Summary
Эта рукопись описывает метод вызывая эпилептический статус путем инъекций системных пилокарпин и мониторинга спонтанное периодических изъятий в живых животных, с использованием беспроводной телеметрии видео и системы электроэнцефалограммы. Этот протокол может использоваться для изучения патофизиологические механизмы хронической эпилепсии, epileptogenesis и острые приступы.
Abstract
Височная эпилепсия (TLE) является общей неврологические расстройства в зрелом возрасте. Для трансляционного исследования хронического эпилепсии эпилептический статус, пилокарпин индуцированной (SE) часто выбирается резюмировать спонтанное периодические приступы (SRS). Здесь мы представляем протокол SE индукции внутрибрюшинного (и.п.) для инъекций пилокарпин и мониторинг хронических повторяющиеся судороги в живых животных, с использованием беспроводной телеметрии видео и системы электроэнцефалограммы (ЭЭГ). Мы продемонстрировали заметные изменения в поведении, которые требуют внимания после инъекции пилокарпин и их корреляции с гиппокампа нейрональных потери на 7 дней и 6 недель после пилокарпин. Мы также описывают экспериментальные процедуры имплантации электродов для видео и записи ЭЭГ и анализ частоты и продолжительности хронический рецидивирующий судорог. Наконец мы обсуждаем возможные причины, почему ожидаемые результаты не достигаются в каждом конкретном случае. Это обеспечивает обзор основных моделирования хронический эпилепсии у мышей и руководящие принципы для устранения неполадок. Мы считаем, что этот протокол может служить в качестве основы для подходящих моделей хронических эпилепсии и epileptogenesis.
Introduction
TLE является одним из наиболее распространенных приобретенных эпилепсий1. Люди с эпилепсией испытывают периодические приступы вследствие ненормальной деятельности нейронов в мозге2,3. Учитывая, что TLE зачастую неразрешимыми, важно понять основные механизмы, лежащие в основе развития эпилепсии.
Животные модели, которые можно резюмировать основные характеристики человека TLE может предложить лучшее понимание TLE патофизиологии, что позволяет нам легко контролировать и управлять критическими факторами в epileptogenesis. Среди них chemoconvulsants индуцированной SE был широко используется4,5. В отличие от других моделей эпилепсия, например электрической стимуляции, который показывает не склероз гиппокампа и надежной SRS6,7,8системного введения chemoconvulsants может имитировать клинических патогенеза человека TLE, т.е., первоначальный черепно-мозговой травмы, латентного периода и хронического эпилептический стадии проявляется SRS5,9,10. Таким образом этот метод может использоваться в различных исследованиях, объясняя механизмов острого повреждения головного мозга, epileptogenesis или ареста пресечение. Кроме того аналогичные тем, которые видели в человека TLE, дополнительным обоснованием использования TLE грызунов модели10,,1112гистопатологические изменения, вызванные chemoconvulsants. Примечательно структурные повреждения, с участием гиппокампа были последовательно воспроизведены в обеих моделях кислоты - и пилокарпин индуцированной SE Каиновая. Однако по сравнению с Каиновая кислоты инъекции, пилокарпин модель может производить более надежной SRS в мышей, которые может предложить значительные преимущества для изучения хронических эпилепсии при рассмотрении широкая доступность трансгенные мыши линии5, 13 , 14 , 15. Кроме того, захват прогрессии после инъекции пилокарпин обычно быстрее, чем в модели Каиновая кислоты, предоставляя дополнительные доказательства для эффективного использования пилокарпин модели эпилепсии.
Здесь мы демонстрируем способ заставить SE и.п. инъекции пилокарпин и выполняя видео и ЭЭГ-мониторинг в хронический эпилепсии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были утверждены Комитетом по этике католический университет Кореи и были проведены в соответствии с национальными институтами здравоохранения руководство для ухода и использования лабораторных животных (низ публикации № 80-23).
1. SE индукции
- Приобрести 8-недельных самцов мышей C57BL/6NHsd и весят каждой мыши. Затем используйте маркер ручка для обозначения хвосты всех мышей для их быстрой идентификации во время SE индукции.
- Рассчитать количество скополамин бромистого метила (скополамин; 2 мг/кг), hemisulfate тербуталин (тербуталин; 2 мг/кг) и пилокарпин гидрохлорид (пилокарпин; 280 мг/кг), основанный на вес мыши и добавить солевой раствор (0,9% NaCl, 10 мл/кг) для принятия решений.
Примечание: Например, если вес мыши — 25 г, применяются следующие суммы: скополамин и тербуталин: 2 мг/кг * (25 г/1000 г) = 0,05 мг, солевой раствор: 10 мл/кг * (25 г/1000 г) = 0,25 мл, пилокарпин: 280 мг/кг * (25 г/1000 г) = 7 мг , Физиологическим: 10 мл/кг * (25 г/1000 г) = 0,25 мл. - Загрузите скополамин и тербуталин смеси в 1 мл шприц с иглой 30 G. Внедрить решение внутрибрюшинно в каждой мыши, а затем вернуть их клетки мышей. В 30 мин после приема скополамин и тербуталин inject пилокарпин решение в каждой мыши (и.п.; 1 мл шприц иглой 30 G). Сразу же после инъекции пилокарпин место мышей в инкубатор (28-30° C) для наблюдения.
- Тщательно контролировать поведение мышей до тех пор, пока SE индуцируется. При обнаружении лимбической моторные судороги, которые соответствуют стадии 3 или выше по шкале Расина в рекордное время и контролировать мышей, чтобы определить, является ли изъятия происходят более часто. После непрерывного моторные приступы длятся более 2 мин, поместите указатель мыши в новой клетке при комнатной температуре и держать мониторинг для 3 h для определения ли продолжить их судорожными припадками и SE индуцируется. Усыпить мышей, которые не удалось ввести SE на около 2 ч после инъекции пилокарпин.
Примечание: Расин в масштабе; этап 1, рот и движения лица; этап 2, глава кивая головой; Этап 3, Клонус передних конечностей; Этап 4, воспитания с Клонус передних конечностей; этап 5, воспитания и падения с передних конечностей Клонус16. Если мышь не передается в клетке при комнатной температуре, сразу же после SE индукции, мышь может умереть вследствие гипертермии. - Прекратить поведенческих острые приступы в 3 ч после начала SE путем инъекций раствор диазепама (и.п. 10 мг/кг 1 мл шприц; иглой 30 G). Сделать раствор диазепама путем разбавления 5 мг/мл диазепама в polyoxyl 10% 35 гидрогенизированное касторовое масло, добавив физраствора (и.п. 10 мл/кг 1 мл шприц; иглой 30 G).
Примечание: 10% polyoxyl 35 гидрогенизированное касторовое масло раствор: 1 мл раствора polyoxyl 35 гидрогенизированное касторовое масло + 9 мл физиологического раствора. Хранят раствор при комнатной температуре. Например, если мышь вес 25 г, придать 250 мкл раствора диазепама: 50 мкл диазепама 5 мг/мл + 200 мкл 10% polyoxyl 35 гидрогенизированное касторовое масло решение = 250 мкл диазепама 1 мг/мл. - Для мышей Шам, выполняют и.п. инъекции скополамин бромистого метила и тербуталин hemisulfate смеси (и.п.; оба 2 мг/кг, 10 мл/кг; 1 мл шприц; иглой 30 G). 30 минут позже, придать Салине внутрибрюшинно (и.п. 10 мл/кг 1 мл шприц; иглой 30 G).
Примечание: Если вес тела мыши — 25 г, придать 250 мкл раствора вместо пилокарпин. - После инъекции диазепама (и.п.; 1 мл шприц иглой 30 G) управлять 1 мл 5% декстрозы в отдельных мыши (и.п.; 1 мл шприц; 26 G иглы).
Примечание: 1 мл 5% декстрозы инъекции обеспечивает источник энергии и гидратации, что может повысить выживаемость. - Во время после ухода в инкубатор (28-30 ° C) протрите чрезмерной секреции таких как слюна, слезы и Кала.
- В день 1 после SE индукции весят мышей и держать их в инкубатор (28-30 ° C) на один дополнительный день. На 2 день, после ГП индукции весят мышей и их возвращения в их дома клетке. Обеспечивают влажных Чоу для содействия их восстановлению.
Примечание: В этом эксперименте уровень смертности для C57BL/6NHsd после окончания SE был 8,57% в среднем (3 из 35 мышей испытания). - Ежедневно измерять вес тела животных до 7 дней после пилокарпин и придать мышей с 5% декстрозы (и.п.; 1 мл шприц; 26 G иглы) когда масса тела не увеличилась. Остановите мониторинг вес тела, когда мышей начинают восстановить вес тела и потребляют влажные Чоу без затруднений на 2 дней после инъекции пилокарпин.
Примечание: Если вес тела мыши не увеличивается до 7 дней поста SE, исключить мыши из эксперимента и усыпить углекислого газа. В зависимости от фона мыши иногда может наступить смерть; Однако в случае C57BL/6NHsd, менее 1% мышей умер в этих экспериментах. С выживание более чем через 7 дней после SE индукции мышей редко умирают во время латентный период.
2. Имплантация хирургии для видео ЭЭГ-мониторинг
- Подготовка 12-week-old мышей (4 недели после SE индукции) для выполнения имплантации телеметрии для мониторинга ЭЭГ.
Примечание: Сроки проведения имплантации может быть изменен в зависимости от экспериментальных целях и мыши штаммов. - До операции анестезировать мышь со смесью (4:0.5) кетамина (50 мг/мл) и ксилазина (23,3 мг/мл) раствора растворяют в физиологического раствора в дозе 2,5 мкл/г веса тела (и.п.; 1 мл шприц; 26 G иглы). Контролировать частоту дыхания и дыхания усилий мыши на регулярной основе (максимальный интервал 15 мин) и оценить глубину анестезии по педали вывода рефлекс.
- Поместите указатель мыши в Стереотаксическая рама с уха баров и укус пластины и применять мазь ветеринар на оба глаза, чтобы избежать слепоты.
- Чтобы поддерживать стерильные условия во время операции, брить хирургических сайтов с помощью лезвия бритвы. Будьте осторожны, чтобы предотвратить загрязнения меха хирургического поля. После бритья, дезинфекция кожи с 70% этанола и йода раствор.
Примечание: Операции должны выполняться в асептических манере ношения стерильные перчатки и маски, используя стерилизовать оборудование и асептических методов. - После подтверждения глубины анестезии, сделайте срединной линии разреза кожи подвергать черепа. Сделать два Берр отверстия сверлом, прилагаемый к стереотаксического аппарата в точке с координатами Bregma в переднезаднем оси (AP): + 0,1 мм, медиолатеральной оси (мл): + 0,1 мм (Справочник) и AP: −0.2 мм, мл: +0.22 мм (левой теменной коре)13.
- Протрите кожу PBS-пропитанной хлопка ОСП, следуют 70% этанола и йода раствор. Сделайте продольный разрез в середине головы с помощью ножниц выставить лямбда (точки, где встречаются сагиттальной и lambdoid шов), Bregma (точка пересечения корональный шва, Сагиттальный шов) и в целевое расположение.
- Определите анатомические ориентиры например лямбда и Bregma. Поместите сверло в Bregma и Примечание X, Y координаты для этой точки.
- Использовать книги Атлас мозга или опубликованные ссылки чтобы определить соответствующие координаты регионов мозга для записи ЭЭГ. Затем рассчитайте координаты для винтов (ссылка и запись) с использованием координат Bregma измеряется на шаге 2.5.2.
- Медленно опустите сверло, чтобы сделать отверстие Берр, стараясь избежать вставив сверло слишком далеко в точке, где череп становится тоньше.
- Вставить тело одного канала беспроводной передатчик ЭЭГ позади затылка подкожно и место гибкие приводит вблизи черепа.
- Установите винт из нержавеющей стали (длиной 2 мм) в каждое отверстие заусенцев с помощью пинцета и затяните его с помощью отвертки, вращение по часовой стрелке. Убедитесь, что винт не вставлена слишком далеко глубоко регулируя степень вращения винта для того, чтобы предотвратить повреждение Дура или в тканях мозга.
- Полосы изоляции слоя 2 мм от кончика приводит и растянуть провод достаточно долго чтобы округлить винт вал для хорошее соединение между проводом и винт. Подключите провод ссылка к передней винт и записи приведет к винт в теменной коре. Затем примените стоматологического цемента для обеспечения всей сборки в месте, не подвергая металлических частей.
- После проверки, что стоматологического цемента полностью высох путем визуального осмотра, шовные кожи и применять Мупироцин актуальных мазь. Поместите курсор мыши в инкубаторе 30 ° C только до тех пор, пока он восстанавливает от хирургии (около 30 мин). Затем возвращает мыши дома Кейдж пока непрерывной видео ЭЭГ-мониторинг начинается.
Примечание: После операции каждая мышь вводят (и.п.; 1 мл шприц иглой 30 G) с 5 мг/кг гентамицина (антибиотики) и 5 мг/кг кетопрофена (анальгетиков). Животные должны быть проверены до тех пор, пока они становятся полностью передвигающихся самостоятельно. Передатчик имплантированные мышей есть восстановительный период около 1 недели.
3. видео и ЭЭГ-мониторинг и анализ
- Место мыши в индивидуальной клетке и место Кейдж поверх плиты беспроводной приемник где клетку Фарадея установлен чтобы избежать прерывания электрических сигналов от любых источников, включая компьютер, линии переменного тока и прилегающих приемников.
Примечание: Обратитесь к руководству производителя. Необходимо позаботиться о том, чтобы избежать белых пятен. - Запись электрической активности, с использованием беспроводной видео ЭЭГ телеметрической системы.
- Откройте программное обеспечение для записи видео ЭЭГ. Нажмите кнопку «Оборудование» и выберите «Изменить настройки». Матч, приемник и передатчик, имплантируется в каждой мыши. Нажмите кнопку «Канал конфигурации» и подтвердите, что все каналы являются активными. Нажмите «Настройки видео» для синхронизации видео с данных ЭЭГ (резолюция 40 x 480 и частота кадров 30.00).
Примечание: Установите IP-камеры с высокой чувствительностью, если важно собирать хорошие изображения качества, которые можно определить тонкие изменения в поведении мышей в ночное время. - Нажмите кнопку «Настройка» и «P3 установка» для ввода информации отдельных животных, соответствием камеры и настройка графа.
- Нажмите кнопку «Приобретение» и «Дискретизации A/D» для настройки дискретизации. Нажмите кнопку «имя набора данных» для обозначения каждого эксперимента.
Примечание: Частота дискретизации для ЭЭГ должен быть выше чем 500 Гц. Ввиду больших видео и размер данных ЭЭГ, рекомендуется что только 24 h данных обрабатываются за сессию вместо непрерывной 2-недели записи как один файл. Данные могут быть сохранены отдельно интервалами 8 h или 12 h в случае нехватки памяти RAM. - Активировать передатчик с магнитной полосой и нажмите кнопку «Начать приобретение» для сбора записи видео ЭЭГ. Постоянно контролировать мышь системой видео ЭЭГ для по крайней мере 2 недель.
Примечание: Для мышей C57BL/6 SRS, как правило, происходят в кластерах, что последний около 5,2 суток и продолжительности периода бесплатно захват около 6,7 дней17.
- Откройте программное обеспечение для записи видео ЭЭГ. Нажмите кнопку «Оборудование» и выберите «Изменить настройки». Матч, приемник и передатчик, имплантируется в каждой мыши. Нажмите кнопку «Канал конфигурации» и подтвердите, что все каналы являются активными. Нажмите «Настройки видео» для синхронизации видео с данных ЭЭГ (резолюция 40 x 480 и частота кадров 30.00).
- Определите захват частоты и продолжительности, ручного контроля с использованием программного обеспечения для анализа.
- Марк области показаны SRS и экспортировать данные для статистического анализа. Будьте осторожны, чтобы исключить ЭЭГ артефакты, которые могут быть получены путем чесать голову или жевания; они могут быть удалены путем проверки видео данных.
Примечание: SRS определяется как внезапное повторяющихся эпилептиформный пики активности (≥ 3 Гц), сохраняется, за более чем 10 s. судорожными поведения часто могут сопровождаться всплеск пики активности. Non судорожные припадки могут также продемонстрировать электрографические пики деятельность без судорожными поведения. Прекращения захвата определяется как происходящее когда шипы стрельбы вернуться к базовой деятельности. - Для анализа Частота приступов делят общее количество случаев СГД в течение 2 недель на общее количество дней запись для каждого отдельного животного.
- Для анализа продолжительности захвата Измерьте время от начала до конца эпилептиформный пики деятельности.
- Марк области показаны SRS и экспортировать данные для статистического анализа. Будьте осторожны, чтобы исключить ЭЭГ артефакты, которые могут быть получены путем чесать голову или жевания; они могут быть удалены путем проверки видео данных.
- После завершения записи видео ЭЭГ исправить мозга с параформальдегида 4%, transcardial перфузии. Чтобы анестезировать мыши, вводить раствор (4:0.5) кетамина (50 мг/мл) и ксилазина (23,3 мг/мл) растворяют в физиологического раствора в дозе 10 мкл/г веса тела (и.п.; 1 мл шприц; 26 G иглы). После подтверждения мыши чтобы быть глубоко под наркозом выполните transcardial перфузии.
- Прежде чем изолировать мозга мыши, получить передатчик от мыши для повторного использования после чистки.
- Удалите стоматологического цемента вокруг провода, используя пинцет.
- Замочите кончик провода с стоматологического цемента в 100% ацетона, до растворения стоматологического цемента.
- Удаление загрязнений ткани вокруг передатчика, промыв ее с дистиллированной водой.
- Промыть передатчика с 70% этанола для 3 h и воздух сушить для хранения. Непосредственно до следующего использования промойте винт и передатчик с 70% этиловом спирте, следуют дистиллированной воды и поместите их в солевой раствор.
Примечание: Должны позаботиться о том, чтобы избежать резки гибких проводов, когда декапитационный мыши, поскольку, если гибкий приводит слишком коротким, шум в следующем имплантации и запись видео ЭЭГ может возрасти.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешное SE может вызвать гибель клеток гиппокампа и SRS (рис. 1 и рис. 2). Мы прекращено поведенческих острые приступы инъекции диазепама в 3 ч после начала SE и жертву мышей 7 дней и 6 недель спустя.
Для видео ЭЭГ-мониторинг, мышей получил имплантации в 4 недели после SE, и SRS случаев были оценены за 2 недели с 5-7 недель после начала SE.
Рисунок 1 показывает гибели клеток в гиппокампе, оцениваются количество кресил фиолетовое окрашивание. 7 дней после SE pyknotic клетки были обнаружены в регионах центрального (Рисунок 1Ad) зубчатой извилины и слой пирамидальной клетке CA3 subfield гиппокампа (Рисунок 1Af), тогда как нетронутыми гиппокампа наблюдался в животных Шам, инъекции физраствора вместо пилокарпин (Aa-cрис. 1). Интересно, что животные, которые прошли несколько припадки, но не ввести SE, показан не гибели клеток в регионе центрального или слой пирамидальной клетке (Рисунок 1АГ i). В 6 недель после SE заметное сокращение было отмечено в количество центрального клеток (рис. 1б). Кроме того, было отмечено нейрональных потери в СА1 (Рисунок 1млрд) и CA3 (Рисунок 1Бо) регионах.
Рисунок 2 показывает представитель следы ЭЭГ в Шам и SE групп (рисA). По сравнению с группой Шам, показаны физиологического электрической активности, SE группы иногда показали эпилептиформный сбросов, сопровождаемые судорожными поведения. Местах эпидуральной электродов проиллюстрированы в рисунке 2C. Рисунок 2 B демонстрирует пример электрические шумы от прилегающих монитора и неспособность сигнала коллекции. Мы также продемонстрировали следы ЭЭГ Шам манипулировали животных, которые показали спонтанные судороги в течение 2 недель записи видео ЭЭГ (Рисунок 2E) и нашли корковых травм в перфузии, возможно, полученных от чрезмерно глубокой размещения Эпидуральная винта (рис. 2D).
Рисунок 1 : Нейронов смерти после пилокарпин индуцированной SE в гиппокампе. Представитель изображения из групп (A) 7 дней и (B) через 6 недель после инъекции пилокарпин или физиологического раствора. Увеличенные изображения показывают хилус (, j), СА1 подполе (b, k) и CA3 подполе (c, l) группы физраствора лечение Шам, хилус (d, m), СА1 подполе (e, n) и CA3 подполе (f, o) SE группы и хилус (g), СА1 подполе (h) и CA3 подполе (я) мышей, которые не развиваются SE. черные стрелки , gи j указать некоторые представитель центрального клеток, и наконечники стрел в d и m указывают pyknotic клеток. Линейки в нижней левой стороне = 200 мкм, действительны для всей левое большинство столбцов, шкалы бар в a и c = 20 мкм, действительны для всей средней колонки и правой колонке. Аббревиатуры на этом рисунке: СА1, CA3: гиппокампа подполей Cornu Ammonis; ДГ: Зубчатой извилины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Запись видео и ЭЭГ показывает спонтанное периодические приступы эпилепсии мыши. (A) представитель ЭЭГ следы от Шам-(вверху) и SE-манипулировали животных (внизу). Обратите внимание, что SE-подвергаются животные шоу эпилептиформный пики активности (≥ 3 Гц), не выставлены Шам животных. (B) представитель изображение электрических шумов и провал коллекции сигнала. Обратите внимание на высокой амплитудой однополярного шипы и прекращение электрических сигналов. (C) схема, чертеж мозга мыши с расположения электродов. (D) два изображения показаны нетронутыми и раненых мозга в коре головного мозга, возможно из-за чрезмерно глубокой вставки эпидуральной винтов. Черная стрелка справа указывает сайт корковых повреждения. Шкалы бар = 250 мкм. (E) представитель ЭЭГ следы животных, Шам манипулировали с или без повреждения мозга. Обратите внимание, что Шам манипулировали животных с корковой травмы генерируется пики активности и судорожными SRS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта работа описывает экспериментальной процедуры для SE индукции и оценки хронического судорог.
Ряд факторов может повлиять на Успешный SE индукции. Точная поведенческие наблюдения согласно шкале Расина имеет решающее значение для развития SRS. Кивал головой, Клонус передних конечностей, воспитание и падения являются поведенческих признаков острого изъятий, развивающихся в SE фаза4,16. После обнаружения первого мотор захват, длина интервала между позднее судорожными припадками уменьшается перед входом SE. Кроме того SE должно быть устойчивым для по крайней мере 6 h, если поведенческие изъятий завершенны диазепама5. Стоит отметить, что исследователи должны быть осведомлены о возможности того, что устойчивый захват, что деятельность может быть обнаружена через electrocorticograms, даже несмотря на то, что поведенческие изъятия, как представляется, спадать с инъекции диазепама. Повышение температуры окружающей среды после инъекции пилокарпин, до тех пор, пока SE индукции может значительно улучшить количество животных с SE. Важно также обеспечить интенсивный уход после захвата, включая достаточного увлажнения, нутритивная поддержка и вес, мониторинг за более высокие показатели выживания, чем около 70-80% в среднем5,18. В зависимости от животного генетический фон подверженность пилокарпин могут отличаться. Если животные отображения тяжелые острые приступы с высокой смертности, снижение дозировки пилокарпин, SE продолжительность, или увеличение скополамин и тербуталин может быть полезным. Хотя серьезные SE, как известно, быть связанным с более высокой заболеваемости SRS, с более высокой смертностью, важно учитывать эти факторы. Гиппокампа нейрональных смертей последовательно соблюдаются после SE. В 6 ч пост SE обширная потеря центрального интернейронов был сообщили19. 7 дней после SE пирамидальных нейронов в подполе CA3 обычно умирают и постоянно наблюдаются на 6 недель после SE индукции, хотя степень повреждения нейронов слоя пирамидальных клеток является переменной у мышей. Часто наблюдается также нейрональных потери в подполе СА1 гиппокампа. Интересно, что животные с несколькими захватами, которые не вводите SE показал почти нетронутыми гиппокампа похож на группе Шам, указанием гистологических клеточную смерть может быть хорошим маркером достаточно тяжелой острой изъятий.
Примерно через 4 недели после SE все лечение пилокарпин мышей C57BL/6NHsd стал эпилептические и показал SRS, демонстрируя один из крупных заслуживает, с помощью этой модели. Так как хронические приступы сгруппированы, видео ЭЭГ должны регистрироваться непрерывно по крайней мере 2 недели, а не с перерывами, несмотря на то, что период записи могут быть изменены в зависимости от штаммов мыши или экспериментальных целях17. Кроме того спонтанные судороги в TLE имеют суточные вариации, демонстрируя высокие частоты SRS в конце второй половине дня20. Практически для точной записи видео ЭЭГ, любые источники, включая линии переменного тока, компьютеры, камеры или приемник, имплантированных в мыши в прилегающих приемника необходимо будет заблокирован. Установка клетку Фарадея и камеры с высокой чувствительностью во время дня и ночи может уменьшить электрических шумов и помочь определить обобщенный хронические приступы, соответственно. Наконец чрезвычайно важно избежать повреждения головного мозга, когда винты находятся на поверхности твердой мозговой оболочки, как он может генерировать заблуждение данных ЭЭГ. Хотя Частота СГД не высок, механических кортикальной травм путем вставки принудительного винт может генерировать судорожными припадками в только одну неделю.
В заключение несмотря на время, ограничения для моделирования и требование об углубленной подготовки для выполнения имплантат хирургии и анализ ЭЭГ, пилокарпин индуцированной SE является одним из лучших моделей для изучения хронических эпилепсии среди имеющихся в настоящее время животных модели TLE. Здесь мы опишем способ заставить SE после инъекции пилокарпин и оценке хронического изъятий, с использованием системы видео ЭЭГ беспроводной телеметрии. Мы считаем, что этот протокол может предоставить подробную информацию о подходящих животных моделей для хронических эпилепсии и epileptogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальный фонд исследований Кореи (NRF) Грант, финансируемых правительством Кореи (СР 2014R1A1A3049456) и Грант от Кореи медицинских технологий R & D проекта через Корея здравоохранения промышленности развития института (ХИДИ), финансируется министерством здравоохранения и социального обеспечения, Республика Корея (HI15C2854).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 | Envigo | C57BL/6NHsd | |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma | S2250 | Make 10X stock |
| Terbutaline hemisulfate salt | Sigma | T2528 | Make 10X stock |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Ketamine hydrochloride | Yuhan corporation | ||
| Xylazine hydrochloride | Bayer Korea | ||
| Diazepam | SAMJIN | ||
| Castor oil (Kolliphor EL) | Sigma | C5135 | Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil |
| Saline | Daihan pharm. Co. | ||
| 5% Dextrose | Daihan pharm. Co. | ||
| Iodine solution (Povidin) | Firson | ||
| vet ointment (Terramycin) | Pfizer | ||
| Blue Nylon | AILEE | NB617 | |
| Mupirocin (Bearoban) | Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Ketoprofen | Samchundang Pharm. Co., Ltd | 5 mg/kg | |
| Gentamicin | Huons, Ltd. | 5 mg/kg | |
| 1 mL syringe | Sung shim medial Co., Ltd. | ||
| 26 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 26 G * 13 mm (1/2") | |
| 30 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 30 G * 13 mm (1/2") | |
| Razor blade | Dorco | ||
| Drill | Saeshin precision Co., Ltd. | 207A, 35K (speed) | |
| Telemetry video/EEG system | Data sciences International. Inc. | Version 5.20-SP6 | |
| Implantable transmitter | Data sciences International. Inc. | ETA-F10 | |
| Screw | Sungho Steel | M1.4, 2 mm length stainless steel | |
| Vertex dental material | Dentimex | ||
| Acetone | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | CAS 67-64-1 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | millipore | 1.04005.1000 | 4 % |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 30 % solution in 0.01 M PBS |
| Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | |
| Ethanol | EMD Millipore Co. | UN1170 | |
| xylene | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | UN1307 | |
| Acetic acid glacial | Junsei chemical | 31010-0350 | |
| FSC33 Clear | Leica biosystems | OCT compound for tissue freezing | |
| DPX Mounting for histology | Sigma | 6522 | |
| Forceps | Fine science tools | 11002-12 | |
| Scissors | Solco biomedical | 02-2445 | |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | E51070012 |
References
- Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Epilepsy. N Engl J Med. 349 (13), 1257-1266 (2003).
- Scharfman, H. E.
- Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nat Rev Neurol. 5 (7), 380-391 (2009).
- Cavalheiro, E. A. The pilocarpine model of epilepsy. Ital J Neurol Sci. 16 (1-2), 33-37 (1995).
- Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. J Neurosci Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
- Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Prog Neurobiol. 73 (1), 1-60 (2004).
- Levesque, M., Avoli, M. The kainic acid model of temporal lobe epilepsy. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 37 (10), 2887-2899 (2013).
- Sharma, A. K., et al. Mesial temporal lobe epilepsy: pathogenesis, induced rodent models and lesions. Toxicol Pathol. 35 (7), 984-999 (2007).
- Hellier, J. L., Dudek, F. E. Chemoconvulsant model of chronic spontaneous seizures. Curr Protoc Neurosci. 9, Chapter 9 Unit 9 19 (2005).
- Pitkanen, A., Lukasiuk, K. Molecular and cellular basis of epileptogenesis in symptomatic epilepsy. Epilepsy Behav. 14, Suppl 1 16-25 (2009).
- Mathern, G. W., Adelson, P. D., Cahan, L. D., Leite, J. P. Hippocampal neuron damage in human epilepsy: Meyer's hypothesis revisited. Prog Brain Res. 135, 237-251 (2002).
- Turski, W. A., et al. Limbic seizures produced by pilocarpine in rats: behavioural, electroencephalographic and neuropathological study. Behav Brain Res. 9 (3), 315-335 (1983).
- Brulet, R., Zhu, J., Aktar, M., Hsieh, J., Cho, K. O. Mice with conditional NeuroD1 knockout display reduced aberrant hippocampal neurogenesis but no change in epileptic seizures. Exp Neurol. 293, 190-198 (2017).
- Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nat Commun. 6, 6606 (2015).
- Cavalheiro, E. A., Santos, N. F., Priel, M. R. The pilocarpine model of epilepsy in mice. Epilepsia. 37 (10), 1015-1019 (1996).
- Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 32 (3), 281-294 (1972).
- Hester, M. S., Danzer, S. C. Accumulation of abnormal adult-generated hippocampal granule cells predicts seizure frequency and severity. J Neurosci. 33 (21), 8926-8936 (2013).
- Shibley, H., Smith, B. N. Pilocarpine-induced status epilepticus results in mossy fiber sprouting and spontaneous seizures in C57BL/6 and CD-1 mice. Epilepsy Research. 49 (2), 109-120 (2002).
- Borges, K., et al. Neuronal and glial pathological changes during epileptogenesis in the mouse pilocarpine model. Exp Neurol. 182 (1), 21-34 (2003).
- Pavlova, M. K., Shea, S. A., Bromfield, E. B. Day/night patterns of focal seizures. Epilepsy Behav. 5 (1), 44-49 (2004).
