Summary
ここでは、3齢幼虫の神経筋接合部（NMJ）における運動ニューロンの神経変性を視覚化および定量化するために、 ショウジョウバエ幼虫における分節神経を傷つける簡単かつ広くアクセス可能な方法について説明する。
Abstract
ニューロンの変性は、正常な発達中、および傷害、ストレス、および疾患に応答して起こる。ニューロン変性の細胞の特徴は、ヒトおよび無脊椎動物において、これらの過程を駆動する分子メカニズムと同様に著しく類似している。 ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster ）は、神経変性疾患の細胞の複雑さを研究するための強力で単純な遺伝モデル生物を提供する。実際には、疾患関連ヒト遺伝子の約70％がショウジョウバエ相同体を有し、ヒト神経変性疾患を研究するためにハエを用いて多数のツールおよびアッセイが記載されている。より具体的には、 ショウジョウバエの神経筋接合部（NMJ）は、神経細胞と筋肉との間の構造的結合を解析する能力のために、神経筋疾患を研究するための有効なシステムであることが証明されている。ここでは、 ショウジョウバエの in vivo運動ニューロン損傷アッセイについて報告する。24時間までにNMJにおいて神経変性を再現可能に誘発する。この方法論を用いて、運動ニューロン変性をもたらす細胞事象の時間的順序を記載した。傷害方法は多様な用途を有し、神経変性に必要な特定の遺伝子を同定し、神経損傷に対する転写応答を解剖するために利用されている。
Introduction
ニューロンの変性は、正常な発達中に起こり、自然な老化過程、傷害、ストレス、または病状によって引き起こされうる。 ショウジョウバエのmelanogasterは、一般的なフルーツフライは、ニューロンの変性を駆動する分子メカニズムの顕著な類似性のため、神経変性を研究するためのシンプルで強力なモデル生物を提供します。これらの類似性は、疾患関連ヒト遺伝子の約70％がショウジョウバエ相同体を有するという事実によって強調される。 1はまた、数多くのアッセイおよび人間の神経変性疾患を研究するための技術のツールは、ショウジョウバエで開発され、利用されています。 ショウジョウバエ内で2、3、神経筋接合部（NMJ）は、両方の細胞および電気生理学的特性の解析を可能にし、可視nに神経筋疾患を研究するための重要なシステムであることが証明されましたユーロン - 筋肉の接続。 図2は、本研究では、分節神経の再現性の傷害を可能にし、ショウジョウバエの幼虫におけるin vivo神経細胞傷害アッセイを説明します。この運動ニューロン損傷は、損傷後24時間のNMJにおいて神経変性を生じる細胞事象の一時的な配列を生じる。神経変性を生じる運動ニューロンを再現可能に傷つける能力は、変性過程に必要とされる特定の遺伝子の同定、ニューロン損傷に対する転写応答の解剖および保護シグナル伝達カスケードの分析などの多様な用途を有する。 図4、 図5、 図6は、この方法は、生きている動物における神経変性および再生を研究するために、マイクロ流体と組み合わせて使用されてきました。 7
我々は、確立された定量アッセイを利用して、運動ニューロン変性イオンが機械的損傷後にショウジョウバエ NMJで検出される。このアッセイは、シナプス前膜およびタンパク質の損失が、シナプス後の筋膜の折畳みによって特徴付けられる潜在網状赤血球（SSR）の分解に先行するという事実に基づいている。 8、9、10、11、12、13このアッセイは、シナプス前ニューロンが隣接シナプス後筋肉への接続を失った「シナプス足跡」の定量化を可能にします。変性工程は、幼虫の発育12を通じて進行性であることが示されており、変更されたシナプスの発達又は発芽によって説明することができません。 8、9、10、11、12広告既存の突然変異よりも機械的損傷を使用することの利点は、それが、NMJでの神経変性に至る細胞事象の時間的順序の解剖を可能にすることである。 13
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Protocol
1.試薬および装置の準備
- 1X解離緩衝液を調製する（70のNaCl、5mMのKCl、0.02mMのCaCl 2を、20mMのMgCl 2を 、10mMのNaHCO 3を、115 mMスクロース、5 mMのトレハロース、5mMのHEPES、pHは7.2）。
- 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を調製する。
- 0.01％Triton X-100を含む1x PBSを使用して1x PBTを調製します。
- フルーツジュース寒天プレートを準備する。 14簡潔には、H 2 O 700mLおよびオートクレーブ中で寒天30gを混合する。メチルパラベン0.5gをエタノール10mLに溶解し、果汁濃縮物（ブドウまたはリンゴ）300mLに添加する。濃縮物をオートクレーブ寒天溶液に混合し、10mm×35mmペトリ皿の蓋に注ぐ。
注：ブドウ寒天培地プレミックスは、さまざまな企業から購入することもできます（ 材料表を参照）。 - 幼虫を機械的に傷つけることを可能にするサイズ5の鉗子を得る。
- 標準的なショウジョウバエの CO 2を使用する
2. ショウジョウバエの幼虫の選択
- 25℃で培養した放浪している3齢幼虫を含むショウジョウバエのバイアルまたはボトルを取る。
- 外観に基づいて10個の個々の2 番目または3 番目の幼虫を選択する。第3齢幼虫は、前枝の奇形の出現によって識別することができ、第2齢幼虫はより小さく、よりクラブ様の前棘を有する。
注：幼虫の段階は、タイミングによっても識別することができます。 25℃で、第2齢幼虫は孵化後約48時間後に現れ、第3齢幼虫は約24時間後に脱皮する。 NMJで神経変性を調べることに興味がある場合、第2齢の幼虫を傷つける必要がある。
3.機械的損傷のためのショウジョウバエ幼虫の準備
- 慎重に個々の幼虫を鉗子や絵筆で慎重に選んでください。とにかくそれを圧縮しないでください。
- 冷たい1X PBSまたは解剖緩衝液を含むガラス皿に直接10匹の幼虫を置き、食物残骸を除去し、幼虫運動性を減速させる。
4. ショウジョウバエ幼虫の機械的損傷および処置
- 個々の幼虫をCO 2麻酔装置に置きます。
- 切開顕微鏡下で、キュービクルを通して分節神経を視覚化するために、各幼虫をその背側に注意深く転がす。
- 位置の大きさ5の鉗子は、口のフックから始まる幼虫の長さのおよそ1/2から2/3の距離を下っています。いったん配置されると、サイズ5の鉗子で分節神経を含む腹側キューティクルの約1/3が挟まれる。
- 幼虫の分節神経が傷ついていることを確認するには、分節神経を粉砕するのに十分な力をかけてください。正確な力量を決定するには、10匹の幼虫を粉砕し、5時間後の死亡率は50％未満である。
- 傷害後、約0.5gの酵母ペーストを含む果汁寒天プレートに幼虫を注意深く移す。その前端が酵母ペースト上にあるように、各幼虫を置いてください。
注：幼虫の分節神経が損傷したことを確実にするために、寒天プレートに移した後、幼虫の運動性が崩壊することがあります。負傷した幼虫は、損傷の部位の後ろで効果的に麻痺するが、口のフックと餌をまだ動かすことができる。損傷後の動物の高い死亡率は一般的であるため、実験に必要な量よりも20〜50％多い動物を傷つけることが最善である。 - 空の100×15mmペトリ皿の底に、酵母ペーストと10匹の傷害した幼虫を含む寒天プレートを置く。湿ったペーパータオルで寒天プレート上の負傷した幼虫を含むこのペトリ皿を覆い、ペーパータオルが幼虫または寒天プレートに触れないようにします。これを置くペトリ皿を室温でより大きな気密容器に入れる。
- 傷害後の特定の期間（6,12、または24時間）後に解剖のために幼虫を回収する。
注：軸索細胞骨格に対する損傷の即時の影響を調べるために、幼虫を損傷後に直接解剖することができる。軸索輸送欠陥を調べるために、幼虫を損傷の約6時間後に解剖することができる。損傷の約12時間後に、ユビキチン化タンパク質の蓄積が観察され、損傷の24時間後に、NMJにおける運動ニューロンの変性が観察され得る。
NMJでの神経変性の解析
- 前述のようにショウジョウバエの幼虫NMJを解剖する。 15、16背側表面に沿って切断したシルガードプレート上に簡単に説明すると、ピン幼虫、及び体壁筋肉組織を露出させる解剖緩衝液滴のピンとフィレット。 4％パラホルムアルデヒド（PFA）またはBouin's Solutionのいずれかで幼虫を抗ニューロンと筋肉を視覚化するために使用されるボディ。
注意：Bouin固定液があまりにも過酷な場合があるため、緑色蛍光タンパク質（GFP）などの蛍光タンパク質タグを視覚化する場合は、PFA固定を使用する必要があります。 - 11、13、16は 、同時にシナプス前運動ニューロンと隣接シナプス後（SSR）筋襞をマークするために、以前に記載された免疫蛍光を行います。蛍光共役型西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）（1：300） 17でシナプス前膜および軸索を視覚化し、活性部位を抗Bruchpilot（Brp）抗体（nc82; 1：100; Developmental Studies Hybridoma Bank）を用いて染色することができる。抗Dicsラージ（Dlg）抗体（1：10,000）でシナプス後の筋肉を同時に標識する。 18
- 以前に記載されているように、NMJでの神経変性を定量化するための確立されたアッセイを実施する。 8 P>、9、10、11、12、13、14簡単に説明すると、同時に前およびシナプス後コンパートメントの両方のために個々のNMJを可視化します。シナプス後のマーカーで標識されているがシナプス前のマーカーではないブトンは、神経変性の部位を示す（ 図1 ）。 NMJあたりの平均ブトン数および動物あたりのNMJの平均数を定量化することができる。
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Representative Results
ここに示した手順を使用して、我々は、機械的な神経損傷が神経変性事象の時間的解剖を可能にすることを実証した。 14、イベントのシーケンスが以前に特徴付けられ、軸索トラフィッキング欠陥続いて細胞骨格の即時中断、ユビキチン化タンパク質の蓄積、およびそれに続く神経変性の24時間後に傷害で始まるされている18。傷害の前に、WT NMJsは、シナプス前マーカーであるBrpを、NMJ全体にわたるシナプス後マーカーDlgに付随して示す （ 図1A ）。分節神経の機械的損傷は中程度から重度の神経変性を誘導することができ、Dlgで染色されたブトンは今やシナプス前活性ゾーンタンパク質Brpを欠いている（ 図1B ）。 Dlgで染色されているがBrp染色が欠けているブトンはいずれも "syn"とみなされますこのような神経変性表現型の頻度と重症度の両方を、前述のように定量化することができる[ 11] 。
図1：機械的ニューロン損傷は、筋肉のNMJで神経変性を誘導する6/7。 （ A ）損傷していないNMJsはシナプス前マーカーであるBrp（緑色）と、シナプスマーカーであるDlg（赤色）とをNMJ全体にわたって示す。 （ B ）ニューロンの機械的損傷は、Brpの消失とともにDlg染色されたブトン（赤色）によって示される神経変性を誘導する。矢印は、神経変性の個々の部位を示す。スケールバー=10μm。 より大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてくださいこの数字。
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Discussion
以前に記載され、ここに示されたニューロンの機械的損傷は、 ショウジョウバエの幼虫の分節神経における損傷/ストレスを誘発するために使用され得る。 4、5、6、14この実験的手法は、神経変性を導く事象の時系列を分析するために、ならびに損傷後の運動ニューロンの細胞体における転写の変化を調べるために以前に使用されてきました。 5、14また、この技術は、観察し、 ショウジョウバエの幼虫における軸索変性と再生を研究するために、マイクロ流体チップと併せて記載されています。この技術の7つの制限事項は、けがの導入時にキューティクルの穿刺による幼虫の死亡が含まれます。しかし、大量の幼虫は、shで粉砕することができます高幼虫死亡率を克服するための期間を短縮する。私たちが含まれている修正は、24時間後に傷害を発生するNMJ、で運動ニューロン変性を視覚化することが重要である2 番目の齢や早期の第3齢幼虫の損傷です。
ここでは、ニューロンの機械的損傷がNMJでの運動ニューロン変性を研究するために利用できることを示す。我々は、ニューロンおよびそれらの関連タンパク質が隣接筋よりもより速く変性するという事実を利用して、神経変性を定量化する確立された方法を使用する。神経変性を観察し、定量化するために8、9、10、11、12、13、14、NMJが同時に前および後シナプスマーカーの両方について染色されることが重要です。ここでは、活性領域マーカーBrpおよびシナプス後マーカーDlgの使用を示しているが、NMJで神経変性を研究するために利用できる他のプレシナプスおよびシナプス後マーカーの数多くのものがある。さらに、自分が選んだ蛍光標識分子を用いて、神経変性プロセス中のそれらの効果を研究することができる。 1）それは非常に安価である、2）ほとんどのショウジョウバエの研究室には既に必要な装置がある、3）組織は固定されているなど、いくつかのメリットがあるが、マイクロフルイディクス7のような軸索損傷後の変性を研究する方法は複雑である。従来の蛍光顕微鏡法を用いて損傷後の神経変性事象を定量化することができる。
我々は、このプロトコールが、損傷後の神経変性に関連する広範囲の細胞および分子機構を調べるために適応され得ることを想定する。特に、これらの方法は、ニューロン傷害および運動ニューロン変性および再生前後の任意の蛍光標識されたタンパク質の特徴を示す。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
私たちはQuinnipiac UniversityのKellerとMagie Labsのメンバー全員に有益な提案をいただき、ありがとうございます。特に、Keller Lab内でこの損傷アッセイを開発したBarron L. Lincoln IIに感謝したいと思います。 LC Kellerに授与されたQuinnipiac University of Arts and Science Grant-In-Aidにも感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) in Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
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