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anticorps anti-nc82 | Etudes développementales Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-disques gros anticorps | Etudes développementales Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-raifort peroxydase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021 ; 123-585-021 ; 123-605-021 | On peut vous Alexa Fluor® ; 488, 594 ou 647 |
| Flystuff Jus de raisin Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Lames de microscope | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Lamelles en verre | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Utilisé pour créer une chambre humide pour la récupération des larves |
Références
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Réimpressions et autorisations
