Summary
Denna artikel beskriver en enkel protein microarray metod för profilering humorala immunsvar mot en 7-plex panel av mycket renad Clostridium difficile antigener i humant serum. Protokollet kan förlängas för bestämning av specifika antikroppen svaren i förberedelserna av polyklonala intravenöst immunglobulin.
Abstract
Vi ger en detaljerad översikt över en roman hög genomströmning protein microarray analys för bestämning av anti -Clostridium difficile antikroppsnivåer i Humansera och i separata beredningar av polyklonala intravenöst immunglobulin (IVIg). Protokollet beskrivs de metodologiska steg som ingår i provberedning, utskrift av matriser, analysförfarande och dataanalys. Detta protokoll kan dessutom utvecklas ytterligare för att införliva olika kliniska prover inklusive plasma och cell cellkulturer. Vi visar hur protein microarray kan användas för att bestämma en kombination av isotyp (IgG, IgA, IgM), underklass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2) och stam-specifika antikroppar mot höggradigt renat hela C. difficile toxiner A och B (toxinotype 0, stam VPI 10463, ribotyp 087), toxin B från en C. difficile toxin-B-only uttrycker stam (CCUG 20309), en föregångare form av ett B fragment av binära toxin, pCDTb, ribotyp-specifika hela ytskiktet proteiner (SLPs; 001, 002, 027), och styra proteiner (stelkramp tetanustoxoid och Candida albicans). Under experimentet, microarrays är utforskad med sera från individer med C. difficile -infektion (CDI), personer med cystisk fibros (CF) utan diarré, friska kontroller (HC), och från enskilda pre- och post-IVIg-terapi för den behandling av CDI, kombinerad immunbrist sjukdom och kronisk inflammatorisk demyeliniserande polyradiculopathy. Vi möter betydande skillnader i toxin neutralisering efficacies och multi-isotyp specifika antikroppsnivåer mellan patientgrupper, kommersiella beredningar av IVIg, och sera före och efter IVIg-administrering. Dessutom finns det en signifikant korrelation mellan microarray och enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) för antitoxin IgG-nivåer i serumprover. Dessa resultat tyder på att microarray skulle kunna bli ett lovande verktyg för profilering antikroppssvaret mot C.difficile antigener hos vaccinerade eller infekterade människor. Med ytterligare förfining av antigen paneler och en minskning av produktionskostnaderna, räknar vi med att Mikroarrayteknik kan hjälpa optimera, och välj de mest kliniskt användbar immunterapier för C. difficile infektion i ett patient-specifika sätt.
Introduction
Det här protokollet beskriver utveckling och validering av en roman och anpassade protein microarray analys för detektion och semi kvantifiering av bakteriell stam och isotyp-specifika antikroppssvaret mot C. difficile antigener. Vi använder framgångsrikt våra C. difficile-specifika microarray analys som ett lovande nytt verktyg för den kompositionella bioanalys av specifika antikroppen innehåll i patientsera1,2, beredningar av IVIg3, och identifiering av antikropp särdrag som korrelerar med dålig utfall i CDI4. Vi visar hur biobanked serumprover och kommersiella preparat av IVIg kan analyseras på microarray diabilder, möjliggör hög kvalitet reproducerbara profilering av C. difficile patogen-specifika antikroppen svaren i denna analys.
Många friska barn och vuxna har detekterbara serum IgG och IgA antikroppar mot C. difficile toxiner A och B5,6. Dessa tros uppstå efter övergående exponering under spädbarnstiden och efter exponering för C. difficile i vuxen ålder. Av denna anledning polyklonala IVIg har varit används off-label för att behandla både återkommande och fulminant CDI7,8,9. Dock oklar sin slutgiltiga roll och verkningsmekanismen. Flera studier har visat att det humorala immunsvaret för C. difficile toxiner spelar en roll i sjukdomen presentation och resultatet. Specifikt, uppvisar asymtomatiska patienter en ökad anti toxin A IgG koncentration i serum jämfört med patienter som utvecklar symtomatisk sjukdom10. En påvisbar association har rapporterats för median anti toxin A IgG titrar och 30-dagars totalmortalitet11. Flera rapporter har också visat en association med ett skydd mot återfall och antikroppen Svaren till toxin A, B och flera icke-toxin antigener (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD och ytskiktet proteiner (SLPs))12,13 , 14 , 15. dessa observationer har sporrat utvecklingen av den första passiva immunterapi drog inriktning C. difficile toxinen B (bezlotuxumab), som nyligen har godkänts av den amerikanska Food and Drug Administration och Europeiska läkemedelsmyndighetens Byrån för förebyggande av återkommande CDI16. Vaccination strategier med inaktiverade toxiner eller rekombinant toxin fragment är också för närvarande under utveckling17,18,19. Dessa nya terapeutiska strategier kommer utan tvekan att stimulera krav på utvärdering humorala immunsvar mot flera antigener i stort urvalsstorlekar.
Idag finns det en anmärkningsvärd brist på kommersiellt tillgängliga hög genomströmning analyser kan samtidigt bedöma bakteriestam och isotyp-specifika antikroppssvaret mot C. difficile antigener. I området i närheten finns det ett icke tillgodosett behov att utveckla sådana analyser för att underlätta framtida forskningsinsatser och kliniska tillämpningar. Protein microarrays är en metod för att immobilisera stort antal individuellt-renat protein som en rumsligt organiserade matris av fläckar på en mikroskopisk bild-baserade yta med hjälp av en robotarm-system, som kan vara antingen en kontakt20 eller en icke-kontakt skriva ut verktyg21. Fläckarna kan representera komplexa blandningar såsom cell lysates, antikroppar, vävnad homogenates, endogen eller rekombinanta proteiner eller peptider, kroppsvätskor eller droger22,23.
Protein Mikroarrayteknik erbjuder tydliga fördelar jämfört med standard in-house ELISA teknik, som har traditionellt använts för att bedöma anti -C. difficile antikroppssvar. Dessa inkluderar en ökad kapacitet för att upptäcka ett utbud av multi-isotyp-specifika antikroppar mot en mer omfattande panel av protein mål, minskad volymkrav för antigener, prover och reagenser, och en ökad förmåga att införliva en större antal tekniska replikat, förutom flera interna kvalitetskontroll (QC) mäter1. Microarrays är därför mer känsliga, exakt och reproducerbar och har en större dynamiskt omfång. Dessa faktorer gör microarrays ett billigare och potentiellt gynnsamma alternativ till ELISAs för storskaliga detektion av kända proteiner. Men nackdelarna med Mikroarrayteknik leda främst från stora initiala kostnader i samband med att upprätta en panel av högrenade antigener och inrätta en teknisk plattform.
Protein microarrays har använts flitigt under de senaste två decennierna som ett verktyg för diagnostik och grundläggande forskning i kliniska tillämpningar. Specifika tillämpningar inkluderar proteinuttryck profilering, studiet av enzym-substrat relationer, biomarkör screening, analys av värd-mikrobinteraktioner, och profilering antikropp specificitet23,24, 25,26,27,28. Många nya patogen protein/antigen microarrays har fastställts, inklusive malaria (Plasmodium)29, HIV-130, influensa31, svår akut respiratorisk sjukdom (SARS)32, viral hemorragisk feber33 , herpesviruses34, och tuberkulos35.
Detta protokoll gäller inrättandet av en lätt operativa C. difficile reaktiva antigen microarray analys, som möjliggör korrekt, exakt och specifika kvantifiering av multi-isotyp och stamspecifika antikroppssvaret mot C. difficile antigener i sera och polyklonala IVIg. Häri, inkluderar vi representativa resultat som hänför sig till en godtagbar microarray analys prestanda i jämförelse med ELISA samt Analysens precision och reproducerbarhet profiler. Denna analys kan utvecklas ytterligare för att profilera andra kliniska prover och sätter en ny standard för forskning i den molekylära basen för CDI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förbereda en Microarray tallrik
- Späd C. difficile antigener med en utskrift buffert [PBS-Tween-trehalos (50 mM)] på den optimala koncentrationen (som var fördefinierade innan du kör patientsera): toxin en (200 µg/mL) och toxin B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL), och renad native hela SLPs härrör från ribotypes 001, 002 och 027 (200 µg/mL).
Obs: Toxin B erhölls från ett toxin B-uttryckande stam CCUG 20309 (90 µg/mL).- Späd de positiva kontrollerna, lysates av C. albicansoch tetanustoxoid med utskrift bufferten på 100 µg/mL. Slutligen, späd den renade humant immunglobulin matchande den testade antikropp isotypen seriellt, börjar på 50 µg/mL över 10 utspädningar i utskrift bufferten att skapa en kalibreringskurva.
- Över 10 µL av utspädningarna i utskrift bufferten till en plattan med 384 brunnar.
- Täck plåten med en tallrik sigill och centrifugera vid 300 x g under 5 minuter.
2. utskrift matriser med en kontakt Robot
- Värme kisel stiftet med hjälp av handhållen gasbrännare 3 x 2 s varje och skölj i rent vatten 3 x 3 s varje.
- Placera microarray plattan i lastningen kassetten av arrayer.
- Placera aminosilane glasen på bilden facket.
Obs: Skjut facket rymmer 27 bilder: tre rader med nio bilder. Bilderna är ordnade i stående orientering start från vänster på nedersta raden och resten av utrymmen är täckta med tomma bilder att se till att alla hål i Skjut facket omfattas.- Tryck på OK och kontrollera att ett vakuum har aktiverats och alla bilder är säkra. Lämna bilderna i den fuktiga miljön för minst 1 h innan du börjar skriva ut.
Obs: Aminosilane bilder tillhandahålls i en förseglad påse med torkmedel. Öppnad bör eventuella oanvända bilder returneras omedelbart till exsickatorn för lagring upp till utgångsdatum.
- Tryck på OK och kontrollera att ett vakuum har aktiverats och alla bilder är säkra. Lämna bilderna i den fuktiga miljön för minst 1 h innan du börjar skriva ut.
- Ställ in lämplig utskrift programmet skriva ut Clostridium difficile antigener. Starta den TAS Application Suite och öppna filen krävs kör utskriftsparametrar från katalogen 'Min Gridding Runs'. Välj Clostridium difficile fil för att skriva ut alla Clostridium difficile antigenerna i fyra exemplar.
- Dubbelklicka på ikonen MicroArray i huvudfönstret visas ett tre-tabbed fönster kallas 'MicroArraying parametrar'. De tre flikarna är ”källa”, ”Target” och ”alternativ”. Fliken ”Källa” visar Detaljer antalet prover som används i microarray plattan. Fliken ”mål” visar Detaljer för hur bilderna är laddas, där matrisen ska skrivas ut på bilden och redigera bildlayouten (16 subarray format). ”Alternativ”-fliken visar Detaljer för den tvätta protokoll och verktyg ska användas t.ex. Tvätta efter varje slutförd prov. Ren kisel pin mellan prover att undvika eventuella korskontaminering mellan olika prover.
- Programmering alternativen finns under Alternativ > köra inställningar i verktygsfältet TAS Application Suite. Det finns 9 flikar att arbeta igenom i detta avsnitt och som du komplett en flik flytta till nästa genom att klicka på den. Klicka på ”OK” knappen tar dig ur ”kör preferenser”. I fliken ”Allmänt” i ”kör inställningar” finns ett antal kryssrutor tillgängliga enligt detta avsnitt avser hur instrumentet ska fungera när ett program startas. Markera rutan ”Prime bad före start av kör”, alla tre wash stationer kommer att genomgå en kort priming sekvens före kör början. Kontrollera rutan ”tvätta början av kör”, PIN-verktyget kommer att tvättas innan den första källan besök. ”Tvätta slutet av kör” kryssrutan PIN-verktyget kommer att tvättas efter den sista källan besök. Användaren kan ställa in antalet tvätta cykler. I fliken ”klimat” i ”kör inställningar” och starta befuktning. Den inställning som vi använder är följande: start hastighet 55%, kör rate 55%, lägsta luftfuktighet 55%, målet luftfuktighet 60%. Börja inte kör tills målet luftfuktigheten har nåtts, annars fläckarna blir fel storlek och biblioteket avdunstar snabbt.
- Klicka på knappen grön gå i menyn bar av TAS. Börja kör och regelbundet Observera arrayer under utskrift kör vissa allt är OK.
Obs: Detta gör analysen av 15 prover parallellt på varje bild som en subarray används som en negativ kontroll. Utformningen av subarrays bestäms av antalet utskrivna proteinerna (antigener) och antalet utskrivna biologiska replikerar.
Obs: Efter utskrift varje prov, huvudet rör sig mot den tvätt bad att tillåta flera doppning av klämma fast i två tvätta bad som innehåller destillerat vatten och 0,002% Tween-20 för 1,5 s i varje bad, följt av sköljning stiftet med ultrarent vatten och torkning stiftet i huvudtvätt stationen för 4 s.
3. lagring av arrayer
- Hålla de utskrivna bilderna lagras över natten i rumstemperatur i en exsickator.
Obs: De utskrivna bilderna kan lagras i upp till en vecka.
4. matris sondering
- Placera försiktigt utskrivna bilderna i en hållare av 16 flera kamrar format.
Obs: Avdelningar, med ett djup på ca 7,5 mm, ger en generös yta för att underlätta blandning och tvätt steg baserat på volym. - Låt samtliga reagenser värmas till rumstemperatur före användning. Om inte annat anges, utför alla följande steg i rumstemperatur.
- Tillsätt 100 µL av filtrerade 5% bovint serumalbumin tween (BSAT; användning ett 0,2 µm spruta filter) för varje block, täcka bilderna och inkubera dem med skakningar för 1 h.
- Tvätta på bilderna 5 x 1 min varje i 120 µL fosfatbuffrad saltlösning med Tween-20 (PBST; 0,1% Tween) per brunn med skakningar. Låt inte bilderna torka ut.
- Tina serumprover på is i 20 min och späd varje prov med en kommersiellt tillgänglig antikropp spädmedel med bakgrunden minska komponent (se Tabell för material).
- Optimera utspädningen av serumet proverna enligt den testa immunglobulin som visas i tabell 2.
- Över 100 µL av de utspädda serumprov till alla block utom en, som kommer att användas som en negativ kontroll; till detta block, tillsätt 100 µL av antikropp spädningsvätska endast. Inkubera i bilderna med mild agitation för 1 h.
- Tvätta på bilderna 5 x 3 min varje i 120 µL PBST (0,1% Tween) per brunn med skakningar.
- Tillsätt 100 µL biotinylerade get antihumana antikroppar utspädd med antikropp spädningsvätska.
- Optimera utspädning av den sekundära antikroppen enligt den testa immunglobulin som beskrivs i tabell 2. Täcka bilderna och inkubera dem med milda skakningar för 1 h.
- Tvätta på bilderna 5 x 3 min varje i PBST 120 µL per brunn med skakningar.
- Tillsätt 100 µL av streptividin Cy5 till varje block utspätt till 1: 2000 i 5% BSA. Täcka bilderna med folie för att skydda dem från ljus samtidigt skakar för 15 min med försiktig skakning.
- Tvätta på bilderna 5 x 1 min varje i 120 µL av PBST per brunn med skakningar, följt av 2 tvättar 1 min varje i PBS endast med skakningar.
- Snurra bilderna för 5 min vid 300 x g torka dem.
- Förvara bilder i en mörk låda för transport och lagring i rumstemperatur.
- Fortsätt att skanna de arrayer omedelbart för att garantera signal efter sondering.
Obs: Dock sonderade bilder kan lagras i mörker och skannas inom en vecka från sondering.
5. Skanna arrayer
- Slå på laserscannern (se Tabell för material) 30 min före skanning för att värma upp lasern. Ladda upp skannerprogramvara och ansluta datorn till skannern.
- Placera en bild med den tryckta sida uppåt i skannern tills spela ljuset lyser stadigt grönt.
- Tryck på knappen Inställningar och justera följande inställningar när du skannar bilder enligt följande: skanningsläge, Median; Förvärv, 635 Förvärv läge, manuell; Vinning, 20; Kraft, låg; Bild typ, omärkt bild; Fokus, autofokus. Stäng av automatisk rullning och ange Barcode Reading till Pixel storlek 10 och skanna 35.
- Spara de resulterande bilderna som 16-bitars gråskala flera bild TIFF-format. Tryck på knappen Importera rutnät och välj listan lämplig matris.
Obs: Array listan beskriver storleken och positionen för subarrays och namnen på de tryckta ämnen som förknippas med varje funktion-indikator.- Justera gallret för att fläckarna på bilden.
- Analysera bilderna genom att trycka på knappen kvantifiering processen att mäta fluorescens signal stödnivåerna varje plats och spara resultaten i en textformat som kallas GenePix resultat (GPR).
Obs: GPR filen innehåller variablerna lokalisering och identifiering av antigen målen på matrisen och även median fluorescensintensiteten och lokala bakgrunden som representerar den antikropp bindande signal värdena för varje plats.
6. dataanalys
- Beräkna medianvärdet för varje antigen replikerar efter bakgrunden subtraktion med hjälp av en gratis microarray analys programvara kallad omvänd fas protein array (RPPA) analyzer, en modul inom R statistiska språk på CRAN36.
- Rita standardkurvan och interpolera signalerar av varje antigen i förhållande till immunglobulin standardkurvan använda kommersiella vetenskapliga grafritande och statistik-program (se Tabell för material) för att beräkna antikroppsnivåerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar ett flödesschema som beskriver de stora stegen i protokollet beskrivs. Figur 2 visar Spearman korrelation tester visar betydande avtal mellan microarray och ELISA IgG och IgA anti toxin A och B nivåer i patientens testserumen. Figur 3 visar differentiell IgG och IgA antikroppar-klass specifika antikroppen Svaren till toxin A, toxin B och binära toxin (pCDTb) hos patienter med CF utan diarré, CDI patienter med diarré, och i HC. Figur 4 visar C. difficile antitoxin neutraliserande antikroppen svaren i patientsera. Figur 5 visar immun reaktivitet (mot C. difficile toxiner och SLPs) och neutraliserande effekt (mot C. difficile toxiner) av IVIg. Figur 6 visar immun reaktivitet (mot C. difficile toxiner och SLPs) och neutraliserande effekt (mot C. difficile toxiner) patientsera pre-och post-IVIg-administrering. Tabell 1 visar acceptabel intra - och inter - analysen koefficienter av variabilitet av microarray med testserum. Tabell 2 visar en lista av immunglobuliner som används i denna studie med relevanta koncentrationer av renade proteiner samt optimerad spädningar för sera och sekundära antikroppar.
Figur 1 : Allmän översikt över stora stegen i protokollet microarray. Det första steget är utarbetandet av de antigener och kontroller. De efterföljande provspädningar överförs till en 384-skylt i beredskap för utskrift i quadruplicates på aminosilane bilderna. Efter torkning och blockering av diabilder, inkuberas arrayer med patientsera. Efter ytterligare tvättning, läggs den biotinylerade anti-humant immunglobulin (Ig) av den angivna isotypen. Efter sista tvätt och torkning steg, bilderna är skannade och resulterande bilderna bearbetas med en analys bildbehandlingsprogram mikroarray. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Korrelation mellan microarray och ELISA resultat. Spearman korrelationskoefficienten användes för att bedöma nivån på avtalet mellan de båda plattformarna. När man jämför microarray prestanda med en egen glykoproteinenzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA), A. en bra korrelationskoefficient observerades för toxin A (r = 0.7051; P < 0,0001), B. och en måttligt god korrelation för toxin B (r = 0.5809; P < 0,0001). Full ELISA protokollet har varit detaljerad någon annanstans37. Denna siffra har varit omtryckt från Negm o.a. 1 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: isotyp-specifika antikroppen Svaren till Clostridium difficile toxiner. Denna bild suggor serum mot toxin IgG och IgA svaren (toxinotype 0, stam VPI 10463, ribotyp 087; toxin A vid 200 µg/mL, toxin B på 100 µg/mL), toxin B (C. difficile toxin B-producerande stam CCUG 20309; toxin B på 90 µg/mL) och föregångaren form av a B fragment av binära toxin, pCDTb (200 µg/mL), hos patienter med cystisk fibros (CF) utan diarré, patienter med C. difficile -infektion (CDI) med diarré, och hos friska kontroller (HC). Serumspädningen för IgG och IgA är 1: 500 och 1: 100, respektive. Skillnaderna mellan grupperna bedömdes i Kruskal-Wallis test, följt av Dunn's post hoc-test för flera svar. Jämfört med HC (n = 17) och patienter med symtomatisk CDI (n = 16), de vuxna CF-patienterna (n = 16) uppvisade signifikant högre nivåer av serum IgA anti toxin A och B nivåer; P ≤0.05. Samma mönster segrade för IgG, förutom att det fanns ingen skillnad i anti toxin A IgG nivåer mellan grupperna. Box och morrhår tomter representerar medianen, utbud och kvartiler. P ≤0.0001; P ≤0.01; P ≤0.05. De standardiserade signalerna är normaliserad till immunglobulin standardkurvan. Denna siffra har varit omtryckt från Monaghan o.a. 2 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Neutralizing antikropp efficacies till C. difficile gifter A och B i patienternas sera. Denna figur visar de skyddande neutraliserande antikroppen (NAb) Svaren till C. difficile toxiner A och B [toxinotype 0, stam VPI 10463, ribotyp 087, används på en dödlig dos för 50% (LD50)] i sera (1: 100 utspädning; toxin A 2,5 ng/mL, toxin B 0,5 ng/mL) från HC , patienter med CF utan diarré, och patienter med CDI med diarré. Sera från CF-patienter uppvisade betydligt starkare skyddande anti toxin NAb svar jämfört med sera från HC (toxiner A och B) och patienter med CDI (toxin A). Skillnaderna mellan grupperna bedömdes i Kruskal-Wallis test, följt av Dunn's post hoc-test för flera svar. Box och morrhår tomter representerar medianen, utbud och kvartiler. P ≤0.01; P ≤0.05. Denna siffra har varit omtryckt från Monaghan o.a. 2 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Immun reaktivitet och neutraliserar effekten av IVIg C.difficile antigener. A. denna bild visar Reaktiviteten hos multi-isotyp specifika antikroppar mot C. difficile antigener i kommersiella intravenöst immunglobulin (IVIg) preparat. Stresskartan illustrerar nivåerna av specifika antikroppen isotypes (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2 och IgM) i tre kommersiellt tillgängliga preparat (se Tabell för material) mot sju C. difficile antigener [toxin en (200 µg /mL), toxin B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL), toxin B (CCUG 20309; 90 µg/mL), och surface layer proteiner (SLPs) 001, 002 och 027 (alla 200 µg/mL)] använder protein Mikroarrayteknik. Färgkod för stresskartan är följande: grön (låg) till röd (hög) signalintensitet. De signalen värden representeras på färgskalan för stresskartan är log2-omvandlad från godtyckliga fluorescens enheterna (AFU). Vänligen signaler Observera att AFU mer nyligen ersatts av deskriptorn standardiserade2. Den totala IgG, IgG1 och IgG2 isotyper gav de högsta bindande reactivities mot toxin A, toxin B, binärt toxin (pCDTb), och toxin B (CCUG 20309). B. dessa tomter Visa IVIg neutralisering effekten mot de infödda C. difficile hela gifter A och B. De ger procentandelen av skyddande neutralisering verkställa av kommersiella IVIg-produkter mot C. difficile toxiner A och B. Varje tomt representerar medianen av tre exemplar experiment vid spädning 1: 100. IVIg beredning 1 uppvisar den lägsta skyddande effekt jämfört med IVIg preparat 2 och 3, särskilt mot toxin A. *** P ≤0.0001; P ≤0.05 (envägs variansanalys). Denna siffra har ändrats från Negm o.a. 3 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Immun reaktivitet och neutraliserar effekten av patientens serum för C. difficile -antigener. A. denna figur visar en jämförelse av antikropp reactivities mot C. difficile proteiner i patienternas sera före och efter IVIg-infusionen. Stresskartan illustrerar uttrycket nivån på isotypes (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2 och IgM) i serumprov hos sju patienter före och efter IVIg infusion mot sju C. difficile antigener [toxin en (200 µg/mL), toxin B (100 µg / mL), pCDTb (200 µg/mL), toxin B (CCUG 20309; 90 µg/mL), och SLPs 001, 002 och 027 (alla 200 µg/mL)] använder protein Mikroarrayteknik. Färgkod för stresskartan är följande: grön (låg) till röd (hög) signalintensitet. De signalen värden representerade på färgskalan för stresskartan är log2-förvandlas från AFU. Observera att AFU mer nyligen ersatts av standardiserade signaler2. Det fanns en efter infusion förbättring av de totala IgG, IgG1, IgG2 och IgG3 reactivities toxin A, toxin B och pCDTb. B. denna bild visar IgG Svaren till toxin A, toxin B, och binära toxin (pCDTb), pre- och post-IVIg-administrering. De totala IgG-nivåerna mot alla gifter visar en betydande ökning efter IVIg administrering (med hjälp av Wilcoxon undertecknat-rank-test). Varje tomt representerar medianen av tre exemplar experiment på 1:10 utspädning. C. dessa tomter visar neutralisering effekten mot infödda C. difficile toxiner A och B efter IVIg-administrering. En jämförelse före och efter infusion neutraliserande antikropp aktiviteter visar en förstärkt skyddande effekt efter IVIg infusionerna mot infödingen C. difficile toxiner A och B. Varje tomt representerar medianen av tre exemplar experiment på 1:10 utspädning. En betydande ökning av den skyddande effekten mot gifter A och B noterades i patientsera som testade post-IVIg infusion (med hjälp av Wilcoxon undertecknat-rank-test). Denna siffra har varit omtryckt från Negm et al. 3 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reproducerbarhet | Toxin A | Toxin B | SLP001 | SLP002 | SLP027 | Toxin B CCUG 20309 | pCDTb |
| Inom analysen | 7,70% | 6.40% | 7.40% | 5.10% | 7,60% | 7% | 3.70% |
| Mellan analyser | 9.10% | 9.10% | 7.40% | 11.20% | 12,8 | 9,70% | 12.50% |
Tabell 1: Microarray inom analysen och mellan analyser precision 1. Microarray intra - och inter - analysen variabilitet beräknades med hjälp sera hos 7 patienter. Identiska prover analyserades på varje två bilder på två oberoende tidpunkter. Alla antigener (n = 7 test och n = 2 kontroller) sågs i replikat av fem på varje matris.
| Renat proteinkoncentration | Spädning av serumet | Sekundära antikroppar utspädning | |
| IgG | 50 mikrog/ml | 1/500 | 1/20000 |
| IgG1 | 200 μg/ml | 1/100 | 1: 5000 |
| IgG2 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/10000 |
| IgG3 | 200 μg/ml | 1/100 | 1: 5000 |
| IgG4 | 200 μg/ml | 1/100 | 1: 5000 |
| IgA | 50 mikrog/ml | 1/100 | 1: 5000 |
| IgA1 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/10000 |
| IgA2 | 200 μg/ml | 1/100 | 1: 5000 |
| IgM | 50 mikrog/ml | 1/500 | 1/20000 |
Tabell 2: lista av immunglobuliner som används i denna studie. Igs visas med de relevanta renat protein koncentrationer (µg/mL) och spädningar för serum och sekundära antikroppar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll, har vi visat att microarray är en lämplig plattform för att definiera humorala immunsvar mot C. difficile proteinantigener i patientsera (figur 3 och 6) och kommersiella preparat av IVIg (figur 5). Vi har också visat att microarray tekniken presterar väl jämfört med konventionella ELISA (figur 2) och visar utmärkt reproducerbarhet, med intra - och inter - analysen variabilitet som faller inom acceptabla gränser precision ( Tabell 1).
Kritiska steg:
Ett antal kritiska steg måste följas när man bygger någon framgångsrik antigen microarray plattform. Inledningsvis är det oerhört viktigt att köra QC experiment. I QC experiment, bör olika parametrar utvärderas, som val av lämpliga ytkemi, utskrift buffertar, blockerande buffertar, utspädningar av serumprover och sekundära antikropparna. Dessa experiment måste utföras med syftet att leverera en väl validerad och tillförlitlig teknik38,39.
Valet av en lämplig protein immobilisering process är en av de viktigaste stegen i microarray-analyser, för att säkerställa en hög kvalitet prestanda av testade aminosilane bilderna, som kan ses i denna studie. Det är viktigt att iaktta regelbunden och cirkulär fläck morfologi, höga och specifika signalintensitet och en klar bakgrund. En annan faktor som påverkar microarray prestanda är utskrift bufferten, vilket är lika viktigt att uppnå den önskade ytkemi för att producera enhetliga och regelbundna fläckar i bilden.
Det är viktigt att välja rätt inställningar för utskrift eftersom detta gör att den optimala storleken och formen på en plats som ska skrivas ut. Till exempel bör luftfuktigheten bibehållas omkring 55% under utskrift, eftersom utan fukt avdunstning i microarray kammaren är ökat och färre ställen skrivs ut.
Icke-specifika proteinbindning är ytterligare en faktor som påverkar bakgrunden och plats signaler; Därför skulle kunna lämpligt urval av en blockerande buffert minska eventuella icke-specifik bindning, leder till bättre känslighet och noggrannhet av den array data39.
Modifieringar och felsökning:
Antigener och serumprov vara aliquoted och lagras i mindre lagring rör i frysen tills användning, vilket hjälper till att undvika upprepade flera frysning-tining cykler som kan försämras signalstyrkan för matrisen. För att öka chanserna för ett lyckat experiment, alla reagenser måste vara beredda färska och filtreras. Rengöring av arrayer innan utskrift och kontrollera inställningarna krävs. Dessutom måste diapositivhållaren hållas rena för att minimera bakgrundsljud.
Begränsningar:
Tillämpningen av protein microarrays försvåras för närvarande av den stränga efterfrågan på ytkemi i protein microarray fabrication. Här nödvändiggör den stora variationen i de kemiska och fysikaliska egenskaperna av proteinmolekyler custom-designa unika ytkemi för olika klasser av protein och antikropp molekyler40. Andra tekniska utmaningar utbredd genomförandet av sådan teknik inkluderar behovet av dyr specialiserad utrustning och programvara med tilldelat bänk-utrymme, liksom övervägande av underhållsavgifter, komplexa dataanalys, släkting protein kvantifiering och kritiskt tillgång till renade antigener.
Betydelsen av metod med avseende på befintliga/alternativa metoder:
Mikroarrayteknik i princip liknar ELISA, Meso skala Discovery eller Luminex immunanalyser, men är anpassningsbara, kan skalas upp för att uppnå statistisk power, förlitar sig på bara mikroliter mängder av dyrbara prover och har förmågan att skärmen sera för flera protein reactivities. Det är därför särskilt lämplig för storskaliga, historiska serum banker och biomarkör identifiering och screening.
Framtida tillämpningar eller riktningar av metod:
Framtida insatser kommer att inriktas på att optimera analysen för andra prover (cell supernatanterna), med analys som prognostiska verktyg för patientens stratifiering, externt validera potentiella biomarkörer med stora kohorter i en dubbel-blind mode, och förutsäga och optimera svar på immunterapi (mAb, vacciner). I framtiden, kunde microarray tekniken användas på sjukhus som ett användbart diagnostiskt verktyg eller för att övervaka en drog behandlingsplan över en tidsperiod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av en Hermes-stipendium till Ola Negm och Tanya Monaghan och genom separat finansiering från Nottingham mag sjukdomar centrum och de NIHR Nottingham mag sjukdomar Biomedical Research Centre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobotics MicroGrid II arrayer | Digilab, Malborough, MA, USA | N/A | Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides. |
| Scanner InnoScan 710. | Innopsys | N/A | A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction. |
| MAPIX software version 7.2.0 | Innopsys | N/A | Measure signal intensities of the spots. |
| Silicon contact pin | Parallel Synthesis Technologies | SMT-P75 | Print the samples onto the slides. |
| Thermo Scientific Nalgene Desiccator | Thermo Scientific | 41102426 | To store the new and printed slides. |
| 384-well plate | Genetix | X7022UN | To prepare the antigens. |
| Plate cover | Sigma Aldrich, UK | CLS6570-100EA | To reduce evaporation of the samples. |
| Aminosilane slides | Schott, Germany | 1064875 | The slide of choice for printing the antigens. |
| Slide holders | GraceBio Labs, USA | 204862 | Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells . |
| Candida albicans lysate | NIBSC | PR-BA117-S | Positive control |
| Tetanus Toxoid | Athens Research and Technology | 04/150 | Positive control |
| Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707 | Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-1 | Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-2 | Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-3 | Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-4 | Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma. |
| Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701 | Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-1M | Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-2M | Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma. |
| Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090713 | Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma. |
| Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific | Vector Labs | BA-3080 | Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9052-08 | Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT | Southern Biotec | 9060-08 | Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9210-08 | Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT | Southern Biotec | 9190-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - Biotinylated | Vector Labs | BA-3030 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA1-BIOT | Southern Biotec | 9130-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA2-BIOT | Southern Biotec | 9140-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgM-BIOT | Southern Biotec | 9020-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| 0.2 mm syringe filter | Thermo scientific | 723-2520 | Filter the 5% BSA. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, UK | A7284 | Use 5% BSA for blocking the slides. |
| Antibody diluent | Dako, UK | S3022 | To dilute the serum and the secondary antibody. |
| Streptavidin Cy5 | eBioscience | SA1011 | Detection of the immune reaction. |
| Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb | University of Bath | NA | Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70) |
| Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins | Dublin City University | NA | |
| Vigam (IVIg preparation 1) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Privigen (IVIg preparation 2) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Intratect (IVIg preparation 3) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A |
References
- Negm, O. H., et al. Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).
- Monaghan, T. M., et al. High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection. Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).
- Negm, O. H., et al. Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration. Clinical & Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).
- Monaghan, T., et al. OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection. Gut. 66, Suppl. 2 31 (2017).
- Bacon, A. E. Immunoglobulin G directed against toxins A and B of Clostridium difficile in the general population and patients with antibiotic-associated diarrhea. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 18 (4), 205-209 (1994).
- Viscidi, R., et al. Serum antibody response to toxins A and B of Clostridium difficile. The Journal of Infectious Diseases. 148 (1), 93-100 (1983).
- Salcedo, J., et al. Intravenous immunoglobulin therapy for severe Clostridium difficile colitis. Gut. 41 (3), 366-370 (1997).
- Abougergi, M. S., Kwon, J. H. Intravenous immunoglobulin for the treatment of Clostridium difficile infection: a review. Digestive Diseases and Sciences. 56 (1), 19-26 (2011).
- Shah, N., Shaaban, H., Spira, R., Slim, J., Boghossian, J. Intravenous immunoglobulin in the treatment of severe Clostridium difficile colitis. Journal of Global Infectious Diseases. 6 (2), 82-85 (2014).
- Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A. The New England Journal of Medicine. 342 (6), 390-397 (2000).
- Solomon, K., et al. Mortality in patients with Clostridium difficile infection correlates with host pro-inflammatory and humoral immune responses. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 9 1453-1460 (2013).
- Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea. Lancet. 357 (9251), 189-193 (2001).
- Leav, B. A., et al. Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium difficile infection (CDI). Vaccine. 28 (4), 965-969 (2010).
- Drudy, D., et al. Human antibody response to surface layer proteins in Clostridium difficile infection. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 41 (3), 237-242 (2004).
- Bauer, M. P., Nibbering, P. H., Poxton, I. R., Kuijper, E. J., van Dissel, J. T. Humoral immune response as predictor of recurrence in Clostridium difficile infection. Clinical Microbiology and Infection. 20 (12), 1323-1328 (2014).
- Wilcox, M. H., et al. Bezlotoxumab for prevention of recurrent Clostridium difficile infection. The New England Journal of Medicine. 376 (4), 305-317 (2017).
- Leuzzi, R., Adamo, R., Scarselli, M. Vaccines against Clostridium difficile. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 10 (6), 1466-1477 (2014).
- Ghose, C., Kelly, C. P. The prospect for vaccines to prevent Clostridium difficile infection. Infectious Disease Clinics of North America. 29 (1), 145-162 (2015).
- Henderson, M., Bragg, A., Fahim, G., Shah, M., Hermes-DeSantis, E. R. A review of the safety and efficacy of vaccines as prophylaxis for Clostridium difficile infections. Vaccines. 5 (3), Basel. (2017).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Delehanty, J. B., Ligler, F. S. Method for printing functional protein microarrays. BioTechniques. 34 (2), 380-385 (2003).
- Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 27 (Unit 27) 21 (2013).
- Huang, Y., Zhu, H. Protein array-based approaches for biomarker discovery in cancer. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 15 (2), 73-81 (2017).
- Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
- Bacarese-Hamilton, T., Mezzasoma, L., Ardizzoni, A., Bistoni, F., Crisanti, A. Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays. Journal of Applied Microbiology. 96 (1), 10-17 (2004).
- Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).
- Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection. Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).
- Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 30, 21-27 (2016).
- Crompton, P. D., et al. A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6958-6963 (2010).
- Khodakov, D. A., et al. An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV. BioTechniques. 44 (2), 241-246 (2008).
- Ryabinin, V. A., et al. Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus. PLoS One. 6 (4), 17529 (2011).
- Zhu, H., et al. Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).
- Cleton, N. B., et al. Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers. PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580 (2015).
- Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies. PLoS One. 8 (9), 73842 (2013).
- Zhou, F., et al. Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection. Scientific Reports. 5, 15349 (2015).
- Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data. Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).
- Monaghan, T. M., et al. Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis. PLoS One. 8 (9), 74452 (2013).
- Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. Current microarray surface chemistries. Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).
- Wellhausen, R., Seitz, H. Facing current quantification challenges in protein microarrays. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, article ID 831347 (2012).
- Guo, A., Zhu, X. -Y. The critical role of surface chemistry in protein microarrays. Functional Protein Microarrays in Drug Discovery. , CRC Press. Boca Raton. (2007).
