Summary
Этот документ подробно использования фиксированной потенциал Амперометрическое записей с использованием углеродного волокна электродов и ферментативные биосенсор технологии для измерения выпуска допамина и глутамата с высоким временным разрешением во время естественного награждение поведения в Женский хомяк.
Abstract
Возможность нейромедиатора релиз в масштабе быстрого времени измерения позволяет модели синапсах увязываться с конкретным поведением или манипуляций; Это мощный инструмент в изучение основополагающих механизмов и схем. В то время как метод микродиализом был использован на протяжении десятилетий для измерения почти любой аналита интерес в головном мозге, этот метод ограничен временного разрешения. Кроме того быстрое сканирование циклической вольтамперометрии височно точные и чрезвычайно чувствительных; Однако потому что это технически сложным метод основывается на electroactivity аналита интерес, исключается возможность обнаружить nonelectroactive веществ (например, нейромедиатора глутамата). Этот документ подробно описывает использование системы под ключ, которая сочетает в себе amperometry-потенциал и ферментативные biosensing для измерения Электроактивные и nonelectroactive нейротрансмиттеров с височной точностью. Сопряжения этих двух мощных методов позволяет для измерения тоник и фазовые синапсах с относительной легкостью и позволяет одновременно с записью нескольких нейротрансмиттеров. Цель этой рукописи – продемонстрировать процесс измерения допамина и глутамата синапсах в естественных условиях с помощью естественно награждение поведения (т.е., сексуального поведения) в женских хомяков, с конечной целью отображения Техническая осуществимость этого анализа для изучения других поведений и экспериментальных парадигм.
Introduction
Возможность измерения нейромедиатора релиз в бодрствовать поведения животных позволяет исследователям увязать конкретные режимы с пространственных и временных моделей синапсах-мощный инструмент для изучения механизмов и схем, лежащие в основе обоих природных и оперантной поведение в режиме реального времени. Исторически микродиализом был нанят для измерения в внеклеточной средой мозга1электрически реактивной и неспекающиеся веществ. Этот метод использует непрерывный поток водный раствор аналогичные ионного состава внеклеточной жидкости через зонд микродиализом, состоит из небольшой вал с наконечником из полупроницаемых полые волокна мембраны2. После введения зонда, медиаторы или другие аналитов интерес может пересечь полупроницаемой мембраны путем пассивной диффузии перед будучи собиранными высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), интервалы для последующего анализа Техника аналитическая химия, обычно используются для разделения, определить и количественно компонентов в гетерогенных смесь3.
Хотя микродиализом является чувствительной технологией, которая может использоваться для измерения практически любой аналита интерес, временное разрешение низка, с максимальной частотой дискретизации по приказу минут до десятков минут1,2. Изобретение быстрого сканирования циклической вольтамперометрии (FSCV), техника, которая опирается на redox потенциал Электроактивные видов, можно выяснить вблизи мгновенной концентрации аналита интерес в внеклеточной жидкости. В краткой (см. Робинсон и др. 4 для обширный обзор), электрод применяется для поднятия и опускания в треугольная волна моды на быстрое время шкала4напряжение. Когда напряжение находится в допустимом диапазоне, соединение интереса неоднократно окисляется и уменьшена. Этот окисления и сокращение приводит в движение электронов, которое создает небольшой переменный ток. Сканировать курсы проходят на шкале секунды с окислением и сокращение соединений, происходящих в микросекундах. Вычитанием фона текущего созданные зонда от тока, один может генерировать напряжение vs. текущие сюжет, уникальные для каждого соединения. Поскольку шкала времени колебаний напряжения, как известно, эти данные могут использоваться для вычисления участок тока как функцию от времени. Таким образом относительной концентрации комплекса может быть определено до тех пор, как количество электронов, переданных в каждом окисления и снижение реакции, как известно,4.
Эта химическая специфика и высокое временнóе разрешение сделать FSCV мощный метод для обнаружения изменения концентрации химических веществ в естественных условиях. Однако несмотря на эти многочисленные преимущества, этот метод требует обширных технических знаний и дорогостоящее оборудование и установки. Кроме того nonelectroactive нейромедиаторов (например, глутамата) не может измеряться с помощью этой техники. К счастью технологических достижений в области электрохимии5, а также коммерциализации этих изобретений, ввела сравнительно простой подход для измерения не Электроактивные нейротрансмиттеров в бодрствовать поведения животных без ущерба для временных метод точности а, известный как ферментативные биосенсор технологии. Этот метод использует Энзиматическая конверсия нейромедиатор nonelectroactive интерес в двух подложек, одним из которых является Электроактивные перекиси водорода, которая определяется как окисление Амперометрическое текущего генерируется прикладной потенциал5 . Коммерчески доступных биосенсор зонды (см. Рисунок 1) избирательно измерить аналитов интереса конкурсно уменьшая вклад эндогенного счётчик. В случае глутамата вклад общей interferent аскорбиновой кислоты (AA) конкурсно уменьшен для измерения тока совместно локализации оксидазы AA на активной ферментативные поверхность датчика, преобразование АА не Электроактивные dihydroascorbate и вода. Кроме того отрицательно заряженных Nafion полимерный слой под слоем фермента исключает эндогенных анионные соединений.
Этот же биосенсор экспериментальной установки можно измерить Электроактивные медиаторы как FSCV, но вместо этого он использует фиксированный потенциал записи6. В отличие от колебаний напряжения в FSCV в записи фиксированной потенциал напряжения хранится в redox потенциал для аналита интерес. Хотя это менее химически селективным, чем FSCV, как несколько нейротрансмиттеров, возможно же окислительно-восстановительного потенциала, в областях мозга, которые преимущественно наклон к одной нейромедиатора, ключ характер этого подхода перевешивает отсутствие химического специфика.
Возможность измерить Электроактивные и nonelectroactive нейромедиатора релиз в режиме реального времени и связать его с конкретных поведенческих событий предоставляет возможность изучить сходящихся нейромедиатора релиз. Эта рукопись подробности использования этой системы допросить допамина и глутамата синапсах в ответ на природные награду в бодрствования себя хомяков. Цель этого документа заключается в деталях процесс измерения этого нейромедиатора релиз во время сексуального поведения в женских хомяков, с целью продемонстрировать свои возможности для изучения других поведений и экспериментальных парадигм.
Хомяков являются идеальной моделью для использования в электрохимических записи
Исторически крыс и мышей модели были использованы в исследовании сексуального поведения. Эти виды грызунов заниматься динамической копулятивного последовательности, с участием многочисленных женских тендерной поведения, которые включают скачкообразной, бросаясь и уха шевелить побудить мужчин и погони и в конечном итоге монтировать девушки7. Монтаж, самец (с или без вагинального проникновения) длится всего несколько секунд, в течение которых женщина участвует в ее сексуальное поведение осанки (называемых лордоз) также только на несколько секунд, прежде чем возобновить активные тендерной поведения. Эта модель поведения, состоящий из высокий уровень активности, перемежаются с короткими периодами бездействия, является проблематичным для измерения в синапсах поведение животных. Во-первых может быть движение артефакты в Амперометрическое записи, которые не связаны с нервной деятельности. Во-вторых локомоции ассоциируется с выпуском определенной нейротрансмиттеров в определенных областях мозга. К примеру допамина релиз был соединен двигательной активности в дорсальной и вентральной стриатума8,9, что является основой для измерения микродиализом дофамина, после психостимулятор Администрация10. Потому что девушки типичный тендерной поведения в МОСt грызунов включают высокий уровень двигательной активности и представлены основная часть теста сексуального поведения 10 минут, это делает его трудно приписать явного компоненты сексуального поведения, которые коллективно только последние изменения в синапсах минут.
Чтобы проанализировать нейрохимических профиль женского сексуального поведения, эта лаборатория разыскал видов, в котором есть минимальный двигательной активности, сопровождающие сексуальное поведение. Копулятивного последовательности в сирийских хомяков (Mesocricetus auratus) идеально подходит для нейрохимических записей из-за отсутствия тендерной поведения обычно видели в крыс и мышей11. Как следствие женщины хомяков будет вводить и обновлять лордоз позы для свыше 9 минут 10 минут тестирования сессии12. С отсутствием посторонних опорно движений, женщина, в естественных условиях могут быть получены электрохимических записей, которые могут быть связаны с компонентами сексуальных взаимодействий с мужчиной.
Копулятивного схватки в хомяков
После введения мужской стимул животного в испытательной камере самец будет первоначально участвовать в аногенитальной области расследования (AI) самка перед монтажомее (Рисунок 2). Чтобы мужчина для монтирования самка должны взять восприимчивы сексуальные позы, известный как лордоз, в котором она арки ее обратно и отклоняет ее хвост, так что мужчины монтажа может получить полового члена доступ к ее влагалище. Мужчина будет смонтировать самка, обхватив ее конечности с обеими лапами (рис. 2B) и начать, засовывая в попытке получить intromission полового члена (рис. 2C). Мужчина будет смонтировать самка (без вставки), а также intromit несколько раз, прежде чем в конечном итоге достижение эякуляции. Эта последовательность крепления и вмешательство приводит к эякуляции, называется «копулятивного бой». Мужчины будут иметь несколько копулятивного приступами в течение одной сессии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
все описанные здесь процедуры были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) университета Миннесоты и в соответствии с руководство по уходу и использованию лабораторных животных 13 .
1. животных и катетеризации хирургии
- получить Сирийской хомячков от общего поставщика животных в возрасте приблизительно 55 дней.
Примечание: Хотя возраст животных будут отличаться из-за ограничений различных экспериментальных парадигм, для сексуального поведения важно получить половозрелых животных, которые находятся примерно того же возраста. - Дом животных в контролируемой температурой (22 ° C) и освещения (14 ч света следуют 10 h темные с светами вне в 13:00) среды, продовольствия и воды доступны ad libitum за исключением периоды экспериментальных испытаний.
Примечание: Поскольку сезонные воспроизвести хомяков, 14:10 свет/темно цикла имитирует условия их естественный разведения. - После 1 недели адаптационного в лабораторию, выполнять асептических двусторонних ovariectomies и внутричерепных стереотаксического cannulations под общим наркозом (например, Пентобарбитал) и управлять надлежащих институционально одобрил послеоперационные болеутоляющее и антибиотик лечения как описано 15 14 ,.
Примечание: Для изучения сексуального поведения, ovariectomies необходимо удалить основным источником эндогенных половых гормонов, так что животные могут равномерно вынуждены сексуальной восприимчивости экзогенные гормон в соответствии с экспериментальной шкале с.- Для дофаминергической и глутаматергические зонд имплантации, stereotaxically имплантата руководство канюли (диаметром 0,7 мм; рис. 3) в область интересов (например, этой лаборатории направлены справа прилежащем ядре (NAc)) как подробно описано в ступенчатой других 15.
Примечание: Хотя представленные данные от одного датчика записи одной глутамата или допамина зонда на животное, эта система позволяет для одновременной записи до 4 датчиков в одиночного животного; Таким образом 1-4 канюли может быть имплантирован в зависимости от желаемого экспериментальный дизайн и результаты.- Определить имплантат координаты области интереса, с использованием стереотаксического атлас (например, Золотой мозг хомяка, Морин & дерево), держать в виду, что датчик простирается 1 мм ниже канюли в мозговой ткани.
- После канюля stereotaxically опускается в нужное место спинной вентральный, прикрепить его к черепа с помощью Кап, построенных из стоматологических акрил, обеспеченные с Костные винты из нержавеющей стали и пластиковые главой Маунт ( Рисунок 3 ; Смотреть 15 для получения более подробной информации).
- Для тестирования углеродного волокна, вставьте ссылку электрода (350 мкм диаметром, Общая длина 7,5 мм) в контралатеральной полушарии.
Примечание: Определенное место или расстояние от катетер не требуется; Ссылка электроды могут быть размещены в любом в контралатеральной полушарии, что удобно.
- Для дофаминергической и глутаматергические зонд имплантации, stereotaxically имплантата руководство канюли (диаметром 0,7 мм; рис. 3) в область интересов (например, этой лаборатории направлены справа прилежащем ядре (NAc)) как подробно описано в ступенчатой других 15.
2. Биосенсор и углеродного волокна тестирования
- после 1 неделя восстановления от хирургии, управлять режимом гормона грунтование побудить сексуальной восприимчивости.
- Подкожно вводить 10 мкг бензоата эстрадиола в 0,1 мл масло хлопковое (с.к.), около 48 ч и за 24 часа до сексуального поведения, тестирование, чтобы побудить сексуальной восприимчивости к мужской 11.
- Придать 500 мкг прогестерона в 0,1 мл масло хлопковое, s.c., 4 ч до введения мужчин и побудить сексуальной восприимчивости 11.
- Тест всех животных в начале этапа темные их день цикла, как социальное поведение грызунов подлежат изменению под белый свет и красный свет тестирования условий 16 , 17 , 18.
- для ферментативного биосенсор глутамата тестирования, калибровки датчиков в пробирке ( рис. 4) перед использованием, как описано ранее, 15 , 19.
- сделать калибровка решения свежие на день тестирования в стекла 20 мл центрифуга трубы. Для решения исследуемое вещество растворяются 7.4 мг L-глутаминовой кислоты в 10 мл ультра-чистой H 2 O, нежно инвертирование трубки. Сделать interferent решение путем растворения 176.1 мг АА в 10 мл ультра-чистой H 2 O.
- Создан для калибровки, поместив магнитную мешалку на основе базовой лаборатории кольцо стенда. Место 20 мл стакан с рубашкой поверх Магнитная мешалка и зажим на месте с использованием средних зажим 2 пуговицы.
Бар
- Добавить магнитные перемешать и 20 мл 100 мм фосфата буфер солевой раствор (PBS) в стакан с рубашкой. Подключите с рубашкой стакан к циркулирующим водяной бане нагреть буферного раствора до 37 ° C.
Примечание: Энзимный биосенсор калибровок должны быть выполнены при температуре тела с ферментативной активности под влиянием температуры.
- Добавить магнитные перемешать и 20 мл 100 мм фосфата буфер солевой раствор (PBS) в стакан с рубашкой. Подключите с рубашкой стакан к циркулирующим водяной бане нагреть буферного раствора до 37 ° C.
- Место держатель калибровки датчика на вершине с рубашкой стакан и установить калибровки 4-канальный предусилитель на верхней части, обеспечение безопасности на месте с помощью углом зажим. Подключиться к записи калибровочных данных устройства для кондиционирования и приобретение данных предусилитель.
- Проверки чувствительности каждого ферментативные биосенсора, глютамат (или других аналитов интереса для других коммерчески доступных биосенсор зонды например, глюкоза) до экспериментальной записи, поместив зонд в держатель калибровки на вершине с рубашкой стакан, погружаясь зондирования полости и часть ведения хлорида серебра (AgCl) провод в буферном растворе.
- Перед подключением каждого датчика (до 4) тестируется на порт калибровки 4-канальный предусилитель, инициировать новую запись на компьютерный интерфейс, используя бесплатный загружаемый приобретение программного обеспечения. Разрешить датчики для достижения стабильной базовой.
- Начать добавление аналита инъекции, когда датчики достигли стабильной базовой линии. Используйте отверстие в держателе калибровки ввести наконечник пипетки для буферного раствора. Используйте средство быстрого основные аннотации в записи программного обеспечения для аннотирования при инъекции.
- Сделать 10 мкм дополнения глутамата дозирования 40 мкл раствора аналита в буферный раствор. Подождите, пока Датчик стабилизации между дополнений. Добавить 3 инъекции аналита решения перед добавлением одной инъекции из interferent AA решения (50 мкл инъекции объем 250 мкм изменений в концентрации).
Примечание: Калибровка позволяет преобразования изменения в Амперометрическое сигнал (видел во время ферментативные экспериментальной записи на шаге 2.12) для изменения концентрации глутамата, при желании. Смотрите ссылку 15 для пошаговая инструкция. Дофаминергической датчики, используемые этой лаборатории калибруются в процессе изготовления коммерческим поставщиком. Зонды глутамата должен быть откалиброван во время использования как их чувствительность может уменьшаться с течением времени как ферментативные компоненты ухудшить 19. Потому что углеродного волокна электроды не подвергаются деградации, калибровка, выполняемые компанией до отгрузки достаточно вдоль как tВот повышенную вероятность повредить тонкие волокна углерода (диаметр 350 мкм) через дополнительный.
- Сделать 10 мкм дополнения глутамата дозирования 40 мкл раствора аналита в буферный раствор. Подождите, пока Датчик стабилизации между дополнений. Добавить 3 инъекции аналита решения перед добавлением одной инъекции из interferent AA решения (50 мкл инъекции объем 250 мкм изменений в концентрации).
- Линия испытательную камеру с постельным бельем, взяты из животных ' s дома Кейдж.
Примечание: Это увеличивает самка ' s знакомство с тестирования камеры, а также предоставляет мужчин сексуально стимулирования обонятельные спаривания сигналы, которые были распространены самка в ответ на лечение эстрадиола. - Слегка анестезировать животных до вставки зонда изофлюрановая или другой летучих анестетика в камеру всасывание.
- Удалить окклюзионной obdurator из канюли руководство и вставлять электрод углеродного волокна или ферментативный зонд через вал руководство.
- После введения зонда, поместите животное в испытательной камере.
Примечание: Эта лаборатория использует 10-Гал стекла аквариум (24,5 x 48,9 x 29,4 см), но круглых камерах равной площади может также использоваться. - Начать запись видео и время locked Амперометрическое сигнала в коммерчески доступное программное обеспечение программы, подробно описаны в другом 15.
- Подключите датчик к системе записи: потенцио через электрически экранированного кабеля и электрические шарнирного соединения. Стабилизировать подключение датчика путем завинчивания ПИН насадку на головы горе. Укрепление соединения с помощью лаборатории фильм при необходимости.
Примечание: Настраиваемый соединитель необходимо придавать углеродного волокна электрода и электрод сравнения потенцио, в то время как ферментативные глутамата датчики могут быть непосредственно подключены к потенцио. - Позволяют датчика, чтобы сбалансировать в мозге до экспериментального тестирования.
Примечание: Уравновешивания раз различаются в зависимости от датчика записи (например, ферментативные сенсоры требуют уравновешивания 2-4 ч, в то время как углерод волокна электроды требуют только около 30 мин). Если оба вида датчиков имплантируются, сбалансировать дольше ферментативные датчик. - После уравновешивания датчик, ввести мужчина стимул в испытательной камере.
- После первого горе с полового члена вставки (называют intromission) стимул самец, продолжить запись для дополнительных 10-30 мин, в зависимости от целей экспериментальной.
- После поведенческое тестирование, отключите самка ' Датчик ф.
- Удалить оба хомяков из испытательной камеры. Удаление постельные принадлежности и чистой камере с помощью 70% этанол.
Примечание: Из-за краткое уравновешивания, необходимых для записи углеродного волокна, шаги 2.3-2.14 может быть повторен для тестирования нескольких животных в тот же день. В противоположность этому, потому что ферментативные сенсоры требуют приблизительно 4 ч уравновешивания, тест только одно животное в день, чтобы ограничить возможные вариации между предметом из-за различий в животных ' суточного времени на тестирование.
3. Жертвы и перфузии
- после завершения периода тестирования, глубоко анестезировать женского испытуемого с euthanizing агента (например, эта лаборатория использует внутрибрюшинного введения 0,2 мл раствора фенитоин и Пентобарбитал) .
- Transcardially perfuse животное с 25 мм PBS, рН 7,6, чтобы удалить все циркулирующей крови, после 20 мин фиксации с помощью параформальдегида 4%-PBS.
- Удаление мозга и postfix в ~ 30 мл параформальдегида 4% раствора в 50-мл Конические трубки на ночь.
- Магазин мозга в 10% раствор сахарозы PBS до готовности серийный секции.
Примечание: Мозг может храниться до 2-х недель, с загрузок изменений раствор сахарозы, чтобы избежать потенциал роста загрязнений.
- Магазин мозга в 10% раствор сахарозы PBS до готовности серийный секции.
- Серийный секции мозга в 40 мкм ломтиками через имплантированного регион с либо замораживания микротома или криостата как описано 19.
- Подключить фрагментов поочередно на коммерчески доступных слайды, клей покрытием (или увидеть 20 сделать). Дайте высохнуть, по крайней мере на ночь.
- Пятно слайды с количество кресил фиолетового красителя, ясно, и coverslip как описано 20.
- Изображения слайдов, используя яркие области микроскопии для подтверждения анатомические размещение датчика.
4. Поведенческие кодирование
- мнение и комментировать видео с помощью бесплатно коммерчески загружаемое программное обеспечение (см. Таблицу материалы) в медленное движение, чтобы точно кодекса поведения к морю времени сигнал Амперометрическое.
Примечание: Для использования MATLAB код в анализе (см ниже ), аннотировать Начало и конец каждого из самка ' s и мужской ' s поведение.- StartLordosis заметки в кадре, когда самка инициирует dorsoflexion ее обратно и дефектов ее хвоста вверх. Заметки endLordosis, когда самка завершает эту позу, которая часто происходит, когда самка выравнивала в другое место в испытательной камере.
- Аннотации startAI, когда самка в позе лордоз и самец движется его морда направлении самка ' s аногенитальной области региона, где может возникнуть нюхает, лизать или nuzzling ее промежности региона. Комментировать endAI когда самец удаляет его морду от близости к самка ' s аногенитальной области.
- Аннотации startMount, когда самец подходы и помещает его передними лапами на женщину в позе монтажа, независимо от ориентации попытки монтирования (например, стороны, Кострец).
- Аннотации startIntromission, когда успешный засовывая получает навесные мужского полового члена доступ к самка ' влагалище ф.
Примечание: Intromission поведенчески отличается от навесные толкая, что происходит до intromission, как самец заметно тянет его верхних конечностей к его телу, направления его таз вперед и кудри его хвоста вверх, указывающее проникновения (см < сильный класс = «xfig» > рисунок 4 C).- , Когда это применимо, аннотировать эякуляции.
Примечание: В конце спаривания Бута и в связи с успешным intromission, мужчина будет эякулята. Хотя один не может визуализировать фактических выбросов, мужской хомяков имеют характерный ступая движение с их задних ног во время intromission 21, таким образом комментировать эякуляции при наступлении движения ног.
- , Когда это применимо, аннотировать эякуляции.
- Аннотации endIntromission и endMount одновременно в кадре, когда мужчина снял его передние две лапы и таким образом, не имеет контакта с женщиной. Из-за частых неспособности визуализировать его вывода, синхронный код эти два поведения, чтобы позволить для согласованности и надежности всей спаривания приступы.
Примечание: Спаривания схватки следующим успешным эякуляции или когда женщина ломает лордоз осанки, после, по крайней мере один Маунт.
5. Пример анализа данных
Примечание: использование-потенциал углеродного волокна и ферментативные записей для допаминаND глутамата, соответственно, обеспечивает возможность измерения тоник и фазовые модели электрохимического релиз. Эта лаборатория использует свободный, коммерческих приобретение системы и программное обеспечение для записи и преобразования записаны сигналы от аналоговой к цифровой (смещения 0.600 V, частота дискретизации = 1 Гц).
- Описание примера данных анализа протокола хотя другие программы могут быть использованы, количественно тоник и фазовые (временных) изменения в записанные электрохимических сигналов с использованием MATLAB.
- Для представленных данных, вычисления сигнала тоник, с использованием движущихся средний фильтр 50 пунктов. Только для переходных нормализованное представление сигнала была рассчитана путем вычитания тоник сигнал от исходных данных. При определении фазовые пиков, существуют различные варианты алгоритма (например, маркировка вершины как изменения в более чем 1 сигнал SD выше среднего).
- Определения местоположения этих пиков, т.е., локальные максимумы, от нормализованной сигнала с использованием MATLAB функция peakfinder с амплитудой минимальный пик установить Среднее квадратическое сигнала. Местоположение пики, обнаружено от сигнал нормализованные был использован для извлечения амплитуда из каждого пика. Способность обнаруживать пики позволяет для идентификации любого к морю время поведения, которые могут быть совпало с, или вождения относительной пик в нейрохимических расследуется.
- Сегмент обработанных данных в соответствии с поведенческой аннотации (см. шаг 3), студент ' s t-тест был использован для оценки различий в уровень нейромедиатора тоник и возникновение транзиентов, амплитуда переходные процессы при предварительно спаривания лордоз бой против лордоз во время спаривания приступы. Для измерения изменений в тоник модели электрохимического релиз, точек данных, происходящих во время лордоз положение непосредственно перед спаривания схватки (то есть, предварительно спаривания схватки лордоз) были по сравнению с точки данных во время спаривания Бут сеанс с использованием t-test.
- Описание примера данных анализа протокола хотя другие программы могут быть использованы, количественно тоник и фазовые (временных) изменения в записанные электрохимических сигналов с использованием MATLAB.
- Подготовка исходных данных для анализа протокола описаны данные
Примечание: как отмечалось, хотя другие программы или анализы могут быть одинаково жизнеспособными, чтобы использовать MATLAB код, описанных выше, необработанные данные должны быть подготовлены следующим образом:- Экспорт файлов аннотации и напряжения. Для этого, под ' файл ' вкладку, выберите ' экспорт ' функции и выберите ' аннотации ' вкладку, чтобы сохранить примечания. Под ' файл ' вкладку, выберите ' экспорт ' функции и выберите " TSV ' вкладку, чтобы сохранить измерения напряжения как файл расширения TSV.
- Открыть каждый файл с помощью программы электронных таблиц и сохранить как ' xls/xlsx ' чтобы сделать совместимым с MATLAB файлы.
Примечание: Для ' Аннотация ' файла, есть дополнительные аннотации, которые необходимо вручную добавить после экспорта в программу электронных таблиц, чтобы диктовать начала и окончания обоих предварительно спаривания схватки лордоз (помечен как PreMBlordorsis ) и спаривания схватки, таким образом, чтобы эти моменты времени может сравниться непосредственно, как указано в шаге 5.1.2. - Аннотации начало предварительно спаривания схватки лордоз (startPreMBlordosis) в то же время, как лордоз поведение начинает (startLordosis), который также включает подключить поведение, а также в начале нового спаривания схватки если самка остается в позе лордоз.
- Аннотации в конце предварительно спаривания схватки лордоз (endPreMBlordosis), когда первый смонтировать начинается.
- Заметки начала спаривания схватки (startMB) в то же время endPreMBlordosis, как это означает начало спаривания схватки.
- Аннотации к концу спаривания схватки (endMB) в любом конце смонтировать который включает эякуляции (см. шаг 4.1.4.1), или после самка ' s прекращение лордоз осанки (endLordosis).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С использованием электрохимических и поведенческих кодирования методологии, описанной выше, эта лаборатория начал характеризуют тоник и фазовые колебания допамина и глутамата во время записи в естественных условиях сексуального поведения. Благодаря височно-точно этой методологии мы можем более точно характеризуют синапсах во время сексуального поведения; а также приписать соответствующие изменения тоник конкретные изменения в структуре выпуска во время спаривания приступы и соответствующие временные колебания во время получения женского поведения отдельных копулятивного (например, intromission, эякуляция) от мужчин монтажа.
В частности мы использовали эту методологию сосредоточиться на измерении выпуска моделей допамина и глутамата в НАК отдельных животных. NAc является критической области, участвующих в обработке22 награду и был описан как неотъемлемой региона в награду аспекты сексуального поведения23.
Мы отметили, что во время сексуального поведения, женщины демонстрируют тоник увеличение уровней дофаминергической в ядре НАК во время спаривания приступы (рис. 5). Хотя эти изменения тоник, показано для всех спаривания приступы, описанная выше методология может измерить тоник изменения между каждой спаривания схватки и таким образом увеличить временной идентификации общих изменений тоник уровней нейромедиатора релиз во всем вся сессия. Кроме того это описывается методология может определить фазовые изменения и височно карта поведения, вероятно, связанные с эти фазовые нейромедиатора колебания. В частности эти предварительные результаты показывают, что во время спаривания приступы, дофаминергической переходные процессы в Североатлантическом совете возникают во время вагинальных вставки (intromission) мужчина (рис. 6). Кроме того эта ассоциация с intromission конкретные, с незначительным дофаминергической ответы на другие копулятивного поведения, такие как АИ.
Аналогичная картина наблюдается в других животных в отношении выпуска глутамата, с быстрые переходные процессы, которые соответствуют отдельным вмешательство в ядре спинной НАК во время схватки копулятивного (рис. 7). Эта модель является регион конкретные, с заметной сигнал не происходящие в NAc оболочки или медиальной хвостатого других животных.
Рисунок 1 : Технологии ферментативного биодатчик.
Стандартное изготовление коммерчески доступных ферментативные биосенсор преобразователей, которые обнаружить медиаторы через фермента опосредованной обработки (изображение слева). В случае глутаматергические датчики, глутамата оксидазы занята в ферментативные слой (правое изображение) для преобразования nonelectroactive нейромедиатора Электроактивные перекиси водорода (H2O2), которое обнаруживается окисления на иридия платины (Pt-Ir) электрода. Аскорбиновая кислота (AA), общей interferent, которая окисляется на те же потенциал, исключается через дополнение оксидазы AA на ферментативные слой, который преобразует interferent в nonelectroactive воды. Другие негативные Электроактивные счётчик в мозге исключаются через пассивное избирательное мембраны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Компоненты хомяка спаривания бут.
В хомяков спаривания схватки состоит из последовательности копулятивного поведений, во время которых самка остается неподвижным лордоз осанки в то время как мужчины anogenitally расследует (A), монтирует (B)и достигает intromission (C). . Обратите внимание, что intromission поведенчески отличается от монтажа как самец тянет его верхних конечностей к его телу, направления его таз вперед и кудри хвостом вверх, указывающее проникновения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Череп шапочки.
Руководство канюли, костные винты и стоматологическая акрил используются в строительстве тюбетейке позволяют вставки углеродного волокна или ферментативный зонд (см15 для поэтапного детали). Эта цифра изображает один канюля имплантат над правой NAc для ферментативного датчик (не имплантированных ссылка электрод) и пластиковые головы крепление для датчика стабильности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Калибровка глутамата биосенсор.
Чувствительность каждого биосенсор глутамата это испытанные в vitro до экспериментальной записи 10 мкм дополнения глутамата (зеленый) при 37 ° C (поскольку ферментативную активность зависит от температуры). Каждый датчик подтверждается не реагировать на аскорбиновую кислоту (AA; красный) или допамина (да; синий). Калибровка позволяет для преобразования изменения сигнала Амперометрическое видели во время экспериментальной записи изменений в концентрации глутамата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Тоник увеличение допамина во время спаривания схватки.
A. стилизованный пример premating схватки лордоз сигнал против спаривания схватки лордоз сигнала. Для измерения выпуска допамина тоник, Амперометрическое ответы на уровни допамина в ходе лордоз до спаривания схватки (МБ) были по сравнению с теми во время MB. Серые клеточки указывают лордоз перед МБ. BLUE прямоугольники указывают лордоз во время МБ. B. представитель Квантификация от одного животного, сравнивая среднее напряжение между preMB лордоз и MB лордоз. Планки погрешностей указывают Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM), и звездочка указывает на существенное различие (p значение < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Представитель допамина след.
Фазовые высвобождение дофамина время закрывается на вмешательство от мужчин в дорсальном ядре НАК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7 : Представитель глутамата след.
Глутамата переходные процессы соответствуют отдельным вмешательство от мужчин в дорсальном ядре НАК во время длительного сексуального опыта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя сравнительно простой, некоторые проблемы могут возникнуть при использовании этой техники. Во-первых, должна быть точной стереотаксического размещение зондов: в отличие от микродиализом, что образцы широкого радиуса внеклеточных среды вокруг зонд, эта техника позволяет только измерение нейромедиатора, который вступает в непосредственный контакт с зондом. Во-вторых в случае записи углеродного волокна, из-за небольшой ширины волокна, может произойти обрыв, и зонд должен быть вставлен с преднамеренного ухода. В случае глутаматергические биодатчики энзимной деградации может произойти если зонд не используется в гарантированная сроки 3-х недель. К счастью все эти вопросы являются доступными и могут быть устранены с надлежащей заботой и вниманием к деталям.
Потенциально проблематичное предостережение возникает в специфика записей фиксированной потенциал углеродного волокна. Потому что прикладной потенциал для допамина совпадает с другими моноаминов, например норадреналина, если записи сделаны в областях, которые освободить обоих нейротрансмиттеров, чем отсутствие химических особенностей может ограничить интерпретацию результатов. В Североатлантическом совете это не создает серьезной проблемой, с допамина, будучи основным катехоламинов передатчик24. Потому, что примерно 98% ячеек в НАК средних колючий нейронов, которые реагировать дофаминергической синапсах24, сигнал является предвзятым к обнаружению допамина и облегчает использование этого подхода более под ключ.
Еще одно преимущество этого ферментативные биосенсор и фиксированной потенциал углеродного волокна записи системы является, что записи двухъядерный зонд может быть выполнена, так что Электроактивные и nonelectroactive нейротрансмиттеров допамина и глутамат может быть измерена в то же самое животное одновременно. Хотя представленные здесь данные из записей в отдельных животных, эти методы могут быть использованы одновременно, таким образом, что один можно оценить конвергенции синапсах в нескольких регионах мозга или в том же регионе на двусторонней основе. Сочетание записей в то же самое животное, или Сравнение записей через животных, как показано здесь, являются оба мощные инструменты для выяснения механизмов за сетевые подключения и сигнализации.
В целом этот документ демонстрирует мощные методы ферментативного biosensing и запись-потенциал для измерения нескольких Электроактивные и nonelectroactive медиаторы, используя единый экспериментальной установки. Хотя данные представленные здесь приходят от отдельных нейромедиатора записей через несколько животных, эта система обеспечивает возможность записывать до 4 датчиков в одно животное одновременно15. Результаты образца, представленные коллективно обеспечить понимание быстрого синапсах женский хомяк, результате конкретных моделей копулятивного стимуляции от мужчин. Кроме того эти эксперименты продемонстрировать к морю времени ответы дофаминергической и глутаматергические транзиентов в ядре НАК самка intromission от мужчин, предполагая, что этот релиз может быть ответственным за кодирования различных полезных свойств сексуальное поведение. Наша цель – продолжать использовать спаривания шаблон в женских сирийских хомяков разработать более всеобъемлющую картину отношения в vivo допамина и глутамата выпуска и базовой схемы отдельным компонентам копулятивного раздражителей от мужчин. Мы считаем, что возможность характеризовать шаблонов эти нейротрансмиттеры выгодно не только от фундаментальной науки перспективы23, но и в изучение потенциальных терапевтических подходов для патологических форм вознаграждения поведение таких как лекарственная зависимость от25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить студентов Даниэль Корус за его помощь, запуск Matlab код и студент Алекс Боттчер за его помощь в управлении поведенческих экспериментов. Этот проект поддерживается NSF IOS 1256799 к R.L.M. и Национальный институт по проблемам злоупотребления наркотиками национальных институтов здоровья под награду номер T32DA007234.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nembutal | Oak Pharmaceuticals Inc. | 76478-501-50 | Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5 mg/100 g body weight, injected intraperotineally. |
| Loxicom analgesic | Norbrook Laboratories | 6451603670 | NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam. |
| Enroflox antibiotic | Norbrook Laboratories | 5552915411 | Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin. |
| Beuthanasia-D | Merck Animal Health | 00061047305 | Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent. |
| Bone screws | Pinnacle Technologies, Inc. | 8111-16 | 1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull. |
| Dental acrylic (Bosworth Duz-All) | Bosworth | 166261C | Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull. |
| Hardware biosensor setup | Pinnacle Technologies, Inc. | 8400-K2 | Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system |
| Base video computer package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K1 | The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables. |
| Video EQ700 EverFocus camera package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K10 | EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available. |
| Sirenia Acquisition software | Pinnacle Technologies, Inc. | Free--available to download from pinnaclet.com | Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review. |
| Tethered rat in vitro calibration kit | Pinnacle Technologies, Inc. | 7000-K2-T-BAS | In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051). |
| Stir plate | Corning | 6795-410D | Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors. |
| Water bath capable of closed loop circulation | PolyScience | 8006A11B | PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature. |
| Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae | Pinnacle Technology, Inc. | 7002-CFS | Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission. |
| Ag/AgCl reference electrode | Pinnacle Technology, Inc. | 7065 | Necessary for carbon fiber recordings. |
| Glutamate biosensors | Pinnacle Technology, Inc. | 7001 | Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission. |
| BASi guide cannulae | Pinnacle Technologies, Inc. | 7030 | Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe. |
| BASi cannula plastic headpiece for rats | Pinnacle Technologies, Inc. | 7011 | Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat. |
References
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 7, Unit 7.1.1-7.1.28 (2009).
- Chaurasia, C. S., et al. AAPS-FDA Workshop white paper: Microdialysis principles, application and regulatory perspectives. Pharm Res. 24 (5), 1014-1025 (2007).
- Lindsay, S., Kealey, D. High performance liquid chromatography. , John Wiley and Sons. New York, NY. (1987).
- Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin Chem. 49 (10), 1763-1773 (2003).
- Hu, Y., Mitchell, K. M., Albahadily, F. N., Michaelis, E. K., Wilson, G. S. Direct measurement of glutamate release in the brain using a dual enzyme-based electrochemical sensor. Brain Res. 659 (1-2), 117-125 (1994).
- Agnesi, F., et al. Wireless instantaneous neurotransmitter concentration system-based amperometric detection of dopamine, adenosine, and glutamate for intraoperative neurochemical monitoring. J Neurosurg. 111 (4), 701-711 (2009).
- Erksine, M. S. Solicitation behavior in the estrous female rat: A review. Horm Beh. 23 (4), 473-502 (1989).
- Weiner, I., Gal, G., Rawlins, J. N., Feldon, J. Differential involvement of the shell and core subterritories of the nucleus accumbens in latent inhibition and amphetamine-induced activity. Behav Brain Res. 81 (1-2), 123-133 (1996).
- Heidbreder, C., Feldon, J. Amphetamine-induced neurochemical and locomotor responses are expressed differentially across the anteroposterior axis of the core and shell subterritories of the nucleus accumbens. Synapse. 29 (4), 310-322 (1998).
- Pierce, R. C., Kalivas, P. W. Amphetamine produces sensitized increases in locomotion and extracellular dopamine preferentially in the nucleus accumbens shell of rats administered repeated cocaine. J Pharmacol Exp Ther. 275 (2), 1019-1029 (1995).
- Pfaff, D. W. Drive: Molecular and physiological analyses of a simple reproductive behavior. , The M.I.T. Press. Cambridge, MA. (1999).
- Carter, C. S. Postcopulatory sexual receptivity in the female hamster: The role of the ovary and the adrenal. Horm Behav. 3 (3), 261-265 (1972).
- Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , The National Academies Press. New York, NY. National Research Council (2011).
- Meisel, R. L., Camp, D. M., Robinson, T. B. A microdialysis study of ventral striatal dopamine during sexual behavior in female Syrian hamsters. Beh Brain Res. 55 (2), 151-157 (1993).
- 4 Channel EEG/EMG/Biosensor Manual V005. , Pinnacle Technology. (2012).
- Pellis, S. M., Pellis, V. C. Play-fighting differs from serious play fighting in both target of attack and tactics of fighting in the laboratory rats Rattus norvegicus. Aggress Behav. 13 (3), 227-242 (1987).
- Pellis, S. M., Pellis, V. C. Differential rates of attack, defense and counterattack during the developmental decrease in play fighting by male and female rats. Dev Psychobiol. 23 (3), 215-231 (1990).
- Pellis, S. M., Hastings, E., Shimizu, T., Kamitakahara, H., Komorowska, J., Forgie, M. L., Kolb, B. The effects of orbital frontal cortex damage on the modulation of defensive responses by rats in playful and non-playful social contexts. Behav Neurosci. 120 (1), 72-84 (2006).
- Wakabayashi, K. T., Kiyatkin, E. A. Rapid changes in extracellular glutamate induced by natural arousing stimuli and intravenous cocaine in the nucleus accumbens shell and core. J Neurophysiol. 108 (1), 285-299 (2012).
- Kapelsohn, K. I. Improved methods for cutting, mounting, and staining tissue for neural histology. Protoc Exch. , (2015).
- Siegel, H. I. Chapter 7: Male sexual behavior. The Hamster: Reproduction and Behavior. , Plenum Press. New York, NY. (1985).
- Day, J. J., Carelli, R. M. The nucleus accumbens and pavlovian reward learning. Neuroscientist. 13 (2), 148-159 (2007).
- Meisel, R. L., Mullins, A. J. Sexual experience in female rodents: Cellular mechanisms and functional consequences. Brain Res. 1126 (1), 56-65 (2006).
- Meredith, G. E., Pennartz, C. M., Groenewegen, H. J. The cellular framework for chemical signaling in the nucleus accumbens. Prog Brain Res. 99, 3-24 (1993).
- Hedges, V. L., Staffend, N. A. Neural mechanisms of reproduction in females as a predisposing factor for drug addiction. Front Neuroendocrinol. 31 (2), 217-231 (2010).
