Summary
Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung von genetisch codierte Fluorogenic Reporter in einer live Cell Imaging-Anwendung für die Prüfung der Harnblase-induzierten oxidativen Stress. Diese experimentelle Ansatz bietet unvergleichliche räumlich-zeitliche Auflösung, Sensitivität und Spezifität vieler die Unzulänglichkeiten der konventionellen Methoden zur Erkennung von toxikologischen oxidativen Stress zu vermeiden.
Abstract
Während oxidativer Stress eine häufig zitierte toxikologischen Mechanismus ist, leiden einige Mängel, einschließlich Zerstörung der Probe, Einführung der möglichen Artefakte und mangelnder Spezifität für die reaktive konventionelle Methoden zu studieren beteiligten Spezies. So gibt es einen aktuellen Bedarf auf dem Gebiet der Toxikologie für die zerstörungsfreie, sensitive und spezifische Methoden, die verwendet werden können, zu beobachten und zu quantifizieren, intrazellulären Redox-Störungen, häufiger als oxidativer Stress bezeichnet. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode für die Verwendung von zwei genetisch codierte Fluorogenic Sensoren, roGFP2 und HyPer in live Cell imaging Studien verwendet werden, um Fremdstoff-induzierte oxidative Reaktionen zu beobachten. roGFP2 gestalten mit der Glutathion-Redoxpotential (EGSH), während HyPer direkt erkennt Wasserstoffperoxid (H2O2). Beide Sensoren in verschiedenen Zelltypen über Transfektion oder Transduktion ausgedrückt werden können, und können zu bestimmten zellulären Kompartimenten ausgerichtet sein. Am wichtigsten ist, bietet live-Cell-Mikroskopie mit diesen Sensoren hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung, der mit herkömmlichen Methoden nicht möglich ist. Änderungen in der Fluoreszenzintensität überwacht bei 510 nm dient als Anzeige für beide genetisch codierte Fluorogenic Sensoren nacheinander begeistert von 404 nm und 488 nm Licht. Diese Eigenschaft macht beide Sensoren ratiometrischen, Beseitigung von gemeinsamen Mikroskopie Artefakte und Berichtigung für Unterschiede bei den Sensor Ausdruck zwischen den Zellen. Diese Methodik kann über eine Vielzahl von fluorometrisch Plattformen in der Lage, spannende und sammeln von Emissionen bei der vorgeschriebenen Wellenlängen, bildet es verwendbar für Gebrauch mit konfokale bildgebenden Systemen, konventionellen Weitfeld-Mikroskopie und Platte Leserinnen und Leser. Beide Fluorogenic genetisch codierten Sensoren wurden in einer Vielzahl von Zelltypen und toxikologischen Studien zur zellulären EGSH und H2O2 Generation in Echtzeit zu überwachen. Die hier skizzierten ist eine standardisierte Methode, die allgemein anpassungsfähig Zelltypen und fluorometrisch plattformübergreifend für die Anwendung von roGFP2 und HyPer im Leben-Zelle toxikologische Bewertungen von oxidativem Stress.
Introduction
Der Begriff "oxidativer Stress" häufig als einen Mechanismus in der Toxikologie, zitiert ist noch ist selten dieser Begriff konkret beschrieben. Oxidativer Stress kann beziehen sich auf verschiedene intrazelluläre Prozesse, einschließlich der Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies, Schäden durch freie Radikale, die Oxidation von antioxidativen Molekülen, und auch die Aktivierung der spezifischen Signalisierung Kaskaden. Ein breites Spektrum von Umweltkontaminanten1,2 und pharmazeutische Wirkstoffe3,4 , oxidativen Stress durch entweder direkte Aktion der Xenobiotika Verbindung selbst5 induzieren dokumentiert wurden ,6 oder sekundär durch Produktion von Oxidationsmittel Arten im Rahmen einer zellulären Antwort7,8,9,10. Es ist daher von großem Interesse in der Toxikologie genau zu beobachten und charakterisieren die oxidative Prozesse, die zu unerwünschten Ergebnissen führen. Herkömmliche Methoden der Messung von oxidativen Stress beteiligt Identifizierung von oxidierter Biomoleküle11,12,13,14,15 oder Antioxidantien16 ,17,18,19,20, oder die direkte Messung von reaktiven Spezies sich21,22,23, 24. Diese Methoden erfordern jedoch in der Regel zellulären Störungen, die oft verbraucht die Probe, beseitigt räumlichen Auflösung und potenziell stellt Artefakte25. Die Entwicklung sensitiver und spezifischer Methoden für die Erkennung von Oxidationsmittel Arten und Marker des oxidativen Stresses ist breit anwendbar für die Untersuchung der Nebenwirkungen von Xenobiotika Exposition.
Live-Cell-Mikroskopie mit einer neuen Generation von genetisch codierte Fluorogenic Sensoren ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Überwachung des intrazellulären Redox-Status von lebenden Zellen entstanden. Diese Sensoren sind in der Regel durch einen Vektor unter der Kontrolle von viralen Promotor, der über Transfektion oder Transduktion Methoden eingeführt wird ausgedrückt. Hohe Expression Wirkungsgrade sind nicht notwendig, da Zellen, die mit dem Ausdruck des fluoreszierenden Sensors optisch leicht identifiziert werden können. Für die toxikologische Beurteilung können Zellen, die mit dem Ausdruck dieser Sensoren mit Fluoreszenz-Mikroskopie, wie sie, insbesondere Verbindungen in Echtzeit ausgesetzt sind beobachtet werden. Diese Versuchsanordnung erlaubt wiederholte Messungen in der gleichen Zelle, so dass jede Zelle etablierten Grundlinie als seine eigene Kontrolle zu handeln. Die hohe zeitliche Auflösung, die gebotene live Cell Imaging eignet sich gut für die Erkennung von oxidativen Ereignisse, insbesondere solche, die bescheiden in Größe oder Transienten in der Natur sind. Abgesehen davon, dass Sensitivität und Spezifität zu ihren Zielmolekülen, kann die Fluoreszenz von einigen dieser Sensoren mit zwei Wellenlängen des Lichts angeregt werden. Dieses Phänomen ermöglicht die fluoreszente Emission als Verhältnis, ausgedrückt werden, das ermöglicht die Unterscheidung der Signal Veränderungen im Zusammenhang mit authentischen Sensor Antworten von denen verursacht durch Artefakte wie Variationen im Sensor Ausdruck, Zelle Dicke, Lampe Intensität, Immunofluoreszenz und Empfindlichkeit der Fluoreszenz-Detektor-26. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Fluorogenic Sensoren ist, dass sie können, um spezifische zelluläre Fächer ausgerichtet werden, erstellen ein Maß an räumlicher Auflösung, der durch konventionelle Methoden25,26,27unübertroffen ist.
Eine große Familie von genetisch codierten Sensoren basierend auf grün fluoreszierendes Protein (GFP) entwickelt und charakterisiert, Bericht über eine Vielzahl von physiologischer Marker, einschließlich pH-Wert, Temperatur, Kalzium-Konzentrationen und das ATP/ADP-Verhältnis25 ,28,29,30,31. Unter diesen sind Sensoren des Glutathion Redoxpotential (EGSH) und Wasserstoffperoxid (H2O2). Während diese Sensoren für Anwendungen in der Redox-Biologie und Physiologie entwickelt wurden, wurden sie auch angepasst, Fremdstoff-induzierten oxidativen Stress zu studieren. Insbesondere beschreibt das Protokoll hier skizzierten die Nutzung von E-GSH -Sensor roGFP2 und H2O2 Sensor HyPer.
roGFP2 berichtet über das Redoxpotential von intrazellulären reduzierte und oxidierte Glutathion (GSH/GSSG) über ein Redox-Relais mit Glutathion-Peroxidase (GPx), Glutaredoxin (Grx) und Glutathion-Reduktase (GR) (Abbildung 1)25, 32 , 33. Glutathion ist das vorherrschende zelluläre antioxidative Molekül und ist in erster Linie in seiner reduzierten Form (GSH) in millimolaren Konzentrationen im Zytosol25,34. Während EGSH nicht mit irgendeinem funktionellen Ergebnis verbunden worden ist, wird es als ein wichtiger Indikator der intrazellulären oxidativen Status34erkannt. Eine relativ geringe Erhöhung der Konzentration von GSSG führt zu einer Erhöhung in EGSH , die durch roGFP2 nachweisbar ist. Ebenso wichtig, Überwachung der EGSH mit roGFP2 bei Xenobiotika Belichtungszeiten kann potenziell verraten viel über den Wirkmechanismus an mehreren Stellen in der Redox-Staffel und damit verbundenen Wege, wie die Pentose-Phosphat-shunt (Abbildung 1 )35. Der zweite Sensor hier diskutiert, HyPer, ist eine intrazelluläre H2O2 Sonde abgeleitet aus der Einfügung gelb fluoreszierenden Proteins (YFP) in der regulatorischen Domäne von bakteriellen H2O2-sensible Transkription Faktor OxyR136. Obwohl es zuvor eine schädliche reaktiven Sauerstoff Mittelstufe behandelt hat, ist H2O2 zunehmend als eine wichtige intrazelluläre Signalmolekül unter physiologischen Bedingungen37, erkannt 38, was darauf hindeutet, dass unbekannte Rollen für H2O2 in der Toxikologie als auch vorhanden sind. Zum Beispiel könnte überschüssige H2O2 induziert durch Xenobiotika Exposition eine Vorstufe zu Dysregulation in zellulären Signal- oder eine Verschiebung der Bioenergetik.
Beide Fluorogenic genetisch codierten Sensoren wurden in mehrere etablierte Zelllinien, einschließlich der menschlichen epidermoid Carcinoma Zelle A431 und menschlichen bronchialen Epithelzelle Linie BEAS-2 b, zu Änderungen in EGSH und H2 beobachten geäußert O2 in Reaktion auf eine Vielzahl von toxikologischen Belichtungen. Dazu gehören gasförmige Schadstoffe (Ozon-35), lösliche Bestandteile von Feinstaub (1,2 Naphthoquinone39,40 und Zink41) und Nickel-Nanopartikel (unveröffentlichte Daten). Diese Studien stellen nur eine kleine Teilmenge der möglichen Anwendungen der beiden Sensoren. Theoretisch kann jeden Zelltyp, der empfangen und mit dem Ausdruck der DNS dieser Sensoren durch konventionelle molekularbiologische Techniken kann, genutzt werden, um die Beurteilung der Auswirkungen von Xenobiotika im Verdacht, den zellulären oxidativen Status ändern. Bis heute hat eine oder mehrere dieser Sensoren in verschiedenen Prokaryoten und Eukaryoten, darunter mehrere Säugetier, Pflanze, Bakterien und Hefe Zelle Arten25,26,36,42geäußert. Die Anzeige für EGSH und H2O2 Sensoren ist eine Änderung in der Intensität der Fluoreszenz emittiert bei 510 nm bei Anregung mit 488 und 404 nm-Licht. Diese Methode ist allgemein anpassungsfähig auf fluorometrisch Plattformen, einschließlich verschiedene Arten von Mikroskopie (konfokale und Weitfeld-) und Platte Leser. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht empfindliche und spezifische Beobachtung der intrazellulären EGSH und H2O2 in in-vitro- toxikologischen Systeme.
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Protocol
1. Vorbereitung der Zellen
Hinweis: Diese Vorgehensweise beschreibt die Lentivirale Transduktion eine immortalisierte Zelllinie (BEAS-2 b; ATCC, Manassas, VA) die gewünschten Reporter (roGFP2 oder HyPer) zum Ausdruck bringen. Andere Linien/Zelltypen und/oder Methoden des Gentransfers, einschließlich Transfection können genutzt werden, solange dadurch ein Maß an Reporter Ausdruck ausreichend, um eine ausreichende Anzahl von Sensor exprimierenden Zellen pro Gesichtsfeld (in der Regel 5 bis 10 Zellen) zu visualisieren. Wenn Transfektion Methoden zu verwenden, sollte das Verfahren durchgeführt werden, in der Schale, die letztlich für die Methode der Analyse verwendet werden (z. B. transfizieren Zellen in das gleiche Gericht, die das Mikroskop vorgelegt werden wird). Die unten beschriebenen Schritte geben Sie Details für die Zubereitung von Zelle Transductions in einer 6-Well Zellplatte Kultur durchgeführt werden. Wenn dieses Format keine geeignete Größe für die gewünschte Anwendung ist, können andere Schiffe ersetzt werden.
- Wachsen Sie Zellen bis ca. 40-60 % Zusammenfluss in normales Wachstumsmedien.
Hinweis: Diese Studie verwendet die menschlichen bronchialen Epithelzelle Linie, BEAS-2 b, in Keratinozyten Wachstumsmedium (KGM) angebaut. - Kurz vor der Transduktion ersetzen Sie die Wachstumsmedien auf die Zellen mit 500 µL serumfreie Medien mit der entsprechenden Menge des Virus, berechnet nach der Formel:
- Verwenden Sie für die Transduktion von BEAS-2 b-Zellen basalen Keratinozyten serumfreien Medium (KBM) zum der KGM Wachstumsmedien während virale Inkubationen ersetzen.
Hinweis: Die obige Berechnung ist für einen einzigen Transduktion von einem gut von den Zellen in einem 6-Well-Format. Bei Bedarf führen Sie Transductions aus mehreren Brunnen durchgeführt werden können, durch eine Anpassung der Formel mit einer Multiplikation mit der Anzahl der Bohrungen, die ausgestrahlt werden. Verwenden Sie für Lentivirale Transductions eine Vielzahl von Infektionen (MOI) zwischen 5 und 20. Verwenden Sie für adenovirale Transductions einer MOI zwischen 100 und 500.
- Verwenden Sie für die Transduktion von BEAS-2 b-Zellen basalen Keratinozyten serumfreien Medium (KBM) zum der KGM Wachstumsmedien während virale Inkubationen ersetzen.
- Inkubieren Sie Zellen mit der viralen Mischung bei 37 ° C für 4 h, Umverteilung der Viruspartikel in der Schale alle 30 bis 60 Minuten mit einer kurzen Schaukeln oder wirbelnden Bewegung.
- Fügen Sie 1 mL der komplette Wachstumsmedien in die Schale und Inkubation bei 37 ° C für weitere 4-16 h.
- Entfernen Sie alle Medien und ersetzen Sie durch frische komplette Wachstumsmedium.
- Weiter wachsen und Durchgang Zellen, je nach Bedarf zu erweitern.
Hinweis: Zellen sollte beginnen, den Sensor innerhalb von 12-48 h deutlich zum Ausdruck zu bringen. Wenn ein Lentivirale Vektor für die Transduktion verwendet wurde, sollte stabile Expression des gewünschten Sensors über Passagen weiter. - Für Mikroskopie-Bewertungen Samenzellen in Glas Mikroskop Gerichte die Talsohle und wachsen, um gewünschte Zusammenfluss (≥70 - 80 %) vor der Bildgebung.
Hinweis: Seeding Dichte hängt von der Größe der Schale, Wachstumsrate der Zelllinie verwendet wird und die Zeit der Bewertung nach Aussaat. Z. B. 300.000 BEAS-2 b Samenzellen in eine 35-mm-Schale um ca. 70-80 % Zusammenfluss nach 1 Tag Wachstum zu erzielen.
2. Mikroskopie-Set-up
Hinweis: Die unten beschriebene Protokoll erfolgt mit einem konfokalen Mikroskop mit Laserlinien bei 404 und 488 nm ausgestattet. Andere Mittel, um fluorometrisch Bewertungen der Sensoren innerhalb dieses Protokolls bei ihrer vorgeschriebenen Erregungen/Emission beschrieben sollte auch brauchbare Daten liefern. Wichtiger ist, variieren die Geräteeinstellungen stark je nach Art, Alter und Zustand des Instruments verwendet wird; so genannten Werten jedes Instrument spezifisch für die Ausrüstung, die in anderen Labors verwendet möglicherweise nicht.
- Führen Sie alle bildgebenden Analyse mit Umweltkontrollen weiterhin eine entsprechende Temperatur (z. B. 37 ° C), Luftfeuchtigkeit (in der Regel > 95 % Relative Luftfeuchtigkeit), und/oder gas-Konzentration (z.B. 5 % CO2) geeignet für die Zellen im ganzen den während des Experiments.
- Wenn hohe Werte der relativen Luftfeuchtigkeit zu verwenden, halten Sie alle Oberflächen, die in Kontakt mit der feuchte Atmosphäre kommen können (zB., das Mikroskopobjektiv) an oder leicht über die Temperatur, bei der die Luftfeuchtigkeit generiert wird, um Kondensation zu verhindern. Dies kann mit dem Einsatz von einer objektiven Heizung und/oder Heizung Tape und eine entsprechende Heizungssteuerung erreicht werden.
- Schalten Sie alle Mikroskopkomponenten und richten Sie alle notwendige Ausstattung für sequentielle Anregung bei 488 und 404 nm mit Emission bei 510 nm. Stellen Sie sicher, dass alle Komponenten der optischen Konfiguration für Echtzeit-Erwerb entsprechend festgelegt sind.
- Richten Sie eine Bühne-Top Klimakammer, konstante Temperatur bei 37 ° C, 5 % CO2 Atmosphäre und > 95 % Luftfeuchtigkeit. Vor dem Beginn der Bildaufnahme, equilibrate der Klimakammer für mindestens 10 min nach der Ersteinrichtung des alle Umweltauflagen.
Hinweis: Umweltbedingungen können beseitigt oder angepasst, je nach Experiment Länge, Zelltyp und Belichtung verwendet wird. - Legen Sie die Schale der Zellen (Schritt 1.7) auf der Bühne-Top in der Klimakammer.
- Mit dem gewünschten Ziel Objektiv die Brennebene der Zellen mit dem Okular und weißes Licht zu finden, und normale Morphologie zu gewährleisten.
Hinweis: Ein 1.4 NA 60 X violett-korrigiert, Ölbad-Objektiv wird häufig verwendet, ermöglicht die Identifizierung der intrazellulären Kompartimenten bei gleichzeitiger Maximierung der optischen Auflösung des konfokalen Systems. - Überprüfen Sie den Fluoreszenz-Ausdruck der Zellen in das Blickfeld. Tun Sie es, während die Zellen unter Weitfeld-Fluoreszenz Beleuchtung mit einem entsprechenden Filter, wie z. B. Fluorescein erfolgt (FITC) zu visualisieren. An dieser Stelle mit Weitfeld-Beleuchtung, während die Blick durch das Okular ist bequemer, weil es einfacher ist, verschieben Sie die Schüssel, wählen einen Bereich von Zellen zu studieren. Wählen Sie in der Regel eine Sichtfeld, die enthält mindestens 5 bis 10 Zellen, die den Sensor zum Ausdruck bringen, wie durch grüne Fluoreszenz.
- Alternativ führen Sie diese Einschätzung konfokal mit Laseranregung bei einer Wellenlänge, die kompatibel mit dem Sensor zum Ausdruck gebracht wird (488 nm funktioniert in der Regel am besten).
Hinweis: Aufgrund ihrer inneren fluoreszierenden Eigenschaften, es wird schwieriger sein, Zellen mit dem Ausdruck HyPer als jene mit dem Ausdruck ihrer roGFP2 mit entweder FITC zu visualisieren oder bei 488 nm. Es sollte jedoch immer noch möglich, schwache Zellen zu sehen.
- Alternativ führen Sie diese Einschätzung konfokal mit Laseranregung bei einer Wellenlänge, die kompatibel mit dem Sensor zum Ausdruck gebracht wird (488 nm funktioniert in der Regel am besten).
- Sobald eine gewünschte Sichtfeld gefunden wird, schließen Sie die Klimakammer.
Hinweis: Die Funktion Fokus beibehalten, oftmals auch auf fortgeschrittene Mikroskop steht, Wartung von einer stabilen Brennebene während der gesamten Studie zu erleichtern. - Richten Sie Aufnahmeparameter, optimale Beurteilung des Sensors von Interesse über den gewünschten Zeitraum zu gewährleisten. Hier sind Empfehlungen und Ansätze für confocal Imaging Sensor Antworten:
- Passen Sie die Laserleistung für Erregung bei 488 nm und Emission bei 510 nm. Wählen Sie eine Laser-Leistungsstufe, die Visualisierung der Zellen ermöglicht, und halten Sie dies konstant zwischen Proben oder replizieren Gerichte zu.
Hinweis: Für diese Studie wurden 12 % und 1,5 % Laserleistung für die 488 und 404 nm Laser-Linien bzw. verwendet. - Verwenden Sie die konfokale Steuerelemente der Datenerfassungs-Software, um sicherzustellen, dass die ausgewählte Brennebene für maximale Fluoreszenz Emissionsintensität in der Mitte der Zellen (z-Achse) optimiert worden ist, durch das Scannen auf 488 nm während der Anpassung der Z-Ebene. Dies wird erleichtert durch den Einsatz einer high-Gain-Einstellung bei der Suche nach der Z-Ebene, die sich in den meisten überbelichtet Zellen ergibt. Sobald die entsprechende Brennebene gefunden worden, den Gewinn zurück zu einem Ambiente, das optimale für die Fluoreszenz des Reporters ohne Übersättigung beobachtet Pixel verwendet werden.
Hinweis: Die Laser und Gain Einstellungen, die für die Suche und Beobachtung von Zellen während der Experimente eignen ist völlig abhängig von der konfokalen System genutzt wird. Im Allgemeinen, wenn die Zellen in das Sichtfeld gefunden haben, es wird empfohlen, eine minimale Menge der Laserleistung werden verwendet (in der Regel ≤20 %), wie übermäßige Scannen von Zellen unter Verwendung von High-Power-Laser-Licht oxidative Veränderungen nachweisbar durch den Sensor auslösen kann. - Verwenden Sie die Verstärkung, um die Basislinie Fluoreszenz zu optimieren. Richten Sie mit roGFP2 die Basislinie in der Nähe der Obergrenze (≈ 90 % relative Intensität) des Gerätes ohne Übersättigung, wie diese Zellen 510 nm Fluoreszenz induziert durch 488 nm Anregung verlieren, wenn EGSH erhöht. Im Gegensatz dazu sollte der Fluoreszenzintensität mit 488 nm Anregung niedrig (≈ 10 % relative Intensität) bei Studienbeginn für HyPer Zellen, auszudrücken, wie diese Zellen 510 nm Fluoreszenzintensität gewinnen, wenn H2O2 erkannt wird.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.9.2 und 2.9.3 mit Erregung bei 404 nm und Emission bei 510 nm. Gain-Einstellungen für die 404 nm Anregung Wellenlänge sind gegenüber denen mit 488 nm Anregung für jeden Sensor (d.h., niedrigen Ausgangswert Fluoreszenz (≈ 10 % relative Intensität) auf 404 nm für roGFP2, hohe Ausgangswert Fluoreszenz (≈ 90 % relative Intensität) für die H2 O2 Sensor).
Hinweis: im Allgemeinen werden die Fluoreszenz (510 Emission) bei 404 nm Anregung deutlich niedriger als sein, dass erhältlich mit 488 nm Anregung in Zellen mit dem Ausdruck roGFP2 und HyPer als 404 nm Gipfel eine relativ geringe Anregung für diese beiden maximale Sensoren.
- Passen Sie die Laserleistung für Erregung bei 488 nm und Emission bei 510 nm. Wählen Sie eine Laser-Leistungsstufe, die Visualisierung der Zellen ermöglicht, und halten Sie dies konstant zwischen Proben oder replizieren Gerichte zu.
3. Datenerfassung
- Richten Sie die Software zur Datenerfassung nacheinander die beiden Erregung Wellenlängen begeistern (erste 488 nm und dann 404 nm) und sammeln Sie Emissionen für beide bei 510 nm in einem vorgegebenen Zeitintervall über die gewünschte Länge des Experiments (z. B. Bilder erfassen alle 60 s für 60 min).
- Alternativ erwerben Sie Bilder manuell vor und nach der Exposition, wenn der ungefähren Zeitpunkt der Änderungen in EGSH oder H2O2 für die Harnblase zu testenden bekannt sind. Jedoch kann dies zum Verlust der zeitlichen Auflösung führen.
- Wählen Sie für Echtzeit-Bewertung der Versuchsparameter mindestens 5-10 Sensor exprimierenden Zellen im Feld und etablieren sie als Regionen von Interesse ("ROIs"), deren Fluoreszenz-Veränderungen während des Experiments zu überwachen.
Hinweis: Dieser Schritt ist optional und kann nach dem Experiment durchgeführt werden, wenn die direkte Beobachtung in Echtzeit unerwünscht ist oder Softwareeinschränkungen zu verhindern, dass die kontinuierliche Überwachung. Je nach Zell-Population könnte die Auswahl des Sensors mit dem Ausdruck Zellen als ROIs einen Ausdruck Niveaus zellenübergreifend darzustellen.- Fügen Sie für diese Studien Umwelt vergiftendes 9,10-Phenanthrenequinone (9,10-PQ) oder Wasserstoffperoxid (H2O2 hinzu) nach einem 5-min Basisperiode.
- Bereiten Sie alle Reagenzien für die spätere Verwendung in diesem Protokoll. Lösen Sie 9,10-PQ in Dimethyl Sulfoxid (DMSO) zu einer Konzentration von 15 mM zu, und verdünnen Sie Basalzell-Medien eine 250 µM funktionierende Lösung zu liefern. Darüber hinaus bereiten Sie eine funktionierende Lösung von Wasserstoffperoxid in Wasser, das eine Endkonzentration von 1 mM nach Einspritzung erbringt.
- Sobald der experimentellen Parameter definiert wurden, beginnt der Kurs Erwerb. Etablieren einer Basisperiode mindestens 5 min (oder 5 Datenpunkte) vor dem Beginn der Xenobiotika Belichtungen.
- Setzen Sie die Zellen, die die Schlüpfzeit untersucht mit herkömmlichen Ansätzen zur in-vitro- Dosierung. Bereiten Sie lösliche Verbindungen in Wasser oder anderen geeigneten Lösungsmittel und Spritzen Sie direkt in den Medien.
- Wenn organische Lösungsmittel (z.B. Dimethyl Sulfoxid oder Ethanol) erforderlich sind, halten Sie die endgültige Lösungsmittelkonzentration bei oder unter 0,1 %. Stellen Sie sicher, dass das Lösungsmittel keine auf EGSH oder H2O2 Produktion mit einer Fahrzeugkontrolle in eine separate Schüssel mit Zellen Wirkung.
- Fügen Sie für Verbindungen mit niedriger Löslichkeit einen Mischschritt mit einer Mikropipette des Protokolls nach die Injektion erfolgt. Pumpen Sie gasförmige Aufnahmen direkt in der Klimakammer mit der entsprechenden Träger-Gas-Gemisch.
- Überwachen Sie Änderungen in Fluoreszenz während der Expositionszeit. Führen Sie nachfolgende Injektionen je nach Bedarf. Sorgsam nicht die Schüssel während Injektionen, verschieben, dass die gleichen Zellen im Laufe die ganze Zeit während in der gleichen Brennebene abgebildet eingehalten werden.
- Am Ende des Experiments setzen Sie die Zellen, die entsprechenden Kontrollen. Fügen Sie für beide Sensoren genetisch codierte Fluorogenic bestimmte Konzentrationen von Verbindungen zu oxidieren und reduzieren diese Sensoren in einer Spitzen Demonstration ihrer Reaktionsfähigkeit ratiometrischen bekannt hinzu. H2O2 und Dithiothreitol (DTT) dienen als angemessene Kontrollen zu oxidieren und beide Sensoren verringern. In der Regel ermöglicht eine Endkonzentration von 100-1.000 µM H2O2, gefolgt von 1-5 mM Dithiothreitol (DTT), dem Benutzer vollständig zu oxidieren und reduzieren diese Sensoren.
- Verwenden Sie für diese Studien 1 mM H2O2 , gefolgt von 5 mM DTT, um die maximale Sensor Reaktion zu bestimmen.
- Warten Sie mindestens 5 min um den Sensor zu reagieren zu ermöglichen, und dann Spritzen Sie Reduktionsmittel, wie DVB-t, reduzieren die Senor und auf ein Niveau von Fluoreszenz an oder nahe der etablierten Grundlinie zurück.
Hinweis: Die Verwendung von Steuerelementen in diesem Schritt ist entscheidend für die Normalisierung und sollte durchgeführt werden, am Ende von jedem Versuch, den Dynamikumfang des Sensors in jeder Zelle zu bestimmen. Für roGFP2 kann Aldrithiol auch am Ende des Experiments hinzugefügt werden. Aldrithiol umgeht das roGFP2 Redox-Relais um den Sensor direkt oxidieren. Dies ist nützlich, um Sensor-Funktion nach Xenobiotika Exposition zu beurteilen.
(4) Datenanalyse
- Wenn nicht bereits etabliert, ROIs zeichnen um die Zellen analysiert werden. Verwenden Sie die entsprechende Software, um der Fluoreszenzintensität von jedem ROI bei jeder Wellenlänge im Laufe der Zeit zu messen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen nicht bewegen oder die Platte während des Laufs nicht verschieben.
Hinweis: Die Einrichtung des ROIs geschieht am einfachsten indem man einen geschlossenen Bereich, der das fluoreszierende Expressionsmuster von jeder Zelle folgt. Um weiter mit diesem Prozess zu unterstützen, kann eine übertragene Licht (oder Hellfeld) Bild der Zellen innerhalb der etablierten Sichtfeld bei Bemühungen um Zellengrenzen definieren auf das fluoreszierende Bild überlagert werden. Allerdings erfordert die Verwendung der übermittelten Lichtbild den Benutzer einen zusätzlichen Kanal (Satz von Bildern) im Laufe des Experiments zu erfassen. Alternativ übernehmen bestimmte Hersteller Algorithmen in ihrer imaging-Software, mit denen bestimmte Parameter z. B. Intensität Schwellenwerte um ROIs in einer mehr quantitative, weniger subjektive Methode zu etablieren. - Exportieren Sie die Daten in der gewünschten Analyse-Software (z. B. elektronische Arbeitsblatt).
- Berechnen Sie die ratiometrischen Sensor Antwort für jedes ROI zu jedem Zeitpunkt mit den Formeln:
- Für jeden Zeitpunkt Durchschnittswerte der berechneten ratiometrischen alle Rois.
- Berechnen Sie den Baselinewert, der verwendet wird, um die Daten zu normieren, indem man die vorher berechnete ratiometrischen Werte (Schritt 4.4) vor Zugabe der Harnblase (z. B. die ersten fünf Mal Punkte) gesammelt.
- Normalisieren Sie die ratiometrischen Werte aus Schritt 4.4 durch Teilung jeder Wert durch den Ausgangswert in 4.5 berechnet. Normalisierte Verhältnisse zentriert um einen Wert von 1 zu Studienbeginn, während der Anstieg der EGSH oder H2O2 folgende Injektionen werden dazu führen, dass das Verhältnis zu erhöhen. Bewertungen der Harnblase, die oxidative Veränderungen zu bewirken sind in der Regel um Werte in einem Bereich von 3 - 6 Mal den Ausgangswert zu erzielen.
- Zur Unterstützung beim Vergleich der Antworten innerhalb und zwischen den Experimenten express normalisierten Daten als Prozentsatz der maximalen Sensor Reaktion durch die Reaktion auf das Steuerelement Oxidationsmittel (z. B. 1 mM H2O2) als 100 % definiert.
Hinweis: Wenn Daten als Prozentsatz der maximalen Sensor Antwort zum Ausdruck zu bringen, ist es wichtig, sicherzustellen, dass die gleiche Konzentration des Oxidationsmittels Kontrolle über Experimente konsistent verwendet wird. Alle Daten aus live Cell imaging Analyse ist offen für konventionelle paarweisen und unternehmensweite statistische Analyse im Ermessen des Prüfers gewählt werden.
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Representative Results
Die Verwendung von roGFP2 und HyPer bei der Erkennung von Änderungen im EGSH und intrazellulären H2O2 wurde zuvor beschriebenen25,36,42,43 und wird hier gezeigt. Konfokale Bilder mit dem Ausdruck roGFP2 bei Baseline und folgenden Zusatz von H2O2 und DVB-t-Zellen sind in Abbildung 2dargestellt. Daten von den Bildern, die während des Experiments gesammelt wurden exportiert und analysiert, wie in Abschnitt 4 des Protokolls beschrieben. Wie gezeigt, produziert der Zusatz von exogenen H2O2 als Positivkontrolle reproduzierbare Antworten wenn die Daten an ihren jeweiligen Grundlinie normalisiert sind und ein definierter Dynamikbereich durch Zugabe von bekannte exogene entsteht Oxidantien/Reduktionsmitteln (H2O2 und DVB-t) (zahlen 3, 4 und 5).
Reaktionen auf toxikologische Reize sind in der Regel variabler als die durch die Kontrollen. Dies ist zu erwarten, da xenobiotischen Verbindungen pleiotrope Effekte auf Zellen von Redox-Radfahren in Adduktion der intrazelluläre Proteine haben können. In den Figuren 6 und 7sind Beispiele von roGFP2 und HyPer Reaktionen induziert durch die Einwirkung von vergiftendes 9,10-PQ, eine oxidierende Luftschadstoff gebildet durch atmosphärische Reaktionen von Phenanthren44, dargestellt. Die Grafiken in diesen Zahlen zeigen den Verlauf der jeden Schritt bei der Analyse der Daten gemäß Abschnitt 4 des Protokolls beteiligt. Wie gezeigt, verringert Normalisierung der einzelnen Zellen auf die eigene Grundlinie und Positivkontrolle (Abb. 6B), interzellulären Variabilität in der Größenordnung der Sensor-Antwort aus den Rohdaten(Abbildung 6). In Fällen, in denen die Varianz in der zellulären Antwort von Interesse ist, kann mit einzelnen Zellen, die durch ihre eigenen Linien in der Grafik dargestellt Normalisierung der Daten bis zu diesem Punkt durchgeführt werden. Variation in der Größe oder Kinetik der Reaktionen zwischen den Zellen in der gleichen Schüssel kann wichtige mechanistische Erkenntnisse offenbaren, die Unterschiede in den Zellzyklus, zum Beispiel widerspiegeln. Alternativ kann die gemittelte Antwort der Zellen in der Schale zusammen mit der Standardabweichung (Abbildung 6C) vorgelegt werden. Andernfalls wenn Wiederholungen der eigenen Experimente präsentiert werden, können die Daten als die normalisierte relative Fluoreszenz Intensitätswerte oder als Prozentsatz der maximalen Reaktion induziert durch das Steuerelement Oxidationsmittel (zahlen 3, 4, 5, und 6 D), unterbreitet werden zeigt den Durchschnitt der alle Replikate, begleitet von den Standardfehler des Mittelwerts. Die Umgebungsluft Verunreinigung 9,10-PQ ist bekanntermaßen eine potente Redox-Cycler, die wir vermuten ist verantwortlich für die zyklische Produktionsspitzen Wasserstoffperoxid von HyPer (Abbildung 7) erkannt und schrittweise EGSH erhöht erkannt durch roGFP2 ( Abbildung 6 ( D).
Abbildung 1 . Das roGFP2 Glutathion Redox-Relais. Glutathion-Peroxidasen (GPx) oxidieren reduzierten Glutathion (GSH) zu GSSG in Reaktion auf Wasserstoffperoxid (H2O2), wodurch die Glutathion-Redoxpotential (EGSH). Fluorogenic Sensor roGFP2 gestalten mit intrazellulären EGSH wenn von Glutaredoxin (Grx) oxidiert. In der reduktiven Weg katalysiert Grx die Reduzierung des roGFP2 durch Deglutathionylation GSSG-Spiegel sinkt und ein normales Niveau von GSH von Glutathion-Reduktase (GR) auf Kosten von NADPH wiederhergestellt werden. NADPH wird durch Glukose durch die Pentose-Phosphat-Weg (PPP) geliefert. Adaptiert von Gibbs-Flournoy Et Al35. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Konfokale Mikroskopie-Bilder von der menschlichen bronchialen Epithelzelle Linie BEAS-2 b mit dem Ausdruck cytosolischen roGFP2. Zellen wurden beleuchtet bei 488 nm (A-D), gefolgt von 404 nm (E-H). Bilder zeigen Fluoreszenz emittiert bei 510 nm für die folgenden Bedingungen: Basis (A, E), 100 µM H2O2(B, F), 1 mM H2O2 (C, G)und 5 mM DTT (D, H). 60 X Plan Apo VC Ziel. Maßstabsleisten repräsentieren 25 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Dosis-abhängige Änderungen in roGFP2 durch H2O2 in BEAS-2 b-Zellen induziert. Zellen wurden für 30 min in Phenol-rot frei Keratinozyten basale Medien (KBM) vor Expositionen equilibriert. Alle Ergänzungen von H2O2 ereignete sich nach einer Basisperiode 5 min. roGFP2 Fluoreszenz emittiert bei 510 nm wurde gesammelt, mit einem 525/30 nm Bandpass filter nach Laseranregung bei 404 und 488 nm. Zelluläre Reaktionen wurden auf ihre jeweiligen Grundlinie und maximale Sensor Reaktion nach der Zugabe von 1 mM H2O2normalisiert. Werte werden dargestellt als Mittelwert ± Standardfehler, n = 3, wo n aus durchschnittlich 5-10 unabhängige Zellen besteht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Reaktion von Glucose verhungert BEAS-2 b-Zellen, die mit dem Ausdruck roGFP2 zu verschiedenen Dosen von H2O2. Zellen wurden für 2 Stunden in einem minimalen Salz Medium equilibriert, die keine Glukose vor Forderungen enthält. Alle Ergänzungen von H2O2 ereignete sich nach einer Basisperiode 5 min. roGFP2 Fluoreszenz emittiert bei 510 nm wurde gesammelt, mit einem 525/30 nm Bandpass filter nach Laseranregung bei 404 und 488 nm. Zelluläre Reaktionen wurden auf ihre jeweiligen Grundlinie und maximale Sensor Reaktion nach der Zugabe von 1 mM H2O2normalisiert. Werte werden dargestellt als der Mittelwert ± Standardfehler, n = 3, wo n aus durchschnittlich 5-10 verschiedene Zellen besteht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5. Antwort von BEAS-2 b-Zellen, die mit dem Ausdruck HyPer zu verschiedenen Dosen von H 2 O 2 . Zellen wurden für 30 min in Phenol-rot frei KBM vor Expositionen equilibriert. Alle Ergänzungen von H2O2 ereignete sich nach einer Basisperiode von 5 min. Fluoreszenz emittiert bei 510 nm wurde gesammelt, mit einem 525/30 nm Bandpass Filtern nach Laseranregung bei 404 und 488 nm. Zelluläre Reaktionen wurden auf ihre jeweiligen Grundlinie und maximale Sensor Reaktion nach der Zugabe von 1 mM H2O2normalisiert. Werte werden dargestellt als der Mittelwert ± Standardfehler, n = 3, wo n aus durchschnittlich 5-10 verschiedene Zellen besteht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6. 9,10-PQ-induzierte Reaktionen der BEAS-2 b-Zellen, die mit dem Ausdruck roGFP2. Zellen wurden für 30 min in Phenol-rot frei KBM vor der Belichtung equilibriert. Zusatz von 25 µM 9,10-PQ mit Misch-ereignete sich um 5 min, schildert gefolgt durch Zugabe von 1 mM H2O2 bei 20 min und 5 mM DTT 24 min. zentrale A das rohe roGFP2 Verhältnis einzelner Zellen in die Schüssel, jede Zelle, die durch eine separate Zeile dargestellt. Zentrale B Normalisierung der Werte aus jeder einzelnen Zelle zu seiner Grundlinie Sensor Fluoreszenz zeigt, und der Mittelwert und die Standardabweichung dieser Daten wird auf die einzelnen normalisierte Verhältnisse im Bedienfeld " C" überlagert. Der Prozentsatz der maximalen Sensor Antwort gemittelt über alle Zellen wird im Bedienfeld " D" dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7 . 9,10-PQ-induzierte Reaktionen der BEAS-2 b-Zellen, die mit dem Ausdruck HyPer. Zellen wurden für 30 min in Phenol-rot frei KBM vor der Belichtung equilibriert. Zusatz von 25 µM 9,10-PQ mit Misch-ereignete sich um 5 min, gefolgt durch Zugabe von 1 mM H2O2 auf 20 min und 5 mM DTT in 25 min. Fluoreszenz emittiert bei 510 nm wurde gesammelt, mit einem 525/30 nm Bandpass filter nach Laseranregung bei 404 und 488 nm. Zelluläre Reaktionen wurden auf ihre jeweiligen Grundlinie und maximale Sensor Reaktion nach der Zugabe von 1 mM H2O2normalisiert. Werte werden als Mittelwert von ca. 5-10 verschiedene Zellen präsentiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die Verwendung von roGFP2 und HyPer bei der Erkennung von Änderungen im intrazellulären EGSH und H2O2, bzw. wurde gut beschrieben in früheren physiologische und toxikologische Studien 25,35,36 ,39,40,41,42,43. Das Protokoll hier skizzierten berichtet ein wirksames Mittel zur Umsetzung diese genetisch codierte Redox-Sensoren in Spitzen toxikologische Studien, Fremdstoff-induzierte Störungen der intrazellulären Redox Homöostase zu beurteilen. Am wichtigsten ist, verbindet die ordnungsgemäße Verwendung dieser Sensoren Änderungen beobachtet, um eine bestimmte Redox-paar oder ROS (EGSH oder H2O2), letztlich die mangelnde Spezifität mit konventionellen oxidativen Stress Ansätzen zu klären. In sichert die Qualität der Daten dieser Sensoren, ein paar Aspekte werden beim Entwerfen von Experimenten berücksichtigt muss und Analyse/Interpretation der Daten. Dazu gehören: (1) die Verwendung geeigneter Kontrollen, 2) die Überprüfung der entsprechenden Sensor Antworten und (3) Manipulation der Versuchsparameter Mechanismen aufzuklären. Davon dient die Zugabe von exogenen H2O2 und DVB-t als Steuerelemente am Ende des Beobachtungszeitraums mehrere Zwecke. Erstens bietet es die Möglichkeit, das Ausmaß der Reaktion auf die toxische Belastung, bezogen auf die erreichbare maximale und minimale Signale vom Sensor zu bewerten. Dies ist besonders nützlich bei der Normalisierung Antworten für Vergleiche zwischen Experimente. Endet das Experiment mit dem Zusatz von exogenen starkes Oxidationsmittel und reduktive Reize kann darüber hinaus die Wirkung der vorangegangenen Ausstellung auf Sensor/Relais Integrität auswerten. Darüber hinaus kann Aldrithiol hinzugefügt werden, am Ende des Laufs zu umgehen das Relais und testen Sie die Funktionalität des Sensors direkt für mögliche Schäden, die die Belichtung der Fluorophor selbst zugefügt haben kann.
Wie bei anderen Techniken, bei der Anwendung dieser Methodik für die konkrete Prüfung der toxikologischen Ergebnisse, ist es wichtig, qualitative Einschätzungen bezüglich der Genauigkeit der Beobachtungen zu machen. Bei der Verwendung von roGFP2 oder HyPer mit jeder neuen xenobiotische es ist wichtig, zunächst eine Reihe von Dosen, testen und sicherstellen, dass der Fluoreszenzintensität (510 nm Emission) von jeder Anregung Wellenlänge (404 nm und 488 nm) ändert sich entsprechend (d. h. Erhöhung oder verringern) für den Redox Sensor verwendet wird. Ziel ist es, eine Dosis zu identifizieren, an der eine Sensor-Antwort ist nachweisbar, aber wird nicht durch offenkundige Manipulation des Sensors oder andere unspezifische Effekte der Verbindung überwältigt. Direkte Adduktion oder Beschädigung des Sensors kann Fluoreszenz bei beiden Erregung Wellenlänge (488 oder 404 nm) als atypische Veränderungen manifestieren. In Situationen, in denen entweder Sensor konsequent unangemessen reagieren auf die Zugabe von einem Schlüpfzeit über Expositionen beobachtet worden, es wird empfohlen, dass der Prüfer prüfen Prüfung experimentellen Parameter in Bezug auf Dosimetrie, Zelle Rentabilität, Sensor Ausdruck und/oder optische/chromatische Abweichungen der Instrumentierung verwendet wird, um die Reaktionen zu beobachten.
Wie mit jeder toxikologischen auslesen, die erfassten Daten in der Regel mehr sind sinnvoll, wenn die beobachteten Reaktionen untersucht oder validiert sind mit einem mechanistischen Ansatz und die experimentelle Einschränkungen gelten. Zu diesem Zweck können verschiedene experimentelle Parameter kombiniert mit den inhärenten Eigenschaften des Sensors genutzt werden, um robuste Redox Bewertungen zu generieren. Untersuchungen speziell für den Einsatz des roGFP2 Sensors betreffen letztendlich das Redox-Relais durch welche roGFP2 Sinne EGSH (Abbildung 1). Das Relais beinhaltet intrazelluläre Enzyme, einschließlich Glutaredoxin (Grx), Glutathion-Reduktase (GR) und Glutathion Peroxidase (GPx). Unterschiede bei endogenen Grx über zelluläre Kompartimente und Zelltypen können Messungen der EGSH beeinflussen und Vergleiche zwischen Experimente schwierig43. Um dieses Problem zu beheben, wurde eine Reihe von "Fusion Sonden" synthetisiert, die das entsprechende Enzym eine direkte Verknüpfung mit der roGFP2-Sensor. Zuletzt war menschliche Grx-1 über Gutscher und Kollegen32 Form Grx1-roGFP2 mit roGFP2 verbunden. Neben einen größeren Dynamikbereich als roGFP1 und pH-Wert-unempfindlich, kann Grx1-roGFP2 überwachen EGSH in Zelltypen oder Fächer, in denen, die GRX Aktivität sonst limitierend sein würde. Unterschiede bei NADPH über Zelltypen oder sogar zwischen den Zellen in der gleichen Schüssel können auch zur Variabilität im roGFP2 Reaktionen beitragen. NADPH entsteht aus Glukose durch die Pentose-Phosphat-Weg und kann durch Glutathion-Reduktase (GR), GSSG zu reduzieren zurück zu GSH (Abbildung 1) verwendet werden. Wenn Zellen in dem selben Gebiet dem Experiment mit unterschiedlichen Kapazitäten reduzieren beginnen, können ihre EGSH Änderungen und daraus resultierende roGFP2 Reaktionen auf einen Reiz nicht einheitlich durchgeführt. Dieses Problem kann durch eine Phase der Glukose Hunger vor dem Experiment, überwunden werden, die zelluläre NADPH Bestände erschöpft und harmonisiert roGFP2 Antworten. Eine verminderte Kapazität für EGSH Erholung ist auch in der 25 µM H2O2 Dosis in Zellen ersichtlich, die der Glukose im Vergleich zu Zellen mit normalen Glukosekonzentration (Abbildungen 3 und 4) ergänzt verhungert waren. Thusly, dienen Manipulation von NADPH Ebenen durch Glukose Hunger als ein Mittel, um die Beteiligung von mehreren Relais-Komponenten in transducing die Wirkung von Xenobiotika Belichtung des Sensors überprüfen. Ein weiteres Problem bei der Verwendung von roGFP2 in einem toxikologischen Kontext ist das Potenzial für die Harnblase interagieren direkt in oxidierenden des Sensors, sondern als handelnd durch das Redox-Relais, EGSHzu ändern. Direkte Oxidation von roGFP2 kann bestimmt werden, von jedem Punkt des Redox-Relais Sondierung und Beurteilung ihrer Wirkung auf das roGFP2-Signal. Ein Beispiel für diese Technik durch Ozon als Anregung zeigt sich in der Studie von Gibbs-Flournoy Et Al 35.
Für Experimente mit dem H2O2 Sensor sind die oben genannten Bedenken nicht als relevant, wie die OxyR1-Domäne von HyPer H2O2 direkt spürt und nicht durch ein Redox-Relais. Allerdings ist im Gegensatz zu roGFP2, H2O2 Sensor empfindlich auf Veränderungen des pH-Wertes, die Fluoreszenz nicht zurechenbaren H2O2 während eines Experiments Veränderungen hervorrufen können. Aus diesem Grund, die Verwendung von ordnungsgemäß gepufferte Medien eine Klimakammer, die gewünschte Temperatur und die Nutzung des Fahrzeugs zu erhalten sind entscheidend für jedes Experiment unter Verwendung des H2O2 Sensors. Darüber hinaus haben speziell Monitor pH, wie z. B. pHRed, Fluorogenic Sensoren entwickelt, die emittiert Fluoreszenz im roten Kanal und können in den Zellen auch Ausdruck HyPer45Co ausgedrückt werden. Der ideale pH-Regelung für den H2O2 Sensor ist SypHer, das ist eine Version von der H2O2 -Sensor, der hat einer einzigen Punktmutation Rendern es nicht Sinn H2O2, noch bewahrt Reaktionsfähigkeit auf pH 46. es wurde auch beobachtet, dass Zellen mit dem Ausdruck H2O2 Sensor eine längere Grundlinie benötigen zu equilibrate vor allem nach dem Transport aus einem Inkubator auf der Website von Analysen, in denen sie erfahren, geringfügige Änderungen in Mediumstemperatur und pH-Wert. Es wird empfohlen, mindestens 5 Datenpunkte zu erwerben, nachdem die Grundlinie stabilisiert hat, bevor Sie beginnen jede Exposition.
Die Sensoren diskutiert in dieser Methode, roGFP2 und HyPer, sind zwei der vielen Fluorogenic-Sensoren, die eine Vielzahl von neuen Anwendungen auf dem Gebiet der Toxikologie haben. Dies umfasst Sensoren zur Erkennung von nicht nur EGSH und H2O2, sondern Peroxynitrit47, Stickoxid-48,49, und sogar Ozon50. Diese Sensoren genutzt werden in live-Cell imaging Studien, speziell und sensibel überwachen die oxidativen Spezies von Interesse. Mit Fortschritten in Techniken wie spectral unmixing, ist es auch möglich, zwei Sensoren mit ähnlichen spektralen Eigenschaften Co auszudrücken (innerhalb von 5 nm voneinander entfernt) in der gleichen Zelle, und den Anteil der von jedem Sensor51 emittierte Fluoreszenz zu trennen . Diese Technik ist besonders interessant für roGFP2 und HyPer, da sie Erregungen und Emission bei den gleichen Wellenlängen beinhalten. Wie kurz erwähnt können hier bestimmte Sensoren auf bestimmte intrazelluläre Fächer, wie z. B. die Mitochondrien oxidative Ereignisse von Interesse beobachten abgestimmt werden. Während diese neuen Sensoren und Techniken dieser Methode behandelt werden, wird der Leser mehrere Publikationen zum Thema der intrazellulären Redox-Sensoren, wie die Überprüfung von Löhnen und Kollegen52bezeichnet. Die Verwendung von genetisch codierte Fluorogenic Sensoren mit live Cell Imaging ist ein robustes Werkzeug für die Überwachung der oxidativen Reaktionen während toxikologische Bewertungen.
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Disclosures
Die Forschung in diesem Artikel beschriebenen wurde bewertet von National Health und ökologischen Auswirkungen Research Laboratory, US Environmental Protection Agency, und zur Veröffentlichung freigegeben. Der Inhalt dieses Artikels dürfen nicht so ausgelegt werden, um die Agentur Politik vertreten, noch stellt die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerzielle Produkte Billigung oder Empfehlung für den Einsatz.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Katelyn Lavrich danken für Unterstützung bei der Versuchsplanung und Manuskript bearbeitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| roGFP2 Plasmid | University of Oregon | N/A | Generous gift of S.J. Remington |
| HyPer Plasmid | Evrogen | FP941 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 10708984001 | |
| 9,10-Phenanthrenequinone | Sigma Aldrich | 156507 | |
| Black Wall Glass Bottomed Dishes | Ted Pella | 14029-20 | |
| BEAS-2B cell line | American Type Culture Collection | CRL-9609 | |
| Keratinocyte Basal Medium | Lonza | 192151 | |
| Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Excel | Microsoft Office Suite | N/A | |
| NIS-Elements AR Imaging Software | Nikon | N/A | |
| Nikon C1si Confocal Imaging System | Nikon | N/A |
References
- Cross, C. E., et al. Environmental oxidant pollutant effects on biologic systems: a focus on micronutrient antioxidant-oxidant interactions. Am J Respir Crit Care Med. 166, 44-50 (2002).
- Kobzik, L. Environmental particulate-mediated cytokine production in lung epithelial cells (A549): role of preexisting inflammation and oxidant stress. J Toxicol Environ Health. 55, 31-44 (1998).
- Jaeschke, H., McGill, M. R., Ramachandran, A. Oxidant stress, mitochondria, and cell death mechanisms in drug-induced liver injury: lessons learned from acetaminophen hepatotoxicity. Drug Metab Reviews. 44, 88-106 (2012).
- Wolf, M. B., Baynes, J. W. The anti-cancer drug, doxorubicin, causes oxidant stress-induced endothelial dysfunction. Biochim Biophys Acta. 1760, 267-271 (2006).
- Kumagai, Y., Shinkai, Y., Miura, T., Cho, A. K. The chemical biology of naphthoquinones and its environmental implications. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 52, 221-247 (2012).
- Pham, H. T., Maccarone, A. T., Campbell, J. L., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Ozone-induced dissociation of conjugated lipids reveals significant reaction rate enhancements and characteristic odd-electron product ions. J Am Soc Mass Spectrom. 24, 286-296 (2013).
- Abdel-Malek, Z. A., Kadekaro, A. L., Swope, V. B. Stepping up melanocytes to the challenge of UV exposure. Pigment Cell Melanoma Res. 23, 171-186 (2010).
- Berisha, H., Pakbaz, H., Absood, A., Foda, H., Said, S. Nitric oxide mediates oxidant tissue injury caused by paraquat and xanthine oxidase. Ann N Y Acad Sci. 723, 422-425 (1994).
- Gao, X., et al. Mitochondrial dysfunction may explain the cardiomyopathy of chronic iron overload. Free Radic Bio Med. 49, 401-407 (2010).
- Shukla, A., et al. Asbestos induces mitochondrial DNA damage and dysfunction linked to the development of apoptosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 285, 1018-1025 (2003).
- Charles, R., Jayawardhana, T., Eaton, P.
- Thornalley, P. J., Rabbani, N. Detection of oxidized and glycated proteins in clinical samples using mass spectrometry-a user's perspective. Biochim Biophys Acta. 1840, 818-829 (2014).
- Arato, S., Ito, H., Miyashita, K., Hayakawa, K., Itabashi, Y. A facile method for the detection of aldehydes in oxidized lipids using solid-phase microextraction fiber and gas chromatograph equipped with a septum-free injector. J Oleo Sci. 58, 17-22 (2009).
- Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840, 794-800 (2014).
- Churg, A., Keeling, B., Gilks, B., Porter, S., Olive, P. Rat mesothelial and tracheal epithelial cells show equal DNA sensitivity to hydrogen peroxide-induced oxidant injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 268, 832-838 (1995).
- Fraga, C. G., Oteiza, P. I., Galleano, M. In vitro measurements and interpretation of total antioxidant capacity. Biochim Biophys Acta. 1840, 931-934 (2014).
- Niki, E., Noguchi, N. Evaluation of antioxidant capacity: what capacity is being measured by which method. IUBMB Life. 50, 323-329 (2000).
- Pharikal, K., Das, P., Dey, C., Dasgupta, S. Tissue ascorbate as a metabolic marker in cadmium toxicity. Int J Vitam Nut Res. 58, 306-311 (1987).
- Tabata, M., Totani, M., Murachi, T. A chemiluminometric method for NADPH and NADH using a two-enzyme bioreactor and its application to the determination of magnesium in serum. Biomed Chrom. 4, 123-127 (1990).
- Ballatori, N., et al. Glutathione dysregulation and the etiology and progression of human diseases. Biol Chem. 390, 191-214 (2009).
- Nauseef, W. M. Detection of superoxide anion and hydrogen peroxide production by cellular NADPH oxidases. Biochim Biophys Acta. 1840, 757-767 (2014).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection and characterisation of radicals in biological materials using EPR methodology. Biochim Biophys Acta. 1840, 708-721 (2014).
- Kettle, A. J., et al. Measuring chlorine bleach in biology and medicine. Biochim Biophys Acta. 1840, 781-793 (2014).
- Carballal, S., Bartesaghi, S., Radi, R. Kinetic and mechanistic considerations to assess the biological fate of peroxynitrite. Biochim Biophys Acta. 1840, 768-780 (2014).
- Meyer, A. J., Dick, T. P.
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J Biol Chem. 279, 22284-22293 (2004).
- Malinouski, M., Zhou, Y., Belousov, V. V., Hatfield, D. L., Gladyshev, V. N. Hydrogen peroxide probes directed to different cellular compartments. PloS One. 6, 14564 (2011).
- Guzman, J. N., et al. Oxidant stress evoked by pacemaking in dopaminergic neurons is attenuated by DJ-1. Nature. 468, 696-700 (2010).
- Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nat Med. 20, 555-560 (2014).
- Wolf, A. M., Nishimaki, K., Kamimura, N., Ohta, S. Real-time monitoring of oxidative stress in live mouse skin. J Invest Dermatol. 134, 1701-1709 (2014).
- Mishina, N. M., et al. Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally. Antioxid Redox Signal. , (2011).
- Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nat Methods. 5, 553-559 (2008).
- Lohman, J. R., Remington, S. J. Development of a family of redox-sensitive green fluorescent protein indicators for use in relatively oxidizing subcellular environments. Biochem. 47, 8678-8688 (2008).
- Schafer, F. Q., Buettner, G. R. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radic Bio Med. 30, 1191-1212 (2001).
- Gibbs-Flournoy, E. A., Simmons, S. O., Bromberg, P. A., Dick, T. P., Samet, J. M. Monitoring intracellular redox changes in ozone-exposed airway epithelial cells. Environ Health Perspect. 121, 312 (2013).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
- Wood, Z. A., Poole, L. B., Karplus, P. A. Peroxiredoxin evolution and the regulation of hydrogen peroxide signaling. Science. 300, 650-653 (2003).
- Sies, H. Role of Metabolic H2O2 Generation REDOX SIGNALING AND OXIDATIVE STRESS. J Biol Chem. 289, 8735-8741 (2014).
- Cheng, W. -Y., et al. Linking oxidative events to inflammatory and adaptive gene expression induced by exposure to an organic particulate matter component. Environ Health Perspect. 120, 267 (2012).
- Cheng, W. -Y., et al. An integrated imaging approach to the study of oxidative stress generation by mitochondrial dysfunction in living cells. Environ Health Perspect. , 902-908 (2010).
- Wages, P. A., et al. Role of H 2 O 2 in the oxidative effects of zinc exposure in human airway epithelial cells. Redox Biol. 3, 47-55 (2014).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E GSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radic Bio Med. 51, 1943-1951 (2011).
- Schwarzländer, M., Dick, T. P., Meyer, A. J., Morgan, B. Dissecting redox biology using fluorescent protein sensors. Antiox Redox Signal. 24, 680-712 (2016).
- Wang, L., Atkinson, R., Arey, J. Formation of 9, 10-phenanthrenequinone by atmospheric gas-phase reactions of phenanthrene. Atmos Environ. 41, 2025-2035 (2007).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: applications in neuroscience and regenerative biology. Biochim Biophys Acta. 1850, 2318-2328 (2015).
- Hou, J. -T., et al. A highly selective water-soluble optical probe for endogenous peroxynitrite. Chem Commun. 50, 9947-9950 (2014).
- Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
- Gabe, Y., Ueno, T., Urano, Y., Kojima, H., Nagano, T. Tunable design strategy for fluorescence probes based on 4-substituted BODIPY chromophore: improvement of highly sensitive fluorescence probe for nitric oxide. Anal Bioanal Chem. 386, 621-626 (2006).
- Garner, A. L., et al. Specific fluorogenic probes for ozone in biological and atmospheric samples. Nat Chem. 1, 316-321 (2009).
- Cheng, W. -Y., Larson, J. M., Samet, J. M. Monitoring intracellular oxidative events using dynamic spectral unmixing microscopy. Methods. 66, 345-352 (2014).
- Wages, P. A., Cheng, W. -Y., Gibbs-Flournoy, E., Samet, J. M. Live-cell imaging approaches for the investigation of xenobiotic-induced oxidant stress. Biochim Biophys Acta. 1860, 2802-2815 (2016).
