Summary
Volumen er en vigtig parameter om fysiologiske og patologiske Karakteristik af celler. Vi beskriver en fluorescerende udstødelse metode tillader fuld-måling af in vitro- neuronal volumen med sub micrometric aksial opløsning kræves til analyse af neurites og dynamiske strukturer underforstået i neuronal vækst.
Abstract
Volumen er en vigtig parameter om fysiologiske og patologiske egenskaber af neuroner på forskellige tidsskalaer. Neuroner er helt unik celler med hensyn til deres udvidede forgrenet morfologier og derfor hæve flere metodologiske udfordringer til måling af volumen. I særlige tilfælde af in vitro- neuronal vækst, bør den valgte metode omfatter sub micrometric aksial opløsning kombineret med full-field observation på tidsskalaer fra minutter til timer eller dage. I modsætning til andre metoder som celle figur genopbygning bruger Konfokal imaging, elektrisk-baserede målinger eller Atomic Force mikroskopi, har den nyligt udviklede fluorescens udstødelse metode (FXm) potentiale til at opfylde disse udfordringer. Men selv om at være enkel i sit princip, gennemførelsen af en høj opløsning FXm til neuroner kræver flere justeringer og en dedikeret metode. Vi præsenterer her en metode baseret på en kombination af fluorescens udstødelse, lav ruhed multi rum mikrofluid enheder, og endelig micropatterning at opnå in vitro- målinger af lokale neuronal volumen. Den høje opløsning leveres af enheden tillod os at måle den lokale volumen af neuronal processer (neurites) og omfanget af nogle specifikke strukturer involveret i neuronal vækst, såsom vækst kegler (GCs).
Introduction
Det præcise kendskab til cellulære volumen har tiltrukket øget opmærksomhed i de seneste år, drevet af spørgsmålet i celle størrelse homøostase i encellede mikroorganismer 1 og mere generelt i mitotiske celler 2. Men spørgsmålet om cellevolumen er relevant også for post mitotiske celler som neuroner udgør en paradigmatiske eksempel.
Volumen er faktisk en vigtig underskrift af fysiologiske og patologiske begivenheder på forskellige skalaer og tid-point i neuronal liv, fra forbigående cytoskeletale deformation tilknyttet elektriske aktivitet (millisekund skala) 3 til den uoprettelige neuronal hævelse opstår under den asymptomatiske fase af neurodegenerative sygdomme (i år hos mennesker) 4. Men den største volume ændring forekommer i en mellemtid omfanget af dage eller uger (afhængig af den pågældende organisme) under neuronal vækst. Den udvidede og komplekse morfologi af neuroner rejser multipla spørgsmål, blandt hvilke forordningen i Cellestørrelse. Cytoskeletale længde og diameter er virkelig stramt reguleret i vivo, med værdier er specifikke for hver neuronal type 5,6.
Disse spørgsmål, komplekse at tage fat i vivo, kan også behandles på en forenklet måde in vitro-. I dette mål, en metode, der er dedikeret til volumen måling hurtigt nok til at følge vækst dynamics (dvs. i en tidsskala minutter) og kompatibel med observation over timer eller dage, der er påkrævet. Flere metoder er blevet udviklet i år give en direkte eller indirekte adgang til cellulære volumen in vitro. Celle genopbygning fra Konfokal imaging er en af dem, men denne metode indebærer mærkning og gentagne engagementer med lys samtidig viser en begrænset aksial opløsning på ca. 500 nm 7. Bemærk, at disse to sidste ulemper delvist er overvundet af en nyere og mere avancerede metode kaldes gitter lys-ark mikroskopi 8. Atomic Force mikroskopi har været brugt 9 men denne scanning metode er af essensen langsom og kedelig. Desuden kan den fysiske kontakt, det kræver med cellen forstyrre målingen overvejer den ekstreme blødhed af neuroner 10. Indirekte metode ved hjælp af impedans eller resonans er blevet ansat for forskellige typer 11, men er utilstrækkelig for udvidet klæbende celler som neuroner.
En af de mest lovende metoder er baseret på foranstaltning af den udstødte mængde af celler i et tæt kammer fyldt med et fluorescerende farvestof. Fluorescens udstødelse metode (FXm) er enkel i sit princip, da det kræver ingen mærkning, og er velegnet til hurtig, langsigtet optiske billeddannelse af cellepopulationer med en potentielt sub optisk aksial opløsning. Mere præcist afhænger løsningen i z af maksimale fluorescens intensiteten i den kultur kammer (dvs. i regionen celler) divideret med det dynamiske område af kameraet, selv om flere støjkilder begrænse denne endelige beslutning. Denne metode har været meget kraftfuldt at følge mængden af overflytter vedhængende celler 12 eller at studere lydstyrke ændring under mitosen i pattedyrceller, som grundigt beskrevet i 13. Men neuroner udgør en metodisk udfordring for FXm i betragtning af deres omfattende forgrening ind i sub micrometric processer.
Vi præsenterer her en metode, der fører til fremstilling af glatte FXm kamre adgang med høj præcision volumen og højden af neuronal grene og dynamiske strukturer involveret i neuronal vækst som vækst kegler.
Afdelingerne bør have lignende højder end objektet for at måle for at optimere aksial opløsning. Derfor, vi har designet forskellige FXm enheder karakteriseret ved central måling kamre i tre forskellige højder. Den tyndeste (3 µm i højden) er dedikeret til neurite måling: denne lav højde udelukker soma, som forbliver i den i nærheden af 15 µm høj mellemliggende kammer. Tykkere centrale kamre (10-12 µm) er tilstrækkelig høj til at følge det hele cellevækst. Enheden indeholder også to bassiner placeret på hver side af den centrale afdeling. Fire injection huller (IH) er således gennemført og er udpeget som følger: indsugnings- og udstødningsporte tjene til at indføre de cellulære suspensioner i chippen, mens de to andre feed reservoirer.
Vi har første fabrikerede kalibrering coverslips højde målinger ved hjælp af photoresist strukturer af kendte geometri. Vi har derefter afbildet gratis voksende neuroner, men også morfologisk begrænsede neuroner i micropatterns af vedhæftning.
Protocol
Undersøgelsen blev foretaget i overensstemmelse med Fællesskabets retningslinjer for pleje og brugen af forsøgsdyr: 86/609/EØF. Forskning formål og protokollen er beskrevet i projektets etiske bilag af ERCadg CellO, som blev godkendt og er regelmæssigt revideres af ERCEA. Institut Curie Dyrefacilitet har modtaget licens #C75-05-18, 24-04-2012, rapportering til Comité d'Ethique en matière d'expérimentation animale Paris centrum et Sud (nationale registreringsnummer: #59).
1. fabrikation af formen
Bemærk: Formen indeholder centrale og mellemliggende kamre forbundet til et indløb og en stikkontakt, plus to reservoirer (og fjorde) ligger på begge sider af den centrale afdeling.
- Bruge flad pincet til at manipulere 51 mm diameter silicium wafers og overføre dem fra ét sted til et andet.
- Centrale kammer silicium skimmel
- Fyld 2-mL plastik pipette med positive photoresist. Placer pipetten på midten af en 51-mm diameter silicium wafer og tryk på sin reservoir indtil der dækker ca. 75% af wafer overfladen med photoresist. Spin-coat på 3000 rpm for 30 s.
- Overføre wafer fra spin-coater til en kogeplade, med en overflade temperatur på 100 ° C, 50 s.
- Overføre wafer fra kogeplade til indehaveren af substrat (chuck) af maske aligner. Udsætte gennem "DRIE maske" (Se supplerende filer "masks_neuron_volume_chips.tiff" og "masks_neuron_volume_chips.dxf").
- Fjern wafer fra chuck derefter dykke det i et 100 mL glas crystallizing parabol indeholdende udvikler (fortynding 1:4 i ionbyttet vand). Frigive wafer og vedligeholde det for 1 min mens kontinuerligt og forsigtigt omrøring crystallizing fadet.
Bemærk: Hvis du vil gemme reagenser, fylde crystallizing parabol til 1 cm i højden på maksimum. - Tage tilbage wafer fra udvikleren og dykke det ind i en 100 mL crystallizing fad fyldt med deioniseret vand til ca. 10 s.Then sted wafer på en absorberende papir og tør det med trykisoleret kvælstof ved hjælp af en luft slag pistol.
- Placer wafer til 50 s på en kogeplade med en overfladetemperatur på 115 ° C.
- Udføre deep-reaktiv Ion radering (DRIE) med følgende parametre (flere oplysninger på DRIE teknik kan findes i henvisningerne 14 og 15); Passivation trin: 50 sccm af C4F8, han opbakning flow 10 sccm, CP 10 W, Induktivt koblet Plasma (ICP) 1500 W, samlede pres 24 mbar, temperatur 18 ° C; Ætsning trin: 100 sccm af SF6, han opbakning flow 10 sccm, CP 11 W, ICP 1500 W, samlede pres 24 mbar, temperatur 18 ° C; Passivation tid: 4 s; Ætsning tid: 7 s; Den samlede proces varighed: typisk 5 min for ca. 10 µm ætset dybde.
- Opløses i photoresist ved dykning underlaget i en crystallizing skål fyldt med acetone.
- Dykke wafer i en piranha løsning (2/3 af H2O2 (30%) og 1/3 af H2SO4 (95 %)) i 5 min.
Forsigtig: Tilføje altid H2O2 først og derefter H2så4 og skylning mindst 3 gange i ionbyttet vand efter rengøringen.
- Fremstil formene svarende til mellemliggende kamre ved at udføre trin 1.2.1 til 1.2.11 efter de parametre, der er anført i tabel 1-3.
Bemærk: Hver tabel svarer til en given enhed karakteriseret ved en bestemt højde af centrale observation kammer.
Bemærk: Udføre hele processen ved hjælp af stigende photoresists heights (masker 1 til 3 for hver enhed, Se supplerende filer "masks_neuron_volume_chips.tiff" og "masks_neuron_volume_chips.dxf").- Placer den ætsede silicium wafer på spin-coater substrat indehaveren.
- Kontroller, at spin-coater fungerer korrekt ved at kontrollere, at aspiration af substratet er effektiv (underlaget bør spin og bo på plads under den nominelle rotationshastighed).
- Viskositet af SU-8 stiger med højden af rækken målrettede tykkelse. Brug altid 20-30 mL flasker at gemme SU-8 photoresists og hæld det på wafer før spin-coating (SU-8 kan blive for tyktflydende at blive manipuleret med en plastik pipette).
- Hæld negative epoxy-type photoresist SU-8 i midten af substratet indtil der dækker ca. 75% af silicium wafer, så spin-coat ved hjælp af parametrene, der er angivet i række "Spincoating" i tabellerne.
- Sted den coatede wafer på en kogeplade til varighed og temperaturen, som angivet i række "bløde bage".
- Montere den ætsede wafer og passende "SU-8 masken" på masken aligner.
- Juster den ætsede wafer med masken ved hjælp af dedikerede justering Kors (typisk størrelse af disse Kors: 50 µm × 150 µm) beregnet på hver maske.
Bemærk: To kors på hver side af enheden er tilstrækkelig (et nederst til venstre) og et øverst til højre. - Expose ved hjælp af jeg-linjen af maske aligner (bølgelængde 365 nm) med den passende UV dosis, som angivet i række "Eksponering energi".
Bemærk: Eksponeringstiden er beregnet ved at dividere eksponering energi E specifikt for hver photoresist af den effektive strøm af UV-lampe, moduleret af absorptionen af masken:
x (1 - Absorptionmaske). Absorption er omkring 20% for fleksible masker og ubetydelig for chrom hårdt maske. - Sted den coatede wafer på en kogeplade til varighed og temperaturen, som angivet i række "Post bage".
- Forbered to 100 mL glas-crystallizing retter, én, der indeholder udvikleren, de andre tomme. Dive wafer i udvikler for varigheden angivet i række "Udvikling". Gnub forsigtigt crystallizing fadet langs udvikling
- Drys wafer med isopropanol ovenfor den tomme crystallizing parabol for omkring 5 s. Endelig, Placer wafer på en absorberende papir og tør det med trykisoleret kvælstof ved hjælp af en luft slag pistol.
- Sted den coatede wafer på en kogeplade til varighed og temperaturen er angivet i række "Hard bage" (valgfrit).
Bemærk: Dette trin er nyttigt at undgå revner i photoresist og giver en ensartet flade overflade for de næste skridt. - Gentag trin 1.3.1 - 1.3.10 at afslutte de processer, der er anført i tabel 1-3.
- Efter det sidste trin i fotolitografi, silanize den endelige master mold består af 3 lag af negativ photoresists ved at sende to 100 µL dråber af Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl) silan på hver side af master i en 100-mm petriskål. Forsegle Petri disk med en plastik paraffin film og inkuberes 20 min. ved stuetemperatur (RT).
Bemærk: Den master mold er klar og kan bruges flere gange.
- Placer den ætsede silicium wafer på spin-coater substrat indehaveren.
x (1 - Absorptionmaske). Absorption er omkring 20% for fleksible masker og ubetydelig for chrom hårdt maske.2. fabrikation af PDMS chip
- Hæld 90 g af silicium-baserede økologisk polymer (Polydimethylsiloxan: PDMS) i en 100 mL plastik kop. Der tilsættes 10 g af sin hærdning agent (1:10 i vægt). Rør blandingen ved hjælp af en plastik pipette for 2-3 min.
Bemærk: Bland 90 g PDMS med 10 g hærdning agent for fabrikation af 6 chips. - Placer blandingen i et vakuum ekssikkator og pumpe i ca 30 min til at fjerne luftbobler fanget i PDMS.
- Placer den master skimmel i en P100 petriskål og hæld 15 mL af blandingen på formen ved hjælp af en sprøjte.
Bemærk: 15 mL fører til samlede chip højde 1,5 mm. - Placer PDMS-skimmel struktur i et vakuum ekssikkator og pumpe, indtil der er ingen mere luftbobler på overfladen af PDMS bristepunktet.
Bemærk: Dette trin tager ca 30 min. - Skubbe wafer nederst i petriskålen ved hjælp af en kegle tip til at undgå PDMS dødvolumen nedenfor wafer. Placere enheden PDMS-skimmel i ovnen indstillet på 70 ° C i mindst 2 timer.
- Demold PDMS blok under en kemisk hætte med en rustfri flade spatel og hælde isopropanol på chippen. Placer den på rustfrit stål bænk af emhætten.
- Skær omkring silicium wafer og demold PDMS replika ved hjælp af en skalpel.
- Skær omkring (orlov en 2-mm margen) chip ved hjælp af en skalpel eller et barberblad.
- Punch fjorde ved at trykke på 1,5 mm diameter puncher fast og aktivere det for at skære og snitte hul af fjorden. Gør det samme på de fire dedikerede zoner af chippen hvor væsken vil blive injiceret.
- Ren chippen ved stikning og peeling dobbeltklæbende tape på microstructured side. Drys isopropanol på begge sider. Derefter tørre chippen med trykisoleret kvælstof ved hjælp af en luft slag pistol.
3. fabrikation af mønstrede coverslips (24 × 24 mm2)
Bemærk: Manipulere coverslips med buet pincet.
- Poly-ornithin (PLO) mønstre
- Anvende en O2 rengøring plasma på glas coverslips. Plasma parametre: pumpning ned pres: 0,25 mbar; O2 levering varighed: 3 min; gas flow: 10 sccm; maksimale afvigelse: ±5 sccm; plasma varighed: 3 min; indstille pres: 0,36 mbar; maksimale afvigelse: ±0.10 mbar; indstille magt: 50 W; maksimale afvigelse: 5%; udluftning varighed: 45 s.
- Mix 484 µL af eddikesyre og 56 µL af 3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane, komplet med absolut ethanol til at få en samlet maengde paa 15 mL.
- Brug en 1 mL spids kegle, sætte en dråbe af 500 µL af denne løsning på hver coverslip, vente 2-3 min. tør ved hjælp af en renrum microfiber vinduesvisker.
Bemærk: TOT silaniseret glas coverslips kan gemmes til 1 måned ved stuetemperatur inden for plastkasser forseglet med en plastik paraffin film. - Placer hvert coverslip på en spin coater beliggende i et venligt miljø. Sætte en dråbe af en positiv photoresist, der dækker omkring 75% af coverslip (ca. 500 µL) og spin-coat ved 4000 rpm for 30 s til at nå frem til en endelig tykkelse på 0,45 µm.
- Placere coverslips for 1 min på en kogeplade med en overfladetemperatur på 115 ° C.
- Ved hjælp af en maske aligner, udsætte hver coverslip ved en bølgelængde på 435 nm (G-line) gennem den dedikerede maske efter fabricant parametre (UV dosis ca. 50-60 mJ.cm-1)
- Forberede 2 glas crystallizing retter, én, der indeholder udvikler (ingen fortynding), de andre indeholdende deioniseret vand.
- Dykke ned én efter én hver coverslip i udvikleren nemlig 1 min mens kontinuerligt og forsigtigt omrøring crystallizing fadet. Derefter nedsænkes wafer i ionbyttet vand til ca. 5 s. sted wafer på en absorberende papir og tør det med trykisoleret kvælstof ved hjælp af en luft slag pistol.
- Anvende en aktivering O2 plasma med de samme parametre som i 3.1.1.
- Under kølerhjelmen, afsætte fire 170 µL dråber af 100 µg/mL PLO opløsning pr. P100 petriskål. Sætte den mønstrede ansigt af coverslips på hver af disse dråber. Forsegle petriskål med en plastik paraffin film at undgå udtørring. Der inkuberes natten over ved RT.
Bemærk: PLO løsningen bør forblive knyttet til coverslips af kapillarvirkning. - Forberede fire modtagere (typisk P60 petriskåle), fylde tre af dem med PBS og den fjerde med deioniseret vand. Forbered to glas crystallizing retter af ren ethanol.
- Tage ud hver coverslip fra Petriskålene, nedsænke det i den første PBS bad for 10-15 s, evakuere væsken på en absorberende væv ved at sætte coverslip lodret på siden, indsætte det med fx de mønstrede ansigt op inde i ethanol bad.
Bemærk: Når opløsningen af photoresist er afsluttet, det bliver svært at finde den mønstrede side af coverslip. Derfor er det vigtigt på dette stadium at spore dens placering. - Placer ethanol crystallizing fad i et ultralydsbad sonikator (120 W / 35 kHz) og lad photoresist blive opløst i 3 min.
Bemærk: Ændre ethanol bad hver 4 coverslips for at begrænse fortynding af PBS, der kan forringe opløsning af photoresist. - Tage ud coverslip fra ethanol bad, derefter dykke ned det flere gange i den anden PBS bad. Tjekke den overflade aspekt gentagne gange indtil fedtet-lignende overflade, at resultaterne fra de resterende flydende film af ethanol forsvinder.
- Dykke for 5-10 s coverslip ind i den tredje PBS bad. Derefter straks overføre det til bad deioniseret vand. Placere coverslip på en absorberende papir og tør det med trykisoleret kvælstof ved hjælp af en luft slag pistol.
Bemærk: Den sidste skyl i afioniseret vand bruges til at undgå dannelsen af PBS krystaller under trinnet til tørring.
- Photoresist strukturer for højde kalibrering
- Udfør kun trin 3.1.4. til 3.1.8. ved hjælp af de dedikerede maske (maske "Photoresist striber", Se supplerende fil "Mask_Photoresist-stripes.dxf").
4. chip montering og endelige gennemførelse
- Chip montage på glas bund retter
- Sætte både PDMS chip og glasskål som det vil være bundet i plasma kammer for overflade aktivering. Parametre: pumpning ned pres: 0,25 mbar; O2 levering varighed: 3 min; gas flow: 10 sccm; maksimale afvigelse: ±5 sccm; plasma varighed: 30 s; indstille pres: 0.40 mbar; maksimale afvigelse: ±0.10 mbar; indstille magt: 50 W; maksimale afvigelse: 5%; udluftning varighed: 45 s.
- Forsigtigt sætte den aktiverede PDMS chip i kontakt med glas coverslip, og forsigtigt lægge pres på kanten af chippen til obligation chip til coverslip. Du kan øge bonding styrken ved at placere enheden i ovnen ved 70 ° C i 5-10 min.
Bemærk: Tryk ikke på dele der indeholder søjler, de kan kollapse under for stort pres. - Under kølerhjelmen (dvs. på RT) og inden for 30 min efter limning, placere en 10 µL spids kegle fyldt med en 100 µg/mL PLO løsning på IHs, derefter injicere væske. Justere lydstyrken for at danne en dråbe på toppen af hver IHs. Derefter, ved hjælp af en 1-mL spids kegle, tilføje PBS i petriskålen rundt omkring chippen.
- Lad chip på RT med et minimum af 2 h inkubation tid. I natten inkubation, forsegle petriskål ved hjælp af en plastik paraffin film for at undgå udtørring.
Bemærk: Væsken bør ikke lække udenfor den chip ellers chippen skal kasseres. - Tryk en 10 µL spids kegle let i hver IH og suge overskydende væske. Derefter holde helt spids kegle inde i forretningen og udarbejde den resterende væske.
- Erstatte PLO ved laminin følge anvisningerne i trin 4.1.5 (tømning) og 4.1.3 (påfyldning). Der inkuberes ved RT i 1 h.
- Erstatte laminin af næringssubstratet følgende instrukser i trin 4.1.5 (tømning) og 4.1.3 (påfyldning). Sammensætning af dyrkningsmediet: MEM 81.8%; Natrium pyruvat 100 mM 1%; Glutamax 200 mM 1%; Hest Serum 5%; B27 supplement 2%, N2 supplere 1%, Gentamicin 0,2%; Filtrer løsning ved hjælp af en 220-nm filter. Bruger en 1 mL spids kegle, erstatte også PBS omkring chippen ved dette medium.
- Sæt chippen i rugemaskinen reguleret ved 37 ° C og 5% CO2 i mindst 5 timer (eller natten over) før neuron såning.
- Chip montage ved hjælp af mønstret coverslips
Bemærk: Hvis de mønstrede coverslips omfatter positive photoresist reference objekter, skal du udføre trin 4.2.1 til 4.2.9. Ellers, udføre kun skridt 4.2.3, stick PDMS enheden på PLO mønstrede coverslip som anført i punkt 4.1.2, sætte næringssubstratet inde i og omkring chippen derefter gå til trin 4.2.10.- Deponere en dråbe vand på et rektangulært tyk objektglas, som glas og holde coverslip på glas dias ved kapillarvirkning (ikke-mønstrede side vender glas dias). Mark placeringen af photoresist striber på bagsiden af glas dias ved hjælp af en filtpen under et mikroskop.
- Pålægge indehaveren maske for maske aligner mønstret glas coverslip. Stole på mærket lavet med den filtpen til at centrere photoresist reference objekter.
- Udføre trin, plasma, som beskrevet i 4.1.1 på PDMS chip.
- Placer PDMS chip på mobile substrat indehaveren (chuck) af maske aligner.
Bemærk: For at øge optic kontrast, placere en silicium wafer under PDMS chip. Silicium wafer skal være solidt fastgjort på chuck under justeringsprocessen (brug en gennemsigtig tape til at holde det til chuck). - Løft chuck på grænsen af mekanisk kontakt til at justere chippen med vifte af photoresist striber placeret på coverslip.
- Opnå mekanisk kontakt mellem chip og coverslip ved efterbehandling op løfte chuck indtil overfladen af PDMS søjler touch glas coverslip.
- Lavere chuck. Fjerne den coverslip nu bundet til chippen fra indehaveren af maske. Derefter placere enheden i et 35-mm petriskål, og overføre alt ind i ovnen (temperatur: 70 ° C) i 5-10 min at øge bonding styrken.
- Udføre som i trin 4.1.3.
Bemærk: Hvis du bruger PLO mønstrede coverslips, gå direkte fra trin 4.2.7 at træde 4.2.9. - Erstatte PLO ved plating medium følge fremgangsmåden i trin 4.1.5 (tømning) og 4.1.3 (påfyldning). Bruger en 1 mL spids kegle, erstatte også PBS omkring chippen ved dette medium.
- Sæt chippen i rugemaskinen reguleret ved 37 ° C og 5% CO2 indtil neuron såning, med et minimum af 5 h inkubation tid.
5. neuron kultur
- Forberede 100 mL af dissektion medium (HH medium) ved at blande 10 mL af HBSS 10 x, 2 mL af Hepes 1 M og 88 mL sterilt vand i en 200 mL plastik kolbe.
Bemærk: HH medium kan tilberedes dagen før kulturen. - Dissekere hippocampus fra E18 mus Foster udvundet fra en mor euthanized af cervikal dislokation (C57BL/6J mus fra Charles Rivers). Trin af dissektion er fx detaljeret i 16.
- Placer hippocampus i et plastikrør, som indeholder trypsin (0,3 mL trypsin 2,5%, w/o EDTA til 2,7 mL HH medium) i 10 minutter ved 37 ° C for at indlede kemiske dissociation.
- Kassere næsten al væsken og erstatte det med 5-10 mL af HH bruge engangs plastic pipetter. Gøre det 3 gange. Den sidste udfyldning, brug 1 mL plating medium i stedet for HH.
- Mekanisk adskille væv ved hjælp af en 1 mL tip-kegle af håbefulde og skubbe den fuld volumen flere gange, at undgå at gøre bobler og bruger ikke mere end 15-20 passager.
- I en separat 500 µL modtager, forberede en løsning ved hjælp af 5 µL af cellesuspension fortyndes i 45 µL af PBS. Tage 1 µL af denne løsning ved hjælp af en 10 µL pipette og indsætte den fortyndede suspension i en Malassez celle counter. Brug de angivelser, der i 17 til at anslå antallet af celler.
Bemærk: En enkelt hippocampus giver normalt omkring 0,5 millioner af neuroner. - Der centrifugeres ved 100 x g i 6 min. ved RT.
- Supernatanten fjernes og erstattes af mængden af plating medium kræves for at opnå en koncentration af 10 millioner celler/mL. Resuspend celler ved successivt aspire og skubbe cellesuspension med en 1-mL spids kegle.
- Udarbejde plating medium i chippen (Se trin 4.1.5). Indsamle 2-3 µL af frisk resuspenderet løsningen ved hjælp af en 10-µL pipette og injicere det ved indgang (der henvises til injektion proceduren beskrevet taktfast 4.1.3). Gentag umiddelbart den samme operation på stikkontakten.
- Injicere om plating medium i hver reservoir samme rumfang (Se trin 4.1.3).
Bemærk: Observere hurtigt chip under mikroskop for at kontrollere tætheden af celler. Størrelsesorden af optimal celle tæthed svarer til omkring 5-10 celler inden for firkantet overfladen afgrænset af 4 søjler (om 0.3 mm2, altså om 15-20 celler pr. mm2). - Til sidst gentage trin 5.10 bruger i stedet 0,5-1 µL af cellesuspension til at nå den målrettede celle tæthed.
- Placere den seedede chip i en inkubator reguleret ved 37 ° C 5% CO2.
6. fluorescens udstødelse observation
- Udskiftning af dyrkningsmediet ved den billeddiagnostiske medium.
- Forberede den billeddiagnostiske medium som 4.1.7 men brug i stedet MEM blottet for phenol rød og tilføje fluorescerende dextran. I dette mål, fortyndes dextran (Molekylær vægt 10.000 g/mol, stamopløsning koncentreret på 10 mg/mL i PBS) for at opnå en endelig koncentration på 0,5-1 mg/mL i den billeddiagnostiske medium.
Bemærk: Brug Dextran konjugater med Absorption/Emission maxima 496/524 eller 650/668. Foretrække de første billede 0,45 µm høje positive photoresist strukturer (at slippe af med deres auto fluorescens i den røde båndbredde) og andet til billede neuroner (mindre giftige). - Tøm alle fjorde ved hjælp af en 10-µL pipette og genopfylde dem helt med den billeddiagnostiske medium (Se trin 4.1.3 og 4.1.5 for den præcise metode til medium udskiftning).
- Forberede den billeddiagnostiske medium som 4.1.7 men brug i stedet MEM blottet for phenol rød og tilføje fluorescerende dextran. I dette mål, fortyndes dextran (Molekylær vægt 10.000 g/mol, stamopløsning koncentreret på 10 mg/mL i PBS) for at opnå en endelig koncentration på 0,5-1 mg/mL i den billeddiagnostiske medium.
- Billedbehandling
- Sted chip under et epifluorescensmikroskop, udstyret med en miljømæssig kammer reguleret ved 37 ° C og 5% af CO2. Brug en 40 X, numerisk blænde (NA) 0,8 tørre objektive, 30% af fuld effekt (fuld effekt: 3 W) og 30 ms af eksponeringstid. Erhverve billeder af celler på fokus (fra én til flere efterfølgende billeder i tilfælde af time-lapse eksperimenter).
- Billedanalyse
- Normalisere billeder ved hjælp af rutinen baggrund reduktion implementeret i dedikeret software til at få en ensartet baggrund. Se 13 yderligere oplysninger om billedbehandling trin er inkluderet i denne software. Udskriftsbillede har en. MAT-format.
- Konvertere. MAT fil ind. TIFF 8 bit billeder ved hjælp af rutinen indføre supplerende materiale (conversion_mattotiff.m, som opfordrer til importfilevol.m).
- Udføre Import > billedsekvens på ImageJ at bygge en video fra den. TIFF billeder.
- Beregne den gennemsnitlige intensitet Pedersen af et firkantet område lokaliseret i midten af en søjle (kantlinje) og den gennemsnitlige intensitet B af et firkantet område af kammeret celler (baggrund, dvs. højden nul). Se 18 for et eksempel på detaljeret metode af billedbehandling.
Bemærk: Den laterale dimension af de firkantede områder bruges som intensitet referencer skal være omkring halvdelen af søjle diameter til at få et tilstrækkeligt antal pixels samtidig undgå lys forurening fra søjle kanter. - Bruge værdierne P og B for at etablere den lineære konvertering lov fra intensitet, jeg til højden h:
med hc kendte højden af kammeret,
og
Bemærk: PDMS viser ingen påviselig autofluorescence. - Vælg et område omkring område af interesse, integrere intensitet ved hjælp af ImageJ (Se 19 for flere detaljer) og anvende konvertering lovgivningen opnået i 6.3.5 til at måle omfanget af en celle rum.
Bemærk: Zone af interesse kan blive udvalgt på baggrund af fluorescens af subcellulære elementer som actin, fxfor udvælgelse af vækst kegler i normal god landbrugspraksis-LifeAct neuroner, Vælg zonen af interesse i normal god landbrugspraksis emission kanal, gemme konturen af dette zone ved hjælp af en ROI manager værktøj, så foranstaltning cellevolumen lukket inden for samme zone i emission kanal af dextran (i rødt).
og
Representative Results
Resultatet af processen med fabrikation beskrevet i afsnit 1 og 2 er illustreret med billeder af figur 1A-1B og kurve i figur 1 c. Tabellen i figur 1 d viser ruhed værdierne af to forskellige repræsentative områder af PDMS chip, dvs i centralt og 20 µm høj næste mellemliggende kammer. Et fald i ruhed med en faktor på ca 7 er opnået ved hjælp af ætset Si-wafer i stedet for SU-8 photoresist. Derefter, FXm blev først anvendt på en photoresist stribe af kendte geometri (figur 2A) inden for en 10 µm store kammer. Efter billedbehandling og intensitet til højde konvertering (se grafen i figur 2B), FXm profiler udføres på tværsnit langs denne stribe (figur 2 c) giver de ønskede højde profiler (figur 2D). Figur 2D viser en sammenligning mellem profiler fremstillet ved hjælp af mekaniske profilometry og FXm metoder. Disse profiler, herunder kant og plateau værdi, er meget ens, validere metoden. Bemærk, at spredning af FXm data ikke er repræsentativ for den ultimative løsning af den metode, som yderligere vurderet i figur 3 og figur 4, men resultaterne fra den lavintensive ansat til at undgå en mulig effekt af den meget svage Auto-fluorescens af photoresist i normal god landbrugspraksis kanal.
Så observeret vi neurites i 3 µm og 10 µm store kamre (figur 3). Standardafvigelsen af baggrundsstøj er omkring 18 nm efter intensitet til højde konvertering og baggrunden korrektion. Denne værdi er lidt højere end den fysiske ruhed af PDMS overflader støbt på silicium overflader (12 nm, se tabellen i figur 1 d) men meget lavere end ruhed målt på PDMS fremstillet af SU-8 forme. Disse resultater understreger merværdien af Bore brønde i silicium wafers i stedet for at åbne huller i SU-8 photoresist at kaste søjler. Sådan en lav værdi giver mulighed for et højt signal til støjforhold og meget klare billeder i volumen som den vises i figur 3A. Som et eksempel på de data, der kan hentes fra sådanne billeder, vi beregnet volumen af 1.6 µm (dvs. 10 pixels) bred neurite Skive (se grafen i figur 3B). Bruge i en første tilnærmelse en lineær pasform af disse data giver en gennemsnitlig neurite højdeværdi af omkring 400 nm, skal sammenlignes med fx 500-nm cytoskeletale diameter fundet i 10 dage gamle hvalpe inden for corpus callosum 5. Vi har også kombineret FXm med micropatterns af adhæsion består af seriefremstillede abutted 2 µm og 6 µm brede striber af 30 µm i længden. Vores mål var at studere neurite bredde indflydelse på sin 3D form. Figur 3 c viser en 3D repræsentation i falske farve af en hel neuron billede fremstillet i en stor sal, 10 µm. Neurites breder sig på 2 µm og 6 µm brede striber, mens soma er beliggende på spidsen af den største stribe. Højde profiler blev trukket i tre forskellige tværsnit. I sammenhæng med grafen vises i figur 3A, integreret overfladen over tværsnit stigning med neurite bredde (figur 3D).
Vi har også fokuseret på vækst kegle (GC) 3D strukturer. Figur 4 A-B vises to forskellige GC profiler er fremstillet i et 3 µm store kammer, der fremhæver deres forgrenede sub-struktur. Derudover udførte vi time-lapse eksperimenter for at følge dynamikken i mængden af GCs i et 12 µm store kammer. Figur 4 c viser en cyklus af krympning og genaktivering af en given GC inden for et tidsrum af et par snese minutter. Takket være brugen af normal god landbrugspraksis-lifeact mus, vækst kegler er lokaliseret i normal god landbrugspraksis emission bølgelængde (510 nm) fra høje actin koncentration. Overfladen identificerede på bølgelængden blev brugt til at integrere over dextran emission bølgelængde på 647 nm til at beregne GC volumen. Figur 4D viser endelig fordeling af GC lydstyrke på forskellige tidspunkter og placering på tre forskellige neuroner, centreret om en værdi af omkring 6 µm3.
Figur 1: FXm PDMS kamre. (A) ordninger af de fire forskellige vigtigste trin i microfabrication fører til den afsluttende mug. Placering af indløb, udløb og reservoirer er angivet. Skalere barer: 1 mm. B billede af PDMS FXm kammer fremstillet ved hjælp af en optisk profilometer. Dette billede viser den centrale afdeling indeholdende 3 rækker af 10 µm høje søjler og de mellemliggende kamre af 20, 50 og 90 µm i højden. Skalalinjen: 500 µm. (C) tværsnits visning af chip langs de to stiplede streger i (B). Gul/guld: tvaersnit i søjler, blå: tværsnit mellem søjler. (D) betyde værdier PDMS ruhed målt på 50 × 50 µm2 områder støbt på silicium og på 20 µm høj SU-8 mellemliggende kammer (Se pilene til placering af disse områder). Middelværdier blev indhentet fra målinger af tre forskellige områder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: kalibrering af FXm metode ved hjælp af en photoresist stribe som genstand for interesse. (A) NGL-fluorescens billede taget i en 10 µm store sal fyldt med 10.000 MW dextran absorberende på 488 nm på 1 mg/mL. (B: baggrund, P: søjle). Observation med en tør 40 X NA 0,8 mål. Skalalinjen: 50 µm. (B) lineær kalibrering lov fremstillet af den gennemsnitlige intensiteten af de to farvede rektangler vist i A. (C) fluorescens intensitet profil opnået på niveau med den blå stiplet linje vises i (A), passage af photoresist stribe (0,45 µm høje positive photoresist). (D) sammenligning af profiler fremstillet af mekanisk profilometer (sorte prikker) og FXm efter intensitet til højde konvertering af data fra (B) (blå prikker). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Neurite volumen imaging. (A) Neurite strækker sig ind i centrale 3 µm høj salen fra soma beliggende i de næste 15 µm mellemliggende kammer. Imaging udføres ved hjælp af 10.000 MW dextran absorberende på 488 nm og en 40 X, NA 0,8 tørre mål. Inset opnås efter brug af baggrunden reduktion rutine fremhæver de to neurites og valgt at plot grafen til højre. Skalere barer: 30 µm. (B) Neurite skive volumen som funktion af neurite bredde fremstillet af 22 profiler (gennemsnit på 10 pixel, dvs på en 1,6 µm "neurite slice") vist i (A). Den faste linje repræsenterer en lineær pasform af hældningen 0,4 µm passerer gennem nulpunktet. (C) falske farvebillede af en mønstrede neuron på en selvklæbende stribe gjort af successive 2 µm og 6 µm store træstubbe (repræsenteret i hvidt). Målingerne er foretaget i en 10 µm store sal fyldt med 10.000 MW dextran absorberende på 647 nm og ved hjælp af en 40 x NA 0,8 tørre mål. (D) højde profiler svarende til de farvede stiplede linjer vises i (C), holde den samme farve kode. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: statiske og dynamiske vækst kegle imaging. (A-B) Vækst kegle højde profiler fremstillet i en 3 µm store sal efter intensitet til højde konvertering langs de gule linjer i tilknyttede billeder. Observation udføres ved hjælp af fyld med 10.000 MW dextran absorberende på 488 nm og en 40 X, NA 0,8 tørre mål. (C) hele neuron billeddannelse i et 12 µm store kammer fyldt med 10.000 MW dextran absorberende på 647 nm. Observationer foretaget i to fluorescerende kanaler: normal god landbrugspraksis for vækst kegle lokalisering (stiplede gule linjer), og CY5 til at beregne GC volumen fra fluorescens udelukkelse. Overfladen inkluderet af stiplede gule linjer blev brugt til at beregne GC volumen. Grafen viser variationen af GC volumen over tid, og tilknyttede morfologier i både normal god landbrugspraksis og CY5 kanaler på to repræsentative forskellige tidspunkter. Alle data, der er anskaffet ved hjælp af en 40 x NA 0,8 tørre mål hver 3 min. skala barer: 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Trin | Maske 1:8 µm lag | Mask 2:30 µm lag | Maske 3:40 µm lag |
| SU-8 type | 2007 | 2025 | 2050 |
| Spincoating | 30 s @ 2000 rpm | 30 s @ 3050 rpm | 30 s @ 3250 rpm |
| Blød bages | 3 min @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C | 3 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C |
| Eksponering energi | 110 mJ/cm2 | 155 mJ/cm2 | 170 mJ/cm2 |
| Efter eksponering bages | 4 min @ 95 ° C | 1 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C |
| Udvikling | 2 min 30 s | 5 min | 6 min |
| Hårde bages (valgfri) | 3-5 min @ 200 ° C | 3-5 min @ 200 ° C | 3-5 min @ 200 ° C |
Tabel 1: fotolitografi trin udføres for at bygge en enhed, der indeholder en central afdeling 12 μm i højden. Højderne af de mellemliggende kamre: 20, 50 og 90 µm.
| Trin | Maske 1:10 µm lag | Mask 2:30 µm lag | Maske 3:40 µm lag |
| SU-8 type | 2007 | 2025 | 2050 |
| Spincoating | 30 s @ 1500 rpm | 30 s @ 3050 rpm | 30 s @ 3250 rpm |
| Blød bages | 3 min @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C | 3 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C |
| Eksponering energi | 125 mJ/cm2 | 155 mJ/cm2 | 170 mJ/cm2 |
| Efter eksponering bages | 4 min @ 95 ° C | 1 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C |
| Udvikling | 2 min 30 s | 5 min | 6 min |
| Hårde bages (valgfri) | 3-5 min @ 200 ° C | 3-5 min @ 200 ° C | 3-5 min @ 200 ° C |
Tabel 2: fotolitografi trin udføres for at bygge en enhed, der indeholder en central afdeling 10 μm i højden. Højderne af de mellemliggende kamre: 20, 50 og 90 µm.
| Trin | Maske 1:12 µm lag | Mask 2:32 µm lag | Maske 3:40 µm lag |
| SU-8 type | 2015 | 2025 | 2050 |
| Spincoating | 30 s @ 3250 rpm | 30 s @ 2500 rpm | 30 s @ 3250 rpm |
| Blød bages | 3 min @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 5 min. @ 95 ° C | 3 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C |
| Eksponeringstiden | 140 mJ/cm2 | 157 mJ/cm2 | 170 mJ/cm2 |
| Efter eksponering bages | 4 min @ 95 ° C | 1 min @ 65 ° C + 5 min. @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C |
| Udvikling | 3 min | 5 min | 6 min |
| Hårde bages (valgfri) | 3-5 min @ 200 ° C | 3-5 min @ 200 ° C | 3-5 min @ 200 ° C |
Tabel 3: fotolitografi trin udføres for at bygge en enhed, der indeholder en central afdeling 3 μm i højden. Højderne af de mellemliggende kamre: 18, 50 og 90 µm.
Supplerende data 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. Skematisk oversigt over de masker, der anvendes til at fremstille PDMS enhed (DRIE maske og masker 1-3). Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende data 2: fil "masks_neuron_volume_chips.dxf". Elektroniske filer gør det muligt for at fabrikere DRIE maske og masker 1-3. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende data 3: "Mask_Photoresist-stripes.dxf". Elektroniske filer gør det muligt for at fabrikere masken anvendes til fotolitografi af photoresist striber. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende data 4: fil conversion_mattotiff.m venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende data 5: fil importfilevol.m venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Volumen billeddannelse af neuroner udgør en udfordring for FXm teknikken på grund af de lange og tynde udvidelser af disse celler. Denne protokol beskriver varianter af den samme type mikrofluid enhed dedikeret til neuron billeddannelse.
Ved siden af aspekter af mikrofluid design, valg af målet er grundlæggende for fluorescens udstødelse imaging og indebærer en afvejning mellem laterale opløsning og billedklarhed. Det har været vist i 13 , en høj NA fører til en dybde af fokus mindre end højden, kammeret ikke var skadeligt for præcisionen af volumen målinger, hvis imaging blev udført på fokus og en tilstrækkelig margen er tilbage mellem kontur af objektet i jeg nterest og grænserne for integration overflade. Men brugen af et kammer meget højere end dybden af fokus svækker billedklarhed på grund af photon diffusion, som udglatter kanterne af objekter af interesse. Fabrikation af en 3 µm store kammer reduceret denne laterale sløring og forudsat usædvanligt godt defineret fluorescerende udstødelse billeder selv ved hjælp af høje NA (0,8) 40 X mål at visualisere neuronal grene med høj lateral opløsning.
Chip montage er et afgørende skridt, navnlig i tilfælde af 3 µm store kamre, men omhyggelig manipulation som beskrevet i punkt 4.1.2 undgår sammenbrud af taget. Høj overflade til volumen ratio er forbundet med disse tynde kamre rejste også spørgsmålet om stabilitet af Dextran koncentration over tid. Vi har tjekket at Dextran overflade absorption efter en nat inkubation var ubetydelig: efter udskiftning Dextran af PBS, intensitet forskellen mellem søjle og baggrunden var ca. 1 pr. 1000 af indledende intensitet kontrasten mellem disse to regioner i overværelse af Dextran. Bemærk, at neuroner kan overholde både på bunden coverslip og Tagareal PDMS. Denne effekt forsvinder når ved hjælp af mønstrede coverslips (dvs. når vi ikke Inkuber klæbende molekyler i PDMS kammer), som belægningen er derfor strengt lokaliseret på kammerets bund.
Ud over deres udfordrende morfologi, neuroner er snarere egnet til FXm, at en af de store begrænsning af metoden, dvs dextran endocytose, er meget begrænset i disse celler. Vi vælger en 10 kDa formulering for at undertrykke i langt rækkevidde (timer) alle synlige endocytose fænomener.
Til sidst, opvejes den begrebsmæssige enkelhed af FXm af en række eksperimentelle problemer, som er blevet løst af denne protokol, som nanometrisk PDMS ruhed og micrometric kammer højde eller baggrundskorrektion at korrigere for ujævnheder i PDMS loftet mellem søjler. Men brugen af et tæt mikrofluid kammer til at begrænse de fluorescerende medium giver et par specifikke begrænsninger som behov for støttesøjler, der sænker effektivt overfladen tilgængelig for celle vedhæftning, eller behovet for at udelukke soma fra centralt kammer til at observere neuronal udvidelser med den højeste klarhed, som begrænser regionerne i den celle, der er tilgængelige for høj opløsning observation. En eventuel udvikling i denne metode ville være at slippe af med denne fysiske indeslutning, skal erstattes af en optisk. Udviklingen af lys ark mikroskopi kan kombineres med fordel med FXm i fremtiden.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at anerkende ChiLab, materialer og Microsystems laboratorium - Politecnico di Torino - DISAT, i skikkelse af Prof. C F Pirri, Dr. M Cocuzza og Dr. S L Marasso, for deres værdifulde støtte i procesudvikling og indretning fabrikation. Vi takker Victor Racine fra Quantacell til diskussion og support i billedbehandling. Vi er taknemmelige for Isabelle Grandjean og Manon Chartier fra dyr facilitet Institut Curie for deres støtte til mus, og Pablo Vargas og Ana-Maria Lennon (Institut Curie) for at give os med normal god landbrugspraksis LifeAct mus. Vi er taknemmelige for Olivier Thouvenin fra Institut Langevin og Clotilde Cadart, Larisa Venkova og Matthieu Piel fra Institut Curie - UMR 144, for deres hjælp i forståelsen af fluorescens udstødelse metode. Endelig, vi takker den teknologiske platform af Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) for deres støtte i microfabrication. Dette arbejde blev støttet i en del af den europæiske forskning Rådet Advanced Grant No. 321107 "CellO," PSL Université (SwithNeuroTrails projekt), ANR Investissement d'Avenir, og IPGG Labex og Equipex.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Plasmalab System 100 | Oxford Instruments | To perform DRIE | |
| MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | SU-8 photolithography | |
| NXQ 4006 Mask aligner | Neutronix Quintel | Photolithography associated to DRIE | |
| Plasma cleaner | Diener Electronic | Pico PCCE | |
| Cell culture hood | ADS Laminaire | Optimale 12 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Multifuge X1R | |
| Incubator 37 °C 5% CO2 | Panasonic | MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator | |
| Epifluorescence microscope | Leica | DMi8 | |
| PDMS Oven between 65 and 80 °C | Memmert | ||
| Mechanical profilometer | Veeco | Dektak 6M Stylus Profiler | |
| Optical profilometer | Veeco | Wyko NT9100 | |
| Vacuum desiccator | Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware) | 230KAR | Diameter 200 mm |
| Ultrasonic bath sonicator | Labo Moderne | SHE1000 | Volume of the bath: 0.8 liter |
| Hotplate | Stuart SD162 | SD162 | |
| Masks | |||
| DRIE | Supplementary data | ||
| Su8 Mask 1 | Supplementary data | ||
| Su8 Mask 2 | Supplementary data | ||
| Su8 Mask 3 | Supplementary data | ||
| S1805 calibration stripes | Supplementary data | ||
| Small laboratory equipment | |||
| 1.5 mm hole puncher | Sigma-Aldrich | 29002519 (US reference) | |
| Scalpel or razor blade | |||
| 9" Stainless Steel Flat Spatula with Spoon | VWR International | 82027-532 | To demold PDMS |
| Top Lip Wafer Handling | VWR International | 63042-096 | |
| Curved tweezer | FST | Dumont #7 Forceps - Standard / Dumoxel | To manipulate glass coverslips |
| Substrates | |||
| Silicon wafer | Prolog Semicor Ltd | ||
| 24x24 mm glass coverslips | VWR | 631-0127 | |
| Photoresists and developpers | |||
| AZ 1518 positive photoresist | Microchemicals GmbH | Before DRIE process, thicknes 1.8 µm | |
| AZ 351B developer | Microchemicals GmbH | To develop positive AZ 1518 photoresist | |
| SU-8 2007 | MicroChem | ||
| SU-8 2025 | MicroChem | ||
| SU-8 2050 | MicroChem | ||
| PGMA developer | Technic | To develop SU-8 negative photoresist | |
| Microposit S1805 resist | Chimie Tech Services | Positive photoresist used to obtain 0.5µm high structures | |
| MF 26A developer | Chimie Tech Services | To develop positive S1805 photoresist | |
| Laboratory consumables | |||
| Disposable plastic pipette 3 mL | LifeTechnologies - ThermoFisher | ||
| P100 Petri dishes | TPP | 93100 | |
| 20 mL syringe | Terumo | SS+20ES1 | |
| Transparent scotch tape | |||
| Square wipes | VWR | 115-2148 | |
| Parafilm | DUTSCHER | 90260 | Plastic paraffin film |
| Chemicals | |||
| (3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane | abcr | AB 109004 | |
| PDMS and curing agent Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
| isopropanol | W292907 | ||
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 - 50 mL | |
| Ethanol absolute | Sigma-aldrich | 02865 | 99.8% |
| 3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane | Sigma-aldrich | M6514-25ML | (C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3 |
| acetic acid | Sigma-aldrich | 71251-5ML-F | |
| Dextran 10kW conjugated with Alexa488 | LifeTechnologies - ThermoFisher | D22910 | Absoprtion at 488 nm |
| Dextran 10kW conjugated with Alexa647 | LifeTechnologies - ThermoFisher | D22914 | Absoprtion at 647 nm |
| Culture medium | |||
| MEM | LifeTechnologies - ThermoFisher | 21090-022 | |
| Horse Serum | LifeTechnologies - ThermoFisher | 26050088 | |
| B27 | LifeTechnologies - ThermoFisher | 12587-010 | |
| Glutamax 200 mM | LifeTechnologies - ThermoFisher | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM | LifeTechnologies - ThermoFisher | 11360-070 | |
| Gentamicin | LifeTechnologies - ThermoFisher | 15710-049 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| HBSS 10x | LifeTechnologies - ThermoFisher | 14180-046 | |
| Hepes 1M | LifeTechnologies - ThermoFisher | 15630-056 | |
| trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | |
| Neurobasal | LifeTechnologies - ThermoFisher | 21103-049 | |
| Neurobasal without phenol red | LifeTechnologies - ThermoFisher | 12348-017 | |
| Softwares | |||
| Routine in Matlab for background normalization | Quantacell | Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com | |
| ImageJ | To select specific ROI for image analysis | ||
| Routine | ImageJ | Supplementary data | |
| Routine | Matlab | Supplementary data |
References
- Jun, S., Taheri-Araghi, S. Cell-size maintenance: universal strategy revealed. Trends Microbiol. 23 (1), 4-6 (2015).
- Zlotek-Zlotkiewicz, E., Monnier, S., Cappello, G., Le Berre, M., Piel, M. Optical volume and mass measurements show that mammalian cells swell during mitosis. J. Cell Biol. 211 (4), 765-774 (2015).
- Kim, G. H., Kosterin, P., Obaid, A. L., Salzberg, B. M. A mechanical spike accompanies the action potential in Mammalian nerve terminals. Biophys J. 92 (9), 3122-3129 (2007).
- Iacono, D., et al. Neuronal Hypertrophy in Asymptomatic Alzheimer Disease. J Neuropathol Exp Neurol. 67 (6), 578-589 (2008).
- Cheli, V. T., et al. Conditional Deletion of the L-Type Calcium Channel Cav1. 2 in Oligodendrocyte Progenitor Cells Affects Postnatal Myelination in Mice. J Neurosci. 36 (42), 10853-10869 (2016).
- Kneynsberg, A., Collier, T. J., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. Quantitative and semi-quantitative measurements of axonal degeneration in tissue and primary neuron cultures. J Neurosci Methods. 266, 32-41 (2016).
- Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PloS one. 10 (3), (2015).
- Aguet, F., et al. Membrane dynamics of dividing cells imaged by lattice light-sheet microscopy. Mol Biol Cell. 27 (22), 3418-3435 (2016).
- Roland, A. B., et al. Cannabinoid-induced actomyosin contractility shapes neuronal morphology and growth. eLife. 3, (2014).
- Lu, Y. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Chen, J., Xue, C., Zhao, Y., Chen, D., Wu, M. H., Wang, J. Microfluidic impedance flow cytometry enabling high-throughput single-cell electrical property characterization. Int J Mol Sci. 16 (5), 9804-9830 (2015).
- Bottier, C., et al. Dynamic measurement of the height and volume of migrating cells by a novel fluorescence microscopy technique. Lab Chip. 11, 3855-3863 (2011).
- Cadart, C., et al. Fluorescence eXclusion Measurement of volume in live cells. Methods Cell Biol. 139, 103-120 (2017).
- Marasso, S. L., et al. A novel graphene based nanocomposite for application in 3D flexible micro-supercapacitors. Materials Research Express. 3 (6), 065001 (2016).
- Welch, C. C., Goodyear, A. L., Wahlbrink, T., Lemme, M. C., Mollenhauer, T. Silicon etch process options for micro-and nanotechnology using inductively coupled plasmas. Microelectronic Engineering. 83 (4), 1170-1173 (2006).
- Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Götz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4 (1), 78-85 (2008).
- abcam. Counting cells using a hemocytometer. , Available from: http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2017).
- ImageJ. Getting intensity values from single ROI. Image Intensity Processing. , Available from: https://imagej.net/Image_Intensity_Processing (2017).
- ImageJ. 19. Tools. ImageJ User Guide. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html (2017).
