Summary
Detta protokoll illustrerar de viktig på varandra följande steg krävs för att bedöma relevansen av övervakning vitalitet parametern och processer för DNA-reparationer i återuppliva Bacillus subtilis sporer efter behandling med lågtryck plasma av spårning fluorescens-märkt DNA reparation proteiner via tid-löst konfokalmikroskopi och svepelektronmikroskopi.
Abstract
Plasma sterilisering är ett lovande alternativ till konventionella sterilisering metoder för industri-, kliniska, och rymdfärder. Lågt tryck plasma (LPP) utsläpp innehåller ett brett spektrum av aktiva arter, som leder till snabb mikrobiell inaktivering. För att studera effektivitet och mekanismer för sterilisering av sekretess, använder vi sporer av testorganismen Bacillus subtilis på grund av sin extraordinära motstånd mot konventionella sterilisering procedurer. Vi beskriver produktionen av B. subtilis spore enskiktslager, steriliseringsprocessen av lågtryck plasma i en dubbel induktivt kopplad plasma reaktor, karakterisering av spore morfologi med scanning electron microscopy (SEM), och analys av grobarhet och utväxt av sporer av levande cell mikroskopi. Ett viktigt mål av plasma arter är genetiska material (DNA) och reparation av plasma-inducerad DNA lesioner på spore väckelse är avgörande för överlevnaden för organismen. Här studerar vi grobarheten av sporer och rollen av DNA reparation under sporgroning och utväxt efter behandling med LPP genom att spåra fluorescently-märkt DNA reparation proteiner (RecA) med tid-löst confocal fluorescensmikroskopi. Behandlade och obehandlade spore enskiktslager aktiveras för groning och visualiseras med en inverterad confocal levande cell Mikroskop över tid följa reaktionen av enskilda sporer. Våra observationer avslöjar att fraktionen av spira och outgrowing sporer är beroende av behandlingens längd LPP-nå ett minimum efter 120 s. RecA-YFP (gul fluorescens protein) fluorescens upptäcktes endast i några sporer och utvecklat i alla outgrowing celler med en lätt förhöjning i LPP-behandlade sporer. Dessutom några av de vegetativa bakterierna härrör från LPP-behandlade sporer som visade en ökning i cytoplasman och tenderade att lysera. De beskrivna metoderna för analys av enskilda sporer kan vara exemplariska för att studera andra aspekter av sporgroning och utväxt.
Introduction
Ett viktigt mål av utforskning av rymden är sökandet efter signaturer av livsformer och biomolekyler på andra planetariska kroppar och månarna i solsystemet. Överföring av mikroorganismer eller biomolekyler av terrestrial beskärningen till kritiska områden av utforskning är av särskild risk att påverka utveckling och integritet av liv-detection uppdrag på planetariska organ som fördärvar och Europa1. De internationella riktlinjerna för planetariska skydd, som fastställs av kommittén av utrymme forskning (COSPAR) 1967, införa strikta bestämmelser om bemannade och robotiserade uppdrag till andra planeter, månar, asteroider och andra himlakroppar och reglera den rengöring och sterilisering av ett rymdskepp och kritisk hårdvarukomponenter tidigare att lansera för att eliminera kontaminerande markbundna mikroorganismer och förhindra korskontaminering av himlakroppar2. Under det senaste decenniet, har tillämpningen av icke-termisk plasmor fått stor uppmärksamhet i biomedicinsk och näringsmässiga forskning samt i rymdfärder program3,4,5. Plasma sterilisering är ett lovande alternativ till konventionella sterilisering metoder eftersom den erbjuder snabb och effektiv mikrobiell inaktivering6, samtidigt som den är skonsam för känslig och värmen labila material. Plasma utsläpp innehåller en blandning av reaktiva ämnen såsom fria radikaler, neutral/upphetsad atomer, laddade partiklar, fotoner i ultraviolett (UV) och vakuum ultraviolett (VUV) spektrum som leder till snabb mikrobiell inaktivering3. I denna studie använder vi lågtryck plasma genereras av dubbel induktivt kopplade lågtryck plasma (DICP) källa7,8 för att inaktivera Bacillus subtilis endosporer fördelat på glasytan test.
Grampositiva bakterier av familjen Bacillaceae är spridda i livsmiljöer av jord, sediment och luft samt i ovanliga miljöer såsom rena rumsfaciliteter och den internationella rymdstationen9,10 ,11. Den mest tydliga inslaget i släktet Bacillus är förmågan att bilda Högresistent vilande endosporer (hädanefter benämnd sporer) för att överleva ogynnsamma förhållanden, till exempel näringsmässig utarmning12. Sporer är generellt mycket mer motståndskraftiga än motsvarigheterna vegetativ cell till en mängd olika behandlingar och miljöpåfrestningar, inklusive värme, UV, gammastrålning, uttorkning, mekaniska störningar och giftiga kemikalier, såsom kraftiga oxidationsmedel eller pH-ändra ombud (ses i referenser13,14) och är därför perfekt objekt för att testa effektiviteten av mikrobiell inaktivering metoder. Eftersom genomiskt DNA är ett viktigt mål av plasmabehandling av bakterier15,16, reparation av plasma-inducerad DNA lesioner (t.ex. dubbel DNA-strängen bryter) när spor revival är avgörande för överlevnaden av bakterier13, 17.
Således, vi studerar grobarheten av sporer och rollen av DNA-reparation under sporgroning och utväxt efter behandling av sporer med lågtryck argon plasma av följande enskilda sporer och deras uttryck för fluorescens-märkt DNA reparation protein RecA med tid-löst confocal fluorescensmikroskopi. Vi ger en steg för steg instruktion för beredning av B. subtilis sporer i enskiktslager för att uppnå reproducerbara testresultat, behandling av spore enskiktslager med lågtryck plasma för sterilisering, beredning av plasma behandlat sporer för ultrastrukturella utvärdering med hjälp av scanning electron microscopy (SEM) och levande cell mikroskopi analys på nivån för enskilda sporer i konsert med övervakning aktiv DNA reparation processer som sker i cellen i plasma behandlingssvaret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bacillus subtilis Spore produktion och rening
- För produktion av spore, överföra en 5 mL övernattning kultur respektive B. subtilis stam, kompletteras med lämpliga antibiotika, att 200 mL dubbel-styrka flytande Schaeffer sporulering medium (per liter 16 g näringsämne buljong, 0,5 g MgSO KCl 2 g 4* 7 H2O, 2 mL 1 M Ca (nr3)2, 2 mL 0,1 M MnCl2 * • 4 H2O, 2 mL 1 mM FeSO4, 2 mL 50% (w/v) glukos18) och odla det med kraftig luftning vid 37 ° C i 72 tim eller tills > 95% av kulturen har sulfitreducerande. Sporer av följande stammar används: B. subtilis PY79 (vild typ) B. subtilis PY79ΔrecA:: neo (brist av DNA reparation protein RecA) B. subtilis PY79 recA-yfp:: katt (RecA smält med gul fluorescerande protein [YFP]19).
- Skörda sporer genom centrifugering i 15 min på 3 000 x g i 50 mL rör och rena proverna genom upprepade tvättar steg (upp till 15 gånger) med sterilt destillerat H2O och kontrollera för renhet och grobarhet status av faskontrast mikroskopi. Säkerställa att spore suspensioner består av fas-ljusa sporer (> 99%) och är fria från vegetativa celler (stavar), grodda sporer (svart / grå utseende) och cellfragment, annars ytterligare mikroskopi experiment kan störas. Tvätta provet tills önskad renhet uppnås.
- Determinate spore titern av bordläggningen ut 50 µL 10-faldig seriespädningar på LB-agar (dvs: användning 30 µL prov + 270 µL sterilt vatten för en 1:10 utspädning. Ta 30 µL från viss utspädning 270 µL H2O för en spädning 1: 100 och så vidare) att beräkna CFU (kolonibildande enheter) och inkubera plattorna vid 37 ° C över natten. Efter CFU beslutsamhet, justera provet 109 sporer per mL genom att koncentrera sig eller att späda med sterilt vatten.
2. provberedning av Aerosol-deponeras Bacillus subtilis sporer
Obs: Ackumulering och överlappning av sporer kan leda till skuggning effekter under behandlingen, vilket i slutändan resulterar i förfalskade inaktivering kinetik. För att minimera detta problem, förbereda spore prover av en aerosol-nedfall teknik20. Kort, styra hög precision två-ämne munstycket med en elektrisk timer som reglerar den flytande genomströmningen i konsert med flödet av trycksatt bärgas (här N2). Skingra det injicerade flytande provet genom munstycket utlopp använder kväve gasflödet.
- Placera provet bärare i form av steriliserad mikroskopiska diabilder (för överlevnad kinetik) eller runda 25 mm coverslips (för fluorescerande spårning av DNA-reparation processer/cLSM; confocal microscopy för laserscanning) inuti den elstyrda aerosol besprutning enhet i linje med munstycket. Används spor koncentrationen måste motsvara en hundrafalt av önskad slutliga koncentration.
- Överför 1 mL av spore kultur till nozzle fluid inloppet och initiera processen besprutning av 0,1 s vid ett tryck på 1,3 bar. Sprejade sporsuspensionen (1 x 107) bildar en tunn film på den mikroskopiska bilden som torkar snabbt inom sekunder att bilda en fördelade spore enskiktslager. Lagra behandlade prov bärarna i en steril behållare i rumstemperatur.
3. lågt tryck plasmabehandling
- Förbereda plasma systemet för behandling av biologiska prover och driva systemet på 5 Pa med argon plasma vid 500 W för 5 min. Genom detta, alla ytor i systemet rengörs och värmas upp. Detta minskar klibba av molekyler från luften, nämligen kväve, syre och vatten, medan ventilation systemet. Efter förbehandling av systemet, ventilera kammaren och placera proverna försiktigt i mitten av reaktortanken med hjälp av glas rack.
- Använd minst tre biologiska replikat. Nära kammaren och evakuera nedan 2 Pa. efteråt fylla processen gasen in i kammaren. Reglera trycket i systemet till 5 Pa.
- Efter definierade processtiden, stänga av el och gas leverans, och noggrant ventilera systemet för att förhindra blåser proverna från provhållaren. Efter ventilation, ta bort proverna och placera proverna för nästa parameter i systemet. För icke-plasma-behandlade kontroller exponera prover vakuum endast (5 Pa) i närvaro av den processgas motsvarar den längsta tillämpliga plasma tid.
4. återhämtning och utvärdering av Spore överlevnad
- Bered en lösning av Ånghärdad 10% polyvinylacetat (PVA) och täcka prov transportören noggrant med cirka 500 µL och låt dem lufttorka för 4 h. Strip off torkade PVA lagret (nu med spore provet) med steril pincett och överföra det till en 2 mL reaktionsröret. Tillsätt 1 mL sterilt vatten till röret och lös PVA lagret via vortexa. Detta förfarande leder till > 95% återvinning av sporer och påverkar inte deras grobarhet kapacitet21.
- Seriellt späd provet på 1:10 i sterilt vatten i en plattan med 96 brunnar (dvs 270 µL sterilt H2O + 30 µL prov/tidigare utspädning). Platta ut 50 µL av varje utspädning på Lysogeny buljong näringsagar (LB), inkubera plattorna vid 37 ° C över natten och räkna upp antalet odlade kolonier (CFU).
5. levande Cell mikroskopi och spårning av processer för DNA-reparationer i spira sporer
- För grobarhet experiment, förbereda en 1 mm tjock 1,5% LB-agar pad, genom kokning 700 µL medium och Pipettera till en steril mikroskopi petriskål. Efter 10 min, klipp ut ett 8 x 8 mm x 1 mm LB-agar pad med en steril skalpell och överföra ägarn försiktigt ovanpå de spore enskiktslager som vilar på 25 mm glas coverslips.
Obs: Detta steg är avgörande för visualisering av enskilda sporer och låt efter deras reaktion, mot aktivering av grobarhet induceras av näringsagar. Således, LB-ägarn tjänar två syften, (1) att fixa sporer på ytbehandla, som undviker relocalization längs ytan och optiska ofokuserad, och (2) Aktivera spor för groning. - Efter täcker provet med agar, överföra täckglaset snabbt till en tänkbar kammare och Mikroskop av prov med en automatiserad confocal laserskanning Mikroskop med inverterad optik med en 63 X / 1.3 flygplan apokromatiska oljeimmersionsobjektivet.
-
Utföra avbildning av fluorescens (YFP) med en magnetisering våglängd av 514 nm och utsläpp kan upptäckas mellan 520 och 560 nm.
- Spela in ljusa fält bilder i sökningsläge med någon av de foto multiplikatorer (genomlysningsbasen sökväg).
- Time-lapse serien med en lasereffekt på 2,6%, och ställs in confocal bländaren till 5 luftiga rummen och på en prov frekvens av 1 bildruta per 30 s från 0 h 5 h, beroende på experimentet. Det är av särskilt intresse att höga doser av monokromatisk laser belysning på 514 nm helt hämmar groning (figur 1A, B).
- Hålla proverna vid 37 ° C (omgivande luftfuktighet) i en värme-scenen under hela avbildningsprocessen. Använd minst tre biologiska replikat för varje villkor. Vid spore aggregering, multilayered spore distribution eller kontaminering av dammpartiklar, blockering av plasmabehandling (”skugga”) kan förekomma och aktivera groning av skuggad sporer (figur 1C, D).
Figur 1: potentiella problem observeras under confocal levande cell fluorescensmikroskopi av plasma behandlat sporer. (A, B) Hämning av sporgroning av höga doser av monokromatisk (514 nm) laser belysning. (A) översikt (3 x 3 sytt ramar) av B. subtilis (LAS72, RecA-YFP) sporer 180 min efter påbörjande av grobarhet. Ramen i mitten var utsatt intervaller 30 s för höga doser av laserljus (514 nm, 70% lasereffekt), medan de omgivande regionerna (= ramar) inte var upplyst (sammanslagna bilden av ljusa fält kanal och RecA-YFP fluorescens; beställde strukturer var orsakas av att använda 35 mm imaging rätter med ett rutnät som präglade 500 µm). (B) visar en 4 X förstorad bild av gränsen mellan belyst och icke-belysta regionen visar att sporer, som utsattes för höga doser av monokromatisk laserbestrålning inte gro och växa ut, medan sporer i icke-belysta regioner återhämta fullt vegetativa bakterier uttrycker ljusa RecA-YFP fluorescens (grön signal). (C, D) Sporer omfattas av förorenande partiklar eller flera lager av spore (pilar) verkar skydda underliggande sporer från inaktivering av plasmabehandling och tillåta sin grobarhet och utväxt (”skugga effekt”). (C) sporer var plasma-behandlade för 60 s och avbildad 180 min efter initiering av grobarhet eller i (D) för 120 s och avbildas efter 240 min. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
6. svepelektronmikroskopi (SEM)
- Använda skanning elektronmikroskopi ultrastrukturella informerar om ytan morfologi av plasma behandlat sporer jämfört med obehandlade kontroller. Coat torkade spore enskiktslager på coverslips med guld-palladium (3 nm) med hjälp av en fräsande-bestrykare. Använda en fält-utsläpp svepelektronmikroskop för imaging proverna, drivs på 5 kV acceleration spänning inklusive en i objektivet sekundär electron-detektor för att avslöja topografi kontrast.
7. dataanalys
- Bestämma spore överlevnad från kvoten N/N0, där N är Genomsnittligt CFU behandlade prover och N0 är Genomsnittligt CFU av obehandlade vakuum kontroller. Rita spore inaktivering av argon plasmabehandling som en funktion av tiden (i sekunder). Uttrycka alla data som medelvärden och standardavvikelser (n = 3).
- Analysera bilder tagna av levande cell bildåtergivning med avbildningsprogrammet. Kvantifiera andelen sporgroning och outgrowing efter plasmabehandling, räkna sporer i representativa ramar i början av experimentet samt efter 4 h. För betydelse bestämning i spore överlevnad analyser, Använd one-way ANOVA-test (variansanalys) med statistisk programvara). P -värden < 0,05 betraktas som statistiskt signifikanta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Överlevnad av plasma-behandlade B. subtilis sporer
Plasmabehandling av B. subtilis sporer används i denna studie visar en minskning av överlevnad med ökande behandlingstid i plasma (figur 2). Sporer av stammen uttrycker den recA-gen smält till YFP visade överlevnadskurvor liknar sporer av vildtyp stam, vilket indikerar att den genetiska modifieringen har ingen signifikant effekt på bakteriell vitalitet. Sporer av RecA-brist stammen uppvisar en högre känslighet mot plasmabehandling jämfört med sporer av vildtyp stam, visar att förekomsten av genen RecA minskar plasma-inducerad förlust av vitalitet. Särskilt korta plasmabehandling 15 s (P <0,003) och 30 s (P < 0,004) orsaka en betydande minskning av vitaliteten i RecA-brist stammar i jämförelse med vildtyp och RecA-YFP stammar. Efter 90 s plasma behandling, livskraften i alla stammar förminskas av ungefärligt tre tiopotenser.
Figur 2: Överlevnad av B. subtilis sporer från olika stammar efter behandling med lågtryck argon plasma. Överlevnad (genomsnittlig CFU av plasma behandlat sporer/medelvärde CFU av vakuum behandlade sporer; felstaplar representera standardavvikelse) ritas mot plasma behandlingstiden. PY79 (vildtyp, slutna cirklar), LAS72 (RecA-YFP; grå cirklar) och LAS24 (ΔrecA; öppna cirklar). Statistisk analys visade inga signifikanta skillnader i spore överlevnadsförmåga mellan PY79 (omodifierade RecA) och LAS72 (RecA-YFP-fusion).
Ultrastrukturella analys av plasma-behandlade sporer av SEM
För att få en uppfattning om den morfologiska påverkan av plasman användes behandling på sporer, svepelektronmikroskopi (SEM) för att analysera ytan morfologi av plasma behandlat sporer i jämförelse med vakuum-behandlade sporer (kontroll). Den yttre ytan av B. subtilis sporer avslöja karaktäristiska längsgående ås-liknande strukturer som syns ständigt i alla behandlat och obehandlat sporer (figur 3). Plasmabehandling upp till 30 s inducerar inga signifikanta förändringar av spore ytan morfologi jämfört med kontroll (figur 3A-C). Behandlingstid i plasma (60 – 240 s) leder till en mer detaljerad spore yta (figur 3D-F) och små sprickor och sprickor kan observeras i sporer behandlas för 120 eller 240 s. Dessutom små globuler uppstår på spore ytor (120 s och 240 s behandlingar, figur 3E, F), som orsakas av släppt material från pälsen, cortex eller från inre kärna22. Dessa globuler täcka hela spor och kan hittas på ven-formade strukturer samt på mellanliggande ytor.
Figur 3: SEM av B. subtilis (LAS72, RecA-YFP) sporer sprutas på glas coverslips efter lågtryck plasmabehandling. Sporerna utsätts för vakuum endast och inte till plasma (kontroll) visas i (A). (B-F) Sporer som var plasma-behandlade med ökande varaktighet (15, 30, 60, 120 och 240 s). Sporer som var plasma-behandlade 60 s eller längre visas mer detaljerad på deras yta än kontroll sporer eller sporer som plasma-behandlades för 15 och 30 s. sprickor och sprickor (vita pilar) är synliga på ytan av sporer plasma-behandlade för 120 eller 240 s. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Levande cellen mikroskopi av plasma-behandlade B. subtilis sporer
Levande cellen mikroskopi att återuppliva sporer från B. subtilis stammar uttrycker proteinet fluorescens-märkt reparation RecA (RecA-YFP) utförs för att analysera grobarheten och uttrycket av RecA-YFP av enskilda sporer i plasma behandlingssvaret. Här, vi använder tid-löst laserskanning konfokalmikroskopi för att följa grobarhet, utväxt och progression i vegetativt tillstånd av plasma-behandlade sporer (figur 4) med avseende på potentiellt kända problem t ex skuggning effekter eller hämning av groning av höga doser av monokromatisk laserbestrålning (figur 1). Sporer som utsätts för vakuum bara (kontroll, figur 4A-C), uppvisar några fluorescerande signaler under tidiga stater av spore revival (0 - 65 min, inte visas). En ökning av fluorescensintensiteten, troligen på grund av ansamling av RecA-YFP, observeras vid ≥ 65 min när vegetativa celler bildas och första cellerna börjar dela upp. Alla dessa celler hysa en fluorescens signal ackumuleras i minst en position inuti varje cell. Nästan alla sporer (98 ± 2%; 589 ± 14, n = 4) behandlas med vakuum som en kontrollen gror och utveckla en stavformad cellmorfologi med en ganska enhetlig längd av enskilda celler (figur 4B-C). I motsats till sporer i vakuum kontroller, sporer behandlas för 15 s med plasma visar redan en minskad grobarhet på mindre än 75 ± 4% (197 ± 8 sporer, n = 3, figur 4D-F), som anger att plasmabehandling inducerar skador i vilande sporer, som förhindrar grobarhet. Morfologi av outgrowing celler är dessutom olika från morfologi av celler i kontroller. Celler växer antingen till omfattande långa stavar (längre än jämfört med kontroll) eller förblir små och stick i spore pälsen (figur 4G-jag). Dessutom lyse mest långsträckta celler med ökad Cellstorlek (vita pilen huvuden, figur 4F). Fluorescens-signaler av RecA-YFP inom cellerna tycks vara ökade något jämfört med signalerna i kontroll celler (figur 4C, F), men inga signifikanta skillnader kan observeras (visas inte). Sporer som var plasma behandlas för 30 s gror upp till 25 ± 6% (99 ± 4 sporer, n = 3) och vegetativa celler är särskilt försenad tillväxt jämfört med kontroll sporer och sporer efter 15 s av plasma-behandling. Vegetativa celler är ganska små och stavformade men varierar i längd (figur 4G-jag). Dock celler i alla storlekar kan lysera under längre inkubationstider sett för prover efter 15 s av plasma-behandling. Efter 60 s plasma-behandling mindre än 2 ± 2% (8 ± 8 sporer, n = 3) sporer ska kunna bilda vegetativa celler (figur 4J-L). Sporer som plasma-behandlas för 90, 120 eller 240 s kan analyseras, men de visar ingen utväxt eller förändringar i fluorescens nivåer av RecA-YFP (visas inte).
Figur 4: Confocal-laserskanning live cell mikroskopi av B. subtilis sporer från en stam som uttrycker RecA-YFP efter plasmabehandling och initiering av grobarheten. Sporer följdes över tid (en bild per 30 s) och bilder för tidpunkter 0, 2 och 4 h visas. (A-C) Sporer behandlas med vakuum endast och inte med plasma (kontroll) gro och växa ut till vegetativa celler (B) och ange exponentiell tillväxtfas (C). (D-L) Sporer som behandlas för olika varaktighet med lågtryck argon plasma Visa signifikanta skillnader i sin utväxt i jämförelse med sporer av kontroll (se text för detaljer). (D-F), 15 s behandling (den vita pilen huvuden representerar vegetativa celler, som nyligen lyserat), (G-jag) 30 s behandling (svart pil huvuden visualisera vegetativa celler, som var små och stick i spore pälsen) och (J-L), 60 s efter 0, 2 och 4 h spore återhämtningstid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sterilisering av ytor med låg temperatur, lågtryck plasma är ett lovande alternativ till ganska konventionell sterilisering procedurer såsom behandling med joniserande strålning, kemikalier (t.ex. gaser som H2O2 eller etylenoxid) eller torr och fuktig värme23. Vanlig sterilisering metoder ger oftast en effektiv sterilisering, men de är kända för att påverka det behandlade materialet och utgör en potentiell risk för operatören. Lågtryck plasma erbjuder en snabb och homogena biologisk inaktivering med sammansättningen av flera komponenter såsom UV fotoner, fria elektroner, joner och lämnat atomer eller molekyler (t.ex. ROS). LPP kan därför tillämpas på värme- och korrosion känsliga material, såsom termoplastiska polymerer för implantat, elektroniska instrument eller komplexa 3D-strukturer. I detta dokument vi demonstrera tillämpningen av ett sådant testsystem, i vilka enskiktslager av sprejade B. subtilis sporer20 behandlas i en särskild lågtryck plasma-reaktor som beskrevs nyligen i detalj7. Ljusa fält mikroskopundersökning av plasma-behandlade sporer kan räcka för att få en övergripande uppskattning av sterilisering effektivitet. Dock är vi intresserade av att rikta lågtryck plasma underliggande mekanismer och dess påverkan på spore inaktivering på molekylär nivå. I kombination med fluorescerar-tracking mikroskopi kan vi belysa detaljerna i denna särskilt molekylär respons i plasma-behandlade sporer och potentiellt ge oss insikter i grundläggande inaktivering mekanismen av lågtryck plasma.
Här fokuserar vi på analys av plasma-behandling effektivitet och effekter med hjälp av levande cell mikroskopi, vilket gör att efter enskilda sporer efter inledandet av grobarhet. Anmärkningsvärt, detta särskilt tillvägagångssätt avslöjar ett par nya resultat som inte kan tillhandahållas genom att mäta vitalisering av hela spore befolkningen som använder bestämning av antalet celler eller CFU. Först av allt, påverkar plasma-behandling av sporer inte bara kapaciteten av utväxt på ett dosberoende sätt, som förväntat från mätning av överlevnad av bestämning av CFUs, men också av vegetativa celler, som utvecklar ofta stora stavar morfologi till formuläret septa enligt korrekt celldelning tillsammans med små celler fastnar i spor (15 s av plasma-behandling) eller celler vid en minskad längd (30 s plasma-behandling). Observationer av celler med minskad längd visade ingen återställning till normal cell längd vid senare tidpunkter. Dessutom lever cellen imaging visar att de flesta av de morfologiskt förändrade cellerna lyse i senare skeden av observation. Detta innebär att skador som förvärvats av sporer under plasma-behandling endast är effektiv i senare skeden av spore vitalisering, förmodligen på grund av DNA-skador och att de maskiner som används för grobarheten och utväxt är mer robust mot plasma sterilisering än de maskiner som behövs för vegetativ tillväxt. Anmärkningsvärt, uttryck av DNA-reparation RecA protein verkar vara låg och nästan frånvarande i sporer och utvecklar under utväxt och vegetativa fasen som indikeras av en ökning av RecA-YFP fluorescens17. Men hjälper även en något ökad RecA uttryck i outgrowing plasma-behandlade sporer, jämfört med kontroll sporer, inte för att rädda cell vitality kvantitativt, eftersom de flesta celler lyse eller brista efter utväxt, särskilt efter mer än 3 h av inkubation. Denna effekt kan visualiseras med hjälp av levande cell filmer från time lapse bilder av grodda sporer. Vi kan inte utesluta att denna effekt är överbetonat av villkoret viss odling där cellerna tvingas i en enskiktslager med hjälp av en tunn överlagring av agar.
Ett annat resultat av analysen av levande cell mikroskopi är att partikelformiga föroreningar (t.ex. dammpartiklar, andra sporer) på spore enskiktslager ytan kan skydda underliggande sporer från de skadliga effekterna av plasman. I sådana fall verkar ännu längre plasma-behandling vara ineffektiva. Eftersom sådana föroreningar är svåra att undvika helt, bör alternativt plasma-behandlingsstrategier testas, till exempel använda planetens rotation under plasmabehandling i samband med längre varaktighet av behandlingen. Analysen av SEM indikerar att spore pälsen är perforerad med ökad behandlingstid plasma-vilket är i linje med teorin om plasma-medierad effekter på fråga22,24. En långvarig exponeringstid (> 240 s) plasma kan även perforera de förorenande partiklarna och därmed kan skada och inaktivera underliggande sporer.
Presenterade protokollet för levande cell mikroskopi sporgroning och utväxt kan vara lämplig för andra studier också. Som täcker sporer med ett tunt lager av agar tvingar sporer i ett distinkt optiska plan och begränsar laterala rörelse. Både effekter garanterar att sporer och outgrowing celler bo inom ramen för valda imaging. Liknande metoder har beskrivits innan25 men ger mindre flexibilitet än metoden som beskrivs här som gör att du väljer nästan alla prov bärare (t.ex. ett objektglas, täckglas eller petriskål). I våra händer kunde andra vegetativa bakterier analyseras av levande cell mikroskopi med metoden agar-beläggningen). Noggrann kontroll experiment bör helst utföras för att bedöma möjliga effekter av foto skador under levande cell imaging, eftersom vi observerade att höga doser av monokromatisk laserljus helt hämma sporgroning. Frånsett förkorta belysning tiden, dvs genom att öka de observation intervallerna, kan detta fenomen förebyggas genom att minska laser intensitet och/eller öppnande av confocal bländaren (hål).
Sammanfattningsvis, bland de tekniker som används för att studera effektiviteten i plasma-behandling i modellen av sprejade B. subtilis spore enskiktslager, levande cell mikroskopi ger unika insikter i cellulära händelser under spore väckelse och erbjuder möjligheten att analysera dynamiken i fluorescens-märkta proteiner. Dessutom särskilt provpreparering, dvs beläggningen av sporer med ett tunt lager av agar, det kan tänkes paradigmatiska för bildtagning av andra mikroorganismer av levande cell mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter förklarade.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Andrea Schröder för hennes utmärkta tekniska bistånd under delar av detta arbete och Nikea J. Ulrich för hennes hjälp under video skjuta. Vi vill också tacka Lyle A. Simmons för hans generösa donation av Bacillus subtilis stammar: LAS72 och LAS24. Detta arbete stöddes i delar av bidrag från den tyska Research Foundation (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon PAK 728) till PA (AW 7/3-1) och RM (MO 2023/2-1) och DLR bevilja DLR-FuW-Projekt ISS liv, Programm RF-FuW, Teilprogramm 475 (F.M.F, M.R. och R.M.). F.M.F. stöddes av PhD stipendium för forskarskolan Helmholtz Space Life Sciences (SpaceLife) på den tyska rymdflygcentret (DLR) i Köln, Tyskland, som finansierades av Helmholtz Association (Helmholtz-Gemeinschaft) under en period av sex år ( Bidrag nr. VH-Ko-300) och fått ytterligare medel från DLR, inklusive Aerospace direktionen och Institutet för Aerospace medicin. Resultaten av denna studie inkluderas i doktorsavhandlingen av Felix M. Fuchs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
| Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Glass slides | VWR | 48300-026 | |
| Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
| MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glucose | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |
References
- Nicholson, W. L., Schuerger, A. C., Race, M. S. Migrating microbes and planetary protection. Trends Microbiol. 17, 389-392 (2009).
- COSPAR. COSPAR Planetery Protection Policy. Space Research Today, COSPAR's Information Bulletin. 193, 1-14 (2015).
- De Geyter, N., Morent, R. Nonthermal plasma sterilization of living and nonliving surfaces. Annu Rev Biomed Eng. 14, 255-274 (2012).
- Shimizu, S., et al. Cold atmospheric plasma - A new technology for spacecraft component decontamination. Planet. Space Sci. 90, 60-71 (2014).
- Lerouge, S., Fozza, A. C., Wertheimer, M. R., Marchand, R., Yahia, L. H. Sterilization by Low-Pressure Plasma: The Role of Vacuum-Ultraviolet Radiation. Plasma Polym. 5, 31-46 (2000).
- Rossi, F., Kylián, O., Rauscher, H., Gilliland, D., Sirghi, L. Use of a low-pressure plasma discharge for the decontamination and sterilization of medical devices. Pure Appl. Chem. 80, 1939-1951 (2008).
- Halfmann, H., Hauser, J., Awakowicz, P., Koller, M., Esenwein, S. A. A double inductively coupled low-pressure plasma for sterilization of medical implant materials. Biomed Tech (Berl). 53, 199-203 (2008).
- Halfmann, H., Denis, B., Bibinov, N., Wunderlich, J., Awakowicz, P. Identification of the most efficient VUV/UV radiation for plasma based inactivation of Bacillus atrophaeus spores. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 5907 (2007).
- Vaishampayan, P., et al. Bacillus horneckiae sp. nov., isolated from a spacecraft-assembly clean room. Int J Syst Evol Microbiol. 60, 1031-1037 (2010).
- Mandic-Mulec, I., Stefanic, P., van Elsas, J. D.
- Alekhova, T. A., et al. Diversity of bacteria of the genus Bacillus on board of international space station. Dokl Biochem Biophys. 465, 347-350 (2015).
- Claus, D., Bekerley, R. C. W. Genus Bacillus Cohn 1872. Bergey's manual of systematic bacteriology. Sneath, P. A. 2, Williams and Wilkins. Baltimore, MD. 1105-1141 (1986).
- Setlow, P.
- Setlow, P. Spores of Bacillus subtilis: their resistance to and killing by radiation, heat and chemicals. J Appl Microbiol. 101, 514-525 (2006).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Characterization of Bacillus subtilis spore inactivation in low-pressure, low-temperature gas plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 108, 521-531 (2010).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Response of Deinococcus radiodurans to low-pressure low-temperature plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 109, 1521-1530 (2010).
- Setlow, B., Setlow, P. Role of DNA repair in Bacillus subtilis spore resistance. J Bacteriol. 178, 3486-3495 (1996).
- Schaeffer, P., Millet, J., Aubert, J. P.
- Simmons, L. A., et al. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Raguse, M., et al. Improvement of Biological Indicators by Uniformly Distributing Bacillus subtilis Spores in Monolayers To Evaluate Enhanced Spore Decontamination Technologies. Appl Environ Microbiol. 82, 2031-2038 (2016).
- Horneck, G., et al. Protection of bacterial spores in space, a contribution to the discussion on Panspermia. Orig Life Evol Biosph. 31, 527-547 (2001).
- Opretzka, J., Benedikt, J., Awakowicz, P., Wunderlich, J., Keudell, A. v The role of chemical sputtering during plasma sterilization of Bacillus atrophaeus. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 2826 (2007).
- Stapelmann, K., et al. Utilization of low-pressure plasma to inactivate bacterial spores on stainless steel screws. Int. J. Astrobiol. 13, 597-606 (2013).
- Raguse, M., et al. Understanding of the importance of the spore coat structure and pigmentation in the Bacillus subtilis spore resistance to low-pressure plasma sterilization. J. Phys. D: Appl. Phys. 49, 285401 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS one. 8, e58972 (2013).
