Summary
Myelinating oligodendrocytes fremme hurtig aktionspotentialet formering og neuronal overlevelse. Beskrevet her er en protokol til oligodendrocyte-specifikke udtryk af fluorescerende proteiner i organotypic hjerne skiver med efterfølgende time-lapse billeddannelse. Derudover præsenteres en enkel procedure til at visualisere unstained myelin.
Abstract
Neuroner stole på elektrisk isolering og trofiske støtte af myelinating oligodendrocytes. Trods vigtigheden af oligodendrocytes, har de avancerede værktøjer i øjeblikket brugt til at studere neuroner, kun delvist taget af oligodendrocyte forskere. Celle type-specifikke farvning af viral transduktion er en nyttig tilgang til at studere levende organelle dynamics. Dette papir beskriver en protokol til at visualisere oligodendrocyte mitokondrier i organotypic hjerne skiver af transduktion med adeno-associeret virus (AAV) bærer gener for mitokondrie målrettede fluorescerende proteiner under transcriptional kontrol myelin grundlæggende protein promotor. Det omfatter protokollen for at gøre organotypic koronale mus hjernen skiver. En procedure for time-lapse billeddannelse af mitokondrier derefter følger. Disse metoder kan overføres til andre organeller og kan være særligt nyttigt for at studere organeller i myelinskeden. Endelig, vi beskriver en let tilgængelige teknik til visualisering af unstained myelin i levende skiver af Konfokal Reflektionsgraden mikroskopi (kerne). CoRe kræver ingen ekstra udstyr og kan være nyttigt at identificere myelinskeden under live imaging.
Introduction
Hjernens hvide substans består af nerve celle axoner indpakket i myelin, et specialiseret udvidet plasmamembran dannet af oligodendrocytes. Myelin er behov for hurtig og pålidelig aktionspotentialet formering og langsigtede overlevelse af myelinerede axoner, og et tab af myelin kan forårsage neurologiske dysfunktion. Trods deres betydning, er egenskaberne for oligodendrocytes mindre kendt sammenlignet med neuroner og astrocytter. Derfor er færre værktøjer blevet udviklet for at studere oligodendrocytes.
Live imaging af celle organeller som mitokondrier, endoplasmatic reticulum (ER) eller forskellige vesikulære strukturer kan være nyttigt at undersøge dynamiske ændringer i organeller over tid. Billeddannelse af levende oligodendrocytes er traditionelt udført i monokulturer1,2. Men oligodendrocytes i monokultur Vis ikke kompakt myelin, og organotypic eller akut hjernen skiver kan derfor være en bedre løsning når man studerer lokalisering og bevægelse af organeller. Lokalisering af små organeller og proteiner i myelinskeden kan være udfordrende på grund af den korte afstand mellem myelinerede axon og de omkringliggende myelinskeden. Lys mikroskopiske immunfarvning procedurer alene har således ikke den rumlige opløsning til at diskriminere mellem organeller i myelinskeden og myelinerede axon. Dette kan løses ved viral transduktion med gener for organelle-målrettet fluorescerende proteiner drevet af celle typespecifikke initiativtagere. Fordelene er en celle-specifikke og sparsom udtryk, som muliggør nøjagtig vurdering af organelle lokalisering og dynamik. Transgene dyr kan også bruges til at opnå sådanne en organelle-målrettet celle-specifikke udtryk3. Men produktion og vedligeholdelse af transgene dyr er dyre og tilbyder normalt ikke den sparsomme udtryk, der kan opnås ved viral metoder.
Metoden beskrevet bruger her viral transduktion af oligodendrocytes med mitokondrie-målrettet fluorescerende proteiner (dsred eller grøn fluorescerende proteiner, normal god landbrugspraksis) drevet af myelin grundlæggende protein promoter (MBP-mito-dsred eller MBP-mito-NGL) at visualisere oligodendrocyte mitokondrier i organotypic hjerne skiver. Derudover er udtryk for en anden fluorescerende proteiner i cytoplasma (normal god landbrugspraksis bruges sammen med mito-dsred eller tdtomato bruges med mito-normal god landbrugspraksis) bruges til at aktivere visualisering af celle morfologi, herunder de cytoplasmatisk rum af myelinskeden. Protokollen omfatter proceduren for organotypic hjernen skiver (en modificeret version af protokollen, beskrevet af De Simoni og Yu, 20064,5). Vi derefter beskrive proceduren for time-lapse imaging for at studere mitokondrie bevægelse. Denne procedure bruger en opretstående Konfokal mikroskop med en løbende udveksling af billeddiagnostiske medium, en opsætning, der giver mulighed for nem anvendelse af narkotika eller andre mellemstore ændringer under imaging. Time-lapse imaging proceduren kan udføres på en Konfokal mikroskop, med nogle ekstra udstyr til at opretholde levende skiver som beskrevet nedenfor. Protokollen indeholder også flere tips til at optimere imaging og reducere fototoksicitet.
Endelig, en hurtig og enkel måde at visualisere unstained myelin ved Konfokal Reflektionsgraden mikroskopi (kerne) er beskrevet. Dette kan være nyttigt at identificere myelinskeden under live imaging. I de seneste år, flere teknikker er blevet udviklet til billede myelin uden nogen farvning kræves, men de fleste af disse kræver specifikke udstyr og ekspertise6,7,8. Proceduren beskrevet her bruger de reflekterende egenskaber af myelinskeden og er en forenklet single-excitation bølgelængde version spektrale Konfokal Reflektionsgraden mikroskopi (SCoRe, hvor flere laser bølgelængder er kombineret til at visualisere myelin) 9. coRe kan ske på enhver Konfokal mikroskop, der har en 488 nm laser og en 470-500 nm bandpass emission filter eller en afstemmelige emission filter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
de procedurer, der er beskrevet her er blevet godkendt af det norske dyr forskning myndighed. Leverandører og katalog numre nemlig forbrugsmaterialer og andre nødvendige udstyr er tilgængelige på listen materialer i slutningen af dokumentet.
1. forberedelse af Organotypic skiver
Bemærk: denne opskrift bruger to mus unger på postnatal dag 7-9 (p7-9), som giver 24 organotypic skiver opdelt på to seks-godt kultur retter. Medmindre andet er angivet, alle procedurer bør ske i en steril hætte og nitril eller latex handsker bør anvendes. Kun celle kultur grade ingredienser anvendes.
- Autoklave flasker, dissektion værktøjer (1 stor saks, 1 lille saks, 1 stor flad spatel, 1 lille afrundet og skærpet spatel og 1 pincet, se materialer liste for detaljer), glas pipetter, pipette tips og væv klude bruges til skive forberedelse.
- Som halvdelen af glas pipetter bør anvendes med den store åbning, bryde ud den smalle ende.
- Score med en diamant scriber pen (hvis tilgængelig) omkring pipette lige under det punkt, hvor glasset starter forsnævring. Derefter placere den spidse ende af pipetten til en nitrilhandske eller lignende. Omhyggeligt knække spidsen ved at bøje pipetten mens skubbe det mod et arbejdsbord.
- Derefter sløve den knækkede ende ved at gnide på et stykke sandpapir eller smelte lidt på en bunsenbrænder. De brudte pipetter bruges til at overføre cut hjernen skiver med brudt slutningen forvandlet til gummi pære og de store åbne ende rørende løsning/skiver.
Bemærk: Dette er ikke færdig i en steril hætte og kan gøres flere dage i forvejen.
- Forberede kultur retter.
Bemærk: Dette kan gøres dagen før udskæring eller mindst 2 timer før udskæring.- Sterilisere polytetrafluorethylen (PTFE) membraner (" konfetti "). Bruge to steril pincet til at fjerne enkelt konfetti fra de omkringliggende blå plast stykker og sterilisere ved at dyppe to gange i en petriskål, som indeholder 96% ethanol (EtOH). Derefter lå konfetti lejlighed i en steril store petriskål tørre.
Bemærk: Konfetti er hydrofile PTFE membraner svarende til membraner i kultur skær. Brugen af konfetti aids live imaging fordi enkelt skiver kan nemt overføres fra indsatsen til opsætningen mikroskop ved at løfte konfetti med pincet (Se 4.8. for detaljer). Alternativt, kan hjernen skiver kulturperler uden konfetti (hvor skiver vil knytte direkte til membranen af kultur-Indsæt). I dette tilfælde membran Indsæt skal skæres med en skalpel til at overføre skive til mikroskop badet. - Tilsættes 1 mL af næringssubstratet (opskrift i reagenser ' tabel) til hvert hul i seks-godt kultur retter.
- Sted én kultur indsætte i hver brønd ved hjælp af steril pincet. Undgå luftbobler mellem indsatsen og næringssubstratet.
Bemærk: For at spare penge og miljø, er det muligt at genbruge kultur skær. Dette kan gøres ved grundig skylning i destilleret H 2 O (dH 2 O) efterfulgt af inkubation i 70% EtOH i mindst 24 timer før genbrug. Når forberedelserne til nye kultur, tørre skær i en celle kultur plade under ultraviolet (UV) lys i 15-30 min. - Sted to (steriliseret og tørre) konfetti på hver af kulturen skær. Placer konfetti mod kanterne af skær til at få minimal overlapning.
- Sætte pladerne i celle kultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO 2.
- Sterilisere polytetrafluorethylen (PTFE) membraner (" konfetti "). Bruge to steril pincet til at fjerne enkelt konfetti fra de omkringliggende blå plast stykker og sterilisere ved at dyppe to gange i en petriskål, som indeholder 96% ethanol (EtOH). Derefter lå konfetti lejlighed i en steril store petriskål tørre.
- Boble kolde dissektion medium (opskrift i reagenser ' tabel) med bioxide gas (95% O 2 /5%CO 2). For at holde løsningen sterile, Tilslut røret fra gas cylinder til en steril sprøjte filter (0,22 µm porestørrelse).
- Par anden enden af sprøjten filter til en steril rør forbundet til et sterilt glas pipette. Placer glas pipette i opløsningen, dække med parafilm og tænde gassen. Holde dissektion medium på ice.
- Forberede området dissektion/udskæring.
Bemærk: Ideelt set denne procedure bør ske i en steril hætte. Hvis dette ikke er muligt, kan at vibratome stå på et arbejdsbord. I dette tilfælde anbefales det at bruge en hårmaske net og ansigt.- Ved hjælp af en enkelt kant barberblad, skåret ud af et rektangulært stykke (ca 2 cm x 0,5 cm) agarosegel (opskrift i reagenser ' tabel) og lim dette på vibratome scene, sådan at den lange side vender vibratome klinge.
- Rense alle overflader og vibratome dele med 70% EtOH og tørre med autoklaveres væv vådservietter.
Bemærk: Det er vigtigt, at alle de stykker, som vil være i kontakt med hjernevæv er helt tørt, da EtOH kan skade cellerne. - Fastgør et sterilt barberblad til vibratome og udføre kontrol af vibrationer, hvis vibratome har denne funktion.
- Sted autoklaveres dissektion værktøjer i hætte samt autoklaveres væv wipes, fire små petriskåle, en runde-kant skalpel, 2 glas pipetter med gummi pærer, to tidsubegrænsede glas pipetter (Se pt. 1.1) og super lim (sprøjtes med EtOH).
- Hæld boblede dissektion medium i vibratome båden og ind i de fire små petriskåle.
Bemærk: Dette trin bør kun ske umiddelbart før dissektion da medium fra dette punkt ikke er boblede eller holdes ice.
- Dissekere og mount hjerner.
Bemærk: For at opnå sunde skiver, dette skridt skal ske hurtigt og præcist. Nogle praksis er nødvendig.- Aflive dyr #1 af dislokation af neckor overensstemmelse med lokale retningslinjer og derefter halshugge med den store saks.
- Brug af små, skarpe saks, hurtigt fjerne huden ved at lave en sagittal snit fra nakken til næsen og trække til side til at afsløre kraniet.
- Klippe langs den sagittal sutur, efterfulgt af laterale snit over den indvendige del af de frontale knogler og lamboid sutur (grænsen mellem cerebrum og cerebellum).
- Bruge pincet til at bøje åbne kraniet på hver side. Hjernenerver er afskåret fra hjernen ved at indsætte en afrundet, skarpt spatel under den ventrale side af hjernen og forsigtigt flytte spatel lateralt.
- Bruge en enkelt kant barberblad til at gøre en koronale rostralt for lillehjernen.
Bemærk: Denne nedskæring vil bestemme den vinkel, hvor skiver. Det bør derfor gøres en lige vinkel. - Flip hjernen ud af kraniet og ind i en lille petriskål indeholdende dissektion medium.
- Gentag trin 1.6.1.-1.6.4. til dyr #2, og denne hjerne i en anden Petri fad.
Bemærk: Dyr er ikke sterilt. Udføre dissektion på den ene side af kalechen og derefter flytte til den andre, ren side når hjernen er blevet fjernet fra kraniet. - Ændre handsker.
- Vedhæft hjernen til vibratome fase: tilføje et tyndt lag af super lim på scenen lige foran den monterede agarosegel. Hold hjernen #1 med en stor flad spatel med frisk skåret (caudale) side rørende spatel og den ventrale side vendende mod (og at være så tæt som muligt til) agarosegel.
- Derefter forsigtigt placerer hjernen på limen ved at skubbe det ud spatel med et sæt af tang. Sørg for at forlade nok plads for hjernen #2.
Bemærk: Det er vigtigt, at hjerner er godt knyttet til scenen, men uden overdreven lim, som dette kan blokere opskæring.
- Derefter forsigtigt placerer hjernen på limen ved at skubbe det ud spatel med et sæt af tang. Sørg for at forlade nok plads for hjernen #2.
- Straks efter montering af hjernen #1, bruge den store spatel til at tilføje nogle dråber af dissektion medium oven på hjernen. Dette vil holde hjernen fugtig, hærde limen og forhindre det klistrer til siderne af hjerner.
- Gentag trin 1.6.7 og 1.6.8. for hjernen #2.
- Lægger scene i båden vibratome.
- Skære 230 µm tykt koronale skiver med en amplitude på 1-1,5 mm, en frekvens på 85 Hz og en hastighed på 0,2 mm/s. indsamle skiver ca mellem 1,4 mm rostralt og 2,1 mm caudale til Bregma.
- Indsamle skiver efter hver skive har været skåret ved hjælp af tidsubegrænsede glas pipetter (pt. 1.1). Overføre skiver til en petriskål, som indeholder dissektion medium. Brug en afrundet skalpel til at skære skiver i to stykker, dividere de to hjernehalvdele.
- Når alle skiver er skåret, læg skiver i kultur retter.
- Tage kultur fadet, (en på tidspunktet) ud af rugemaskinen.
- Ved hjælp af tidsubegrænsede glas pipetter, omhyggeligt overføre én skive til hver af konfetti.
Bemærk: Skiver bør lægge fladt i midten af konfetti. Det kræver nogle færdigheder. Men hvis nogle skiver ikke er perfekt, det er bedre at overlade dem end at tilbringe tid på at forsøge at flytte dem da det er vigtigt at få alle udsnittene i væksthuset så hurtigt som muligt. - Bruger et glas pipette (spidse ende) forsigtigt fjerne overskydende medium uden at røre skive.
Bemærk: Skiver bør ikke være nedsænket i væske under inkubation. Således skal overskydende medium indsugning så skiverne er udsat for luft (en tynd film af medie vil stadig dække skiver). Udsnit, der forbliver nedsænket i væsken vil normalt være usundt eller dø (4 og vores observationer). - Flytte parabol tilbage i inkubatoren, når alle konfetti har ét udsnit.
- Gentag trin 1.7.8.-1.8.4. for parabol #2.
- Ændre næringssubstratet.
Bemærk: Det skal ske dagen efter udskæring (dag 1 in vitro DIV1) og derefter hver 2-3 dage.- Forvarm næringssubstratet i et vandbad eller i inkubator.
- i en steril hætte, bruge vakuum sug eller en regelmæssig pipette med en steril tip til Aspirér næringssubstratet fra hver brønd. Dette gøres ved deponering skålen (med omkring 30 grader) og placere pipette tip på kanten af kultur-Indsæt forsigtigt.
- Fjerne ca 800 µL fra hver brønd (forlader lige nok medium for at holde bunden af skæret dækkes i medium). Derefter, ved hjælp af en ren pipette, tilføje 800 µL forvarmet medium til hver brønd. Derefter placere retterne tilbage i celle kultur inkubator.
2. Viral transduktion
- Køb eller gøre AAVs med et plasmid af interesse, som tidligere beskrevet 10 , 11.
Bemærk: Denne protokol beskriver brugen af AAV serotype 2/8 (AAV 2/8) transporterer mitokondrie målrettet dsred eller normal god landbrugspraksis som et reporter gen under myelin grundlæggende protein promotor 12 transcriptional kontrol (AAV2/8 MBP_mito_dsred eller AAV2 / 8 MBP_mito_GFP) til at visualisere oligodendrocyte mitokondrier. AAV 2/8 transporterer normal god landbrugspraksis eller tdtomato som reporter gen drevet af den generelle CAG promoter (AAV 2/8 CAG_GFP eller AAV 2/8 CAG_tdtomato) bruges til at visualisere oligodendrocyte cytoplasma. Således kombinationen af AAV2/8 MBP_mito_dsred med AAV 2/8 CAG_GFP giver røde mitokondrier og grønne cytoplasma i oligodendrocytes, der henviser til, at kombinere AAV2/8 MBP_mito_GFP og AAV 2/8 CAG_tdtomato giver grønne mitokondrier og røde cytoplasma. Konstruktioner er beskrevet i flere detaljer andetsteds 13. - På dag 7 in vitro (DIV7), transduce oligodendrocytes med AAVs.
Forsigtig: Følg sikkerhedsforskrifterne for at arbejde med AAVs. Sørg for at have den rette uddannelse og biosikkerhed niveau godkendelse kræves. Alle de følgende punkter bør udføres i en klasse II biosikkerhed kabinettet ved hjælp af handsker og laboratoriekittel. Her, er anvendelse af AAV til området cortex af skiverne beskrevet, da dette er det område, der viser de bedste opsving.- Dilute AAV i forvarmet (37 ° C) næringssubstratet. Fortyndinger omkring 2 × 10 9 genom kopier/mL (GC/mL) anbefales at få en sparsom transduktion af oligodendrocytes, som gør det muligt for billeddannelse af enkelt celler i Skive. Dog bør en pilot ved hjælp af forskellige titers gøres for at sikre en tæthed af transduced oligodendrocytes, der er egnet til de specifikke eksperimenter. Hvis der anvendes to forskellige AAVs, de skal blandes i den samme løsning og tilføjes til skive samtidigt.
- Tilføje omkring 1,3 µL fortyndet AAV til hver skive: Sørg for ydersiden af pipette tip er tør. Afpipetteres 1,3 µL fortyndet AAV og holde pipetten ovenfor cortex, så tæt som muligt uden at røre ved skive med pipette spids (ca 1 mm væk).
- Skub derefter langsomt løsning ud af en pipette. Når løsningen rører skive, flytte pipetten tip over cortex til at sprede løsningen over området hele cortex.
Bemærk: Denne procedure bør gøres så hurtigt som muligt for at undgå at holde skiver ud af hood i længere tid end nødvendigt. Gør dette på et fad på tidspunktet og sætte det første fad tilbage i inkubatoren før du starter på fad #2. At få en tilfredsstillende fordeling af AAV uden at beskadige vævet kræver lidt øvelse og en rolig hånd.
- Hvis en opretstående fluorescens mikroskop er tilgængelig i celle lab, protein udtryk kan kontrolleres under tiden i kultur ved at placere skålen ind under microscope.
Bemærk: Skålen bør ikke holdes ude af rugemaskinen for mere end 2-5 minutter.
3. Time-lapse Imaging
NOTE: imaging kan udføres, når udtrykket niveauer af de fluorescerende markører er tilstrækkelige og skiver ser sund (normalt DIV11-14).
- At sikre, at mikroskopet, perfusion og varme er indstillet korrekt således at boblede afbildningsløsning er opvarmet og kan indtaste og afslutte badet.
Bemærk: Findes forskellige løsninger til bad kamre. En simpel version præsenteres her.- Gøre ind- og udtag af badet af afrundede sprøjte nåle (bent på ~ 45°), der er knyttet til siderne af badet af blu-tack/sjov tack.
- Sikre, at slangen går fra en flaske af løbende boblede afbildningsløsning, via den peristaltiske pumpe, gennem de varme rør af varmelegeme enhed, og derefter til indløb sprøjte nål i badet.
- Tilsluttes sprøjte nål stikkontakt et andet rør. Dette rør derefter går via den peristaltiske pumpe og tilbage til flaske af imaging løsning (eller til en affald flaske).
- Boble imaging løsning (opskrift i reagenser ' tabel) med bioxide gas.
Bemærk: Dette bør være staRTed mindst 15 minutter før imaging og fortsætte gennem hele eksperimentet. - Tur på peristaltisk pumpe og varmelegeme og køre løsning gennem de bad for at opnå optimal bad temperatur (37 ± 0,5 ° C). Sikre, at termometeret sensor tilsluttet enhedens temperatur er neddykket i opløsningen bad.
- Tænde mikroskopet, fluorescens lampe og passende lasere.
- Sæt op et passende lys sti til stikprøven.
Bemærk: Dette vil variere afhængigt af mikroskop setup og sonde. Generel viden om hvordan man bruger Konfokal mikroskop er påkrævet og skal ikke behandles her. - Bruge en vand fordybelse mål med passende forstørrelse og numerisk blænde (n.a.). Vi bruger en 40 x vand fordybelse plan-apochromat mål (n.a. 1,0).
- Åben pinhole at opnå en optisk sektion på ca 2-2,5 µm for time-lapse video. Dette reducerer forekomsten af mitokondrier flytter ud af fokus under time-lapse.
- Overførsel organotypic skive til bad:
- tilføje en dråbe billedbehandling løsning eller næringssubstrat til en lille plastik petriskål.
- i en steril hætte, brug steril pincet til at overføre en organotypic skive fra membranen indsætte til drop. Pincet bør kun røre konfetti og ikke skive.
- Lægge låg på petriskålen.
- Straks sætte kultur fad med resten af skiver tilbage i inkubatoren.
- Bringe petriskål indeholdende skive til mikroskopet.
- Slukke peristaltisk pumpe mens overføre skive til mikroskop bad. Brug først pincet til at løfte konfetti med skive fra petriskål til toppen af badet (konfetti vil flyde). Derefter placere de to tips af pincet på hver side af konfetti, så de rører konfetti uden at røre skive, og skubbe konfetti gennem opløsningen til bunden af badet. Centrere konfetti midt i badet.
- Brug pincet til at placere hold-down anker (harpe) oven på konfetti uden at røre skive.
Bemærk: En harpe er en hesteskoformet platin anker, som bruges til at forhindre slice fra flyder eller drivende i badet. For akut skiver køre tynde strenge fra den ene side af harpe til den anden (der ligner et musik harpe). For organotypic skiver, harpe bør være ribber og passer til størrelsen af konfetti på en sådan måde, at det kan lægge oven på konfetti uden at røre udsnittet. - Drej peristaltisk pumpe tilbage på.
- Lavere mål ned til prøven.
- Marker celle og region at billede.
Bemærk: Undgå overdreven udsættelse af celler til laser lys, som dette kan medføre celle toksicitet (Se tips i nedenstående punkter).- Brug okularerne og fluorescerende lampe til at finde en sundt udseende oligodendrocyte med det korrekte udtryk. Oligodendrocytes, der har en stærk overekspression af fluorescerende proteiner vises typisk, usunde. Usunde oligodendrocytes vil have processer med en blobby udseende, og mitokondrier vises fragmenteret. I sund oligodendrocytes, soma og processer vises glat og mitokondrier har forskellige længder (selvom typisk meget kortere end i neuroner og astrocytter 13 , 14 , 15).
- placere cellen i interesse i midten af synsfeltet.
- Brug den " live " funktion i softwaren (for Leica og Zeiss mikroskoper) at identificere celle på skærmen og vælge et område af interesse, f.eks. en del af den celle, der indeholder flere primære processer eller myelin skeder eller en enkelt proces eller myelinskeden.
Bemærk: For at være i stand til billede så meget af processer/skafter som muligt, vælge områder, der indeholder processer, der lå forholdsvis flad i x-y-retningen. - Zoome ind på området af interesse (typisk producere et billede med pixelstørrelse på 0,14 - 0,30 µm).
- Ved hjælp af de " regioner " værktøj, tegne et rektangel omkring området, og vælge muligheden for at scanne kun det valgte område. Scanning tid, og dermed laser eksponering, reduceres ved at kun scanne den valgte region.
Bemærk: Vandrette rektangulære områder bliver scannet hurtigere end lodret regioner på grund af den kortere antal scannede linjer nødvendig. Hvis en lodret rektangel region er scannet, den scanning tid kan reduceres ved at rotere feltet scan ved 90 grader (ved hjælp af værktøjet rotation).
- Juster laser power og få at få et godt overblik på mitokondrier.
Bemærk: Brug minimal laser power behov. Hvis det er muligt, slå op gevinst snarere end stigende laser power. Ud over forårsager celle toksicitet, bliver for høj laser power afblege de afbildede objekter over tid, hvilket kræver en yderligere forøgelse af laser power eller få under scanningen. Kræves laser magt og vinding vil afhænge af udtryk og mikroskop. Med en LSM700 Konfokal mikroskop, bruger vi en 555 nm laser på en effekt på 20-40 µW til billede dsred eller tdtomato og en 488 nm laser bruges på 20-30 µW til billede normal god landbrugspraksis (laser power målt på den tilbage blænde af målet). Gain er indstillet højt for live imaging, normalt i størrelsesordenen 700-800 for normal god landbrugspraksis og 850-980 for dsred og tdtomato. Den høje gevinst kan forårsage nogle mere baggrundsstøj, som er fjernet ved at øge den digitale offset (opveje værdier typisk lå mellem 0 og 15). Vores erfaring, ved hjælp af MBP_mito_GFP giver et bedre signal-til-støj end MBP_mito_dsred. - Vælg Skan hastighed.
Bemærk: Minimere scanning tid ved hjælp af en hurtig scanning hastighed og ved at tegne en lille scanning region (se punkt 4.10.5 nedenfor). Det er også muligt at gemme scanning tid ved at udføre en tovejs scanning. Men dette kan ikke anbefales på grund af dårligere billedkvalitet. - Sæt hyppighed og varighed af time-lapse optagelse, fx capture billeder hver 2 sekunder for i alt 20 minutter til mitokondrie imaging i oligodendrocytes.
Bemærk: Hyppighed og varighed fastsættes efter mobilitet af genstande af interesse. En højere frekvens vil udsætte prøven laserprodukter mere lys, men hurtigere-flytte objekter også kræver en kortere samlet varighed af time-lapse videoer (f.eks. mitokondrier i neuroner, som flytter oftere og med en meget højere hastighed end mitokondrier i oligodendrocytes, er typisk filmede hvert sekund, i alt 2 minutter 16). - Start time-lapse optagelse.
Bemærk: Mitokondrier kan flytte ud af fokus og/eller glider ud af regionen afbildet under optagelsen. For at minimere vibrationer og bevægelse, justere ind - og udtag af badet og reducere pumpens omdrejningstal, hvis nødvendigt. Små ændringer i fokus som regel stadig forekomme. Således løbende overvågning af skærmen under imaging er påkrævet, med små justeringer af fokus under optagelsen. - Fange en z-stak af hele cellen for fremtidige identifikation af celle og afbildet proces.
Bemærk: For bedre opløsning, pinhole skal nulstilles til 1 luftige enhed for z-stakken. - Valgfrit: visualisere unstained myelin.
Bemærk: I oligodendrocytes transduced med (cytoplasmatisk) normal god landbrugspraksis, myelin skeder kan normalt identificeres som lige linjer af cytoplasma (cytoplasmatisk kamme) forbundet til en primær proces (Se figur 2 A og B). Hvis normal god landbrugspraksis udtryk er for svagt eller et cytoplasmatisk markør er ikke anvendes, er det imidlertid muligt at visualisere myelinskeden af Konfokal Reflektionsgraden mikroskopi (kerne) som forklaret her.- Oprettet en ny lys sti i software med laser excitation på 488 nm og fange udsendte lys omkring den samme bølgelængde, fx 470-500 nm.
- Juster laser power og få indtil myelin er synlige (se eksempel i < stærk class = "Xfig "> figur 3). Brug en LSM 510 Meta mikroskop, vi typisk bruge en laser power af 7-12 µW (målt ved målet tilbage blænde).
- Valgfrit: forberedelse af skiver for immunfarvning.
- Hvis cellen afbildet skal identificeres efter immunfarvning, fange en lav forstørrelse billede (10 x) af cellen og angive dens placering i billedet ved at tegne en pil eller lignende. Hjælp til påvisning af cellen, det anbefales at også tegne en manuel kort over en hel skive, der angiver placeringen af cellen.
- Fix skive i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) på shaker i 1 time ved stuetemperatur.
Forsigtig: PFA er skadelige. Bruge beskyttende slid og brug kun i en ventileret hætte. - Fortyndes fiksativ 1:10 i PBS og forlade ved 4° C indtil starter Immunhistokemi som beskrevet andetsteds 17.
Bemærk: Selvom skiver kan stå i fortyndet fiksativ i flere uger, fluorescens kan falme. Udfører Immunhistokemi senest 10 dage efter fiksering anbefales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Organotypic hjernen udsnit, der var kulturperler og transduced som beskrevet ovenfor viste en sparsom fordeling af kortikale oligodendrocytes udtrykker mito_dsred og normal god landbrugspraksis. Immunfarvning med antistoffer mod Olig2 og MBP bekræftede, at udtrykket var specifikke for oligodendrocytes (figur 1).
Live imaging, blev transduced oligodendrocytes anerkendt ved deres karakteristiske morfologi af flere myelin skeder kører parallelt (figur 1 og figur 2A). Ved at udføre time-lapse imaging på de transduced oligodendrocytes, er det muligt at overvåge bevægelse af mitochondrier i primære processer og myelin skafter (figur 2B-D).
I celler med lav normal god landbrugspraksis udtryk, der kunne identificeres under live imaging myelinskeden af lysende eksempler på 488 nm og indfange udsendte lys 470-500 nm (figur 3A). Denne Konfokal Reflektionsgraden mikroskopi (kerne) teknik også arbejdede på PFA fast og immunostained væv, selvom myelin kapper, hylstre syntes lysdæmper (figur 3B-C). Ved immunfarvning med antistoffer mod myelin grundlæggende protein (MBPS), vi fandt, at næsten 100% af myelin skeder æglæggende vandret til billedbehandling flyet (angivet af pilespidser, figur 3B-C) er synlig med kerne, mens myelin kapper, hylstre at lægge vinkelret synsfelt (angivet med en Asterisk, figur 3B-C) er mindre eller slet ikke synlige. Selv om næsten alle stængelled er visualiseret, vises mange stængelled diskontinuerligt, med små dele af kappe ikke bliver synlige (figur 3A Indsæt). Disse små "huller" i myelin kan udfyldes af imaging med tre komplementære bølgelængder, såkaldte SCoRe9.
Figur 1 : Immunhistokemi bekræfter, at MBP-mito-dsred udtrykkes selektivt i oligodendrocytes, der er immune positiv for Olig2 og MBP. Billeder er fra neocortex af kulturperler mus hjernen skiver transduced med (AAV2/8) MBP-mito-dsred (rød, mitokondrie markør) og CAG-normal god landbrugspraksis (grøn, cytosol). Skiverne blev immunolabeled for myelin markør Myelin grundlæggende Protein (MBP, blå) og Olig2 (oligodendrocyte afstamning celle nukleare markør, magenta). (Figur ændres fra reference13) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Time-lapse imaging for at spore mitokondrie bevægelse i oligodendrocytes. (A) projektion af z-stak (optisk sektion 10.35 µm) af oligodendrocyte transduced med MBP_mito_dsred (røde mitochondrier) og CAG_GFP (grønne fluorescens). (B) enkelt Konfokal billede (optisk sektion 1,04 µm) i den samme celle. Firkant angiver region, der blev valgt for time-lapse imaging (C) og streger for at gøre kymographs (kym) i (D) er angivet. (C) billeder fra time-lapse optagelse af cellen i A og B tages på forskellige tidspunkter. Bevægelige mitokondrier er angivet (røde pile). (D) Kymographs fra baner angivet i (B). Stationære mitochondrier ses som lige lodrette linjer og bevægelige mitochondrier ses som Diagonale linjer. Som det kan ses i kymographs, og i de tid-kursus billeder i (C), er kun mitokondrier i den primære Behandl markerede Kymograph 1 (Kym 1) på vej. Mitokondrier i de andre tre kymographs er stationær under time-lapse optagelsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Visualisering af unstained myelin af Konfokal Reflektionsgraden mikroskopi (kerne). (A) projektion af z-stak (optisk sektion 10.35 µm) fra en levende organotypic hjerne skive neocortex. Normal god landbrugspraksis udtryk i oligodendrocyte vist her (grøn cellen kroppen) er for svagt til identifikation af primære processer og myelin skeder. I stedet, myelin skafter blev visualiseret ved excitation på 488 nm og fanger udsendte lys på 470-500 nm (vist i magenta). Nogle af cytoplasma-rige paranodes af normal god landbrugspraksis + oligodendrocyte kan ses på spidsen af myelin stængelled (pile). Indsæt: Forstørret del af myelinskeden viser, at den myelin visualiseret med CoRe vises "spredte" eller diskontinuerlig (jf. hovedteksten for detaljer). (B-C) Konfokal billeder fra striatum (B) og stratum radiatum af hippocampus CA1 (C) af en akut mus hjernen skive, der er fastsat i 4% PFA og immunostained for myelin grundlæggende protein (MBPS). Horisontale myelin skafter (pilespidser) er synlig med kerne, mens skeder, der er vinkelret på synsfelt (stjerner) er oftest ikke synlige. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Reagenser tabel: Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokol for at gøre organotypic kulturer beskrevet her er en modificeret udgave18 i protokollen beskrevet af De Simoni og Yu (2006)5. De vigtigste ændringer er blevet skitseret nedenfor. Tris buffer er føjet til næringssubstrat, som forbedrer overlevelsen af skiver når uden for inkubator under viral transduktion og ændring af celle-medium. Sterilisering procedure for konfetti er også ændret. Mens andre protokoller sterilisere konfetti ved autoklavering, vi ikke anbefale dette, fordi det vil forårsage flere af konfetti til at krølle. Undgå at bruge krøllet konfetti da skiver dyrkes på disse har tendens til at være mindre sunde. Vores protokol bruger mus, ikke rotter og er ændret for at kultur cortex i stedet for hippocampus, som vi finde fungerer godt med tyndere skiver (230 µm vs 300 µm). Som myelination toppe omkring postnatal dag 10-20 i mus og rotter19, kulturer fremstillet af er mus på p7-9 (og derefter kulturperler i 11-14 dage) optimal til at studere myelinating oligodendrocytes. På 11-14 dage in vitro indeholder kulturer flere modne oligodendrocytes med kompakt myelin skeder13. Kulturer lavet fra yngre mus vil indeholde færre ældre oligodendrocytes i slutningen af perioden kultur, boer kulturer fra ældre mus har vist mere udfordrende at holde sunde20.
Proceduren for at gøre organotypic skiver indebærer flere kritiske trin. Dissektion og montering af hjerner, samt placere skiver på konfetti, skal ske hurtigt og kræver nogle færdigheder. Typisk, de første forsøg på at gøre organotypic skive kulturer er mindre vellykket, men 2-3 runder af praksis bør være nok til at erhverve de kvalifikationer, der kræves for at gøre sunde kulturer. Det er vigtigt at holde et sterilt miljø under hele proceduren at undgå kontaminering af kulturer. Desuden, når du arbejder med levende celler, det er altid vigtigt at sikre korrekte pH og osmolalitet af løsninger til at opretholde celle sundhed. Det er derfor et godt råd at kontrollere osmolalitet (bør 270-310 mOsm/kg) og pH-værdi i alle løsninger, der er anvendt på skiver, især når du gør forsøget for første gang. Kultur og dissektion løsningerne for organotypic kulturer indeholder et pH indikator (phenol rød), men den gule serum i dyrkningsmediet kan give et indtryk af en lavere end den faktiske pH. Næringssubstratet indeholder Penicillin, Streptomycin og Nystatin for at minimere risikoen for infektion. Det anbefales derfor at bruge disse antibiotika og antimykotika, når du konfigurerer organotypic skive kultur teknik i laboratoriet, men de kan senere undgås, når ekspert aseptisk teknik anvendes. Den nuværende protokol bruger celle morfologi til at vurdere cellernes levedygtighed. For en mere kvantitativ undersøgelse, kan skiver indlæses med propidium Iodid eller lignende farvestoffer som beskrevet andetsteds21. Det er dog vigtigt at være opmærksom på, at emission spektrum af propidium Iodid overlapper med dsred, tdtomato og andre røde indikatorer. En anden begrænsning af propidium Iodid og lignende reagenser er, at de ikke umiddelbart angiver de dybere lag af skive, hvilket begrænser vurdering af cellernes levedygtighed til det øverste lag af celler5.
Forskellige metoder findes til gen levering. De vigtigste fordele ved at bruge AAV transduktion af organotypic skive kulturer for at visualisere organeller er som følger: AAV transduktion har en bedre succesrate for postmitotic oligodendrocytes sammenlignet med ikke-virale Transfektion metoder22. Yderligere, i organotypic kulturer alle hjerne celletyper er til stede, og oligodendrocytes har en morfologi ligner at ses i vivo, herunder kompakt myelin13. Dette er forskelligt fra oligodendrocytes i monokultur, der mangler kommunikation med axoner, og dermed gør ikke kompakt myelin. Imaging in vitro- er lettere sammenlignet med in vivo og tilbyder en bedre rumlige opløsning, som er af særlig interesse, når imaging lille organeller som mitokondrier. Kommende forskning vil stræbe efter at billedet i vivo, men ansigter en stor udfordring med de optiske aberrationer forårsaget af lipid-rige myelinskeden. Derudover kan AAV serotype tropisme og promotor specificitet variere mellem i vivo og in vitro- betingelser13,23. I protokollen præsenteres her, bruges AAV2/8 MBP_mito_dsred og AAV2/8 MBP_mito_GFP til at visualisere oligodendrocyte mitokondrier. AAV serotype 2/1 blev også testet med MBP_mito_dsred men inficeret et lavere antal oligodendrocytes i organotypic skiver (ikke vist). AAV2/8 CAG_GFP og AAV2/8 CAG_tdtomato blev brugt til at visualisere oligodendrocyte cytoplasma. Trods brug af generelle CAG initiativtageren til dette, AAV 2/8 CAG_GFP og CAG_tdtomato selektivt inficeret oligodendrocytes, med kun et lille antal astrocytter og neuroner at blive smittet (disse kan let identificeres ved deres karakteristiske morfologi). Denne selektivitet for oligodendrocytes skyldes formentlig tropisme AAV 2/8 serotype24. Dog organelle-målrettet udtryk, den større celle-specificitet opnås med MBP - eller andre oligodendrocyte-specifikke initiativtagere anbefales. Andre serotyper testet med CAG_GFP af os var AAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/7, 2/9, mest som inficeret hovedsagelig neuroner og astrocytter (ikke vist).
Afhængig af konstruktionen og de eksperimentelle betingelser, vil være behov for ændring af celle transduktion. Hvis de transduced celler vises for svagt, prøv en længere tid i vitro efter transduktion at øge udtryk. Hvis cellerne vises lyse men usund, reducere tid efter transduktion. Hvis meget få celler er transduced, kan blive øget koncentration af AAV. Det er imidlertid også muligt, at in vitro-efter transduktion tiden er for lang og at transduced celler er døde. For konstruktioner anvendes her, var udtryk niveauer optimal 4-6 dage efter transduktion. 7-8 dage efter transduktion, celler syntes mindre sunde, med blobby processer og 10 dage efter transduktion, kun et par transduced celler var synlige (ikke vist).
Denne protokol bruger en opretstående mikroskop for den levende billedbehandling af organotypic skiver. Dette er anderledes end mest mono- og co kulturer, der bruger typisk en inverteret mikroskop. Det er ikke optimalt at bruge en inverteret mikroskop her fordi skiver skal derefter omsættes med konfetti opad, hvilket formentlig forårsager skiver mindre sunde. En fordel ved den opretstående mikroskop er muligheden for at tilføje Elektrofysiologi til opsætningen. Desuden betyder brug af en pumpe til at ændre medium at narkotika løsninger nemt være tilføjet og fjernet under de time-lapse imaging. En ulempe med pumpen er problemer fastholde fokus forårsaget af vibrationer og strømninger i badet. Under mikroskopet, cellerne bliver gradvist mindresund. Vi holder derfor skiver under mikroskop for et maksimum på 1 time. Afbildet skiver smides væk (special affald). For at sikre de billeddiagnostiske betingelser er optimal, bør billeddannelse af kontrol celler, hvor mitokondrie bevægelse er allerede godt karakteriseret, køres parallelt. For eksempel, mitokondrie bevægelse i axoner eller dendritter kan være afbildet af transducing skiver med AAV 2/1 Syn_mito_dsred (i hvilke dsred udtryk er drevet af neuron-specifik synapsin promotor) eller AAV 2/1 CAG_mito_dsred (efterfulgt af immunfarvning til bekræfte celle identitet). Analyse af mitokondriel bevægelse kan gøres ved hjælp af værktøjet flere kymograph i ImageJ som beskrevet andetsteds25.
Her beskriver vi CoRe for visualisering af unstained myelin under live imaging. Sammenlignet med SCoRe9, som bruger tre excitation bølgelængder, CoRe kun bruger en (488 nm) og er således lettere at gennemføre. I SCoRe afsløre de tre bølgelængder hver forskellige "stykker" af myelinskeden og sammen giver et komplet billede af kappe. Derudover kan SCoRe bruges til at registrere myelinskeden strukturer såsom cytoplasmatisk lommer. Med enkelt bølgelængde bruges i CoRe, en mindre detaljeret visning er givet og skeder virke granuleret eller diskontinuerlig (Fig. 3). Ikke desto mindre visualiserer kerne nær 100% af myelin skeder, der er vandret til synsfelt. Kernen er således nyttigt til påvisning af myelin skeder, men ikke for analyse af myelin strukturer eller integritet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Linda Hildegard Bergersen og Magnar Bjørås for adgang til celle lab og udstyr, Janelia Molekylærbiologi delt ressource personale for plasmid og virus produktion og Koen Vervaeke for bistand med laser power målinger. Dette arbejde blev finansieret af den norske Health Association, det norske Forskningsråd og mikroskopi udstyr blev finansieret af Norbrain.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | Needles used for in- and outlet of bath |
| Bioxide gas | AGA | 105701 | |
| Brand pipette bulbs | Sigma-Aldrich | Z615927 | Pipette bulbs |
| Bunsen burner (Liquid propane burner) | VWR | 89038-530 | |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | 64-0106 | Temperature controller - thermometer part |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | CO2 for incubator |
| Cover glass, square Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly. |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Delicate forceps | Finescience | 11063-07 | For dissection |
| Diamond scriber pen | Ted Pella Inc. | 54463 | |
| Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm | VWR | 612-1702 | Glass pipettes |
| Double edge stainless steel razor blade | Electron Microscopy Sciences | #7200 | Razor blade for vibratome |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| Filter paper circles | Schleicher & Schuell | 300,220 | Filter paper used for filtration of PFA |
| Fun tack | Loctite | 1270884 | Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath |
| Hand towel C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
| Harp, Flat for RC-41 Chamber, | Warner Instruments | 64-1418 | Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15 |
| HEPES, FW: 260.3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir, Model 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Laminar flow hood |
| Horse serum, heat inactivated | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LCR Membrane, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | Confetti |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratome |
| MEM-Glutamax with HEPES | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Micro Spoon Heyman Type B | Electron Microscopy Sciences | 62411-B | Small, rounded spatula with sharpened end for dissection |
| Millex-GP filter unit | Millipore | SLGPM33RA | Syringe filter unit |
| Millicell cell culture insert, 30 mm | Millipore | PICM03050 | Cell culture inserts |
| Minipuls 3 Speed Control Module | GILSON | F155001 | Peristaltic pump for live imaging - Control module part (connect to two-cannel head) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta Surface | Thermo Fischer Scientific | 140675 | Culture plate |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR |
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |
| Paraformaldehyde, granular | Electron Microscopy Sciences | #19208 | |
| PC-R perfusion chamber | SiSkiYou | 15280000E | Bath for live imaging |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri dish 140 mm | Heger | 1075 | Large Petri dish |
| Petri dish 92x16 mm | Sarstedt | 82.1473 | Medium Petri dish |
| Petridish 55x14,2 mm | VWR | 391-0868 | Small Petri dish |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | PBS tablets |
| R2 Two Channel Head | GILSON | F117800 | Peristaltic pump for live imaging - Two channel head part (requires control module) |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Large spatula for dissection |
| Sand paper | VWR | MMMA63119 | Optional, for smoothing broken glass pipettes |
| Scissors, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Large scissors for dissection |
| Scissors, 8,5 | Finescience | 14084-08 | Small, sharp scissors for dissection |
| Single edge, gem blade | Electron Microscopy Sciences | #71972 | Single edge razor blade |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | Temperature controller - heater part |
| Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm | Millipore | SCGPT05RE | Filter to sterilize solutions |
| Super glue precision | Loctite | 1577386 | |
| Surgical scalpel blade no. 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | Rounded scalpel blade |
| Temperature controller TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly) |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| Water jacketed incubator series II | Forma Scientific | 78653-2882 | Incubator |
References
- Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
- Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
- Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
- Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
- Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
- Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).
- Gow, A., Friedrich, V. L. Jr, Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
- Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
- Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
- Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
- Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
- Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
- Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).
- Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
- Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029 (2014).
