Oligodendrocytes myélinisantes favorisent la propagation du potentiel d’action rapide et la survie des neurones. Décrit ici est un protocole pour l’expression des protéines fluorescentes dans organotypique oligodendrocyte spécifique des tranches de cerveau avec l’imagerie Time-lapse ultérieur. En outre, une procédure simple pour la visualisation de la myéline non-colorées est présentée.
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Article de méthode
Visualisation et l’imagerie direct des oligodendrocytes Organelles dans des tranches de cerveau organotypique utilisant Virus Adeno-associé et microscopie confocale
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les neurones dépendent de l’isolation électrique et le soutien trophique des oligodendrocytes myélinisantes. Malgré l’importance des oligodendrocytes, les outils avancés actuellement utilisés pour étudier les neurones, en partie seulement ont été prises par des chercheurs de l’oligodendrocyte. Cellule spécifique au type de coloration par transduction virale est une approche utile pour étudier la dynamique de l’organite direct. Cet article décrit un protocole pour la visualisation des mitochondries des oligodendrocytes dans des tranches de cerveau organotypique de transduction avec adeno-associated virus (AAV) transportant des gènes mitochondries protéines fluorescentes ciblés sous le contrôle transcriptionnel de le promoteur de la protéine basique de la myéline. Il inclut le protocole pour faire des coupes de cerveau de souris coronale organotypique. Une procédure de Time-lapse imagerie des mitochondries puis suit. Ces méthodes peuvent être transférées vers les autres organites et peuvent être particulièrement utiles pour l’étude des organites dans la gaine de myéline. Enfin, nous décrivons une technique facilement accessible pour la visualisation de la myéline non colorée dans des tranches de vie par microscopie confocale réflectance (CoRe). Noyau a besoin d’aucun équipement supplémentaire et peut être utile pour identifier la gaine de myéline pendant la formation image live.
Introduction
La substance blanche du cerveau se compose des axones des cellules nerveuses enveloppés dans la myéline, une plasmalemme étendu spécialisé formé par les oligodendrocytes. La myéline est nécessaire pour la propagation du potentiel d’action rapide et fiable et une survie à long terme des axones myélinisés, et une perte de la myéline peut provoquer des dysfonctionnements neurologiques. Malgré leur importance, les propriétés des oligodendrocytes sont moins connues comparées avec les neurones et les astrocytes. Par conséquent, moins d’outils ont été développés pour l’étude des oligodendrocytes.
Vivre l’imagerie des organites cellulaires tels que....
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Protocole
les procédures décrites ici ont été approuvés par l’autorité norvégienne de recherche des animaux. Fournisseurs et les numéros de catalogue pour les consommables et autres requis matériel n’existe pas dans la liste du matériel à la fin du document.
1. préparation de tranches organotypique
Remarque : cette recette utilise deux souriceaux à jour après la naissance, 7-9 (7-9), qui donne 24 tranches organotypique divisés sur deux Pétri de six puits. Sauf indication contraire, toutes les procédures doivent être faites dans une hotte stérile et Gants nitril ou latex doivent être utilisés. Devraient servir uniquement c....
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Résultats
Organotypique des tranches de cerveau qui ont été cultivées et transduites tel que décrit ci-dessus montrent une distribution clairsemée des oligodendrocytes corticales exprimant mito_dsred et GFP. Immunohistochimie avec des anticorps contre Olig2 et MBP a confirmé que l’expression spécifique d’oligodendrocytes (Figure 1).
Pour l’imagerie live, oligodendrocytes transduits ont été reconnus par leur m.......
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Discussion
Le protocole permettant la culture organotypique décrite ici est une version modifiée de18 du protocole décrit par De Simoni et Yu (2006)5. Les changements les plus importants ont été décrites ci-dessous. Tampon Tris est ajouté au milieu de culture, ce qui améliore la survie des tranches en dehors de l’incubateur au cours de la transduction virale et la modification du milieu cellulaire. La procédure de stérilisation de confettis est également modifiée. Alors que les autres.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.
Remerciements
Nous remercions Linda Hildegard Bergersen et Magnar Bjørås pour accéder à la cellule de laboratoire et équipement, personnel Janelia biologie moléculaire ressource partagée pour la production de virus et de plasmide et Koen Vervaeke pour assistance avec mesures de puissance de laser. Ce travail a été financé par l’Association norvégienne de la santé, le Conseil norvégien de la recherche et de l’équipement de microscopie a été financée par Norbrain.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Agarose ; | Sigma ; | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | Aiguilles pour l’entrée et la sortie du bain |
| Gaz biohydroxyde Ampoules de marque | AGA | 105701 | |
| Ampoules pipette | Sigma-Aldrich | Z615927 | |
| Bec Bunsen (Brûleur au propane liquide) | VWR | 89038-530 | |
| Ensemble de câbles pour contrôleurs de chauffage Warner | Instruments | 64-0106 ; | Régulateur de température - pièce thermomètre |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 ; | AGA | 100309 | CO2 pour incubateur |
| Verre de protection, carré Corning | Thermo ; Fischer Scientific | 13206778 | À fixer sous le bain pour l’imagerie en direct. Sceller avec de la colle ou de la gelée de pétrole. |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Pince délicate | Finescience | 11063-07 | Pour dissection |
| Diamant scriber | pen Ted Pella Inc. | 54463 | |
| Pipettes jetables en verre Pasteur 230 mm | VWR | 612-1702 | Pipettes en verre |
| Lame de rasoir en acier inoxydable à double tranchant | Microscopie électronique Sciences | #7200 | Lame de rasoir pour vibratome |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| Cercles de papier filtre | Schleicher & Schuell | 300,220 | Papier filtre utilisé pour la filtration de PFA |
| Fun | tack Loctite | 1270884 | Utiliser pour connecter/ajuster la position des entrées et sorties dans la baignoire |
| Serviette de bain C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
| Harp, Plat pour chambre RC-41, | Warner Instruments | ; 64-1418 | Harpe pour retenir les confettis dans le bain. Coupez les ficelles avant de les utiliser avec des tranches organotypiques. 1,5 mm, 13 mm, SHD-41/15 |
| HEPES, FW : 260.3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir, modèle 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Hotte à flux laminaire |
| Sérum de cheval, inactivé thermiquement | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Membrane LCR, PTFE, ; | Confettis | Millipore | FHLC0130 |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratome |
| MEM-Glutamax avec HEPES | Thermo ; Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Micro cuillère Heyman Type B | Microscopie électronique Sciences | 62411-B | Petite spatule arrondie avec extrémité affûtée pour la dissection |
| Unité de filtration Millex-GP Unité | Millipore | SLGPM33RA | Unité de filtration à seringue |
| Insert de culture cellulaire Millicell, 30 mm | Millipore | PICM03050 | Inserts de culture cellulaire |
| Minipuls 3 vitesses Module de contrôle | GILSON | F155001 | Pompe péristaltique pour l’imagerie en direct - Pièce du module de contrôle (connexion à deux têtes cannel) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta | Surface Thermo ; Fischer Scientific | 140675 | Plaque de culture |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Objectif W « Plan-Apochromat » 40x/1.0 DIC ; | Zeiss | 441452-9900-000 ; | Objectif à immersion dans l’eau utilisé pour l’imagerie en direct. (WD=2.5mm), VIS-IR |
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |
| Paraformaldéhyde, | Microscopie électronique | #19208 | |
| Chambre de perfusion PC-R | SiSkiYou | ; 15280000E | Bain pour l’imagerie en direct |
| Pénicilline-Streptomycine, liquide | Invitrogen | 15070-063 | |
| Boîte de Pétri 140 mm ; | Heger | 1075 | Grande boîte de Pétri |
| Boîte de Pétri 92x16 mm ; | Sarstedt ; | 82.1473 | Boîte de Pétri moyenne ; |
| Pétridure 55x14,2 mm | VWR | 391-0868 | Petite boîte de Pétri |
| Saline tamponnée au phosphate (PBS) | Sigma | P4417 | Comprimés PBS |
| R2 Tête à deux canaux ; | GILSON | F117800 | Pompe péristaltique pour l’imagerie en direct - Tête à deux canaux (nécessite module de commande) |
| Spatules rondes/plates, acier inoxydable | VWR | 82027-528 | Grande spatule pour la dissection |
| Papier de verre | VWR | MMMA63119 | En option, pour lisser les pipettes en verre brisé |
| Ciseaux, ; 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Grands ciseaux pour la dissection |
| Ciseaux, 8,5 ; | Finescience | 14084-08 | Petits ciseaux tranchants pour la dissection |
| Lame à un seul tranchant, gemme | Microscopie électronique Sciences | #71972 | Lame de rasoir à un seul tranchant |
| Chauffage de solution en ligne unique SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | Régulateur de température - pièce chauffante |
| Steritop-GP Unité de filtration, 500 ml , 45mm | Millipore | SCGPT05RE | Filtre à stériliser solutions |
| Super colle de précision | Loctite | 1577386 | |
| Lame de scalpel chirurgical n° 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | Lame de scalpel arrondie |
| Régulateur de température TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | Régulateur de température pour l’imagerie en direct (nécessite un réchauffeur de solution et un ensemble de câble) |
| Base Trizma | Sigma ; | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| Incubateur à chemise d’eau série II | Forma Scientific | 78653-2882 | Incubateur |
Références
- Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
- Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T.
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Réimpressions et autorisations
