Enquête sur les néfastes effets de basse pression Plasma stérilisation sur la survie de Bacillus subtilis Spores en utilisant Live microscopie des cellules

Des principaux objectifs de l’exploration spatiale sont la recherche de signatures de formes de vie et de biomolécules sur d’autres corps planétaires et lunes de notre système solaire. Le transfert des micro-organismes ou des biomolécules d’origine terrestre à des domaines critiques d’exploration est présentant un risque particulier d’influencer le développement et l’intégrité des missions vie-détection sur les corps planétaires tels que Mars et Europe¹. Les directives internationales de protection planétaire, mis en place par le Comité de la recherche spatiale (COSPAR) en 1967, imposer des règlements stricts sur les missions habitées et robotisées d’autres planètes, leurs satellites, astéroïdes et autres corps célestes et de réglementer les nettoyage et la stérilisation d’un véhicule spatial et composants matériel critique avant de lancer afin d’éliminer la contamination de micro-organismes terrestres et éviter toute contamination croisée des corps célestes,². Durant la dernière décennie, l’application des plasmas non thermiques a gagné l’attention dans la recherche biomédicale et nutritionnelle, ainsi que dans le vol spatial applications^3,4,5. Stérilisation de plasma est une alternative prometteuse aux méthodes de stérilisation classique car il offre⁶d’inactivation microbienne rapide et efficace, tout en étant douce à sensible et matériaux labile de la chaleur. Décharges de plasma contiennent un mélange d’agents réactifs tels que les photons dans l’ultraviolet (UV) et du spectre ultraviolet sous vide (VUV) qui conduisent à une inactivation microbienne rapide³, neutre/excités des atomes, particules chargées, radicaux libres. Dans cette étude, nous utilisons plasma basse pression généré par double torche à plasma basse pression (RCID) source^7,8 pour inactiver les endospores Bacillus subtilis distribués sur le revêtement de verre.

Bactéries Gram-positives de la famille des Bacillaceae sont largement distribués dans les habitats naturels du sol, des sédiments et aériens ainsi que dans des environnements inhabituels tels que les salles blanches et de la Station spatiale internationale^{9,10 ,11}. La caractéristique plus particulière du genre Bacillus est la capacité à former des endospores dormants très résistants (ci-après dénommés "spores") pour survivre à des conditions défavorables, telles que l’épuisement des nutriments,¹². Les spores sont généralement beaucoup plus résistants que leurs homologues de la cellule végétative d’une variété de traitements et des contraintes environnementales, y compris la chaleur, UV, irradiation gamma, dessiccation, rupture mécanique et produits chimiques toxiques, tels que les oxydants ou des agents de changement de pH (révisés dans les références^13,,¹⁴) et sont donc des objets idéales pour tester l’efficacité des méthodes d’inactivation microbienne. Puisque l’ADN génomique est un objectif majeur du traitement plasma des bactéries^15,16, la réparation des lésions de l’ADN induite par le plasma (comme les ruptures double brin d’ADN) sur spore revival est crucial pour la survie de bactéries^{13, 17}.

Ainsi, nous étudions la capacité de germination des spores et le rôle de réparation de l’ADN au cours de la germination des spores et une excroissance après avoir traité les spores avec plasma d’argon basse pression par des spores individuels suivants et réparer leur expression d’ADN marqués par fluorescence protéine RecA avec la microscopie en fluorescence confocal résolution temporelle. Nous donnons une instruction étape par étape de la préparation des spores de b. subtilis en monocouches pour parvenir à des résultats de test reproductible, le traitement des monocouches de spore avec plasma basse pression pour la stérilisation, la préparation des spores du plasma traité pour ultrastructurale évaluation au moyen de la microscopie électronique à balayage (SEM) et l’analyse de microscopie de cellules vivantes au niveau des spores individuelles de concert avec l’ADN actif de surveillance processus survenant dans la cellule en réponse à un traitement plasma de réparation.

1. Production de spores de bacillus subtilis et Purification

1. Pour la production de spores, transférer une culture nuit 5 mL de la souche de b. subtilis , complétée avec des antibiotiques appropriés, à 200 mL double résistance Schaeffer sporulation milieu liquide (par litre bouillon nutritif de 16 g, KCl 2 g, 0,5 g MgSO ₄* 7 H₂O 2 mL 1 M Ca (NO₃)₂, 2 mL 0,1 M MnCl₂ * • 4 H₂O, 2 mL 1 mM FeSO₄, 2 mL de glucose 50 % (p/v)¹⁸) et de cultiver avec aération vigoureuse à 37 ° C pendant 72 h ou jusqu'à ce que > 95 % de la culture a sporulé. Les spores des souches suivantes sont utilisées : b. subtilis PY79 (type sauvage) b. subtilis PY79ΔrecA:: neo (carence de réparation d’ADN protéine RecA) b. subtilis PY79 recA-yfp:: chat (RecA fusionné avec jaune protéine fluorescente [YFP]¹⁹).
2. Récolter des spores par centrifugation pendant 15 min à 3 000 x g, en tubes de 50 mL et de purifier les échantillons par des lavages répétés étapes (jusqu'à 15 fois) à l’aide de stérile distillée H₂O et cocher pour état de pureté et de germination par microscopie à contraste de phase. Veiller à ce que les suspensions de spores sont constitués d’une phase brillante spores (> 99 %) et sont libres de cellules végétatives (tiges), les spores germées (aspect noir / gris) et les débris cellulaires, autrement plus amples expériences microscopie peuvent être perturbés. Laver l’échantillon jusqu'à ce que la pureté désirée est atteinte.
3. Déterminée, le titre de spores par ensemencement sur 50 µL de dilutions en série 10 fois sur LB-agar (c.-à-d. : utilisation 30 µL d’échantillon + 270 µL d’eau stérile pour un 01:10 dilution. Prendre 30 µL de la dilution particulier à 270 µL H₂O pour une dilution au 1/100, etc.) pour calculer l’UFC (unités formant des colonies) et incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit. Après détermination de l’UFC, ajuster l’échantillon à 10⁹ spores / mL de concentration ou de dilution avec de l’eau stérile.

2. préparation des Spores déposé par aérosol Bacillus subtilis

Remarque : L’Accumulation et le chevauchement des spores pourraient conduire à l’occultation des effets pendant le traitement, entraînant finalement cinétique de l’inactivation falsifiés. Pour minimiser ce problème, préparer les échantillons de spores par une technique de dépôt aérosol-²⁰. En bref, contrôler la buse de deux substances de haute précision avec une minuterie électrique qui régule le débit de liquid en concert avec le débit de gaz pressurisé transporteur (ici N₂). Disperser l’échantillon liquide injectée par le biais de la prise de bec avec le débit de gaz d’azote.

1. Placer un support de l’échantillon sous forme de stérilisé diapositives microscopiques (pour la cinétique de survie) ou ronds 25 mm lamelles couvre-objet (fluorescent suivi de réparation de l’ADN des processus/cLSM ; laser confocal, microscopie à balayage) à l’intérieur de l’aérosol électrovanne unité de pulvérisation en alignement avec la buse. La concentration de spores utilisé doit correspondre à un cent fois de la concentration finale souhaitée.
2. Transférer 1 mL de la culture de spore dans l’admission de fluide de buse et entamer le processus de pulvérisation de 0,1 s à une pression de 1,3 bar. La suspension de spores pulvérisée (1 x 10⁷) forme une couche mince sur la lame microscopique qui sèche rapidement en quelques secondes pour former une monocouche de spore uniformément distribuée. Stocker les entreprises de l’échantillon dans un flacon stérile à la température ambiante.

3. basse pression traitement au Plasma

1. Préparer le système plasma pour le traitement d’échantillons biologiques et exploiter le système à 5 Pa avec plasma d’argon à 500 W pendant 5 min. Par la présente, toutes les surfaces du système sont nettoyées et réchauffés. Cela réduit le collage des molécules de l’air ambiant, à savoir d’azote, d’oxygène et d’eau, tandis que le système d’évacuation. Après le prétraitement du système, aérer la chambre et placer les échantillons soigneusement dans le centre de la cuve du réacteur avec l’aide de grilles de verre.
2. Utilisez au moins trois réplicats biologiques. Fermer la chambre et évacuer inférieures à 2 PA. Remplissez par la suite, le gaz de procédé dans le compartiment. Régler la pression dans le système à 5 PA.
3. Après le temps de processus définis, coupez l’alimentation électrique et gaz et aérer soigneusement le système pour éviter de souffler les échantillons du porte-échantillon. Après aération, supprimer les échantillons et placer les échantillons pour le paramètre suivant dans le système. Pour les contrôles non traités-plasma exposent échantillons d’aspirer uniquement (5 Pa) en présence du gaz processus équivalent à la fois appliquée plasmatique plus longue.

4. récupération et évaluation de survie des spores

1. Préparer une solution d’autoclave 10 % acétate de polyvinyle (PVA) et couvrir le transporteur échantillon soigneusement avec environ 500 µL et laissez-les sécher à l’air pendant 4 h. bande de hors la couche séchée de PVA (maintenant contenant l’échantillon de spore) en utilisant une pince stérile et la transférer à une 2 mL tube à essais. Ajouter 1 mL d’eau stérile dans le tube et dissoudre la couche PVA via Vortex. Cette procédure conduit à > 95 % de récupération des spores et n’affecte pas leur capacité de germination²¹.
2. En série, diluer l’échantillon à 01:10 dans de l’eau stérile dans une plaque à 96 puits (c.-à-d. 270 µL stérile H₂O + dilution d’échantillon/ancienne 30 µL). Plaque de 50 µL de chaque dilution sur gélose nutritive de bouillon lysogénie (LB), incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit et énumérer le nombre de colonies cultivées (CFU).

5. vivre la microscopie des cellules et le suivi des processus de réparation de l’ADN dans la germination des Spores

1. Pour les essais de germination, préparer un tampon de LB-agar 1 mm épaisseur 1,5 %, en faisant bouillir 700 µL de milieu et pipette dans une boîte de Pétri stérile de la microscopie. Après 10 min, coupez un 8 x 8 mm x 1 tampon mm LB-agar avec un scalpel stérile et transférer l’agar soigneusement sur le dessus les monocouches de spore qui reposent sur des lamelles de verre de 25 mm.
   Remarque : Cette étape est cruciale pour la visualisation des spores individuels et laisser suite à leur réaction, vers l’activation de germination induite par la gélose nutritive. Ainsi, le LB-agar sert à deux fins, (1) pour fixer les spores à la surface, ce qui évite la relocalisation, le long de la surface et hors foyer optique et (2) pour activer la spore pour la germination.
2. Après avoir couvert l’échantillon avec l’agar, transférer la lamelle de verre rapidement dans une imagerie chambre et microscope les échantillons avec un microscope à balayage laser confocal automatisé avec une optique inversée à l’aide d’un 63 X / 1.3 avion apochromatique objectif à immersion d’huile.
3. Effectuer l’imagerie de fluorescence (YFP) avec une excitation de longueur d’onde de 514 nm et d’émission peut être détectée entre 520 et 560 nm.
   1. Enregistrer des images lumineuses-champ dans la numérisation de mode en utilisant un des multiplicateurs de photo (chemin de la lumière transmise).
   2. Enregistrer une série Time-lapse avec une puissance de laser de 2,6 % et régler l’ouverture confocale à 5 unités aérées et à une fréquence d’échantillonnage de 1 images / 30 s de 0 h à 5 h, selon l’expérience. On notera en particulier que des doses élevées de monochromatique laser éclairage au 514 nm complètement inhiber la germination (Figure 1A, B).
4. Conserver les échantillons à 37 ° C (humidité de l’air ambiant) dans une phase de chauffage durant tout le processus d’imagerie. Utilisez au moins trois réplicats biologiques pour chaque condition. Dans le cas d’agrégation de spore, distribution de spore multicouches ou contamination par des particules de poussière, blocage du traitement plasma (« ombrage ») peut-être se produire et activer la germination des spores occultées (Figure 1C, D).

Figure 1 : les problèmes potentiels observés au cours de la microscopie de fluorescence des cellules vivantes confocal du plasma traité spores. (A, B) L’inhibition de la germination des spores par de fortes doses de monochromatique (514 nm) illumination au laser. (A) vue d’ensemble (3 x 3 images piquées) de b. subtilis (LAS72, RecA-YFP) spores 180 min après le début de la germination. Le cadre au milieu a été exposé à intervalles de 30 s à de fortes doses de lumière laser (514 nm, puissance du laser de 70 %), tandis que les régions environnantes (= cadres) n’étaient pas allumées (image fusionnée de lumineux-zone canal et fluorescence RecA-YFP ; commandés étaient des structures causés par l’utilisation de 35 mm d’imagerie plats avec une grille imprimée 500 µm). (B) montre un 4 X vue agrandie de la frontière entre la région lumineuse et non lumineuses, montrant que les spores, qui ont été exposés à des doses élevées d’illumination laser monochromatique n’ont pas germer et croître, alors que des spores dans régions non éclairée se remettre complètement de bactéries végétatives, exprimant la fluorescence brillante de RecA-YFP (signal vert). (C, D) Spores couvertes par contamination des particules ou des couches multiples de spore (flèches) semble protéger les spores sous-jacente de l’inactivation par traitement au plasma et permettre leur germination et la croissance (« effet d’ombrage »). (C) les Spores ont été imprégnées sur le plasma pour 60 s et imagé 180 min après le début de la germination ou en (D) pour 120 s et imagés après 240 min. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

6. microscopie électronique par balayage (SEM)

1. Microscopie électronique à balayage permet de fournir des informations ultrastructurales sur la morphologie de la surface des spores de plasma traité par rapport aux témoins non traités. Enrober les monocouches de spores sèches sur les lamelles couvre-objet avec or-palladium (3 nm) à l’aide d’un pulvérisation-coater. Utiliser un microscope électronique à balayage-émission de champ pour l’imagerie des échantillons, exploités à 5 kV tension d’accélération notamment un détecteur d’électrons secondaires à l’objectif pour faire apparaître le contraste de la topographie.

7. analyse de données

1. Déterminer la survie des spores au quotient N/N₀, où N est la moyenne UFC des échantillons traités et N₀ correspond à la moyenne UFC des témoins sous vide. Tracer l’inactivation des spores par traitement au plasma argon en fonction de la durée (en secondes). Exprimer toutes les données en valeurs moyennes et écarts-types (n = 3).
2. Analyser les images obtenues par imagerie de cellules vivantes en utilisant le logiciel d’imagerie. Quantifier la proportion de la germination des spores et l’étroit après traitement au plasma, compter les spores dans des cadres représentant au début de l’expérience, ainsi qu’après 4 h. Pour la détermination de l’importance dans les essais de survie de spores, utilisez unidirectionnels tests ANOVA (analyse de variance) avec un logiciel de statistique). Les valeurs P < 0,05 sont considérés comme statistiquement significatifs.

Des spores de survie du plasma traité b. subtilis

Traitement plasma des spores b. subtilis utilisés dans cette étude démontrent une diminution de la survie avec l’augmentation de la durée du traitement plasma (Figure 2). Les spores de la souche exprimant la recA-gène fusionné à YFP montre les courbes de survie semblables à des spores de la souche de type sauvage, ce qui indique que la modification génétique n’a pas d’effet significatif sur la vitalité bactérienne. Les spores de la souche RecA déficient présentent une sensibilité plus élevée vers un traitement plasma par rapport aux spores de la souche de type sauvage, ce qui démontre que la présence du gène RecA diminue perte induite par le plasma de la vitalité. Particulièrement court traitement au plasma de 15 s (P <0,003) et 30 s (P < 0,004) provoque une diminution significative de la vitalité chez les souches de RecA-déficientes en comparaison de type sauvage et les souches de RecA-YFP. Après 90 s de traitement au plasma, la vitalité de toutes les souches est réduite d’environ trois ordres de grandeur.

Figure 2 : Survie de b. subtilis spores de différentes souches après un traitement par plasma d’argon à basse pression. Survie (moyenne UFC de plasma traité spores/moyenne UFC de spores traitées sous vide ; barres d’erreur représentent l’écart-type) est tracée contre durée de traitement au plasma. PY79 (type sauvage, des cercles fermés), LAS72 (RecA-YFP ; cercles gris) et LAS24 (ΔrecA; ouvrir les cercles). L’analyse statistique a montré aucune différence significative dans la survie des spores PY79 (non modifié RecA) et LAS72 (RecA-YFP-fusion).

Analyses ultrastructurales des spores imprégnées de plasma par SEM

Pour avoir une idée de l’impact morphologique du plasma, traitement des spores, microscopie électronique (MEB) a servi à analyser la morphologie de la surface des spores de plasma traité par rapport aux spores traitées sous vide (contrôle). La surface extérieure des spores de b. subtilis révèlent des structures ressemblant à crête longitudinales caractéristiques qui sont constamment visibles dans toutes les spores traitées et non traitées (Figure 3). Traitement au plasma jusqu'à 30 s n’induit aucun changement significatif de la morphologie de surface de spores par rapport aux témoins (Figure 3A-C). La durée du traitement au plasma (60-240 s) conduit à une surface plus granulaire des spores (Figure 3D-F) et les petites fissures et fissures peuvent être observées dans les spores traitées pour 120 ou 240 s. En outre, petits globules se posent sur des surfaces de spore (120 s et 240 traitements s, Figure 3E, F), qui est causé par le matériel sorti de la couche, cortex ou de l’intérieur de la base22. Ces globules couvrent la spore entier et peuvent être trouvés sur les structures en forme de veine, ainsi que sur des surfaces intermédiaires.

Figure 3 : SEM des spores de b. subtilis (LAS72, RecA-YFP) vaporisée sur couvre-objet en verre après traitement au plasma basse pression. Spores exposés au vide uniquement et pas au plasma (contrôle) figure dans le (A). (B-F) Les spores qui ont été imprégnées d’insecticide plasma avec la durée (15, 30, 60, 120 et 240 s). Les spores qui ont été imprégnées de plasma 60 s ou plus apparaissent plus granulaire à leur surface que les spores de contrôle ou de spores qui ont été traités à plasma, de 15 et 30 s. fissures et fissures (flèches blanches) sont visibles à la surface des spores plasma imprégnées d’insecticide pour 120 ou 240 s. Veuillez cliquer ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Vivre la microscopie des cellules du plasma traité b. subtilis spores

Microscopie des cellules vivantes de faire revivre les spores des souches de b. subtilis exprimant la protéine RecA (RecA-YFP) de réparation marqués par fluorescence est réalisée afin d’analyser la capacité germinative et l’expression de RecA-YFP de spores individuelles dans réponse au traitement plasma. Ici, nous utilisons la résolution temporelle de le microscopie confocale à balayage laser à suivre la germination, la croissance et la progression dans un état végétatif des spores imprégnées de plasma (Figure 4) en ce qui concerne les problèmes potentiellement connus, par exemple l’occultation des effets ou la inhibition de la germination par de fortes doses d’illumination laser monochromatique (Figure 1). Exposées au vide seule (contrôle, Figure 4A-C), les spores présentent quelques signaux fluorescents au cours des premiers Etats de reconstitution de spore (0 - 65 min., non illustré). Une augmentation de l’intensité de la fluorescence, probablement due à l’accumulation de RecA-YFP, on observe à ≥ 65 min lorsque les cellules végétatives sont formés et les premières cellules commencent à diviser. Toutes ces cellules hébergent un signal de fluorescence accumulé dans au moins un poste à l’intérieur de chaque cellule. Presque toutes les spores (98 ± 2 % ; 589 ± 14, n = 4) traités avec le vide comme un contrôle germent et développer une morphologie de cellules en forme de bâtonnet avec une longueur plutôt uniforme des cellules individuelles (Figure 4B-C). Contrairement aux spores chez les témoins sous vide, spores traitement pendant 15 s avec plasma montrent déjà une faculté germinative réduite de moins de 75 ± 4 % (197 ± 8 spores, n = 3, Figure 4D-F), ce qui indique que le traitement plasma induit des dommages dans les spores dormantes, qui empêche la germination. En outre, la morphologie des cellules l’étroit est différente de la morphologie des cellules chez les témoins. Cellules croissent dans beaucoup de longues tiges (plus de temps que par rapport au témoin) ou restent petits et coller dans le manteau de spore (Figure 4G-I). Par ailleurs, plus les cellules allongées lysent avec l’augmentation de la taille des cellules (têtes de flèche blanche, Figure 4F). Signaux de fluorescence de RecA-YFP dans les cellules semblent être légèrement augmenté par rapport à des signaux dans les cellules de contrôle (Figure 4C, F), mais aucune différence significative peut être observée (non illustré). Des spores ont été plasma traitement pendant 30 s germer jusqu'à 25 ± 6 % (99 ± 4 spores, n = 3) et les cellules végétatives sont retardées notamment en croissance par rapport aux spores de contrôle et les spores après 15 s de traitement au plasma. Les cellules végétatives sont plutôt petites et en forme de bâtonnet mais de longueur variable (Figure 4G-I). Cependant, les cellules de toutes tailles peuvent lyser pendant de plus longues périodes d’incubation comme on le voit pour les échantillons après 15 s de traitement au plasma. Après 60 s de plasma-traitement est inférieure à 2 ± 2 % (8 ± 8 spores, n = 3) spores sont aptes à former des cellules végétatives (Figure 4,J-L). Les spores qui sont traités plasma pour 90, 120 ou 240 s peuvent être analysées, mais ils montrent aucune excroissance ou tout changement dans les niveaux de fluorescence de RecA-YFP (non illustré).

Figure 4 : Laser confocale à balayage direct microscopie des cellules de b. subtilis spores d’une souche exprimant RecA-YFP après traitement au plasma et début de la germination. Les spores ont été suivies au fil du temps (une image par 30 s) et des images pour des moments-0, 2 et 4 h sont indiqués. (A-C) Spores traitement à vide seulement et pas avec du plasma (contrôle) germent et grossissement de cellules végétatives (B) et entrer dans la phase de croissance exponentielle (C). (D-L) Spores traitées pour une durée différente avec le plasma argon basse pression montrent des différences significatives dans leur croissance par rapport aux spores du contrôle (voir le texte pour plus de détails). Traitement de s (D-F), 15 (têtes de flèche blanche représentent les cellules végétatives, qui récemment lysent), (G-j’ai) 30 traitement s (têtes de flèche noire visualiser les cellules végétatives, qui étaient de petite taille et collent dans la couche de spores) et traitement s (J-L) 60 après un temps de récupération spore 0 h, 2 h et 4 h. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.